JPH01104179A - バシラス内に於いて異種起源タンパク質の発現のために使用することができる組換プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、組換ＤＮＡ技術による、冶原および診断に使
用できるタンパク質の製造方法に係る。

本発明は、特に、異種起源タンパク質を暗号化している
ＤＮＡ配列のクローニングのための２価ベクターと、こ
のＤＮＡ配列を含むバシラス内で発現される組換プラス
ミドと、この組換プラスミドにより形質転換されるホス
ト（宿主）の微生物と、これらを用いてタンパク質を製
造するための方法に関する。

より詳細には、本発明は、抗百日咳ワクチンの製造と、
百日咳の診断のための検査システムの中で使用すること
ができる、百日咳毒素の成熟サブユニットを製造するた
めの方法と手段に係る。

百日咳は、ダラム陰性の球場桿菌である百日咳菌３ｏｒ
ｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　（３，ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ）により引き起こされる気管の感染症である
。Ｂ、ｐｃｒｔｕｓｓｉｓは、カタル期または痙咳期に
、この病気に罹っている人から感染し易い健床な人に直
接移る。

百日咳は、呼吸器の合併症や神経に対する障害を引き起
こすことがあり、とりわけ子供や母親から百日咳の抗体
をもらっていない新生児にとって死亡率の高い病気であ
る。

百日咳の臨床的な経過は、潜伏期、カタル期、痙咳期、
快復期の４つの段階を含む。

最初の２つの期間では、普通の風邪と同じような症状が
現われ、Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは患者から容易に分
離することができる。

痙咳期では、百日咳に特有の症状が現れるが、細菌は患
者の僅か５０％からしか分離されない。

快復機では、もはや、の咽頭から３．　ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉＳを分離することはできないが、愚者にはまだ百日咳
の症状が持続する。

この臨床像から、患者が、細菌が為滅した後に最も重度
の臨床的な微１喚を呈することは明かである。これは、
百日咳は、Ｂ、ｐＢｔｕｓｓｉｓの気管への浸入それ自
体ではなく、この！：ＩＩｌ菌により引き起こされる中
毒に起因するからである。したがってこの中毒症状は、
細菌が消滅した後も持続する。

Ｂ　、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの工期（有毒性）から■期
（無毒性）への変化には、百日咳毒素（ＰＴ）、溶血素
（Ｈｌｙ）、アデニルシクラーゼ（Ａｄｄ）、皮９壊旧
毒素（Ｄｎｔ）等の物質を合成する能力の喪失が伴う。

近年Ｗｅｉｓｓ　　Ａ、　Ａ、等（ｌ　ｎｆ、　　■ｍ
ｍｕｎ、　４２　。

３３　（１９８３）：Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｇ、１５０．２
１９　（１９８４））は、これらの物質の全てが８゜ｐ
ｅｒｔｕｓｓ＋ｓの有毒性に等しい役割を果たすわけで
はないことに注目し、百日毒素がこのｍ菌の毒性の主因
であるこを発見した。

百日咳毒素は、分子量が、ｉｏｏ、ｏｏｏダルトンのタ
ンパク質で、工期の間にＢ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによ
り生産され、細胞外の環境に放出される。

百日咳毒素は、他の毒素と同じ様に、２つの異なるフラ
グメント（断片）Ａと８により構成される。

有毒性のＡフラグメントは、分子量が約２８゜ＯｏＯダ
ルトンの単一のポリペプチド３１　（Ｓ１サブユニット
）から成る。このＳ１サブユニットは、ΔＤＰリボーズ
・グループを、外部から細胞の内部へのシグナル通過に
関与するＧ１タンパク質に結合する。

Ｂフラグメントは、分子量がそれぞれ２３，０００、　
２２，０００．　１２，０．００．　９゜ＯＯＯダルト
ンの４つポリペプチド８２．８３゜８４．８５．（３２
，８３，８４，８５サブユニット）から成る。８２．Ｇ
３，８４サブユニットは２つの二９体（Ｓ２＋８４）、
＜８３＋８４）を構成し、Ｇ５は単量体である。

Ｂフラグメントは、真核細胞の細胞膜のレセプター（受
容体）に結合し、Ｓ１サブユニットの細胞内への侵入を
容易にする。

（従来技術） 現在使用されている抗百日咳ワクチンは、永久的な免疫
ができるが、多数の問題点がある。

このワクチンは、病毒性の強い細菌（工期）を５６℃で
３０分間処理して熱に不安定な毒素（皮勅壊痘毒素）を
除去し、ざらにメチオ゛レートで殺菌したものである。

この細菌は全く解毒処理を受けないので、５６℃の温度
に耐え得る毒性物質は全てワクチンに含まれることにな
る。

これらの毒性物質、とりわけＰＴの存在は、単なる発疹
から永久的な神経障害および／または死までの副作用を
起こす。

そのため最近の１０年間に、このワクチンの使用は著し
く減少し、その結果再び百日咳患者が発生している。

基本的に、ｖａＩＩｔ状血球凝集素（ＦＨＡ）と、ホル
ムアルデヒドで解毒された百日咳毒素とを組成する抗百
日咳ワクチンの製法が、Ｙ、佐原等によりＬａｎｃｅｔ
Ｊａｎ、　　２１．１２２（１９８４）に記載されてい
る。

このワクチンは、従来のワクチンの０１作用に比べて軽
度ではあるが副作用を起こすこと、および純粋な、再現
可能な形で製造することができないこと等の点でまだ満
足すべきものではない。

（本発明が解決しようとする課題） このような現状の下で、大規模に製造することができ、
上記のような欠点の無い効果的な百日咳ワクチンの製造
に利用することができる他の材料が求められる。

しかるに、例えば、遺伝子工学の分野の最近の発展によ
り、治療に使用することができる異種起源のタンパク質
を製造する能力をもつ微生物を作り出すことが可能にな
った。特に、イタリア特許出願Ｎｏ、Ａ／８６　１９２
０８は、百日咳毒素のサブユニットを暗号化している遺
伝子の配列決定とそのクローニング、および形質転換さ
れた大腸菌（Ｅ、　Ｃ０１ｉ　）細胞を適当な培養手段
で培養することから成るこれらのサブユニットの製造方
法を記載し、特許を請求している。しかしながら、この
方法を用いると、融合タンパク質すなわち、百日咳毒素
の成熟サブユニットと重合酵素とから成るタンパク質が
生産される。そのため、これらのタンパク質は、抗百日
咳ワクチンの製造に使用する前に加水分解処理を必要と
することも考えられる。さらに人にとって病原性の細菌
であるＥ。

Ｃｏ１１をホストとして使用することは、その方法それ
自体を非常に厄介なものにし、その方法の実施、とりわ
けタンパク質の分離と回収の段階に於いて実施を複雑に
する。

これらの欠点は、内毒素を造らない非病原性の細菌であ
るバシラスを用い、かつバシラス内で安定な、百日咳毒
素の成熟サブユニツ１−の発現を可能にする７０−ニン
グ・ベクターを使用することにより、克服できる可能性
がある。

［発明の溝底］ （課題を解決するための手段） 本発明の１つのの解決手段は、バシラス内で百日咳毒素
の成熟サブユニットを暗号化するＤＮＡ配列のクローニ
ングのために使用できる２画ベクタ・−である。

本発明の他の解決手段は、百日咳毒素の成熟サブユニッ
トを暗号化しているＤＮＡを配列クローニング・ベクタ
ーのＥＣＯＲ＋およびＭｉｎｄｌ１口ｉｌｌ限部位内に
入れてクローニングすることにより得られる、バシラス
内で発現させるためのｔ［ｊＡプラスミドである。

本発明のさらに他の解決手段は、組換プラスミドにより
形質転換されたバシラス細胞を培養することによる百日
咳毒素の成熟サブユニットの製造方法である。

本発明のさらに他の解決手段は、これらのサブユニット
を治療と診断に使用することである。

本発明の内容については、下記の説明と実１ｆｉ　ｆｉ
＋から明かになるであろう。

（作用） 本発明によるクローニング・ベクターは、０８Ｍ２１４
として知られている。このクローニング・ベクターは、
抗生物質カナマイシン、アンビオイリン、クロラムフェ
ニコールに封する耐性をそれぞれ暗号化する。ｋｍ、　
Ｂｌａ、　Ｃａｔ３ｉ伝子をＢ。

５ｕｂｔｉｌｌｉｓおよびＥ、ｃｏｌｉの内部で複製す
ることを可能にするｐＵＢｌｌｏおよびｐ　ＢＲ３２２
の複製開始点と、ＢｌａおよびＣａ（遺伝子配列を含み
ジシストロニツタ・メツセンジャーＲＮＡ　（ＩＩＩ　
ＲＮＡ）の転写を指令する強力な人工プロモーターとを
含む。このようなｍＲＮの生成は、クロラムフェニコー
ルに対する性質により菌株を選択することによりプラス
ミド中の強力なプロモーターを安定化することを可能に
する点で、とりわけ利点がある。特に、本発明によるク
ローニング・ベクターは、次の処理から造られる。

ａ）制限酵素Ｍｂｏｌと）ｌ　ｐａＩＩを用いたダイジ
エスチョンによる、クロラムフェニコール・アクディル
・トランスフェラーゼ（Ｃａｔ）を暗号化する８２０−
塩基対（ｈｐ）の遺伝子と、そのプロモータである２１
２−ｂｒｌ配列とから成る１０３２−ｂｐのＤＮＡフラ
グメントの、プラスミドｐＣ１９４からの分離 ｂ）制限酵素１−１ｉｎｆｌを用いた部分的ダイジエス
チョンによる、前記１０３２−ｂｐフラグメントからの
８２０−ｂｐｉｕ伝子の信子と、フレノウ（Ｋ　Ｉｅｎ
。

Ｗ　）ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いた前記８２０−ｂ
ｐフラグメント上へのプラントエンド（平滑断端）の形
成 Ｃ）制限ＮＸＨｉｎｃｌｒを用いたダイジエスチョンに
よる、直線化されたプラスミドｐＳＭ１９１への前記８
２０−ｂｐフラグメントの結合と、このようにして得ら
れたプラスミドｐＳＭ２１３の分離ｄ）制限酵素Ｂａｍ
１−ＩＩとＨ１ｎｄＩＩＩを用いた連続的なダイジエス
チョンによる、前記Ｃａｔを暗号化する８２０−ｂｐの
遺伝子と、Ｅ、ｃｏｌｉのラムダ・ファージのｔｏター
ミネータ（転写終結区）配列とを含む約１０００１）ｌ
）のＤＮＡフラグメントの、プラスミドｐＳＭ２１３か
らの分離 ｅ）制限酵素Ｘｈ０１　とｌ−１１ｎｄＩＩＬを用いた
プラスミドｐ　５Ｍ２０８−Ａのダイジエスチミンによ
り、プラスミドｐ　５Ｍ２０８−Ａから分離した６３０
０−ｂｐのＤＮＡフラグメントへの、前記１０００−ｂ
ｐフラグメントの結合、そして最後にｆ）形質転換され
たＢ、５ＩＩＩｌｔｉｌｉＳの株からの、前記７３００
−ｂｐのクローニング・ベクター１）８Ｍ２１４の分離 本発明では、プラスミドＤＮＡのグイジエスチョンは、
公知の技術にしたがって、緩衝液の中で、１つまたは複
数の適当な酵素の存在下で、ＤＮＡを懸濁させ、このＤ
ＮＡの懸濁液を、ダイジエスチョン反応を完了させるの
に必要な温度で必要な時間維持することにより行う。

この反応の完了後、得られたフラグメントおよび／また
はＤＮＡのフラグメントは、ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動を用いて、８０から１５０Ｖの電位差を加える
ことにより分離される。そして最後に、所望の配列をも
ったフラグメントが、Ｍ　ａｘａｍとＧ　１ｌｂｅｒｔ
　（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ〈１９８０）　、　ｖｏｌ　、　４５．４９９−５
６０＞により記載されている方法、にしたがって、電気
溶出により分離される。結合反応は、緩謂液の中で、Ｔ
４　　ＤＮＡ合成酊素の存在下で、１４から２５℃の温
度で１０から２０時間かけて行われる。

結合反応の完了後、得られたハイブリッド・プラスミド
は、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２細胞の形質転換を利用して
分離される。すなわち、リガーゼの混合物を用いるＭ　
ａｎｔａｔｔｓ等の方法（Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｖｌ
ａｎｕａｌ　、　１９８２　）と、アンビオイリンおよ
び／またはりＯラムフェニコールに対する耐性を持つ形
質転換株のラクトース寒天ブイヨン（Ｄ　Ｉ　ＦＧＯ＞
培地プレート上での選別とにより適格化される。

本発明の目的に適するＥ、ｃｏｔｉの例は、Ｅ、ｃ。

１ｉ　　ＪＭ　　８３　（ｐｒｏ　、　　ａｒａ　　Δ
ＩａＣｌ）ｒＯ，５ｔｒＡ。

＋８０ｄ　、　　ｌａｃ　Ｚ、　Ｍ　１５）　、　Ｅ、
　ｃｏｌｉ　　ＨＢｌｏｌ　　（Ｆ−、ｈｓｄｓ２０．
（ｒａ−、ｍＢ−）ｒｅｃ　Ａ１３．　ａｒａ　−１４
，ｐｒｏ　Ａ２．　Ｉａｃ　Ｙｌ　。

ａａｌＫ２．ｒｐｓＬ２０（Ｓｍ”　　）、　　Ｘｙｌ
−５゜ｍｔｌ−１，ｓｕｐ　Ｅ４４λ−〉、およびＥ、
ｃｏｌｉＪＭｌｏｌ　　　（ｌａｃ、　　ｐｒｏ、　　
５ｕｐＥ、　　ｔｈｉ　　Ｆ−ｐｒｏ　ＡＢ、　１ａｃ
−’）　テアル。

本発明によれば、上記方法の処理　Ｃ）のプラスミドｐ
ｓＮ　１９１は、Ｖ　１ｓｉｒａ　Ｊ　、およびＭｅｓ
ｓｉｎａ　　Ｊ、（（１９８２）（Ｇｅｎｅ　１９．２
５９＞）により記載されるｐＵＣのｘｂａ１制限部位に
、次のような合成されたＸｂａｌ−Ｘｂａｌフラグメン
トを挿入するこにより構成される。

このフラグメントは、システムワンＤＮＡシンセサイザ
ー（３ｅｃｋｍａｎ）を使い公知の技術したがって合成
され、［：、ｃｏｌｉのラムダファージのｔｏターミネ
ータ−の配列を持つ。このターミネータ−は、その上流
領域に位置するＤＮＡの転写の終結を指令するのに特に
効果的である。

プラスミドＩ）８Ｍ１９１内に於て、前記の合成された
フラグメントはｐＵｃ１３のＬａＣプロモーターと同じ
向き入れられており、このプロモーターから始まる転写
を終結させることができる。本発明によれば、上記方法
の処理　ｅ〉のプラスミドｐ　５Ｍ２０８−Ａは、継続
中のイタリア特許出願Ｎｏ　、Ａ／８６２２６５に記載
スル制限ｎ７素×ｂａｔ　とＥｃｏＲｌを用いるプラス
ミドｐ　５Ｍ２０８のダイジエスチョンと、ＥＩ　５Ｍ
２０８の７３００−ｂｐフラグメントの、下記の様な配
列の７４−塩基の合成りＮＡフラグメントへの結合とに
より得られる。

ＢＳ ＥｃｏＲ工 この人工フラグメントは、メツセンジャーＲＮＡの転写
を非常に効果的に指令するプロモーターの配列を含む。

そしてプラスミドｌ）ＳＭ’２０８−Ａ内では、アンビ
オイリンに対する耐性を授与するβ−ラクトナーゼ遺伝
子（Ｂ　Ｉａ）の上流に位置する。

その次の、制限酵素ＸｈｏｌとＨ１ｎｄｆＩＩを用いた
プラスミドのダイジェスチヨンにより、人工プロモータ
ーとβ−ラクトナーゼ遺伝子を含む６３００−ｂｐのフ
ラグメントが生じる。

そして、Ｃａｔ３］伝子を信子それ自身のブロモ−クー
を持たない１０００−ｂｌｌのフラグメントと、ラムダ
ファージのｔｏターミネータを、６３００−ｂｐのβ−
ラクトナーゼ遺伝子の下流に正しい向きで入れることに
より、その結果生成されるＩ）３Ｍ２１４ベクターに、
要求される性質すなわち３つの抗生物質に対する耐性と
、３１ａおよびＣａｔ３ｉ伝子の配列を含むジシストロ
ニツクｍ　ＲＮＡを転写する能力を与えることができる
。

このようにして得られたベクターは、Ｂ、５ｕｂｔｉｌ
ｉｓやＥ、ＣＯＩ＋の内部で異種起源のタンパク質を発
現するためのプラスミドを構成するために特に適してい
る。要するに、制限酵素ＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｒＩＴを
使ってｐＳＭ２１４からβ−ラクトナーゼ遺伝子を取り
除き、次に同じ制限部位に異種起源の遺伝子を挿入する
ことにより、単一のプロモーターの存在により遺伝子の
転写が保証され、しかもクロラムフェニコールを含むプ
レート上で効率的に選別することができる組換プラスミ
ドの構成が可能になる。

特に本発明では、このベクター１）８Ｍ２１４を、百日
咳毒素の成熟サブユニット８２．８３．Ｓ４゜Ｓ５をそ
れぞれ暗号化する遺伝子を含む組換プラスミドｏ　５Ｍ
２２６．ｐ　５Ｍ２２８．ｏ　５Ｍ２４４、ｐ　５Ｍ２
４３を構成するために用いる。

そして、本発明では、百日咳毒素の成熟サブユニットす
なわち自然に生じるものと同じサブユニットと、アミノ
末端のメチオニンの発現を引き起こすために、タンパク
質の分泌のためのシグナル配列が、サブユニットの前駆
体を暗号化する完全な遺伝子から取り除かれ、このよう
にしてサブユニットの成熟部分のみを暗号化するＤＮＡ
配列が、ベクター１）８Ｍ２１４内でクローン化される
。

特に、百日咳毒素の各サブユニットの前駆体を暗号化す
る完全な遺伝子は、プラスミドＰＴＩ　１０から分離さ
れる。プラスミドＰＴ１１０は、予め適当な制限酵素で
ダイジェストされる。そして、中間プラスミドの構成に
より、ザブユニットの成熟部分だけを暗号化するＤＮＡ
配列が分離される。

これらの配列は、次に成熟配列の１番目のアミノ酸のコ
ドンが翻訳開始コドンＡＴＧに並置されるように、ｌ）
８Ｍ２１４のＥＯＯＲＩとＨｉｎｃＨＪＩ制限部位にク
ローン化される。

成熟ユニットＳ２を暗号化するＤＮＡ配列を０８Ｍ２１
°４内に正確に挿入するために、新しい、簡単で効果的
なイン・ビトロの突然変異誘発方法が開発された。

この方法は、本発明の範囲に含まれるものであり、−本
１ｍＤＮＡの調整も、イン・ビトロの重合および連結反
応も必要としない。

通常、この方法では、プラスミドＤＮＡ　（ＡＤＮＡ）
は、修飾しようとする領域の近くでプラスミドＤＮＡを
切断する制限酵素（ＲＥ　　Ｌ）を用いて直線化される
。この領域は、１つまた被数のヌクレオチド塩基により
表現され得るもので、１３ａ１３１またはＥＸＯゴＩＩ
＋Ｓ１を用いたグイジエスチョンにより除去され、Ｅ　
Ｘ０ＩＩＴによる処理により５′末端が暴露される。

この分子は、第２の制限ＭＭ（ＲＥ　　ＩＩ）を用いて
、２つのフラグメントＢおよびＣに切断され、修飾すべ
き領域が除去されているＤＮＡフラグメント（Ｂ　　Ｄ
ＮＡ）が精製される。

ＲＥ　　Ｉを用いて直・線化されたＡ　　ＤＮＡは、Ｅ
ＸＯを用いて別に処°理することにより３′末端がｎＮ
され、次にＲＥＩＩを用いてダイジェストされて、Ｃフ
ラグメント（ＣＤＮＡ）が精製される。

ＲＩが突出する３′末端を生じさせる場合は、ＥｘＯに
よる処理は必要としない。同時に、オリゴヌクレオチド
（Ｄ　　ＤＮＡ＞が、Ｂ　　ＤＮＡおよびＣＤＮＡの突
出する末端を別にしてその配列が相補的であり、修飾す
べき領域以外は元の配列と同じ配列を再構成するように
合成される。

Ｂ、Ｃ，Ｄ　　ＤＮＡは、次に、Ｔ４　　ＤＮＡリガー
ゼの存在するりガーゼＭＮ液中で混合され、この混合液
全体がＥ、ｃｏｌｉＩＩｌ胞を形質転換するために用い
られる。

特に、第３図に示すように、中間プラスミドｐＳＭ２２
２は、制限酵素Ｓａｔ＋により直線化され、さらにＢａ
１３１によＱｆｆｉ理されて、Ｓ２のアミノ末端領域か
ら、分泌の原因となるシグナル配列を暗号化するヌクレ
オチドが取り除かれる。

その次の、Ｅ　ｘｏｌｌｌによるＤ’ＮＡの処理は、５
′末端を暴露させる。

制限酵素Ｈ１ｎｄｌＨによるＤＮＡのダイジエスチョン
は、成熟なＳ２だけを暗号化する遺伝子を含む６５００
−ｂｐのフラグメントの分離を可能にする。

Ｓ２成熟サブユニットの完全な配列を再構成し、次にそ
れをＩ）８Ｍ２１４内でクローニングすることを可能に
するために、５０塩基の１本鎖オリゴヌクレオチドが合
成される。このオリゴヌクレオチドは、１方の末端で成
熟な＄２のアミノ末端領域と結合することができ、それ
により最初の９つのアミノ酸とメチオニンのための完全
な情報を再生することができる。またこのオリゴヌクレ
オチの他方の末端は、ｐＳＭ２１４のコントロール配列
に結合することができる。

百日咳の成熟サブユニット８２．８３．Ｓ４゜Ｓ５のそ
れぞれのＤＮＡ暗号配列をｐＳＭ２１４内でクローニン
グすることにより得られた組換プラスミドＥＩ　５Ｍ２
２６．ｌ）３Ｍ２２８．ｌ）８Ｍ２４４、９８Ｍ２４３
ば、［３，５Ｕｂｔ＋Ｉｉ３細胞を形質転換するために
用いられる。

特に、我々の研究所で分離されＣｏｎｔｅｎｔｅとＤｕ
ｂｎａｕにより記載されている方法（ＭＯｌ、Ｇ３４１
゜Ｇｅｎｅｔ、（１９７９）、１６７．２５１−２５８
）により適格化された、中性プロテアーゼ陰性およびセ
リン・プロテアーゼ陰性の菌株ＳＭＳ１ｊ８Ｂ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ（ｌｅｕ　　、　　ｐｙｒ　　Ｑｌ　、ｎｐ
ｒ−５ｐｒ−）が用いられている。これは、ＴＢＡＢ　
（Ｄ　Ｉ　ＦＧＯ）培地上でクロラムフェニコール耐性
に基づいて選択することができる、形質転換された菌株
である。

８．５ｕｂｔｉｌｉｓ　　ＳＭＳ　　１１８　（ｐＳＭ
　　３３６）、ＳＭＳ　　１１８　　（ｐＳＭ３３８）
、３Ｍ８　１１８（ｐＳＭ　　２４４）、ＳＭＳ　　１
１８（ｐＳＭ　　２４３）、ＳＭＳ　　１１８（ｐＳＭ
２１４）株は、ブタペスト条約にしたがって、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに昭和６２年（
１９８７年）１２月２日に寄託された。

［発明の効果］ 百日咳毒素の成熟サブユニットの発現を確認するために
、組換プラスミドの０８Ｍ２２６，２２８．２４４．２
４３によりそれぞれ形質転換されたＳＭＳ　　１１８　
　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ細胞を、りａラムフェニコー
ルの存在するｖｙ（ＤＩＦＣＯ）培養液中で、２５から
４０℃の温度で増殖させ、次に公知の技術の１つにより
溶解した。

クーマシー・ブルーで染色することにより溶解シタ細胞
を１−ａｅｌｌｌｌ＋の方法（Ｎａｔｕｒｅ　、　１９
７０２７７．６８０）にしたがって分析した結果、これ
らのＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの株により発現されたタン
パク質は、それぞれ２３，０００．２２，０００゜１２
．０００，１０．００ダルトンの分子量を持ち、さらに
天然の毒素の成熟サブユニット８２゜８３．３４．８５
と一緒に移動した。

７０Ｗｂｉｎの方法にしたがったニトロセルロースへの
転移による分解では、これらのタンパク質は、抗−８２
，抗−８３，抗−８４，抗Ｓ５抗体と特異的に反応し、
この免疫学的な素性が確認された。

したがって、これらのサブユツトは、抗百日咳ワクチン
の製造のために使用することができる。

また百日咳の診断システムの中に使用する゛こともでき
る。

使用されている用語の簡単な説明 制限酵素 ＤＮＡ分子を特定の部位すなわち制限部位で切断するこ
とができる加水分解配素。

発現 遺伝子により暗号化されているタンパク質を合成するこ
とができる生物体の機構。この明細書では、遺伝子が微
生物により発現されるという言い方をしている。

組換プラスミド 異種起源のＤＮＡのフラグメントを含む環状の染色体外
ＤＮＡ分子。

プロモーター ＲＮＡポリメラーゼ酵素が転写を開始するＤＮＡ分子の
特別の領域。プロモーター領域には、この酵素による認
識部位と結合部位がある。

ターミネータ− 転写が終結するＤＮＡ分子の領域。

転写 ＤＮＡからメッセンジ？ＲＮＡ　（ｍ　ＲＮＡ）に遺伝
情報を写し取る過程。

翻訳 ｍ　ＲＮＡにより暗号化されている遺伝情報に基づいて
タンパク質を造り上げるためのアミノ酸の重合。

クローニング・ベクター ホストの微生物内に於ける複製を可能にするための全て
の）コ伝情報を含むＤＮＡ分子で、微生物の中に異種起
源のＤＮＡを入れるために使用される。クローニング・
ベクターの例は、自然のプラスミドあるいは起源の異な
る２つまたはそれ以上のＤＮＡの配列を結合することに
より造られたプラスミドである。

下記の実験例は、本発明の説明のためのもので、本発明
の範囲を限定するものではない。

実施例１ の分離 １）　Ｃ１９４Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ及
びＷｅｉｓｂｌｕｌｍｌＪ　、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｅ　　１９８２．１５０，８１５−８２５）１０μｑを
、１０ｍ　ＭのｐＨ７，５（７）トリス塩化水素、１０
ｍＭのＭＣＩＣ１１２及び５０ｍＭのＮａＣΩを含有す
る１００μΩの緩衝液中で、各３０単位（Ｕ）のＭ　ｂ
ｏＩ　（Ｂ　１ｏｌａｂｓ）及びＨｐａＩ［（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎａｅｒ　）制限酵素を用いて、３７℃で１時間消
化した。

次いで、酵素反応は、反応混合物の、等容岱のフェノー
ル・クロロフォルム（１：１．ｖ／ｖ）及びクロロフォ
ルム・イソアミル・アルコール（２４：１、ｖ・／Ｖ　
）を用いての抽出により停止した。

プラスミドＤＮＡは、２．５容量のエタノール及び醋酸
ソーダを反応混合物に加えて沈澱させ、最終濃度０．３
Ｍを得て、生成混合物を１５分間−８０℃に保った。

沈澱したプラスミドＤＮＡを、Ｅ　ｐｐｅｎｄｏｒ４遠
心分離磯、モデル５４５０を用いた４℃での１５分間の
遠心分離により反応混合物から分離し、次いで真空中で
乾燥した。

このようにして５％のポリアクリルアミド・ゲル上に分
離されたＤＮＡの分析により、予期されたように、夫々
１０３２．９７５及び９０５の塩基対（ｂｌ））に対応
する３つのバンドが見られたが、これらを相互に分離す
るのは困難であった。本発明のベクターの構成に必要な
遺伝子配列を含んでいる１０３２ｂｆ）を分離するため
に、沈澱及び分離の後で、プラスミドＤＮＡは、ｐＨ８
のトリス塩化水素１０ｍＭおよびＭＱ　Ｃ１１２１０ｍ
Ｍを含有する緩衝液１００μΩ中に再懸濁し、３０Ｕの
制限酵素（１＋ａ　Ｉ　（ＢＲＬ）を用いて３７℃で１
時間消化した。

次いで、反応混合物を１０分間６５゛Ｃに保っ又酵素反
応を停止した。

上述の手順により、ｃｎａ　Ｉ酵素に対する認識部位を
有する、９７５及び９０５　ｂｐバンドに対応するＤＮ
ＡフラグメントだけがこのＨＭにより消化される一方、
１０３２ｂｐに対応するフラグメントはそのまま残され
る。

次いでプラスミドＤＮ’Ａは羽化混合物から沈澱され、
分離されて６％のポリアクリルアミド・ゲル上に取付け
られる。３時ａ１２０ボルトで反応５６０頁）により記
述された方法により、ゲルから溶離した。

２１２ｂｐのＨｌ）ａＩＩ−Ｈｉｎｆ　Ｉ　７ラグメン
トニ含有されていて、そのプロモータ配列からＣＡＴ（
８２０ｂｐ）に対しコード化を行う遺伝子を分離するた
めに、１０３２ｂｐフラグメントはｐＨ７゜５トモ Ｍ（Ｉ　Ｃ１１２６ｍ　Ｍ、及びメルカプトエタノール
６ｍＭを含む緩衝液８０μΩ中に再懸濁し、２Ｕの）−
ｌｉｎｔ工を用いて３７℃で１５分間部分消化を行った
。

次いで、反応混合物を等容量のフェノール・クロロフォ
ルム（１：１、ｖ／ｖ）及びクロロフォルム・イソアミ
ル・アルコール（２４：１、ｖ／Ｖ）を用いて抽出する
ことにより反応を停止し、醋酸ソーダ（最終濃度０．３
Ｍ）及び２．５容逗のエタノール添加後に、−８０″Ｃ
で１５分間ＤＮＡを沈澱させた。

次いで、ＤＮＡは遠心分離され、真空中で乾燥し、最後
に、ｐＨ７，２のトリス塩化水素５０ｍＭ、　ＩＶＨ７
ＳＯ４１Ｑｍ　Ｍ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）０．
１ｍＭ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５０μり／ｍ　
ｆｌ　、及び各８０ｍＭのデオキシグアノシン・三リン
酸（ｄ　ＧＴＰ）　、デオキシシチジン・三リン酸（ｄ
　ＣＴＰ）　、デオキシチミジン・三リン酸（ｄ　ＴＴ
Ｐ）　、及びデオキシアデニン・三リン酸（ｄＡＴＰ）
、並びに８ＵのＤＮＡポリメラーゼ＜　Ｋ　Ｉｅｎｏｖ
の大フラグメント）を含有する２００μΩの緩衝液中に
再懸濁した。

合成混合物は３０分間周囲温度（２０〜２５℃）に保っ
てから２５ｍＭのエチレンジアミン四醋酸（ＥＤＴＡ）
の添加により非活性化した。プロティンはフェノール・
クロロフォルム及びクロロフォルム・イソアミル・アル
コールを用いて抽出した。ＤＮＡは水性相から醋酸ソー
ダ（最終濃度０゜３Ｍ）及び２．５容量のエタノールを
用いて−８０”Ｃで１５分間で沈澱させ、遠心分離によ
り分離し真空下で乾燥した。

このようにして得られたＤＮＡは８０μ９のＴＥ　（ｐ
　Ｈ８のトリス塩化水素ｉｏｍＭ及びＥＤＴＡｌｍＡ）
中に再懸濁し、７％のポリアクリルアミド・ゲル上に取
付けて、１２０ボルトで３時間反応させた。

８２０ｂｐバンドに対応するＤＮＡフラグメントはＭ　
ａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの方法で溶離した。

Ｂ）プラスミドｐＳＭ１９１の構築 プラスミドｐ　ＵＣｌ　３　（Ｂｏｅｈｒｉｎｏｅｒ　
）　ＤＮＡ１μＧを、ｐＨ７，５のトリス塩化水素１０
１Ｍ、Ｍａ　ＣΩ２１０ｍＭ、及びＮａ　Ｃ１＋　５０
ｍ　Ｍを含有スルｔａＩｌｉ液１００μｍ）中に懸濁し
、３０ＵのＸｂａＩ（ＢＲＩ）制限配素を用いて３７℃
で１５分間消化した。反応混合物を１０分間６５℃に保
持することにより酵素反応を停止した。プラスミドＤＮ
Ａは、２．５容最のエタノール及び０゜３Ｍの醋酸ソー
ダの添加により沈澱させ、次いで遠心分離により分離し
た。このようにして得られたＤＮＡ１μＧを、ＤＨ７，
４のトリス塩化水素５’Ｑｍ　Ｍ、ＭｇＣ１＋２１０ｍ
　Ｍ、ＤＴＴＩ○ｍ１ｙｌ。

スペルミジン１１Ｍ、及びＡＴＰ１＋ｎＭを含有する緩
衝液１０μ９中に再懸濁し、２Ｕの７４　ＤＮＡリガー
ゼの存在下で、３７℃で、次の配列を有する人工フラグ
メントを得るように連結した。

一般に知られている手法により合成されたこのフラグメ
ントは、Ｅ、ｃｏｌｉのλファージのターミネータ−を
表わしており、転写終結の指示に特に有効である。

全ソガーゼ混合物は、Ｍ　ａｎｉａｔｉｓその他により
記述された方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎｉｎ
ａ　：　ａｌ　ａｂｏｒａｔｏｒ　　　Ｍａｎｕａｌ　
１９８２　）によりコンピテント化されたＥ、ｃｏｌｉ
　　ＨＢｌｏｌの細胞を形質転換するのに使用した。こ
こで形質転換細胞は、ＬＢ寒天（１０ｇ、／＋のバクト
・トリプトン、１０ｇ／ｌｌの塩化ナトリウム、及び５
０／ｉｌのｆｌＨ７，５のイースト抽出物を含む’）（
ＤＩＦＣＯ）及び１００μ（１／１ｍｌのアンシピリン
のプレート上に選択した。

プラスミドＤＮＡは、このようにして得られた抗アンピ
シリン（ＡｍｐＲ）コロニーからＲｏｄｒｉｇｕ２及び
Ｔ　ａｉｔによって記述された方法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ　　ＤＮＡ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、　５０
〜５１頁；Ａｄｉｓｏｎ　−Ｗｅｓｌｅｙ　　ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ　）により抽出された。制限分析の結果、
これらのプラスミド中の１つは、ＤＵＣ１３Ｌａｃプロ
モーターと同じ、組換え体の挿入及び配位を有している
ことが分った。

このようにして得られたプラスミドはｌ）ＳＭＩ９１と
略称され、その地図は第１Ａ図に示しである。

ＣＩＣＡＴ遺伝子のｐＳＭ１９１への挿４μｇのプラス
ミドＩ）８Ｍ１９１をＩ）Ｈ７，５のトリス塩化水素１
０１ｎ　Ｍ、　ＭＩＪ　Ｃ１）２７ｍ　Ｍ１ＮａＣ９６
０ｍＭ及びＤＴＴｌｍＭを含有する緩衝液２０μｐ中に
懸濁し、ＤＮＡを消減する制限配素Ｈｉｎｃ　ＩＦ　（
ＢＲＬ）を用いて３７℃で３０分間消化し、鈍い端部を
生成した。

温度２５ｍＭのＥＤＴＡを用いて反応を停止し、ＤＮＡ
を沈澱させ、分離し乾燥した。

）１ｉｎｃ■及びステップＡ）に記述された方法で得ら
れる８２０ｂｐフラグメント０．０９μＱにより消減さ
れたｐＳＭｏ、１μＱを、ｐＨ７，４のトリス塩化水素
５０ｍ　Ｍ、ＭｇＣβ２１０１ｎＭ、ＤＴＴｌ　０ｍ　
Ｍ、スペルミジン１ｍ　Ｍ、ＡＴＰＩｍＭ、及び１Ｕの
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）を
含有する緩衝液１０μΩ中に懸濁した。

連結反応は２３℃の温度で１４時間にわたり行われ、そ
の後、６５℃で１０分間放コした。次いでリガーゼ混合
物は、Ｍａｎｒａｔ＋ｓその他により記述された方法（
Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｔｏｎｉｎｇ　：　ａ　　
ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ　１９８２　
）によりコンピテント化されたＥ、ｃｏｌｉＪＭ８３細
胞（ｐｒｏΔａｒａΔＩａｃｐｒｏ　　５ｔｒＡ＋　　
８００　１ａｃＺ　　５Ｍ１５）の形質転換のために使
用した。

組換え体は、濃度１００μＯ／ｍ！ｌアンピシリンを含
むＬＢ寒天板上に選択された。

Ａｍｐ　　組換え体の成る物は、２０μＩＪ／ｍＤの濃
度のクロラムフェニコールを含む板上においても成長す
ることができる。これらのＡｍｐＲｃｍＡコロニーは分
離され、プラスミドＤＮＡはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＴ
ａ１ｔの方法により抽出された。

酵素ＢａｍＨＩ、ＰＳｔＩ、及びＸｂａＩを用いる制限
分析の結果、これらプラスミドの中の１つは、適切に挿
入され配位された８２０ｂｌ）ＤＮＡフラグメントを含
んでいることが分った。　　　　　　　５このようにし
て得られたプラスミドはｐＳＭ２１３と名づけられた（
第２図）。

１γのプラスミドｐＳＭ２０８を、１ｌＨ７，５のトリ
ス塩化水素１０ｍ　ＭｌＭ（ｌ　ＣＱ２７１１１　Ｍｌ
Ｎａ　ＣＤ　６０ｍ　Ｍ％ＤＴＴ１ｍ　Ｍ、２ＵのＸｂ
ａＩ。

及び２ＵのＥＣ０ＲＩを含有する緩衝液２０μΩ中に懸
濁した。消化反応は３７℃で６０分間行われ、次いで６
５℃で１０分間停止した。

このようにして、約７３００　ｂｌ）及び７３ｂｐの２
つのフラグメントが得られた。後者はＴ５ファージのブ
ロモ−ター領域に対応している。

７３００ｂｐフラグメントは０．８％のアガロース・ゲ
ル上で電気溶離により精製した。

ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ７３００ｂｌ）のフラグメント１
０ｎｏとその配列が次式： ％式％ で与えられる人工フラグメント１０ｒ＋ｏを、６６ｍＭ
のトリス塩化水素、１０ｍＭのＭりＣＥ１２．１０ｍＭ
のＤＴＴ及び２ＩＩＩＭのＡＴＰを含有する緩衝液５０
μΩ中に懸濁し、０．１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼの存在
下で１４℃で１８時間連結させた。

ＭａｎｉａＨｓにより記述された方法でコンピテント化
されたＨＢ　１０１　Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞は、１０μΩ
のリガーゼ混合物により形質転換され、転換された細胞
は、５０μＱ／ｍＱのアンピシリンを含むＬＢ寒天板上
で選択された。

プラスミドＤＮＡはＡｍ１）　　コロニーから抽出され
、Ｍ　ａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの方拡で配列した。

かくて、ｐ　５Ｍ２０８−Ａ　（第１Ｂ図参照）として
知られるプラスミド中の人工フラグメントの正確な配位
及び挿入を確認することができた。

の挿入 １０ＵｇのプラスミドＤＳＭ２１３を３０Ｕの８　ａ　
ｉｎ　ＨＦＪ素（Ｂ　ｏａｈｒｉｎａｅｒ　）と共に、
ｐＨ８のし・リス塩化水素１０ｍＭ、１００ｍＭのＮａ
Ｃｌ＋、５ｍＭのＭｇＣｆＪ２及び１１ＩＩＭのβ−メ
ルカプトエタノールを含有する緩衝液１００μΩ中で３
７℃で１時間消化した。

反応は、等容量のフェノール・クロロフォルム及びクロ
ロフォルム・イソアミル・アルコールを用いて反応混合
物を抽出することにより停止し、そしてＤＮＡを沈澱し
、分離して真空中で乾燥した。かくして得られたＤＮＡ
は次に、Ｉ）Ｈ７，２のトリス塩化水素５０ｍ　Ｍ、１
０ｍ　ＭのＭ（７８０４，０，ｌｆｆ１ＭのＤＴＴ１５
０μｇ／ＩＩｌΩの８８Ａ、８０ＵＭのｄ　ＧＴＰ、８
０ＵＭのｄ　ＡＴＰ及び１０ｔＪのＫ　Ｉｅｎｏｗ　Ｄ
　Ｎ　Ａポリメラーゼを含有する緩衝液２５０μΩ中で
再懸濁した。

合成混合物は周囲温度で３０分間インキュベートレ、次
いで２５ｍＭのＥＤＴＡで反応を停止し、フェノール・
クロロフォルム及びクロロフォルム・イソアミル・アル
コールを用いてプロティンを抽出した。

Ｄ　Ｎ　Ａを水性相から沈澱させ、遠心分離法で分離し
、真空中で乾燥し、最後に５０ｍＭのＮａＣコ及び２Ｕ
のＨｉｎｄｌ［Ｉ制限ＷＪ素（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｏｅｒ
　）を含む緩衝液２００μΩ中に再懸濁させた。

消化反応は３７℃で１時間行い、次いで６５℃で１０分
間放置した。

次に全反応混合物を６％のポリアクリルアミド・ゲル上
に取付けて、１２０ボルトで３時間反応させた。

ＣＡＴ３Ｘｌ伝子及びλファージのｔｏターミネータ−
を含んでいる、約１０００ｂｐのバンドに対応するＤＮ
Ａフラグメントを、Ｍ　ａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔに
より記述された方法で電気溶離した。それと平行して、
ｐＨ８の！・リス塩化水素、５０ｍ　Ｍ１ＭｇＣＱ２１
０ｍＭ１及びＮａ　Ｃ９５０ｍ　Ｍを含有する緩衝液１
００μΩ中で、１０Ｕｇのｐ、５Ｍ２０８−Ａを、３０
Ｕ（７）ＸｈｏＩ　（ＢＲＬ）　と共に３７℃で１時間
消化した。反応停止後、ＤＮＡを沈澱させ、分離してか
ら、ｐＨ７，２のトリス塩化水素５０ｍ　Ｍ、ＭｇＳＯ
４１０１１ＭｌＤＴＴｏ。

１ｍＭ、８８Δ５０／ｊｃＩ／ＩｌｌΩ、ｄＴＴＰ及び
ｄＣＴＰを各８ＣＩＭ、並びにＫ　Ｉｅｎｏｗポリメラ
ーゼ１０Ｕを含有する緩衝液２５０μ９で再懸濁した。

反応は、周囲温度において３０分間行われ、２５ｎ＋Ｍ
のＥＤＴＡを用いて停止し、フェノール・クロロフォル
ム及びクロロフォルム・イソアミル・アルコールで処理
し、沈澱させた後で、ＤＮＡを、５０ｍＭのＮａＣΩを
含む緩衝液２００μΩ中で再懸濁し、２０１ｊのＨｉｎ
ｄＩＩＩと共に３７℃で１時間消化した。

消化反応を６５℃で１０分間行って停止した後、混合物
を、１ｍＭのＮａＣΩ、ｐ　Ｈ８のトリス塩化水素３０
ｍ　Ｍｌｌ　０ｎ＋　ＭのＥＤＴＡ１５〜２０％のスク
ロース・グラジェントを含むゲル１６ｍΩ上に取付け、
３　ｅｃｋｍａｎ超遠心分子ｓ機を使い毎分２５．００
０回転（ｒ、ｐ、ｍ、）で２２時間２０℃で遠心分離し
て、２つのＤＮＡフラグメントを分離した。

この操作の結果、前述の消化作用で生成された、夫々６
３００ｂｌ）及び２１２ｂｐの２つのＤＮＡフラグメン
トは、グラジェント内で十分分離されていることが分っ
た。

スクロース・グラジェントから集められた各５００μΩ
のフラクションから取った３０μぷを、０．８％のアガ
ロース・ゲル上で水平電気泳動法により分析した。

６３００ｂｐの７ラグメントの存在を示したフラクショ
ンは、２．５容最のエタノールと、−８０℃で１５分間
結合させて沈澱させた。５ｏｒｖａｌｌ遠心分離機、モ
デルＲＣ−５Ｂを用いて１２００Ｏｒｐｍで２０分間遠
心分離した後真空中で乾燥した。

６３００ｂｐのＤＮＡフラグメント２μｇを上述の方法
で得られた１０００ｂｐのフラグメント１μ９に連結さ
せた。

連結反応は、Ｉ）８７．４のトリス塩化水素５０ｍＭ、
１０ｍＭのＭ（ｌ　Ｃｆ１２．１０ｍＭのＤＴＴ。

１ｍＭのスペルミジン、１ｍＭのΔＴＰ及び２ＵのＴ４
リガーゼを含有する緩衝液１００μΩ中で、２３℃で４
時間行われた。

６５℃で反応を停止してから１０分後、全連結混合物は
コンピテントＥ、ｃｏｌｉＪＭ８３１１１Ｉ胞の形質転
換に使用された。

２９μＧ／ｆｆｌ！Ｑのクロラムフェニコール及び１０
０μｇ／ｍΩのアンピシリンを含むＬＢ寒天板上での選
択により得られた組換え体から、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及
びＴ　ａｉｔの方法によりプラスミドＤＮＡを抽出した
。これらプラスミドの中の１つは、ｘｂａ■及び）−１
ｉｎｄｌｌｌｌ素で消化して、アガロース・ゲル上で電
気泳動法により分析した。その結果は予期された特性、
即ち、抗生物質カナマイシン、クロラムフェニコール、
及びアンピシリンに対する三重耐性、及びβラクタマー
ゼ及びクロラムフェニコール−アセチル−トランスフェ
ラーゼを含むジシストロン・メツセンジャの転写の存在
を示した。

実施例２ ＰＴ　１１０　（Ａ、　　Ｎ　１ｃｏｓｉａ他、ＰＮＡ
Ｓ　　ＵＳＡ１９８６．４６３１−４６３５）（７）１
０μ（ｌ　を、ｐＨ８のトリス塩化水素５０ｍ　Ｍ、１
０ｍ　ＭのＭＱ　ＣＦ２及び５０ｍＭのＮａＣＭを含有
する液５０μｍ１中で、１０ＬＩのＡＶａＩ制限酵素と
共に３７℃で２時間消化した。

等容量のフェノール・クロロフォルム及びクロロフォル
ム・イソアミル・アルコールを用いての混合物の抽出に
より反応を停止し、ＤＮＡを、２゜５容聞のエタノール
及び醋酸ソーダ（最終濃度０゜３Ｍ）を用いて水性相か
ら一８０℃で３０分間沈澱させた。

遠心分離機による分離の後でＤＮＡは、ｐＨ７゜６のト
リス塩化水素６０ｍ　Ｍ、Ｎａ　ｃｎ　１２５ｍＭ％Ｍ
！Ｊ　Ｃｊ２６ｎ　Ｍ、２−メルカプトエタノール７ｍ
Ｍ及び０．０１％のトリトンｘ−ｉｏｏを含有する液５
０μΩ中に再懸濁させ、１０ＬＪの５ｐｈＩ制限酵素を
用いて３・７℃で５分間消化した。

６５℃で反応を停止して５分後、混合物を５％のアクリ
ルアミド・ゲル上に取付けて１２０ボルトで３時間反応
させた。

完全なＳ２サブユニットに対する遺伝子を含む７００ｂ
ｐフラグメントを分離し、Ｍ　ａｘａｍ及びＧ１１ｂｅ
ｒｔの方法で溶離した。

このフラグメントのプラスミド１）ＵＣｌ３へのサブク
ローニングを容易にするために、ｐＵ　Ｃ１２のの多重
クローニング部位（ｍ、ｃ、ｓ、）を、下記の配列： Ｈｉｎｄエエ工 を有する２２ｂｐの人ニリンカーで置換した。

特に、２．６μ（Ｊ　（７）ｐＵＣＩ２　（２７３０ｂ
ｐ）（Ｊ　、　Ｖ　１ｅｒｉａ及びＪ、　Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ（１９８２）　Ｇｅｎｅ１９　２５９）を、ｐＨ１８
のトリス塩化水素５０ｍ　Ｍ、１０ｎ　ＭのＭ（ｌｃｌ
１２、及び５０ｍＭのＮａＣΩを含有する緩衝液４０μ
Ω中で、各３ＵのＥｏｏＲＴ及びｌ−１ｉｎｄｌｌを用
いて３７℃で１時間消化した。

６５℃で反応を停止して５分後、混合物を分Ｎｔ用７．
５％アクリルアミド・ゲル上に取付け、１５０ボルトで
３時間反応させた。

全１）ＵＣＩ２ベクターからそのｍ、ｃ、ｓ、を取去っ
たものを含む、ＥＣ０ＲＩ及び）ｌ　ｉｎｄ　ｍ　ｆｉ
末を有する２６８０ｂｐのフラグメント°を、上記の方
法で分離して溶離した。

２６８０ｂｐフラグメント５０ｎａ及び２２ｂｐの人ニ
リンカー５ｎｇを、Ｉ）＋７．６のトリス塩化水素２０
ｍＭ、１０ｍＭのＭｇＣ１１２，１０ｍＭのＤＴＴ、０
．６ｍＭのＡＴＰを含有する緩衝液５０μΩ中に懸濁し
、２ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で、２０℃で４
時間連結させた。６５℃で反応を停止して５分後、全連
結混合物を、コンピテントなＥ　、　ｃｏｌｉＨＢ　１
０１細胞の形質転換に使用した。

２２ｂｐの人ニリンカーを含んでいるｐＳＭ２２１プラ
スミドは、１００μｃ＋／ｍΩのアンピシリンの添加で
、ＬＢ寒天板上で選択された、形質転換細胞の中の１つ
から分離した。このプラスミド２．８μ９を、上述の消
化条件の下で、各３ＵのＡＶａ■及び５ｐｈＩを用イテ
消化し、２７００ｂｐ７ラグメントを得た。このフラグ
メント５０ｎ９と、Ｓ２サブユニットのための完全な遺
伝子を含んでいる７００ｂｐのフラグメント５００ｎ！
Ｊとを、上記の連結条件で、１４℃で１６時間かけて連
結した。

次いで、連結混合物を用いてコンピテントな旦ｌＣｏ１
１ＨＢ　１０１細胞の形質転換を行い、得られた形質転
換細胞を、１００μａ／ｍΩのアンピシリンを含むＬＢ
寒天板上で選択した。

プラスミドＤＮＡの迅速抽出により分析された１６の抗
アンピシリン＜Ａｍ１）　　）形質転換細胞の中１３は
７００　ｂｐフラグメントを含んでいた。

ｐＳＭ２２２と呼ばれる、３４００ｂｐのプラスミドを
これらのクローンの・中の１つから抽出して精製した（
第３図）。

６μｑのｐＳＭ２２２を、１０Ｕの５ＳｔＩ酵素を用い
て、ｐＨ７，５のトリス塩化水素１００ｍＭ、５０ｍＭ
のＮａＣＱ及び１０ｍＭのＭ（ＩＣＩＩ２を含有する緩
衝液２μΩ中で、３７℃で９０分間消化した。

反応停止後、ＤＮＡを沈澱させ、遠心分離法で分離し、
ｐＨ８のトリス塩化水素２０ｍ　Ｍ、１２゜５ｍＭのＣ
ａ　ＣＤ２．１２．５１１ＭのＭ（］ＣＵ２及び１ｍＭ
のＥＤＴＡを含有する液１００μΩ中に再懸濁して、１
．８ＵのＢａ１３１　（ＢＲＬ）ヌクリアーゼを用いて
２３℃で９０秒間インキュベーションした。

このようにして、Ｓ２をＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　ｐｅ
ｒｔｕｓ二の細胞周辺膣中へ分泌することを受持つ信号
配列に対しコード化を行う、約１００のヌクレオチドを
、Ｓ２遺伝子のアミン終結領域から除去した。

６５℃で５分間反応を停止し、ＤＮＡを沈澱させ、分離
し、次いで再び１ｌＨ８のトリス塩化水素６６ｍ　Ｍ、
７７ｍ　ＭのＮａ　Ｃ１ｌ、５ｍ　ＭのＭ（ＩＣＱ２及
び１０ｍ　ＭのＯＴＴを含有する緩衝液８０μΩ中に再
懸濁し、３７℃で２分間２．５ＵのＥｘｏｌｌｌ（ＢＲ
Ｌ）と共にインキュベーションした。

反応の終りに、Ｓ２をコード化する遺伝子の５一端部を
約３０のヌクレオチドにより照射した。

等容量のフェノール・クロロフォルムとエーテルで反応
を停止した後、ＤＮＡを沈澱させ上述のようにして分離
した。

このようにして得られたＤＮＡは、ｌ１ｌ−１８のトリ
ス塩化水素５０ｍＭ、１０ｍＭのＭｇＣ１１及び５０ｍ
ＭのＮａＣＱを含有する緩衝液３０μΩ中で再懸濁し、
１０ＵのＨｉｎｄｌ制限酵素を用いて３７℃で２時間イ
ンキュベーションした。

混合物のインキュベーションを６５℃で５分間停止し、
７．５％のアクリルアミド・ゲル上に取付け、１２０ボ
ルトで３時間反応させた。

成熟Ｓ２の遺伝子を含む６５０ｂｐフラグメントをこの
ようにして分離した。

成熟Ｓ２のサブユニットの完全配列を再構成し、続いて
起こるそのｐＳＭ２１４中でのクローニングを可能にす
るために、配列が： ＋９　　＋８　　＋７　　＋６　　＋５　　＋４　　＋
３　　＋２　　＋Ｉ　　　　　　　　　　ＲＢＳで与え
られる、５０のヌクレオチドの人工フラグメントを用い
た。

この−重鎮オリゴヌクレオチドはその一端において成熟
Ｓ２のアミン終結領域と対を成すことができ、従って最
初の９つのアミノ酸、それに加えて翻訳開始のためのメ
チオニンに対する完全な情報を再生することができる。

又、他端では、３ｓｔ■を用いて、ｐＳＭ２１４調整配
列と対を作ることができる。

３．７μｇのｌ）８Ｍ２１４を、ｐＨ８のトリス塩化水
素５０ｍ　Ｍ、１０ｍＭのＭｇＣＱ２及び５０ｍＭのＮ
ａＣ１１を含有する液２０．ｃｚＵ中で、５ＵのＨｉｎ
ｄＩＩＩ及び５ＵのＳＳｔ工を用いて、３７℃で１２０
分間消化した。

反応停止後、消化混合物を０．８％のアガロース・ゲル
上に取付け、８０ボルトで９０分間反応させて６５００
　ｂｌ）バンドを得た。

このバンドに対応するＤＮＡフラグメントはＳｓｔ■−
Ｈｉｎｄ　ｍ端部を有し、翻訳調整配列ＲＢＳ及びβラ
クタマーゼ遺伝子が欠落している点を除き、ｐＳＭ２１
４プラスミドの主要部分を含んでいる。

ｐＳＭ２１４の６５００　ｂｐ＊フラグメント１１００
ｎ、５′端部が浸食された成熟＄２サブユニットに対す
る遺伝子を含む６５０ｂｐフラグメント３０ｎｇ、及び
５０ベースの人工オリゴヌクレオチド２０ｎＯを、ｐＨ
７，６のトリス塩化水素２０ｍＭ、１０ｍＭのＭＱ　Ｃ
Ｎ２．１０ｍ　ＭのＤＴＴ、０゜６ｍＭのＡＴＴを含有
する緩衝液２０μΩ中で、２ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ
の存在下、１４℃で１６時間にわたり連結した。

得られた連結混合物は、次いでＥ　、Ｃ０１ｉＪ　Ｍ　
１０１細胞（Ｉａｃ　、ｐｒｏ　、　ｓｕｐ　Ｅ　、　
７旧、ｌ”　−ｐｒ。

ＡＢ、ＬａｃＩ９．２６Ｍ１５、ｔｒａＤ３６）の形質
転換のために使用した。

形質転換細胞はクロラムフェニコール２０μｑ／ｍΩの
添加でＬＢ寒天板上で選択した。

プラスミドＤＮＡの迅速抽出により分析されたＣＩ”Ａ
ｍ１）’　　クローンの６０％は、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメントに含まれるプロモーターの調整下で、成
熟Ｓ２サブユニットをコード化する遺伝子を含んでいた
。

プラスミドｐＳＭ２２６はこれらのクローンの中の１つ
から分離した（第３図）。

このプラスミドは、ｃ　ｏｎｔｅｎｔｅ及びＱｕｂｎａ
ｕ　ｋ：より記述された方法（ＭＯｌ、　Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ、　１６１−１２５１−２５８　（１９７９））
によりコンピテント化されたＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
　ＳＭＳ　１１８株（Ｉｅｕ、ｌ］ＶｒＤ１、ｎｐｒ　
　ｓｐｒ　　）の形質転換のために使用された。

ＴＢＡＢ　（ＴｒＶＩ）ｔＯ３ｅＢｌｏｏｄ　　Ａａａ
ｒ　　Ｂａ５ｅ　−ｐ　１ｆｃｏ）上で５μａ／ｍりの
クロラムフェニコールの添加で選択されたすべての形質
転換細胞のクローンは、ｐ　５Ｍ２２６ブラスミドを含
有していた。

実施例３ ５０ｍｔｖｌリスＨＣｌ１（ＰＨ８＞、１０ｍＭＭσお
よび５０１１Ｍ　　ＮａＱΩ緩衝液７０μΩ中のＢＩＪ
　１１１１と８ａｌｌｌＨＩ各２０ｔＪによって、ｐＴ
１ン １０［エイ、　二：＋＠ア（Ａ　、　Ｎ　１ｃｏｓｉａ
）ほか、Ｐ−ＮＡＳ　　ＬＩＳＡ１９８３．４６３１〜
４６３５頁］１５μ９を３７℃において１時間消化させ
た。

反応を６５℃において１時間停止させ、消化混合物を５
％ポリアクリルアミドゲル上に負荷させ、１３Ｑｖｏｌ
ｔにおいて、３時間電気泳動させた。

Ｓ３をコードする遺伝子を含む１７３８バンドを溶離し
、精製した。

同時に、１０ｍＭトリスＨＣｆｌ　（ｐＨ８）、１００
１１１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１）、５ｍＭ　　ＭｇＣ１１２お
よび１ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液３０
μΩ中のＢａｍＨ［１０ＬＩによって、Ｉ）　ＥＭＢＬ
１８プラスミド［エル、デンテ（Ｌ、　Ｄｅｎｔｅ）　
。

エム、サラツツｔ　（Ｍ、　５ａｌｌａｚｚｏ　）　、
シー、バルダリ（Ｃ，Ｂａ１ｄａｒｉ）　、ジー、セサ
レニ（Ｇ。

Ｃｅ５ａｒｅｎｉ　）およびアール、コルテセ（Ｒ，Ｃ
ｏｒｔｅｓｅ）　　（１９８５）　、　　ｒデイ−・エ
ヌ・ニーチューイング（ＤＮＡ　　Ｃｈｅｗｉｎｇ）　
Ｊ　１巻、１０１〜１０７頁１６μｇを３７℃において
１時間消化さぜた。Ｍ素反応をフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール（２５：　２４　：　１．Ｖ
／Ｖ）とクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：
１、Ｖ／Ｖ）によって停止させ、ＤＮＡを沈降させて単
離した。２０ｍＭトリスＨＣΩ（ｐＨ７゜６＞　、　１
０ｍ　Ｍ　　ＭＱ　Ｃ１＋２　、１０ｍＭ　ＭＤＴＴお
よび１ｍＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液５０μΩ中で、上記
のように調製したｐＥＭＢＬｌ　８　２００ｎｑと１７
３８ｂｐフラグメント３００　ｎ’ｏとをＴ４リガーゼ
３Ｕによって、１４℃において１８時間連結させた。

６５℃において１０分間反応を停止させた後に、連結反
応混合物を用いてコンピテント大腸＠（Ｅ。

ｃ’ｏｌｉ）　ＪＭ　１０１細胞の形質転換を行った。

アンピシリン１００μＱ／ｍΩ、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルｂ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ＧａΩ
）４０μＱ／Ｉｌｌ　Ωおよびイソプロピルｂ−Ｄ−ガ
ラクトシド（ＩＰＴＧ）１２５μＱ／ｍΩを含むＬＢ寒
天プレート［デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）　］上での選択に
よって得た組換えクローンから［ジエイ、ヴイエラ（Ｊ
、　Ｖｉｅｒａ）およびジエイ、メッシング（Ｊ　、　
Ｍ　ｅｓｓｉｎｇ）５．ジーン（Ｇｅｎｅ　）　１９巻
、２５９頁（１９８２＞］、白色Ａ尺 ＭＰ　　コロニー２４個を単離した。

これらのコロニーをマニアティス（Ｍ　ａｎｉａｔｉｓ
　）ａｔｏｒｇＭａｎｕａｌ　）　、　Ｄ−ルド　スプ
リング　ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　　５ｐｒｉｒ＋ｇＨａ
ｒｂｅｒ　　）　　１９８２コに述べている方法による
プラスミドＤＮＡの迅速抽出とこれに統＜Ｐｓｔｌ制限
酵素によるプラスミドの消化とによって試験した。

分析したプラスミド２４個の中の５個は、Ｓ３サブユニ
ットの遺伝子を含むフラグメントの正確な位置づけを表
示する４９９５と８００　ｂｐの２７ラグメントをそれ
ぞれ示した。

ｐＳＭ２３１と名づけられたプラスミド（第４図）をこ
れらの５クローンの１つから、マニアティス等の方法に
よって抽出した。

１４ｒＡＭトリスＨＣＩＩ　（１）＋７．５）、６ｍ　
ＭＭａＣΩ２．．６ｍＭ２−メルカプトエタノールおよ
び３０ｍＭ　　ＮａＣｎを含む緩衝液３０μΩ中の５ｓ
ｔｌ　（ＢＲＬ）制限配素１０Ｕによって、３７℃にお
いて１時間消化させた。

反応を６５℃において１０分間停止させた後に、プラス
ミドＤＮＡを沈降させ、上記のように分離し、次に１５
ｍＭトリスＨＣＩ）（１）Ｈ８，５）。

１５ｍＭ　　ＫＣＩＩ、６ｍＭ　　ＭＵ　Ｃ１＋２およ
び６ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液３０μ
Ω中でＳ　ｍａ　Ｉ制限酵素１０Ｕによって、２５℃に
おいて１時間消化させた。

３　ｍａ　ｌ消化後に沈降したｌ）３Ｍ２３１　３μ（
１を、６６ｍＭ）リスＨＣｊｌ　（ｐＬＩ８　）’、　
７７ｉ＋　ＭＮａＣｊ、５１１Ｍ　　ＭＣｌＣｆ１２，
１０ｍＭ　　ＤＴＴおよびエキソヌクレアーゼＩ［［１
５ＬＪを含む緩衝液４０μΩ中に再懸濁させた。

異なる時間に採取したサンプル４μΩ、４．８μΩ、７
６２μ９．１０μΩおよび１４μｇによって消化反応を
３７℃において実施した。これらのサンプルを一緒にし
て０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、０．５Ｍ　　Ｎ
ａＣｎ、６０ｍＭ　　ＺｎＳＯ４およびＳＩヌクレアー
ゼ６０Ｕを含む緩ｉ液４．５μΩに加えた。得られた混
合物を２３℃において１５分間インキュベートＬ２から
、０．１Ｍ　　ＥＤＴＡおよび１．−５Ｍ酢酸ナトリウ
ムを含む溶液１０μｐを加えて停止させた。

混合物をフェノール／クロロホルム／アミルアルコール
とクロロホルム／イソアルミアルコール（２４：　１．
Ｖ／Ｖ）とによって抽出し、プラスミドＤＮＡを沈降分
離後に、５０ｍＭトリスＨＣＤ　（＋）＋７．２）、１
０ｍＭ　　ＭＣＪ３０４．０゜１ｍ　Ｍ　　ＤＴＴ、Ｂ
５Ａ３０μｃ＋／ｍｌｌ、ｄＡＴＰ、ｄ　ＧＴＰおよび
ＤＴＴ各０．２５ｆｆ１ＭならびにＤＮＡポリメラーゼ
ＩＩＩ？素（大フラグメント）（ＮＥＮ）３Ｕを含む緩
衝液２５μΩ中に再懸濁させた。

混合物を周囲温度（２０°〜２５℃）において３０分間
イン、キュベートした後に、０．５ＭＥＤＴＡ０．１　
　μΩを加えて停止させた。プラスミドＯＮＡ　　１０
０ｎａを、２０＋ｎＭトリスＨＣ、ｕ（ｐ　　Ｈ７，６
）、　　１０ｍＭ　　　Ｍ（ｌ　　ＣＯ２、１０ｍ０μ
ｐ中においてＴ４　　ＤＮＡリガーゼ３Ｕの存在下、２
３℃において１８時間それ自体に連結させた。

この連結反応混合物の全回を用いて、コンピテント大腸
菌ＪＭ１０１細胞を形質転換した。

アンピシリン１００μａ　／ｍ　Ｄ　、　Ｘ−Ｇａ　ｊ
　４０μ（１／ｍΩおよびＩＰＴＧ１２５μｑ／ｍΩを
含むＬＢ寒天プレート上での選択によって得られた５０
０組換えクローンをＢＡ８５ニトロセルロースフィルタ
ー［シエリンチャー　アンド　シエネル（Ｓｃｈｅｌｌ
ｉｎｃｈｅｒ　　ａｎｄ　　３ｃｈｎｅｌｌ）　］上で
複製した。

次にフィルターを０．５Ｎ　　Ｎａ　ＯＨによって５分
間、１．５ＭトリスＨＣΩ（ｐＨ７，５）によって５分
間、０．３Ｍ　　ＳＳＣ２Ｘ　　Ｎａ　ＣΩ（ｐ　Ｈ７
）、３０ｍＭクエン酸ナトリウムによって５分間および
７０％エタノールによって５分間処理することによって
複製クローンを溶解し、フィルターを真空下、６０　’
Ｃにおいて２時間乾燥した。

これらのクローンによりＳ３サブユニット生産を免疫学
的試験によって検定した。

特に、ペルオキシダーゼと組合せたウサギ抗Ｓ３抗体と
ヤギ抗体ウサギＩｏＧ抗体の存在下でフ。

イルターをインキュベートした。この処置によつ１て、
百日咳トキシンの８３サブユニットを生産する１５クロ
ーニンを検出した。

これらのクローンの中の４個から抽出したプラスミドＤ
ＮＡを鋳型として変性プラスミドを用いて、ジデオキシ
ヌクレオチド法によって塩基配列決定した［マサヒロ・
ハラトリ（Ｍ　ａｓａｈｉｒｏ　　Ｈａｔｔｏｒｉ）お
よびヨシュキ・ササキ（Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ頁参照］。

ｐ　５Ｍ２３３名づけられた、これらのプラスミドの１
つの塩基配列は次の通りである：β−が゛ラクＦイｆ、
ｑ−に　　　　　　　　　　　　　　　−１４１Ｍｅｔ
　　Ｔｈｒ　　Ｍｅｔ　　ｒＬｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ
　　　Ｓｅｒ　　Ａｈａ　　Ｖａｌ　　ＡｌａＡＴＧ　
　ＡＣＣＡＴＧ　　ＡＴＴ　　ＡＣＧ　　ＡＡＴ　　　
ＴＣＧ　　ＧＣＣＧＴＴ　　ＧＣＣＸｍａエエエ このようにして、ｐ　５Ｍ２３３組換えプラスミドにお
ける非コード領域と、アミノサンが１個少ないペプチド
分泌シグナルをコードする塩基配列とがエキソヌクレア
ーゼ■とヌクレオチドＳＩとによる処理の結果として除
去されて、β−ガラクトオキシダーゼのアミン末端部分
の７アミノ酸に融合したＳ３サブユニットが得られるこ
とが確認された。

さらに、成熟Ｓ３サブユニットの開始点に正確生成した
。

百日咳菌の成熟Ｓ３サブユニットをコードする遺伝子を
ｐＳＭ２３３組換えプラスミドから、終結コドンの下流
の＋１アミノ酸に５３アミノ酸に相当する位置でそれぞ
れ切断するＸｍａｍとｐｓｔｉ制限酵素とによる洞化に
よって単離した。

１０ｍＭ１−リス１−ＩＣΩ（ｐＨ８，２＞、８＋１１
　Ｍｆｖｌｏ　ＣΩ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルおよびＢ５Ａｌ　００μり３７ｍ　Ｑを含む溶液２５
０．ｃｚカ中のＸｍａＩ［［［バイオラブ（Ｂ　１ｏｌ
ａｂｓ）　］　２０１Ｊによって、ｐＳＭ２３３　１５
μｑを３７℃において４時間消化させた。

反応を６５℃において１０分間停止させた後、ＤＮＡを
沈降分離して、７．５％アクリルアミドゲル上に負荷さ
せた。

１２０ＶＯ１ｔにおいて３時間電気泳動さぜた後、成熟
Ｓ３をコード゛する領域と８３の下流の非コード領域（
３３ｏｂｐ）とを含む９４２ｂｐバンドをマキサム（Ｍ
　ａｘａｍ　）とギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）が述べ
ている方法によって単離し溶離した。

次に、９４２　ｂｐバンドに相当するフラグメント１μ
Ｑを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）。

５０ｍＭ　　Ｎａ（ｄｉおよび６１１１　Ｍ　　Ｚｎ　
ＳＯ４を含む溶液２０μΩ中でＳＩヌクレアーゼ２０Ｕ
によって２３℃において１５分間消化させた。

最後にＥＤＴＡ２ｍＭを加えて反応を停止させ、沈降が
生じた後に、５０ｒａＭトリスＨＣΩ（１）Ｈ７，２）
、１０ｍＭ　　Ｍ（＋８０４．０．１１１１　　ＭＤＴ
Ｔ、５０μｇ／ｍ　ｎ　８ＳＡおよび０．２ｍＭｄｉｄ
ＮＴＰｓを含む緩衝液１０μΩ中にＤＮＡを再懸濁させ
、クレノフ（ＫΩｅｎｏｗ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ
４Ｕによって２３℃において３０分間処理した。

このようにして得られたフラグメント５００ｎｃ＋をｐ
　ｓｔ　ｌによって３７℃において１時間消化させ、成
熟Ｓ３サブユニットをコードする８　００　ｂｐフラグ
メントを上記のように電気溶離した。同時に、ベクター
Ｄ　ｔＪＣｌ　２　２．５１１Ｑを、５０ｍＭトリスＨ
Ｃｆｌ　（１）Ｈ８）、１’Ｑｍ　Ｍ　　’Ｍ（Ｉ　Ｃ
ｎ２および５０ｍＭ　　Ｎａ（ｄｉを含む溶液３０μＮ
中のＥｃｏＲＩとｐｓｔｌ制限酵素とによって、３７℃
において１時間消化させた。

反応を６５℃において５分間停止させ、ＤＮＡに最終的
に０．５Ｍ　　Ｎａ　ＣΩ０４中でイソプロパツール０
．５倍量によって周囲温度において１５分間沈降させた
。

このようにして得られたＤＮＡを遠心分離によって分離
した後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０Ｕと下記の人ニリン
カー３７０ｎａとを含むリガーゼ緩衝液１２５μΩ中に
再懸濁させた： ＲＢＳ　　　ＥｃｏＲＩ このリンカ−はｐ　ＬＩＣｌ　２プラスミドのＥＣ０Ｒ
Ｉ末端と結合して、翻訳開始３塩基配列が先行するブラ
ンドエンド（ＡＴＧ）を作製する。リガーゼ混合物を１
４℃において１６時間インキュベートレ、６５℃におい
て５分間停止させた。次にリンカ−の５′ＯＨ遊離端部
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５Ｕによって、３７℃
において１時間リン酸化した。フェノール／クロロホル
ムによって抽出した後に、ＤＮＡをイソプロパツールに
よって沈降させ、５０ｆｆｉＭトリスｌ−ＩＣΩ（ｐｌ
−１８）。

１０ＩＩＩＭ　ＭｇＣΩ２および５０ｍＭ　　ＮａＣＤ
を含む溶液３０μｍ中のｐｓｔｌ　　４Ｕによって、３
７℃において１時間消化させた。

フェノール／クロロホルムによる抽出によって反応を停
止させ、ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウム中でエタノー
ルによって沈降させた。このようにして作製したプラス
ミドＤＮＡ１５０ｎｌｌＪと成熟Ｓ３サブユニットに対
する遺伝子を含むフラグメントロ０ｎａとをＴ４ＤＮＡ
リガーゼ存在下、２３℃において１６時間かけて連結さ
せた。

連結反応混合物を用いて、コンピテント大腸菌ＨＢ１０
１１１１胞を形質転換した。

アンピシリン１００μｆＪ／ｍΩを添加したＬＢ寒天プ
レート上での選択によって得た組換えＡ１１）ゝクロー
ンの１つから０３Ｍ２２７ブラスミドを単離した。これ
では、Ｓ■ヌクレアーゼによる処理によって除去されな
いアミノ酸アラニンと、アミノ末端位置のメチオニンと
が先行する成熟Ｓ３遺伝子がそれぞれ上流および下流の
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ　ｍとによって表示れる（第４図
）。

（ｌ　５Ｍ２２７３μＱを、５０ｎ＋ｔｖｌリス刺Ｃ塁
（ｐＨ８，０）、１０ｎ＋Ｍ　　ＭａＣΩ２および５０
１Ｍ　　ＮａＣｆ１を含む緩衝液３０μΩ中のＥＣ０Ｒ
Ｉ　　３ｔＪおよびＨｉｎｄＩ［［３ＬＪニよッテ、３
７℃において１時間消化させた。

混合物を６５℃において５分間停止させ、次に７．５％
アクリルアミドゲル上に負荷させた。

１２Ｑｖｏｌｔにおける３時間の電気泳動後に、成熟Ｓ
３サブユニットに対する遺伝子を含む６５ｂｌ）バンド
を分離し、溶離した。このバンドに相当するフラグメン
トｉｏｏｎｇを、上記条件下でＥＣＯＲ■およびｌ−１
ｉｎｄｌ［［酵素によって予め消化させた０８Ｍプラス
ミド３００　ｎＱに連結させた。

連結反応はＤＮＡリガーゼ２Ｕの存在下で４℃において
１６時間実施した。

この混合物の２μΩ滅４μｍ部分を用０て、コンピテン
ト大腸菌ＪＭ１０１細胞を形質転換した。

組換え体の選択はクロラムフェニコール２０μ０／ｍΩ
を含むＬ８寒天プレート上で行った。

７４ヌクレオチド人ニブ０モーターの制御下で成熟Ｓ３
サブユニットに対する遺伝子と一１位置のアラニンとを
含むプラスミドｐ　５Ｍ２２８　（第５図）をＣｌ１１
　　クローンの１つから単離した。

ｐＳＭ２２８プラスミド１１００ｎを用いて、コンピテ
ント枯草　（３，５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＳＭＳ　１１
８細胞を形質転換した。

クロラムフェニコール（５μ（１／ｍΩ）を添加したＴ
ＢＡＢ上で分析した組換えクローンの全てがｐＳＭ２２
８プラスミド（第５図）を含有した。

及１１先 ５０ｍＭトリスＨＣｊ　（Ｄ　Ｈ８，０＞、１０ｍＭ　
Ｍ（ｌｃｊ１２および５０ｎ＋Ｍ　　ＮａＣｎを含むｌ
１ＷＪ液１００μｊ中（７）ＡｖａＩ　Ｈ素１２Ｌ、ｌ
　　、！：　ＰｓｔＩ酵索１８Ｕによって、ＰＴｌｌｏ
　　１０μ９を３７℃において１時間消化させた。

反応を６５℃において５分間停止させ、混合物を６％ア
クリルアミドゲル上に負荷させ、１２０ｖ０１【におい
て２時間ランした。

Ｓ４サブユニットに対する遺伝子を含むＤＮＡの７６５
　ｂｐフラグメントをマキサムとギルバートが述べてい
るように電気溶離した。

同時に、ｐＥＭＢＬ１９　１μ９を上記条件下でＡｖａ
ＩとＰ　ｓｔ　Ｉ制限酵素によって消化させた。

反応を６５℃において１０分間停止させた。

このようにして作製したプラスミドＤＮＡ３００ｎｇと
Ｓ４に対する遺伝子を含む７６５　ｂｐフラグメントを
、０．６６ｍＭトリスＨＣｎ　（ｐ　Ｈ７゜６）、５０
ｍＭ　　Ｍ（ｌ　Ｃｌ２，５０ｍＭ　　ＤＴＴおよび１
ｍＭ　　ＡＴＰを含む緩衝液３０μΩ中のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１Ｕの存在下、１４℃において８時間にわたって
連結させた。

反応を６５℃において１０分間停止させた後、連結反応
混合物を用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０１ｉ１［１
胞を形質転換した。

Ｘ−Ｇａ　Ｄ　４０μｏ　／ｍ　ｎ、ＩＰＴＧ１２５μ
ＬＪ／ｍＱおよびアンピシリン１００μａ／ｍΩを含む
ＬＢ寒天プレート上での選択によって得られた形質転換
細胞からプラスミドＤＮＡを抽出した。

１）８Ｍ２４４−Ａと名づけだ、これらのプラスミドの
１つは、正確に挿入され位置づけられた７６５ｂｐフラ
グメントを含有した。

０８Ｍ２４４−Ａ３μＱを、５０ＩＩＩＭトリスＨＣｊ
　（ｐＨ８）、１０１Ｍ　　Ｍ（ｌｃｊ２および５０ｎ
＋Ｍ　　ＮａＣＩ）を含む溶液３０μｌｌ中でＥＣ０Ｒ
１５ＬＪによって３７℃において１時間消化させ、次に
ＢＳｔＥＩＩ９Ｕによって６０℃において１時間消化さ
せた。

この消化によって、それぞれ３８６０ｂｐと１４０ｂｐ
の２７ラグメントが生成し、後者は百日咳菌（［３ｏｒ
ｄｅｔｅｌ　ｌａ　　　ｅｒｔｕｓｓｉｓ　）中の８４
分泌に対するシグナル塩基配列部分と成熟Ｓ４に対する
遺伝子の最初の３６アミノ酸とを含有する。

３８６０ｂｌ）フラグメント１μσを７０ｍＭトリスＨ
ＣＩＩ　（１）Ｈ７，６）、１１０ｎ１　　Ｍ（Ｉ　Ｃ
ｌ＋２．５ｍＭ　　ＤＴＴおよび１１１１Ｍ　　ＡＴＰ
を含む溶液１００μΩ中の７４ＤＮＡリガーゼ１０Ｕの
存在下で、成熟Ｓ４サブユニットのアミノ末端部分のコ
ード塩基配列を再形成して下記の配列を有する４７ｂｌ
）の人工フラグメント１１００ｎと連結させた；＋１　
２　３　４　５　６　７　８　９　１０１１　１２この
連結反応は１４℃において８時間実施し、次に６５℃に
おいて５分間停止させた。

次に連結反応混合物を用いて、コンピテント大腸菌ＪＭ
１０１細胞を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリン
１００μｇ／ＩＩＩｆＪを含むＬＢ寒天プレート上で選
択した。

若干のＡ１１ｌ）ＦＬクローンから抽出したプラスミド
ＤＮＡの分析によって、オリジナル１４０ｂｐフラグメ
ントの位置への４７ｂＤ人工フラグメントの挿人が実証
された。

これらのクローンの１つから抽出した組換えプラスミド
をｐ　５Ｍ２４４−８と名づけだ（第６図）５０ｍＭト
リスＨＣＵ　（＋）８８．２）、８１１１ＭＭｇＣ（１
２，６ｍ　Ｈ２−メルカプトエタノールおよびＢ５Ａｌ
００μ！Ｉｔ／ｍΩを含む溶液３０μり中へｐ　５Ｍ２
４４−８２μ９を懸濁させ、成熟Ｓ４をコードする遺伝
子の開始コドンの上流および末端コドンの下流約３４０
塩基のところでそれぞれ切断するＥｃｏＲＩ５ＵとＨｉ
ｎｄＩＩＩ５ＬＪとによって、３７℃においＣ１時間消
化させた。

反応を６５℃において５分間停止させた後、ＤＮＡを沈
降させ、再懸濁させて、７．５％アクリルアミドゲル上
に負荷させた。

１２０ＶＯ１ｔにおいて３時間電気泳動させた後に、成
熟Ｓ４をコードする部分を含む６８７ｂｐフラグメント
を単離し、溶離した。

６８７ｂｐフラグメント１２０ｎＯをＴ４ＤＮＡリガー
ゼ１Ｕの存在下で、上記のように予め消化させたｐＳＭ
２１４　５００ｎｏと１４℃において８時間にわたって
連結させ、連結反応混合物を作製した。この反応混合物
を用いて、塩化カルシウム法によってコンピテントにし
た大腸菌Ｈ８１０１細胞を形質転換した。クロラムフェ
ニコール２０μ（１／１．ｊを含むＬＢ寒天プレート上
で選択を行った。

ＣＩｌｌ’　Ａ　１１１１）ｓ陽性クローンから抽出し
たプラスミドＤＮＡの分析によって、成熟Ｓ４サブユニ
ットに対する遺伝子が正確に挿入されたことが確認され
た。

これらのクローンの１つから抽出したプラスミド、０８
Ｈ２４４を用いてコンピテント枯草菌５ＹＳ１１８細胞
を形質転換した。クロラムフェニコール５μＱ／ｍ　Ω
を添加したＴＢＡＢプレート上で選択した陽性形質転換
細胞はｐＳＭ２４４プラスミドを含有した（第７図）。

実施例５ Ｓ５サブユニットの成熟部分をコー゛するＤＮＡ塩基配
ｊのクローニング ｐＵＢ１１０プラスミド［ティ、タナ力（Ｔ。

７　ａｎａｋａ　）およびエヌ、スカカ（Ｎ、　５ｕｃ
ａｋａ　）、１８４−１１９４頁１１０μ９とＰＴｌｌ
ｏ　　３゜７μＱとをそれぞれ、６ＩＩＭトリスＨＣｌ
１（＋）Ｈ８）、１５０ｆｆ１Ｍ　　Ｎａ（ｄｉ、６１
Ｍ　　Ｍ（ＩｃＩＩ２および７ｎ＋Ｍβ−メツにカプト
エタノールを含む溶液３０μΩ中でＸｂａ工およびＢａ
１ｎＨＩ制限酵素各５Ｕによって、３７℃において１時
間消化させた。　　　゛ 反応をフェノール／クロロホルム／アミルアルコール／
倍量で抽出することによって停止させ、ＤＮＡを沈降後
に、ＴＥ［１０ＩＩＩＭトリスＨＣ１（ｐＨ８）と１０
１Ｍ　　ＥＤＴＡＩ緩衝液１５μΩ中に再懸濁ざＶた。

次に、このように消化させた各サンプル１３μｍを連結
反応混合物３０μΩ中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２Ｕによっ
て、４℃において１６時間連結させた。

この連結反応混合物を用いて、コンピテント枯草菌ＳＭ
３　１０８　（ｈｉｓ　、　ｌｅｕ　、　ｍｅｔ　５ｎ
ｐｒ−１ｒｅｃＥ４）細胞を形質転換した。

カナマイシン５μＯ／Ｉｆｆを含むＴＢＡＢプレート上
で形質転換細胞を選択した。

百日咳菌の機能の大部分を占める、Ｘｂａ工とＢａｍＨ
Ｉ端部を有する３５００ｂｐインサートを含み、Ｓ５サ
ブユニットに対する遺伝子を含むプラスミドＩ）８Ｈ２
４９を、これらのクローンの１つから抽出し、′Ｍ製し
た。

１０ＩＩＩＭトリスＨＣＩＩ　（１）Ｈ８，Ｏ）　、２
０１１Ｍ　　ＮａＣｆ１．１０１１１Ｍ　　ＭＩＪ　Ｃ
１０，５１Ｍβ−メルカプトエタノールおよびＢ５Ａ１
００μ０７ｍ　ｎを含む溶液１００μΩ中でＮａｅ工制
限酵素、５０Ｕによって、Ｉ）８Ｈ２４９１０Ｍｇを３
７℃において１時間消化させた。

反応を６５℃において５分間停止させ、沈降後にＤＮＡ
を５０Ｉｌ１Ｍトリスｌ−Ｉ　ＣΩ（Ｉｌｌ−１８＞、
１０ｍＭ　　ｔＶ１ｇｃｆ１２および５０ｍＭ　　Ｎａ
（ｄｉを含む溶液１０μｐ中でＢＣｌ［素によって、３
７℃において３０分間消化させた。

消化混合物を６５℃において５分間、反応停止させ、７
．５％ポリアクリルアミドゲル上に負荷させた。

１２０ｖｏｌｔにおいて３時間電気泳動させた後に、ア
ミノ酸９から出発するＳ５に対する遺伝子を含む約３５
０ｂｐのフラグメントを溶離した。

ｐ　ＵＣｌ　２　２．５μｑを、５０ＩｎＭトリスＨＣ
ｊ（ｐＨ８）、１０ａＭ　　ＭｑＣΩ２および５０１Ｍ
　　Ｎａ　Ｃｍを含む溶液ａＣ１ｌｌ中でＥＣＯＲ工と
ＢａｍＨＩ制限酵素各３酵素上って３７℃において１時
間消化させ、２６８０ｂｐフラグメントを上記のように
電気溶離した。

２６８０ｂｌ）フラグメント２０ｎｏ、Ｓ５含有３５０
ｂｐフラグメントおよび次の塩基配列：を有する３４ｂ
ｐ人工オリゴヌクレオチド３ｎ！］を、２０ｍＭトリス
ＨＣΩ（ｐＨ７，６）　、１０ｍＩＶＩＭＱ　Ｃ１０，
１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．６ｍＭ　　ＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ２Ｕを含む溶液２０μカ中で１４℃にお
て１６時間連結させた。連結反応混合物を用いてコンピ
テントＨＢ１０１大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリ
ン１００μ９／ｒａ　Ｑを含むＬＢ寒天プレート上で形
質転換細胞を選択した。

成熟Ｓ５サブユニットをコードする遺伝子を含み、Ｅｃ
ｏＲＩとＨｉｎｄｎ［制限部位によって表示される開始
メチオニンを除いて天然プラスミドと等しいプラスミド
ｐ　５Ｍ２２９　（第８図）をＡｍｐ″クローンの１つ
から単離した。

ｐＳＭ２２９　５μｇを、５０ＩＩＩＭトリスＨＣｕ（
ｐＨ８）、５０ｍＭ　　ＮａＣｆ１および１０ｍＭＭＣ
１ｃｌ＋２を含む溶液５０μΩ中のＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｄ［［［制限酵素各１０ｔＪニよって、３７℃において
３０分間消化させた。、６５℃において５分間停止させ
た後、混合物を７．５％ポリアクリルアミドゲル上に負
荷させ、１２０ｖｏｌｔにおいて３時間電気泳動させた
。

成熟Ｓ５に対する遺伝子を含む４００　ｂｐバンドをマ
キサムとギルバートが述べているように電気溶離した。

このバンドに相当するフラグメント２００　ｎｃ＋と、
上記と同じ条件下でＥＣ０ＲＩとＨｉｎｄｌ［Ｉとによ
って消化させたＩ）８Ｍ２１４　６０Ｏｎ（］とを連結
反応用溶液６μ９中でＴ４ＤＮＡリガーゼ５Ｕの存在下
で１４℃において１６時間連結させた。

反応を６５℃において５分間停止させた後に、混合物を
用いてコンピテント大腸菌ＨＢ１０１ｉ１Ｂ胞を形質転
換した。

形質転換細胞の選択はクロラムフェニコール２０μｇ／
ＩΩを含むＬＢ寒天プレート上で実施した。

成熟Ｓ５サブユニットに対する遺伝子を含むプラスミド
ｐＳＭ２４３をＣＩｌ＋　　クローンの１つから単離し
た。

次にｐＳＭ２４３　１００ｎｏを用いて、コンピテント
枯草菌ＳＭＳ１１８＠胞を形質転換した。

クロラムフェニコール５μ（Ｊ’／ｍΩを含むＴＢＡＢ
上で選択した組換えクローンの全てはｌ）８Ｍ２４３プ
ラスミドを含有した（第９図）。

プラスミドｐＳＭ２２６、ｐＳＭ２２８、ｐＳＭ２４４
およびｐ　５Ｍ２４３をそれぞれ含む枯草＠ＳＭＳ　１
１８１！ｌ胞を、クロラムフェニコール５μＱ／ｒａｍ
を添加したＶＹ倍地［ヴイール侵出ブイヨン（Ｖｅａｌ
　　１ｎｆｕｓｉｏｎ　　ｂｒｏｔｈ　）　　（デイフ
コ）２５０／ｉ酵母抽出物（デイフコ）５ｃ＋／ｊ］１
ＯＩＩｆＪ中で３７℃において１６時間増殖させた。

次に各培養物１ｍΩをエツベンドルフ遠心機（Ｅ　１）
ｌ）ｅｎｄｏｒｆ　　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）中で最大
速度、４℃において１分間遠心分離した。このようにし
て得られた細胞を３０ＩＩＩＭトリスＨ（ｌｌ　（ｐ’
Ｈ８，Ｏ）および５０ｍ　ＭＮａ　ＣΩ中で洗浄してか
ら、Ｓ２と８３の場合にはリゾチーム２０ｍａ／ｍｌｌ
を添加したＳＥＴ緩衝液［２０％ショ糖、５０ＩＩＩＭ
トリスＨＣΩ（ｐＨ７，６＞　、５０ｎ＋　Ｍ　　ＥＤ
ＴＭ］１００μΩ中に再懸濁させた。このようにして得
られた細胞懸濁液を攪拌しながら３７℃に５分間維持し
た。

次に各溶解物２４μΩに、ＳＤＳ緩衝液［１２５ｍＭト
リスＨＣｆｌ　（ｉｌｌ−１６，８）、３％ドデシル硫
酸ナトリウム、３％２−メルカプトエタノール、２０％
グリセＯ−ル〕３６μ９とブＯモフェノールブル−２μ
ｇとを加λ、生成１ノた溶液を１００℃に５分間放置し
た。

次に各溶解物２０μΩを１５％ポリアクリルアミド／ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル［レムリ（Ｌａｅ
ｍｌｉ　）　、ネイチｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ　）、（１
９７０）、２７７巻、６８０頁］上に負荷させ、２５ｍ
Ａにおいて３時間電気泳動的流動させた後に、クーマシ
ーブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　　Ｂｌｕｅ　）による
染色［蛋白質のゲル電気泳動：実際的アブａ　　ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏａｃｈ）、ビー・ティ・ヘ
イムス（Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｍｅｓ）およびデイ・リック
ウッド（Ｄ　、　Ｒｅｃｋｗｏｄ　）編集、アイアール
エル　プレス　リミテッド（Ｉ　ＲＬ　　Ｐ　ｒｅｓｓ
　　Ｌ　１ｍ１ｔｅｄ）から出版１ならびにシュライへ
ル　アンド　ジュール　ニトロセルロース（Ｓ　ｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　　ａｎｄ　　５ｃｈｕｌ！　　　Ｎ　１
ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　）　４５０ｍフィルターへ
の転写と次の、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ　）が述べてい
るような、ウサギ抗Ｓ２、抗Ｓ３、抗Ｓ４および抗Ｓ５
抗体およびペルオキシダーゼ［マイルス（Ｍｉｌｅｓ）
］と結合したヤギ抗つサギＩｇＧ抗体によるフィルター
の処理［エッチ・トウビン（Ｈ。

Ｔｏｗｂｉｎ　）　、ティ・スタッヘリング（Ｔ、　５
ｔａｃｈｅｌｉｎａ　）およびジエイ・ゴルドン（Ｊ、
　Ｑｏｒｄｏｎ　）（１９７９）、ＰＮＡＳ　　ＵＳ、
Ａ７６巻、４３５０−４頁］によって蛋白質を表示した
。クーマシーブルーで染色すると、それぞれ２３，００
０．２２．０００，１２．ＯＯＯおＪ：びｌｏ、０００
ダルトンの分子層を有する蛋白質が出現し、これらは天
然トキシンの成熟サブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４および
Ｓ５と共に共移動する（第１０Ａ図）。

これらの蛋白質は、免疫電気泳動分析によって実証され
るように、また第１０Ｂ図に示すように、抗Ｓ２、抗Ｓ
３、抗Ｓ４および抗Ｓ５抗体と特異的に反応する。

上記のよう培養条件下で合成される蛋白質量は最高８０
ＩＯ／Ｉ）（８２と８４＞から最低２０〜４０ｍｇ／Ω
（Ｓ３と８５）までの範囲である。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、［：、Ｃｏ１１のλ）？−ジ（ｔｏ）のｔ
ｏターミネータ−の人工的配列の、ＰＵＣ１３のＸｂａ
Ｉ制限部位への挿入により得られるプラスミドｐＳＭ１
９１の制限地図を示す。 第１Ｂ図は、ｏ　５Ｍ２０８のＥＣ０Ｒ−ＸｂａＩ７ラ
グメントに対する人工的プロモーターの配列の置換によ
り得られるプラスミドｐ　５Ｍ２０８−Ａを示す。 第２図は、クローニング・ベクター１）３Ｍ２１４及び
゛中間プラスミドｐＳＭ２１３の制限地図を示す。 第３図は、組換え体１）８Ｍ２２６の構築を示す。 第４図及び第５図は、組換え体プラスミドｐＳＭ２２８
の構築を示す。 第６図及び第７図は、組換え体プラスミドｐＳＭ２４４
を示す。 第８図及び第９図は、組換え体プラスミドｐＳＭ２４３
を示す。 第１０Ａ図は、１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルで
、３．　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓＭｓ　１１８　（１）　５
Ｍ２２６）から抽出されたプロティンの総量、（０８Ｍ
２２６）、（ｐＳＭ２２８）、（ｐＳＭ２４４）及び（
１）３Ｍ２４３）を１．２．３及び４で表わしである。 第１０Ｂ図は、ペルオキシダーゼと組合わせた抗Ｓ２、
Ｓ３、Ｓ４及びＳ５ウサギ抗体及び抗ウサギ、ｌ：：’
／シＩｔｌｌＧ抗体を用イテ、Ｂ、ｓｕｂｔｉｌｉｓＳ
ＭＳ１１８の１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルから
抽出されたプロティンの総量、（ｐ　ＳＭ２２６）、（
ｐＳＭ２２８）、　（ｐＳＭ２４４）及び（ｐ　５Ｍ２
４３）　、の免疫プロットを示す。

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. （１）異種蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配列のクロー
   ニングに有用なベクターであって、バチルス属および大
   腸菌の機能的複製の起点、抗生物質のカナマイシン、ア
   ンピシリンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を
   コードする遺伝子、ならびにアンピシリンおよびクロラ
   ムフェニコールに対する耐性をコードするジシストロニ
   ックメッセンジャーＲＮＡの転写を指示する強力な人工
   プロモーターを含むことを特徴とするべクター。
2. （２）バチルス属の機能的複製の起点がプラスミドｐＵ
   Ｂ１１０の起点である請求項第１項記載のベクター。
3. （３）大腸菌の機能的複製の起点がプラスミドｐＢＲ３
   ２２である請求項第１項記載のベクター。
4. （４）人工プロモーターのヌクレオチド塩基配列が 【遺伝子配列があります】 である請求項第１項記載のベクター。
5. （５）ＤＮＡ塩基配列が免疫学的または生物学的に活性
   な蛋白質をコードする請求項第１項記載のベクター。
6. （６）異種蛋白質が百日咳トキシンの成熟サブユニット
   である請求項第５項記載のベクター。
7. （７）枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２１４）として寄託
   した請求項第１項記載のベクター。
8. （８）請求項第１項ないし第７項において定義したよう
   なクローニングベクターから、ＥｃｏＲ I およびＨｉ
   ｎｄIII制限酵素によってβ−ラクタマーゼ遺伝子を除
   去し、制限部位の異種蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配
   列をクローニングすることによって得られる、異種蛋白
   質の表現に有用な組換えプラスミド。
9. （９）異種蛋白質が百日咳トキシンのサブユニットであ
   る請求項第８項記載の組換えプラスミド。
10. （１０）ＤＮＡ塩基配列がＳ２成熟サブユニットをコー
    ドする請求項第９項記載の組換えプラスミドｐＳＭ２２
    ６。
11. （１１）ＤＮＡ塩基配列がＳ３成熟サブユニットをコー
    ドする請求項第９項記載の組換えプラスミドｐＳＭ２２
    ８。
12. （１２）ＤＮＡ塩基配列がＳ４成熟サブユニットをコー
    ドする請求項第９項記載の組換えプラスミドｐＳＭ２４
    ４。
13. （１３）ＤＮＡ塩基配列がＳ５成熟サブユニットをコー
    ドする請求項第９項記載の組換えプラスミドｐＳＭ２４
    ３。
14. （１４）請求項第８項ないし第１３項において定義した
    ような組換えプラスミドによって形質転換した微生物。
15. （１５）大腸菌と枯草菌とから成る群から選択した請求
    項第１４項記載の微生物。
16. （１６）枯草菌ＳＭＳ１１８である請求項第１５項記載
    の微生物。
17. （１７）枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２２６）。
18. （１８）枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２２８）。
19. （１９）枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２４４）。
20. （２０）枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２４３）。
21. （２１）請求項第１４項ないし第２０項において定義し
    たような形質転換微生物を窒素、炭素および無機塩のソ
    ースを含む液体培地のクロラムフェニコール存在下で増
    殖させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
22. （２２）微生物が枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２２６）
    であり、異種蛋白質が成熟Ｓ２サブユニットである請求
    項第２１項記載の方法。
23. （２３）微生物が枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２２８）
    であり、異種蛋白質が成熟Ｓ３サブユニットである請求
    項第２１項記載の方法。
24. （２４）微生物が枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２４４）
    であり、異種蛋白質が成熟Ｓ４サブユニットである請求
    項第２１項記載の方法。
25. （２５）微生物が枯草菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２４３）
    であり、異種蛋白質が成熟Ｓ５サブユニットである請求
    項第２１項記載の方法。
26. （２６）請求項第２１項ないし第２５項に記載の方法に
    よつて得られる、アミノ末端部分にメチオニンを含む百
    日咳トキシンの成熟サブユニット。
27. （２７）請求項第２４項ないし第２６項の記載に従つて
    得られる百日咳トキシンの成熟サブユニットのワクチン
    抗百日咳ワクチン製造への利用。
28. （２８）請求項第２１項ないし第２６項の記載に従つて
    得られる百日咳トキシンの成熟サブユニットの百日咳菌
    検出系の製造への利用。