JP7842291B2 - シチジンジリン酸コリン配糖体、組成物、シチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法、遺伝子組換え微生物、シチジン残基含有化合物の製造方法、及びシチジン残基含有化合物の配糖体の生成の抑制方法 - Google Patents
シチジンジリン酸コリン配糖体、組成物、シチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法、遺伝子組換え微生物、シチジン残基含有化合物の製造方法、及びシチジン残基含有化合物の配糖体の生成の抑制方法Info
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Description
本開示は、シチジンジリン酸コリン配糖体、組成物、シチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法、遺伝子組換え微生物、シチジン残基含有化合物の製造方法、及びシチジン残基含有化合物の配糖体の生成の抑制方法に関する。
シチジン残基含有化合物とは、化合物の構造としてシチジン残基を有する化合物のことを指し、具体的には、シチジン、シチジル酸、シチジンジリン酸（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：以下、ＣＤＰとも称する。）、シチジンジリン酸コリン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｈｏｌｉｎｅ：以下、ＣＤＰ－コリンとも称する。）等が挙げられる。その中でも、ＣＤＰ－コリンは高等生物のリン脂質を構成する成分であるホスファチジルコリンの生合成前駆体であり、神経保護作用などが知られている（非特許文献１）。ＣＤＰ－コリンは天然からの抽出や化学合成により大量に得ることは難しく、主に生物の持つ酵素反応によってシチジン一リン酸（以下、ＣＭＰとも称する。）やオロット酸を出発原料に合成されている（特許文献１、２、非特許文献２、３）。また、シチジル酸及び／又はシチジンの製造方法としては、日本国特公昭３６－１９７４９号公報、日本国特公昭５７－０１８８７２号公報、及び日本国特公昭３６－２１４９９号公報に記載の製造方法が公知である（特許文献３、４、５）。
また、ｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｇｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ（以下、ｏｐｇＨとも称する。）は、浸透圧に応答してＯｐｇＧ（Ｇｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）と共同して働き、ペリプラズムにおいてグルカン合成に寄与することが知られている。さらに、ｏｐｇＨは枯草菌でのＵｇｔＰ（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と機能的に類似し、Ｍｏｏｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎとして機能し、細胞サイズの調整に関与するということが知られている（非特許文献４）。
Nutrients (2020) Vol12 p.793
Bull. Inst. Chem. Res. Kyoto U. (1976) Vol. 53 p.546-562
Appl. Microbiol. Biotechnol. (2017) Vol.101 p.1409-1417
PLoS Genet.(2013) Vol 9: e1003663.
微生物におけるＣＤＰ－コリンの別の化合物へのさらなる代謝変換は、元来ＣＤＰ－コリンを生産する生物でもほとんど知られておらず、まして大腸菌のような元来ＣＤＰ－コリンを生産しない生物での報告はなかった。また、ｏｐｇＨのＣＤＰ－コリンとの関連や、ＣＤＰ－コリンを基質としてグルコースを転移できるということは知られていなかった。
本発明は、ＣＤＰ－コリン等のシチジン残基含有化合物から変換された化合物及びその製造方法を提供すること、及び、ＣＤＰ－コリン等のシチジン残基含有化合物が別の化合物に変換されることを抑制する手段を提供することを目的とする。
本発明者らは、驚くべきことに、蛋白質又は微生物が有する新たな活性である、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性、より具体的にはＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を見出し、この活性によって、シチジン残基含有化合物から新規のシチジン残基含有化合物の配糖体へ変換しえること、より具体的にはＣＤＰ－コリンをＣＤＰ－コリン配糖体に変換し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。更に、蛋白質又は微生物の有する、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を抑制することで、シチジン残基含有化合物製造時にシチジン残基含有化合物配糖体の生成を抑制することを見出した。
本開示は以下を含む。
＜１＞ 下記一般式（１）で示されるシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
＜１＞ 下記一般式（１）で示されるシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
（式（１）中、Ｒは糖残基である。）
＜２＞ 前記シチジンジリン酸コリン配糖体が、下記一般式（２）で示されるシチジンジリン酸コリングルコース配糖体である、上記＜１＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
＜３＞ 上記＜１＞又は＜２＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体及びその溶媒和物の少なくとも１つを含有する組成物。
＜４＞ シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用い、シチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜５＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、上記＜１＞又は＜２＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜６＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜７＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜８＞ 以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子組換え微生物。
（Ａ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物。
（Ｂ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失している、遺伝子組換え微生物。
＜９＞ 前記シチジン残基含有化合物が、シチジンジリン酸コリンである、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１０＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜１１＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１２＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質がＧｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｈである、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１３＞ 前記遺伝子組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１４＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にシチジン残基含有化合物を生産することを含む、シチジン残基含有化合物の製造方法。
＜１５＞ 前記シチジン残基含有化合物がシチジンジリン酸コリンである、上記＜１４＞に記載のシチジン残基含有化合物の製造方法。
＜１６＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１つの遺伝子組換え微生物を調製することを含む、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
＜１７＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、下記一般式（１）に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜１６＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
＜４＞ シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用い、シチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜５＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、上記＜１＞又は＜２＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜６＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜７＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜８＞ 以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子組換え微生物。
（Ａ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物。
（Ｂ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失している、遺伝子組換え微生物。
＜９＞ 前記シチジン残基含有化合物が、シチジンジリン酸コリンである、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１０＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜１１＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１２＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質がＧｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｈである、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１３＞ 前記遺伝子組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、上記＜８＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜１４＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にシチジン残基含有化合物を生産することを含む、シチジン残基含有化合物の製造方法。
＜１５＞ 前記シチジン残基含有化合物がシチジンジリン酸コリンである、上記＜１４＞に記載のシチジン残基含有化合物の製造方法。
＜１６＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１つの遺伝子組換え微生物を調製することを含む、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
＜１７＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、下記一般式（１）に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜１６＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
（式（１）中、Ｒは糖残基である。）
＜１８＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物を用いて製造したシチジンジリン酸コリンを含む組成物であって、シチジンジリン酸コリンの製造量に対するシチジンジリン酸コリン配糖体の製造量の存在比率が３５％以下である、組成物。
＜１９＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１項の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び
前記微生物を用いて組成物を製造すること、を含み、
前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が３５％以下である、
組成物の製造方法。
＜２０＞ シチジンジリン酸コリンの製造量に対するシチジンジリン酸コリン配糖体の製造量の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１８＞に記載の組成物。
＜２１＞ 前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１９＞に記載の組成物の製造方法。
＜１９＞ 上記＜８＞～＜１３＞のいずれか１項の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び
前記微生物を用いて組成物を製造すること、を含み、
前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が３５％以下である、
組成物の製造方法。
＜２０＞ シチジンジリン酸コリンの製造量に対するシチジンジリン酸コリン配糖体の製造量の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１８＞に記載の組成物。
＜２１＞ 前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１９＞に記載の組成物の製造方法。
本開示では、新規のシチジン残基含有化合物の配糖体及びその製造方法を提供する。また、本開示では、シチジン残基含有化合物の製造方法及びシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法を提供する。
以下、本発明について詳細に説明するが、これらは望ましい実施形態の一例を示すものであり、これらの内容に特定されるものではない。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
数値範囲の「～」は、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
［シチジン残基含有化合物］
本開示のシチジン残基含有化合物とは、化合物の構造としてシチジン残基を有する化合物のことを指し、具体的には、シチジン、シチジル酸、シチジンジリン酸（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：以下、ＣＤＰとも称する。）、ＣＤＰ－コリン等が挙げられ、ＣＤＰ－コリンが好ましい。
本開示のシチジン残基含有化合物とは、化合物の構造としてシチジン残基を有する化合物のことを指し、具体的には、シチジン、シチジル酸、シチジンジリン酸（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：以下、ＣＤＰとも称する。）、ＣＤＰ－コリン等が挙げられ、ＣＤＰ－コリンが好ましい。
［シチジン残基含有化合物の配糖体］
本開示では、シチジン残基含有化合物の配糖体を提供する。シチジン残基含有化合物の配糖体は、シチジン残基含有化合物に、糖ヌクレオチドから糖を転移することで生成される。糖ヌクレオチドは糖供与体として用いられる。糖ヌクレオチドとしては、ＵＤＰ－グルコース（以下、ＵＤＰ－Ｇｌｃとも称する。）、ＵＤＰ－ガラクトース（以下、ＵＤＰ－Ｇａｌとも称する。）、ＧＤＰ－マンノース（以下、ＧＤＰ－Ｍａｎとも称する。）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃとも称する。）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（以下、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃとも称する。）、ＧＤＰ－フコース（以下、ＧＤＰ－Ｆｕｃとも称する。）、ＵＤＰ－グルクロン酸（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＡとも称する。）等が挙げられ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ又はＵＤＰ－Ｇａｌが好ましく、ＵＤＰ－Ｇｌｃがより好ましい。
本開示では、シチジン残基含有化合物の配糖体を提供する。シチジン残基含有化合物の配糖体は、シチジン残基含有化合物に、糖ヌクレオチドから糖を転移することで生成される。糖ヌクレオチドは糖供与体として用いられる。糖ヌクレオチドとしては、ＵＤＰ－グルコース（以下、ＵＤＰ－Ｇｌｃとも称する。）、ＵＤＰ－ガラクトース（以下、ＵＤＰ－Ｇａｌとも称する。）、ＧＤＰ－マンノース（以下、ＧＤＰ－Ｍａｎとも称する。）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃとも称する。）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（以下、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃとも称する。）、ＧＤＰ－フコース（以下、ＧＤＰ－Ｆｕｃとも称する。）、ＵＤＰ－グルクロン酸（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＡとも称する。）等が挙げられ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ又はＵＤＰ－Ｇａｌが好ましく、ＵＤＰ－Ｇｌｃがより好ましい。
シチジン残基含有化合物の配糖体として、具体的には、ＣＤＰ－コリンに糖ヌクレオチドから糖を転移することで生成される、下記一般式（１）又は（１’）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体（以下、「本開示のＣＤＰ－コリン配糖体」又は「ＣＤＰ－コリン配糖体」とも称する。）等が挙げられる。
（式（１）及び（１’）中、Ｒは糖残基である。）
Ｒとして好ましくは、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、とも称する。）残基、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ、とも称する。）残基、フコース残基、グルクロン酸（ＧｌｃＡ、とも称する。）残基、及びその他の六炭糖残基（例えばフルクトース残基）である。六炭糖とは、６個の炭素原子を持つ単糖のことを指し、フルクトースの他に、アロース、タロース、イドース、グロース、アルトロース、グルコース、ガラクトースが挙げられ、グルコース又はガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。
シチジン残基含有化合物の配糖体としては、上記一般式（１）又は一般式（１’）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体であることが好ましい。更に、上記一般式（１）又は一般式（１’）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体としては、下記一般式（２）又は一般式（２’）で示されるシチジンジリン酸コリングルコース配糖体（下記一般式（３－１）、以下、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体とも称する。）又はシチジンジリン酸コリンガラクトース配糖体（下記一般式（３－２）、以下、ＣＤＰ－コリンガラクトース配糖体とも称する。）が挙げられる。
下記一般式（３－１）としては下記一般式（４－１）で表されるβグルコースが結合した構造が好ましく、下記一般式（３－２）としては下記一般式（４－２）で表されるβガラクトースが結合した構造が好ましい。
また、下記一般式（２）又は一般式（２’）で示されるシチジンジリン酸コリングルコース配糖体としては、下記一般式（３－１）で示されるＣＤＰ－コリングルコース配糖体がより好ましく、下記一般式（４－１）で表されるβグルコースが結合した構造が好ましい。
また、下記一般式（２）又は一般式（２’）で示されるシチジンジリン酸コリングルコース配糖体としては、下記一般式（３－１）で示されるＣＤＰ－コリングルコース配糖体がより好ましく、下記一般式（４－１）で表されるβグルコースが結合した構造が好ましい。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体及びその溶媒和物は、ＣＤＰ－コリンと同様に、脳梗塞、頭部外傷など脳の病態時に、神経細胞膜の構造を維持し、脳機能障害を抑制することで神経の保護作用を示すことや、記憶力・注意力向上に関与する可能性がある。上記ＣＤＰ－コリン配糖体等はまた、ＣＤＰ－コリンと比較して、水溶性の増大、並びに低毒化等の効果が期待できる。また、一般に水溶性である配糖体は、経口投与されると、通常、腸内細菌や消化酵素によって糖質残基が脱離し、腸管に吸収されやすくなることが知られている。そのため、配糖化されない場合とは吸収や代謝の速度、場所が異なり、異なる機能を発現することも知られている。そのため、更に本開示のＣＤＰ－コリン配糖体はＣＤＰ－コリンと比較し、安定化、親水化によって、吸収が緩やかになったり持続したりすることが期待される。
本開示の組成物は、本開示のＣＤＰ－コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体及びその溶媒和物の少なくとも１つを含有する。本明細書において、このような組成物をＣＤＰ－コリン配糖体を含有する組成物Ａともいう。組成物Ａは、ＣＤＰ－コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体及びその溶媒和物の少なくとも１つを含有していればよく、含有量は限定されない。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体は、公知の方法で塩に変換され得る。塩としては、例えば、酸付加塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、またはアミン塩などが挙げられる。
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩、または酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、またはグルコン酸塩のような有機酸塩が挙げられる。
アルカリ金属塩としては、例えば、カリウムおよびナトリウムなどが挙げられる。
アルカリ土類金属塩としては、例えば、カルシウムおよびマグネシウムなどが挙げられる。
アンモニウム塩としては、例えば、テトラメチルアンモニウムなどが挙げられる。
アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リジン、アルギニン、およびＮ－メチル－Ｄ－グルカミンなどが挙げられる。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体は、公知の方法でＮ－オキシド体に変換され得る。Ｎ－オキシド体とは、本開示のＣＤＰ－コリン配糖体の窒素原子が、酸化されたものを表す。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体は、公知の方法で溶媒和物に変換され得る。溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。適当な溶媒和物としては、例えば、水、またはアルコール系の溶媒（例えば、エタノールなど）のような溶媒和物が挙げられる。
［シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質及び該蛋白質をコードするＤＮＡ］
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体、例えば一般式（１）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いて製造される。ここで、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性とは、シチジン残基含有化合物のシチジン残基に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性であり、更に具体的には、シチジン残基含有化合物のシチジン残基のリボースの２位水酸基に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性であり、更に具体的には、ＣＤＰ－コリンに糖ヌクレオチドから糖を転移する活性であり、更に具体的には、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を含む。シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、例えばＥＣ２．４．１．に分類される蛋白質が挙げられるが、ＥＣ２．４．１． に分類される蛋白質が、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を含むことは、これまで知られていなかった。
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体、例えば一般式（１）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いて製造される。ここで、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性とは、シチジン残基含有化合物のシチジン残基に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性であり、更に具体的には、シチジン残基含有化合物のシチジン残基のリボースの２位水酸基に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性であり、更に具体的には、ＣＤＰ－コリンに糖ヌクレオチドから糖を転移する活性であり、更に具体的には、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を含む。シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、例えばＥＣ２．４．１．に分類される蛋白質が挙げられるが、ＥＣ２．４．１． に分類される蛋白質が、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を含むことは、これまで知られていなかった。
具体的には、本開示の一般式（２）で示されるＣＤＰ－コリングルコース配糖体は、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を有する蛋白質を用いて製造される。具体的には、下記一般式（３）で示されるＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移することで、本開示の一般式（２）で示されるＣＤＰ－コリングルコース配糖体が製造される。
本明細書において、上記一般式（３）で示されるＣＤＰ－コリンに、ＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移し、上記一般式（２）で示されるＣＤＰ－コリングルコース配糖体を製造する際に寄与する蛋白質は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であり、より具体的には「ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を有する蛋白質」である。
なお、後述するように、この活性を有する蛋白質の活性を親株に比べて低下又は欠失させた遺伝子組み換え微生物を用いることにより、シチジン残基含有化合物を効率的に製造しうる。また、この活性を有する蛋白質の活性を親株に比べて低下又は欠失させた遺伝子組み換え微生物を用いることにより、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制しうる。
（（シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質））
上記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、例えば、ＣＡＺｙ分類において、ｇｌｙｃｏｓｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ ２に分類される糖転移酵素（本明細書において「ＧＴ２酵素」とも称する。）及びｇｌｙｃｏｓｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ ２８に分類される糖転移酵素（本明細書において「ＧＴ２８酵素」とも称する。）の少なくとも一方に分類される酵素が挙げられる。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素に分類される糖転移酵素が特に好ましい。
上記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、例えば、ＣＡＺｙ分類において、ｇｌｙｃｏｓｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ ２に分類される糖転移酵素（本明細書において「ＧＴ２酵素」とも称する。）及びｇｌｙｃｏｓｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ ２８に分類される糖転移酵素（本明細書において「ＧＴ２８酵素」とも称する。）の少なくとも一方に分類される酵素が挙げられる。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素に分類される糖転移酵素が特に好ましい。
ＣＡＺｙ分類とは、糖質関連酵素の分類に関する情報が集約されているデータベースである、Ｃａｒｂｏｈｙｄｏｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ（本明細書において「ＣＡＺｙ」とも称する。）データベースにおける酵素の分類のことであり、酵素の分類はＷｅｂサイト（http://www.cazy.org/）等から確認することが可能である（Nucleic Acids Res. 2009 Jan;37(Database issue):D233-8. doi: 10.1093/nar/gkn663. Epub 2008 Oct 5.）。
ＧＴ２酵素としては、例えばＵＤＰ－Ｇｌｃ β－１，６－ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ β－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ： ｂａｃｔｏｐｒｅｎｏｌ β－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ： β－１，３－ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＵＤＰ－Ｇｌｃ： １，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、及びＵＤＰ－Ｇｌｃ β－１，２－ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ等が挙げられ、その中でも、Ｇｌｕｃａｎｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する蛋白質がより好ましい。
Ｇｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する蛋白質としては、例えば、ｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｇｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ（以下、ｏｐｇＨとも称する。）が挙げられる。ｏｐｇＨとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨ（Accession No. WP_001295445.1, AAC74133.1, KAB1960533.1, AMH24428.1 及びNP_415567.1等）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． Ｓｙｒｉｎｇａｅ由来ｏｐｇＨ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２０４０１）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来ｏｐｇＨ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８３Ｚ４２）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ由来ｏｐｇＨ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｂ８ＧＸ７２）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来ｏｐｇＨ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８９ＢＵ５）、及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ由来ｏｐｇＨ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ４６ＴＺ４）等が挙げられ、その中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（本明細書において、「Ｅ．ｃｏｌｉ」とも称する。）由来ｏｐｇＨがより好ましい。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨのアミノ酸配列としては、配列番号８で表されるアミノ酸配列（Accession No. WP_001295445.1）が挙げられる。ｏｐｇＨをコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号３で表される塩基配列（Accession No. CP081489.1 2449812-2452352 ）が挙げられる。ｏｐｇＨは、ｍｄｏＨ、Ｇｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｈともいわれる。
ＧＴ２８酵素としては、例えばＵＤＰ－Ｇｌｃ： １，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ： ｕｎｄｅｃａｐｒｅｎｙｌｄｉｐｈｏｓｐｈｏ－ｍｕｒａｍｏｙｌｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ β－１，４－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、Ｄｉｇａｌａｃｔｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ、及びＭｏｎｏｇａｌａｃｔｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ等が挙げられ、その中でもＵＤＰ－Ｇｌｃ： １，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅがより好ましい。更に、ＵＤＰ－Ｇｌｃ： １，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する蛋白質としてはＵｇｔＰが挙げられる。ＵｇｔＰとしては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ＵｇｔＰ及び、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ由来ＵｇｔＰ等が挙げられ、その中でもＥ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨと同じくＭｏｏｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎであり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨの機能的ホモログである、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰがより好ましい。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰのアミノ酸配列としては、配列番号１０で表されるアミノ酸配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿３９００７５．１）が挙げられる。ＵｇｔＰをコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号９で表される塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＣ＿０００９６４．３ ２３０６５１４－２３０７６６２）が挙げられる。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１が挙げられる。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
上記［１］～［３］は、それぞれ、下記［１’］～［３’］であってもよい。
［１’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
［１’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
上記［１］～［３］のうち、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質としては、［１］が好ましく、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質が、より好ましい。
本明細書において、変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１～２０個、好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
・Ａ群：疎水性アミノ酸
・Ｂ群：酸性アミノ酸
・Ｃ群：極性アミノ酸
・Ｄ群：塩基性アミノ酸
・Ｅ群：二級アミノ酸
・Ｆ群：ヒドロキシル基を持つアミノ酸
・Ｇ群：芳香族アミノ酸
・Ｈ群：含硫アミノ酸
Ａ～Ｈ群としてより具体的には以下の通りである。
・Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
・Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
・Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
・Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
・Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
・Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
・Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
・Ａ群：疎水性アミノ酸
・Ｂ群：酸性アミノ酸
・Ｃ群：極性アミノ酸
・Ｄ群：塩基性アミノ酸
・Ｅ群：二級アミノ酸
・Ｆ群：ヒドロキシル基を持つアミノ酸
・Ｇ群：芳香族アミノ酸
・Ｈ群：含硫アミノ酸
Ａ～Ｈ群としてより具体的には以下の通りである。
・Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
・Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
・Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
・Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
・Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
・Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
・Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本明細書において、相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
相同蛋白質としては、例えば、対象となる蛋白質が有するアミノ酸配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは以下順に６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
２つのアミノ酸配列又は２つの塩基配列の配列同一性のパーセンテージは、当該２つの配列に含まれる残基が最も一致するようにアライメントしたときに、当該一致する残基の比率として算出される。例えば、配列同一性のパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの例としては、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３のホモロジーアライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４－２４４８の類似性を検索する方法、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７に記載されているような、改良された、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムが挙げられる。ただし、数学的アルゴリズムとしては上記の例には限定されない。
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性のパーセンテージを決定するためのアライメントを行うことができる。当該プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ＭＡＦＦＴ（Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., & Miyata, T. (2002), 30(14), 3059-3066.、http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）、ＭＵＳＣＬＥ（Edgar R. C. (2004).Nucleic acids research, 32(5), 1792-1797.、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244, Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, 及びPearson et al. (1994) Meth. Mol.Biol. 24:307-331に記載されている。ＢＬＡＳＴについては、Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). 215(3), 403-410.、Mount D. W. (2007). CSH protocols, 2007, pdb.top17.等に記載されている。具体的には、ＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、配列同一性のパーセンテージが計算できる。
Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ＭＡＦＦＴ（Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., & Miyata, T. (2002), 30(14), 3059-3066.、http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）、ＭＵＳＣＬＥ（Edgar R. C. (2004).Nucleic acids research, 32(5), 1792-1797.、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244, Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, 及びPearson et al. (1994) Meth. Mol.Biol. 24:307-331に記載されている。ＢＬＡＳＴについては、Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). 215(3), 403-410.、Mount D. W. (2007). CSH protocols, 2007, pdb.top17.等に記載されている。具体的には、ＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、配列同一性のパーセンテージが計算できる。
蛋白質の、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性は、例えば以下の方法により確認できる。まず、後述する方法により、該蛋白質をコードするＤＮＡ及び酵素精製用のタグ配列を含む組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡを形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を精製酵素として調製する。続いて、精製酵素を適切な基質と糖供与体、例えば、蛋白質がＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を有していることを確認する場合には、ＣＤＰ－コリンとＵＤＰ－グルコースに接触させ、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体を生成させる。最後に、高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーなどを用いる一般的な分析方法により反応液中のＣＤＰ－コリングルコース配糖体を検出することにより、対象の蛋白質がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有していることを確認できる。
前記酵素精製用のタグ配列は、先行技術文献に記載されており、当業者に公知である。例としては、前記ポリペプチド鎖（例えば、Kimple ME,Brill AL,Pasker RL.Overview of affinity tags for protein purification.Curr Protoc Protein Sci.2013;73:9.9.1-9.9.23.Published 2013 Sep 24.doi:10.1002/0471140864.ps0909s73を参照）、カルモジュリン結合ペプチド、６ＨｉｓタグなどのＨｉｓタグ、及び／又はマルトース結合蛋白質配列を（親和性）精製するために使用され得る配列である。
例えばＨｉｓタグ（ポリヒスチジンタグ）は、典型的に、少なくとも６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基からなり、蛋白質のＮ末端またはＣ末端にあることが多い、蛋白質におけるポリヒスチジンアミノ酸モチーフである。ポリヒスチジンタグは、様々な種類で市販されている、結合した二価ニッケルまたはコバルトイオンを含有する親和性樹脂とのインキュベーションによる、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及び他の原核性発現系において発現されるポリヒスチジンタグ付き組換え蛋白質の親和性精製に使用されることが多い。
これらの樹脂は、一般に、ポリヒスチジンタグがマイクロモル親和性で結合する、ニッケル用のイミノ二酢酸（Ｎｉ－ＩＤＡ）及びニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）、ならびにコバルト用のカルボキシメチルアスパラギン酸（Ｃｏ－ＣＭＡ）などのキレート剤で官能化された、セファロース／アガロースである。樹脂は次いで典型的に、コバルトまたはニッケルイオンと特異的に相互作用しない蛋白質を除去するために、リン酸緩衝液で洗浄される。Ｎｉ系の方法の場合、２０ｍＭイミダゾールの添加によって洗浄効率を改善することができる（蛋白質は通常、１５０～３００ｍＭイミダゾールで溶出される）。
（（ＤＮＡ））
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の一例であるＥ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨをコードするＤＮＡとしては、例えばアクセッションＮｏ．がAccession No. CP081489.1 2449812-2452352 及びX64197.1 1951-4494などが挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰをコードするＤＮＡとしては、例えばAccession No. NC_000964.3 2306514-2307662が挙げられる。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の一例であるＥ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨをコードするＤＮＡとしては、例えばアクセッションＮｏ．がAccession No. CP081489.1 2449812-2452352 及びX64197.1 1951-4494などが挙げられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰをコードするＤＮＡとしては、例えばAccession No. NC_000964.3 2306514-2307662が挙げられる。
また、本実施形態におけるシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、以下の［４］～［９］から選ばれる少なくともいずれか１が挙げられる。
［４］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
［５］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡ。
［６］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［７］配列番号３又は９で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
［８］配列番号３又は９で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［９］配列番号３又は９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［４］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
［５］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡ。
［６］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［７］配列番号３又は９で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
［８］配列番号３又は９で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［９］配列番号３又は９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
上記［５］～［９］はそれぞれ以下の［５’］～［９’］であってもよい。
［５’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡ。
［６’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［７’］配列番号３又は９で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
［８’］配列番号３又は９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［９’］配列番号３又は９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［５’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡ。
［６’］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［７’］配列番号３又は９で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
［８’］配列番号３又は９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［９’］配列番号３又は９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして使用でき、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。
プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡが挙げられる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡが挙げられる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012))、Methods for General and Molecular Bacteriology(ASM Press(1994)）、immunology methods manual（Academic press(1997)）の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えば、ランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが挙げられる。
上記のストリンジェントな条件としては、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が挙げられる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号７または１１で表される塩基配列を含むＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのうち、上記［４］又は［７］に記載のＤＮＡは、例えば、配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列、又は配列番号３又は９で表される塩基配列に基づき設計できるプローブＤＮＡを用いた、微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。前記操作に用いる微生物の染色体ＤＮＡの由来は特に限定されないが、例えば、エシェリヒア属、シェワネラ属、キサントモナス属、又はシュードモナス属等に属する原核生物であり、これらの中でもエシェリヒア属に属する原核生物（大腸菌）が好ましい。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのうち、上記［６］、［８］又は［９］に記載のＤＮＡは、例えば、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは以下順に、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、又は、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号３で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、該検索によって得られたアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて設計し得るプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得できる。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのうち、上記［５］又は［８］に記載のＤＮＡは、例えば、配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号３又は９で表される塩基配列を含むＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
また、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が挿入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、上記［５］又は［８］に記載のＤＮＡを取得できる。すなわち、まず配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号３又は９で表される塩基配列を含むＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’側に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
取得した上記［４］～［９］に記載のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
ＤＮＡの塩基配列を決定する際に使用できる宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等が挙げられる。
上記のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等が挙げられる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列または配列番号３又は９で表される塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
［目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物］
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法及びシチジン残基含有化合物の製造方法では、遺伝子組換え微生物を用いてもよい。遺伝子組換え微生物としては、親株よりも目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物、例えば、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が増強した遺伝子組換え微生物が挙げられる。ここで、そのような微生物の定義や、該微生物の製造方法を説明する。
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法及びシチジン残基含有化合物の製造方法では、遺伝子組換え微生物を用いてもよい。遺伝子組換え微生物としては、親株よりも目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物、例えば、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が増強した遺伝子組換え微生物が挙げられる。ここで、そのような微生物の定義や、該微生物の製造方法を説明する。
本明細書において、「蛋白質の活性が増強している」とは、同蛋白質の活性が親株と比較して増強することを意味してよい。本明細書において、「蛋白質の活性が増強している」とは、具体的には、同蛋白質の細胞当たりの活性が親株に対して増強していることを意味してよい。
目的の蛋白質の活性を増強した遺伝子組換え微生物において、「親株」とは、本明細書において、遺伝子組換えおよび形質転換等の対象となる基準株（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ、すなわち微生物が属する種の基準株）及び、基準株に対し目的の蛋白質の活性が増強するような組換え以外の組換えが既に加えられた株を意味してよく、後述する（親株）の説明において例示した菌株を用いることが出来るが、これに限定されない。
すなわち、一態様において、蛋白質の活性は、親株と比較して増強してよい。
すなわち、一態様において、蛋白質の活性は、親株と比較して増強してよい。
本明細書において、「蛋白質の活性が増強している」とは、より具体的には、親株と比較して、同蛋白質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同蛋白質の分子当たりの機能が増強していることを意味してよい。すなわち、「蛋白質の活性が増強している」という場合の「活性」とは、蛋白質の触媒活性に限られず、蛋白質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（蛋白質の量）を意味してもよい。
また、「蛋白質の活性が増強している」ことには、もともと目的の蛋白質の活性を有する菌株において同蛋白質の活性を増強させることだけでなく、もともと目的の蛋白質の活性が存在しない菌株に同蛋白質の活性を付与することも包含される。また、結果として蛋白質の活性が増強する限り、宿主が元来有する目的の蛋白質の活性を低下または消失させた上で、目的の蛋白質の活性を付与してもよい。
本実施形態において、蛋白質の活性の増強の程度は、蛋白質の活性が親株と比較して増強していれば特に制限されない。蛋白質の活性は、例えば、親株の該蛋白質の活性の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、親株が目的の蛋白質の活性を有していない場合は、同蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより同蛋白質が生成されていればよいが、例えば、同蛋白質はその活性が測定できる程度に生産されていればよい。
蛋白質の活性が増強したことは、同蛋白質をコードする遺伝子の発現が親株と比較して上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が親株と比較して上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現する蛋白質の量が親株と比較して上昇したことを確認することにより確認できる。
また、蛋白質の活性が増強するような組換えは、例えば、蛋白質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）も包含されてよい。すなわち、蛋白質が代謝物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が脱感作された変異蛋白質をコードする遺伝子を宿主に保持させることにより、蛋白質の活性を増強させることができる。
なお、「フィードバック阻害の脱感作」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含されてよい。また、「フィードバック阻害が脱感作されている」（すなわちフィードバック阻害が低減又は解除されている）ことを「フィードバック阻害に耐性がある」ともいう。
比活性が増強された蛋白質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の蛋白質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、蛋白質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。
また、蛋白質の活性を増強する際、可溶性画分への発現及び、蛋白質の正しいフォールディングのための工夫等をしてもよい。具体的には例えば、シャペロンとの共発現、遺伝子誘導物質の検討、リフォールディング技術、蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端の削除や蛋白質発現ベクターの選定、精製条件の最適化、コドンの最適化などが挙げられる。
目的の蛋白質の活性が増強した微生物は、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株に比べ該蛋白質をコードするＤＮＡの発現を上昇させることによっても製造できる。「ＤＮＡの発現が上昇する」ことは、「遺伝子の発現が上昇する」ともいう。
本明細書において、「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が親株と比較して増強することを意味してよい。本明細書において、「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が親株と比較して増強することを意味してよい。本明細書において、「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増強すること、および／または、遺伝子の翻訳量（蛋白質の量）が増強することを意味してよい。
なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。本実施形態において、遺伝子の発現は、例えば、親株の該遺伝子の発現の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと目的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと目的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、目的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させること、転写開始の頻度の高いプロモーターを選択すること、目的遺伝子の発現の制御に関与する転写調節因子の破壊および発現強化により達成できる。即ち、目的遺伝子の発現の抑制に寄与する転写調節因子の場合は破壊により達成でき、目的遺伝子の発現の促進に寄与する転写調節因子の場合は強化により達成できる。
親株よりも蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増加した微生物としては、該蛋白質をコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増加した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記蛋白質をコードするＤＮＡを保有させた微生物を挙げることができる。
＜組換え体ＤＮＡ＞
組換え体ＤＮＡとは、例えば、該ＤＮＡが親株内において自律複製可能なＤＮＡであって、目的の蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、目的のＤＮＡとも称する。）を転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに、目的のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡをいう。
組換え体ＤＮＡとは、例えば、該ＤＮＡが親株内において自律複製可能なＤＮＡであって、目的の蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、目的のＤＮＡとも称する。）を転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに、目的のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡをいう。
ベクターとしては、目的のＤＮＡを宿主細胞に導入し、増殖、発現させるための適当なＤＮＡ分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
親株の染色体中への組込が可能なＤＮＡであれば、目的のＤＮＡそのものもまた、目的のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡである。組換え体ＤＮＡが、親株の染色体ＤＮＡへの組込が可能なＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
細菌等の原核生物において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、目的のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。
自律複製可能な組換え体ＤＮＡでは、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ （いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）等が挙げられる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計組換えされたプロモーターを用いることもできる。
親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５ （１９８４）］等が挙げられる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］が挙げられる。
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
組換え体ＤＮＡは、例えば、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いる、または、所望の酵素をコードするように調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、前記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製できる。
ここで、該ＤＮＡの塩基配列を宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。本発明の製造方法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物は、目的の蛋白質をコードするＤＮＡ（目的のＤＮＡ）を含む、または、目的のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる遺伝子組換え微生物である。ここで、親株について説明する。
＜親株＞
本明細書に記載の微生物を構築するために用いられる親株は特に制限されない。
本明細書に記載の微生物を構築するために用いられる親株は特に制限されない。
親株としては、原核生物または酵母菌株が好ましく、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株であり、これらの中でもエシェリヒア属に属する原核生物（大腸菌）が好ましい。
親株として、具体的には例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ （ＡＴＣＣ２３２２６）， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ ＲＣ９１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
＜親株へのＤＮＡの組み込み＞
目的のＤＮＡを組み込んで遺伝子組換え微生物を得るための、組換え体ＤＮＡの親株への導入方法としては、親株へＤＮＡを導入する方法であればいずれも使用できる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０，１９７２）、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７，１９８８）、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等が挙げられる。
目的のＤＮＡを組み込んで遺伝子組換え微生物を得るための、組換え体ＤＮＡの親株への導入方法としては、親株へＤＮＡを導入する方法であればいずれも使用できる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０，１９７２）、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７，１９８８）、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等が挙げられる。
遺伝子組換え微生物において、目的のＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡはゲノムに挿入されていてもよく、自律複製可能なプラスミドとして存在していてもよいが、目的のＤＮＡが転写可能な状態で含まれている。１つの親株が１種類のみのＤＮＡを含んでいてもよく、２種類以上のＤＮＡを含んでもよい。
また、目的のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを親株のゲノムに挿入する場合は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的のＤＮＡの導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したＤＮＡを、微生物内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］が挙げられる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。当該ＤＮＡを微生物細胞内に取り込ませる方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも使用でき、例えば、上記のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５５， １３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７１， ２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が目的のＤＮＡまたは組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得することができる。
目的の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを発現可能に親株に導入することによって得られた微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、該ＤＮＡ導入前の親株の該ＤＮＡの転写量や該蛋白質の生産量と比較することにより確認できる。
例えば上記の方法で目的の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを発現可能に親株に導入し造成した微生物が、目的の蛋白質を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物であることは、例えば以下の方法により確認できる。まず、該ＤＮＡ導入前の親株と造成した遺伝子組換え微生物をそれぞれ培地に培養し、得られる培養物から目的の蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。続いて、該細胞抽出液を基質に接触させ、目的の蛋白質を基質に作用させ、反応物を生成させる。最後に、反応物に応じた適切な分析方法によって、反応液中の反応物を検出することにより、造成した微生物が目的の蛋白質を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物であることを確認できる。特に、検出された目的物が該ＤＮＡ導入前の親株のそれよりも多い場合に、該ＤＮＡ導入前の親株に比べて目的の蛋白質の活性が増強されているといえる。
［目的物の製造方法］
目的とする製造物が微生物を用いて製造されるとき、当業者には酵素法又は発酵法などによる製造と理解されるが、これに限定されるものではない。
本実施形態において、「酵素法」は微生物を培養して得られる培養物及び該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、基質を水性媒体中に存在せしめ、反応させることにより、目的とする製造物を製造する方法である。その中でも、増殖を伴わない休止状態・静止状態の微生物菌体を触媒（酵素源、とも称する。）として利用した反応系を「菌体反応法」と呼ぶ。
また、「発酵法」とは、増殖又は生育状態にある微生物を使用して、目的とする製造物を微生物内で製造する方法である。この場合、微生物の増殖又は生育のための培地成分の添加が必要である。
以下に、酵素法または発酵法により目的とする製造物を製造する方法について、より詳細に説明する。ただし、微生物と基質との反応の形態は、以下に説明する特定の方法に限られるものではない。
［シチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法］
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることを含む。本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法では、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることによって、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する。
シチジン残基含有化合物の配糖体がＣＤＰ－コリン配糖体である場合について、以下に詳述する。
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることを含む。本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の製造方法では、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることによって、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する。
シチジン残基含有化合物の配糖体がＣＤＰ－コリン配糖体である場合について、以下に詳述する。
［ＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法］
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることを含む。本開示のＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法では、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることによって、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する。例えば、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を有する蛋白質を用いることによって、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースのグルコースを転移させ、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体を製造する。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることを含む。本開示のＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法では、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用いることによって、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する。例えば、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を有する蛋白質を用いることによって、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースのグルコースを転移させ、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体を製造する。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法としては、上述したシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることによる、（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法、（ＩＩ）酵素法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法が挙げられる。以下、各製造方法について説明する。
（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法
発酵法により本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法としては、以下に説明する微生物を培地に培養し、培養物中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させる、ＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法が挙げられる。該製造方法は、例えば、培養物中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させたのち、蓄積せしめ、該培養物中からＣＤＰ－コリン配糖体を採取することを含んでいてもよい。
発酵法により本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法としては、以下に説明する微生物を培地に培養し、培養物中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させる、ＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法が挙げられる。該製造方法は、例えば、培養物中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させたのち、蓄積せしめ、該培養物中からＣＤＰ－コリン配糖体を採取することを含んでいてもよい。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を発酵法により製造する際に用いる微生物（以下、「ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（Ｉ）」とも称する。）としては、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を有し、ＣＤＰ－コリン配糖体を製造する微生物である。ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（Ｉ）は、親株に比べてシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が増強され、かつ、ＣＤＰ－コリン配糖体の生産性が向上した微生物であってもよい。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を有する微生物としては、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を元来有する微生物であっても良いし、用いる基準株がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を元来有さない微生物の場合は、人工的にシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を付与した遺伝子組換え微生物であっても良い。シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を元来有する微生物に対し、更にシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を増強した遺伝子組換え微生物であっても良い。
ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（Ｉ）としては、例えば、前述した「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であり、好ましくは「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素であるか、又は上述の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、微生物である。
「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である場合は、「目的のＤＮＡ」として、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素をコードするＤＮＡ、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨをコードするＤＮＡとして先に例示したＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨをコードするＤＮＡとして先に例示したＤＮＡ等を用いることによって、「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、該微生物を製造できる。
「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」が上述した［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である場合は、「目的のＤＮＡ」として、上述の［４］～［９］から選ばれる少なくともいずれか１を用いることによって、「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、該微生物を製造できる。
微生物の培養は、通常の方法に従って実施できる。該微生物を培養する培地としては、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の基質又は該基質の出発原料、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の基質としては、例えば、糖ヌクレオチド及びＣＤＰ－コリンが挙げられる。糖ヌクレオチドとしては、ＵＤＰ－Ｇｌｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ、ＧＤＰ－Ｍａｎ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ－Ｆｕｃ、ＵＤＰ－ＧｌｃＡ等が挙げられ、ＵＤＰ－Ｇｌｃがより好ましい。これらの糖ヌクレオチドを、「ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド」ともいう。基質の出発原料としては、例えば、オロット酸、ＣＭＰ、塩化コリン、グルコース等が挙げられる。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノールおよびプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等が挙げられる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等が挙げられる。
発酵法によるＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法において、用いる微生物はシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の基質となるＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンを生成する能力（生産能、とも称する。）を有する微生物であってもよい。ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物としては、基準株であってもよいし、基準株がＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を有しない場合は、人工的にＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を付与した株であってもよい。
また、発酵法によるＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法において、用いる微生物がＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を有していない場合には、ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンを培地に添加する代わりに、ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物を、ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（Ｉ）と共培養することにより、該微生物にＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンを供給してもよい。
親株として用いる微生物に、ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を人工的に付与又は強化する方法としては、下記の（ａ）～（ｅ）などが挙げられ、上記公知の方法を単独又は組み合わせて使用できる。
（ａ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（ｂ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（ｃ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（ｄ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（ｅ）基準株に比べ、ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
（ａ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（ｂ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（ｃ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（ｄ）ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（ｅ）基準株に比べ、ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
発酵法によるＣＤＰ－コリン配糖体の製造方法において、用いる微生物がＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンの生産能を有していない場合には、ＵＤＰ－グルコース等の糖ヌクレオチド及び／又はＣＤＰ－コリンを培地に添加してもよい。ＵＤＰ－グルコースは、例えばフナコシ株式会社製のＵＤＰ－グルコース（製品コード：１５６０２）、ＣＤＰ－コリンは、例えば東京化成工業株式会社製のＣＤＰ－コリン（製品コード：Ｃ３４３８）を入手できる。
２種以上の微生物を同一の培地中で培養する場合、これらの微生物を同時に培養しても、一つの微生物の培養中、あるいは培養終了後に残りの微生物を該培地中に培養してもよい。
また、２種以上の微生物を組み合わせてＣＤＰ－コリン配糖体を生成する場合、ＣＤＰ－コリンの基質となる化合物は添加しても良いし、国際公開第２００７／０２３８３０号に記載のように微生物がＣＤＰ－コリン生成活性の一部しか有していない場合、ＣＤＰ－コリン生成活性が得られるように、適宜２種以上の微生物を組み合わせて、ＣＤＰ－コリン生成活性を有する生体触媒として用いてもよい。なお、微生物がＣＤＰ－コリン生成活性を有している場合でも、２種以上の微生物を組み合わせることができる。
さらに、例えば前記一般式（１）で表されるＣＤＰ－コリン配糖体のＲが、六炭糖残基である場合、ＣＤＰ－コリンに糖ヌクレオチドから糖が転移した後、ＣＤＰ－コリン配糖体のＲ構造が微生物の内在酵素の働き等によって六炭糖残基に変換されることによっても、前記一般式（１）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体を製造可能である。
具体的には、Ｒがフルクトース残基である場合、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－Ｇｌｃからグルコースが転移し、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体が生成した後、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体のグルコース残基部分がイソメラーゼ等の酵素の働きによりフルクトース残基に変換されることによって、前記一般式（１）で示されるＣＤＰ－コリン配糖体を製造可能である。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は１５～４０℃が好ましく、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記の培養により、培養物中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させることにより、ＣＤＰ－コリン配糖体を製造できる。ＣＤＰ－コリン配糖体の製造量の定量は、ＨＰＬＣ（例えば、島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ）を用い、後述する[分析例]に記載の方法で実施できる。
該培養物中からのＣＤＰ－コリン配糖体の採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＣＤＰ－コリン配糖体が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＣＤＰ－コリン配糖体を採取できる。
（ＩＩ）酵素法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法
酵素法により本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法は、酵素源として、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を用い、基質または該酵素源と、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させることを含む。該製造方法は、例えば、水性媒体中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させたのち、蓄積せしめ、該水性媒体中からＣＤＰ－コリン配糖体を採取することを含んでいてもよい。
酵素法により本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法は、酵素源として、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を用い、基質または該酵素源と、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させることを含む。該製造方法は、例えば、水性媒体中にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させたのち、蓄積せしめ、該水性媒体中からＣＤＰ－コリン配糖体を採取することを含んでいてもよい。
本開示のＣＤＰ－コリン配糖体を酵素法により製造する際に用いる微生物（以下、「ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（ＩＩ）」としては、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物である。ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（ＩＩ）は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を元来有する微生物であっても良いし、用いる基準株がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を元来有さない微生物の場合は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性を増強することで、人工的にシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を付与した遺伝子組換え微生物であっても良い。シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を元来有する微生物に対し、更にシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性を増強した遺伝子組換え微生物であっても良い。
ＣＤＰ－コリン配糖体製造用微生物（ＩＩ）として、より具体的には、前述した「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であり、好ましくは「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素であるか、又は上述の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、微生物である。
「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である場合は、「目的のＤＮＡ」として、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方をコードするＤＮＡ、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨをコードするＤＮＡとして先に例示したＤＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨをコードするＤＮＡとして先に例示したＤＮＡ等を用いることによって、「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、該微生物を製造できる。
「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」が上述した［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である場合は、「目的のＤＮＡ」として、上述の［４］～［９］から選ばれる少なくともいずれか１を用いることによって、「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、該微生物を製造できる。
酵素源としてシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いる場合、本微生物はシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質だけでなく、ＣＤＰ－コリン配糖体の基質であるＣＤＰ－コリンや更にその出発基質であるコリン、ホスホリルコリン、ウリジン－５’－三リン酸（ＣＴＰとも称する。）、及びＵＴＰ等からＣＤＰ－コリンを生成させる場合に必要となる酵素（例えば、ＣＣＴやｐｙｒＧ等）を生産する能力を有していても良い。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物としては、具体的には例えば、実施例において後述するＢＬ２１（ＤＥ３）ｏｐｇＨ：：ｋａｎ／ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨが挙げられる。
微生物を培養する方法及び培地としては、「（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」において上述したものと同様である。
酵素法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法において、「酵素源」とは、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が増強した、上述した本実施形態の遺伝子組換え微生物を培養して得られる培養物又は該培養物の処理物である。
本明細書において、培養物の処理物としては、例えば、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。
これらの中でも、好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物が挙げられ、最も好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものが挙げられる。
酵素源としてのシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の量は、０．０１ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。
基質の濃度は、０．１ｍＭ～１０Ｍであることが好ましく、より好ましくは１ｍＭ～１Ｍである。基質としては、例えば、糖ヌクレオチド及びＣＤＰ－コリンが挙げられる。基質の出発原料として、「（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」で記載した物質を用いてもよい。糖ヌクレオチドとしては、ＵＤＰ－Ｇｌｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ、ＧＤＰ－Ｍａｎ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ－Ｆｕｃ、ＵＤＰ－ＧｌｃＡ等が挙げられ、ＵＤＰ－Ｇｌｃが好ましい。
水性媒体としては、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩およびトリスなどの緩衝液、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、並びにアセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として使用できる。
ＣＤＰ－コリン配糖体の生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えば、ナイミーンＳ－２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えば、カチオンＦ２－４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば、三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＣＤＰ－コリンの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用してもよい。界面活性剤は、通常０．１～５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
有機溶媒としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１～５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。ＣＤＰ－コリンの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５～１０、好ましくはｐＨ６～８、２０～５０℃の条件で１～９６時間行う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加してもよい。アデニン、ＡＭＰ、ＡＴＰは、通常０．０１～１００ｍＭの濃度で用いられる。
水性媒体中に生成したＣＤＰ－コリン配糖体は、「（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」において上述した方法により定量及び採取できる。
［目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物］
本開示のシチジン残基含有化合物の製造方法やシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法では、遺伝子組換え微生物を用いてもよい。遺伝子組換え微生物としては、例えば、親株よりも目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物、すなわちシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物が挙げられる。ここで、そのような微生物の定義や、該微生物の製造方法を説明する。
本開示のシチジン残基含有化合物の製造方法やシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法では、遺伝子組換え微生物を用いてもよい。遺伝子組換え微生物としては、例えば、親株よりも目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物、すなわちシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物が挙げられる。ここで、そのような微生物の定義や、該微生物の製造方法を説明する。
「親株よりも目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」における目的の蛋白質としては［シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質及び該蛋白質をコードするＤＮＡ］に記載の蛋白質等が挙げられる。
本明細書において、「蛋白質の活性が低下又は欠失している」とは、同蛋白質の活性が親株と比較して低下又は欠失することを意味してよい。「蛋白質の活性が低下又は欠失している」とは、具体的には、同蛋白質の細胞当たりの活性が親株と比較して減少又は消失していることを意味する。該蛋白質の活性は親株に比べ、８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下してよい。
目的の蛋白質の活性を低下又は欠失した遺伝子組換え微生物において、「親株」とは、本明細書において、遺伝子組換えおよび形質転換等の対象となる基準株（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ、すなわち微生物が属する種の基準株）及び、基準株に対し目的の蛋白質の活性を低下又は欠失するような組換え以外の組換えが既に加えられた株を意味してよく、前述した＜親株＞の説明において例示した菌株を用いることが出来るが、これに限定されない。
すなわち、一態様において、蛋白質の活性は、親株と比較して低下又は欠失してよい。
すなわち、一態様において、蛋白質の活性は、親株と比較して低下又は欠失してよい。
「蛋白質の活性が低下又は欠失している」という場合の「活性」とは、蛋白質の触媒活性に限られず、蛋白質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（蛋白質の量）を意味してもよい。該遺伝子の発現量は。８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下してよい。
蛋白質の活性が低下するような組換えは、例えば、同蛋白質をコードする遺伝子の一部又は全部の領域を破壊することや、終止コドンの導入、プロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配等の発現調節配列の組換えや、発現制御に関わる因子の操作、コード領域への変異導入、突然変異処理等により該遺伝子の発現の低下により達成できる。 これらの手法は公知である。
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。ＰＣＲを利用して特定の遺伝子をノックアウトする方法［Ｂａｂａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌ（２００６）］、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］などが挙げられる。
蛋白質の活性が低下したことは、同蛋白質の細胞当たりの活性又は蛋白質量を測定することで確認できる。蛋白質の活性が低下したことは、同蛋白質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現する蛋白質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を親株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザン ハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。ｍＲＮＡの量は、例えば、親株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を親株と比較することによって行うことが出来る。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザン ハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。ｍＲＮＡの量は、例えば、親株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
蛋白質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。蛋白質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、親株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
上記した蛋白質の活性を低下させる手法は、任意の蛋白質（例えば、副生物生 成酵素）の活性低下や、任意の遺伝子（例えば、それら任意の蛋白質をコードする遺伝子）の発現低下に利用できる。
［シチジン残基化合物の配糖体の生成を抑制したシチジン残基含有化合物の製造方法］
本開示のシチジン残基含有化合物を製造する方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にシチジン残基含有化合物を生産することを含む。上記遺伝子組換え微生物は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物であってもよい。
本開示のシチジン残基含有化合物を製造する方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にシチジン残基含有化合物を生産することを含む。上記遺伝子組換え微生物は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物であってもよい。
シチジン残基含有化合物がＣＤＰ－コリンである場合について、以下に詳述する。
［シチジンジリン酸コリンの製造方法］
本開示のＣＤＰ－コリンの製造方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にＣＤＰ－コリンを生産することを含む。
本開示のＣＤＰ－コリンの製造方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にＣＤＰ－コリンを生産することを含む。
本開示のＣＤＰ－コリンを製造する方法としては、具体的には、（ＩＩＩ）発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法、（ＩＶ）酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法が挙げられる。
（ＩＩＩ）発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法
発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法としては、以下に説明する遺伝子組換え微生物を培地に培養し、培養物中にＣＤＰ－コリンを生成させる、ＣＤＰ－コリンの製造方法が挙げられる。該製造方法は、例えば、培養物中にＣＤＰ－コリンを生成させたのち、蓄積せしめ、該培養物中からＣＤＰ－コリンを採取することを含んでいてもよい。
発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法としては、以下に説明する遺伝子組換え微生物を培地に培養し、培養物中にＣＤＰ－コリンを生成させる、ＣＤＰ－コリンの製造方法が挙げられる。該製造方法は、例えば、培養物中にＣＤＰ－コリンを生成させたのち、蓄積せしめ、該培養物中からＣＤＰ－コリンを採取することを含んでいてもよい。
ＣＤＰ－コリンを発酵法により製造する際に用いる微生物（以下、「ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＩＩ）」とも称する。）は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失しており、かつ、ＣＤＰ－コリンの生産能を有する、遺伝子組換え微生物である。
シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株に比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を用いることで、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移することによるＣＤＰ－コリン配糖体の生成が抑制できることから、効率的にＣＤＰ－コリンを製造し得る。
ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＩＩ）としては、例えば、前述した「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であり、好ましくは「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素であるか、又は上述の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１であり、かつＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物である。そのような微生物は「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、製造できる。
ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＩＩ）はＣＤＰ－コリンの生産能を有するため、親株として、ＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物を用いる。ＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物としては、基準株であってもよいし、基準株がＣＤＰ－コリンを生産する能力を有しない場合は、人工的にＣＤＰ－コリンを生産する能力を付与した株であってもよい。ＣＤＰ－コリンを生産する能力を元来有する微生物に対し、更にＣＤＰ－コリンを生産する能力を付与しても良い。また、「（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」で上述したように、２種以上の微生物を組み合わせてＣＤＰ－コリンを生成してもよい。
ＣＤＰ－コリンはＣＴＰとホスホリルコリンからコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．７．７．１５］（以下、ＣＣＴと略す）によって合成される。ＣＤＰ－コリンを生成できる微生物はＣＴＰとホスホリルコリンを生成する活性を有し、さらにＣＣＴの活性を有していることが求められる。
ホスホリルコリンの生成はコリンとＡＴＰからコリンキナーゼ［ＥＣ２．７．１．３２］（以下、ＣＫＩと略す）によって行われる。そのため、ホスホリルコリンを生成できる微生物はＣＫＩの活性を有していることが求められる。
ＣＴＰの生成はピリミジン核酸の生合成経路に従い、アスパラギン酸とカルバモイルリン酸からオロット酸が生成され、その後オロチジン－５’－一リン酸（以下、ＯＭＰと略す）、ウリジン－５’－一リン酸（以下、ＵＭＰと略す）、ウリジン－５’－二リン酸（以下、ＵＤＰと略す）、ＵＤＰからウリジン－５’－三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）を経てＵＴＰからＣＴＰを生成する活性を有するシチジン－５’－三リン酸シンセターゼ［ＥＣ６．３．４．２］（以下、ＰｙｒＧと略す）によって生成される。ＣＴＰの効率的な合成のためには、グルタミンからカルバモイルリン酸を生成させるためのカルバモイルリン酸合成酵素［ＥＣ６．３．５．５］、カルバモイルリン酸とアスパラギン酸からＮ－カルバモイルアスパラギン酸を合成するアスパラギン酸カルバモイル転移酵素［ＥＣ．２．１．３．２］、カルバモイルアスパラギン酸からジヒドロオロット酸を生成するジヒドロオロターゼ［ＥＣ ３．５．２．３］、ジヒドロオロット酸からオロット酸を生成するジヒドロオロット酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．３．５．２］、オロット酸とＰＲＰＰからオロット酸からオロチジン－５’－一リン酸（以下、ＯＭＰと略す）を生成する活性を有するオロット酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．４．２．１０］、ＯＭＰからウリジン－５’－一リン酸（以下、ＵＭＰと略す）を生成する活性を有するオロチジン－５’－モノリン酸デカルボキシラーゼ［ＥＣ４．１．１．２３］、ウラシルからウリジンを生成する活性を有するウリジンホスホリラーゼ［ＥＣ２．４．２．３］、ウリジンからＵＭＰを生成する活性を有するウリジンキナーゼ［ＥＣ２．７．１．４８］、ＵＭＰからウリジン－５’－二リン酸（以下、ＵＤＰと略す）を生成する活性を有するウリジル酸・シチジル酸キナーゼ［ＥＣ２．７．１．４８］、ＵＤＰからウリジン－５’－三リン酸（以下、ＵＴＰと略す）を生成する活性を有するヌクレオシドニリン酸キナーゼ［ＥＣ２．７．４．６］、ＵＴＰからＣＴＰを生成する活性を有するシチジン－５’－三リン酸シンセターゼ［ＥＣ６．３．４．２］が必要となる。
ＣＴＰの合成経路は大腸菌を初めとした微生物の多くが保有しているが、ＣＤＰ－コリンの製造方法に用いる組換え微生物においては、これらの活性が増強されていることが好ましい。
すなわち、ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＩＩ）に用いられる、ＣＤＰ－コリンの生産能を有する親株は、ＰｙｒＧ等を含む、ＣＴＰの合成経路に必要な上記酵素の少なくとも１つ、ＣＣＴ及びＣＫＩの少なくとも１つの活性が増強した遺伝子組換え微生物であってもよい。そのような微生物としては、例えば、前述した「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」が、ＰｙｒＧ等を含む、ＣＴＰの合成経路に必要な上記酵素の少なくとも１つ、ＣＣＴ及びＣＫＩの少なくとも１つである、微生物である。
そのような微生物は、「目的のＤＮＡ」として、ＰｙｒＧ等を含む、ＣＴＰの合成経路に必要な上記酵素の少なくとも１つ、ＣＣＴ及びＣＫＩの少なくとも１つをコードしたＤＮＡを用いることによって、「目的の蛋白質の活性が増強した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、該微生物を製造できる。
微生物がＣＤＰ－コリンを生成し得る微生物であることは、該微生物を培地に培養し、ＣＤＰ－コリンを後述のＨＰＬＣ（例えば、島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ）を用いて検出することにより確認できる。
「（ＩＩＩ）発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」における培養条件（好気的条件、温度、時間、ｐＨ）、培地に添加してもよい物質、培養物中からのＣＤＰ－コリンの採取方法は、「（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」で上述した内容と同様である。
上記の培養により、培養物中にＣＤＰ－コリンを生成させることにより、ＣＤＰ－コリンを製造できる。ＣＤＰ－コリンの製造量の定量は、ＨＰＬＣ（例えば、島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ）を用い、後述する［分析例］に記載の方法で実施できる。
該培養物中からのＣＤＰ－コリンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＣＤＰ－コリンが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＣＤＰ－コリンを採取できる。
（ＩＶ）酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法
酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法としては、例えば、ＣＤＰ－コリンを生成する反応の酵素源として、以下に記載する遺伝子組換え微生物の培養物または該培養物の処理物を、基質または該酵素源と、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＤＰ－コリンを生成させることを含む、ＣＤＰ－コリンの製造方法が挙げられる。
酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法としては、例えば、ＣＤＰ－コリンを生成する反応の酵素源として、以下に記載する遺伝子組換え微生物の培養物または該培養物の処理物を、基質または該酵素源と、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＤＰ－コリンを生成させることを含む、ＣＤＰ－コリンの製造方法が挙げられる。
ＣＤＰ－コリンを酵素法により製造する際に用いる微生物（以下、「ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＶ）」ともいう。）は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失している微生物である。
ＣＤＰ－コリンを生成する反応の酵素源として、組換え微生物の培養物及び該培養物の処理物を用いる場合、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失している遺伝子組換え微生物を用いることで、ＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移することによるＣＤＰ－コリン配糖体の生成が抑制できることから、効率的にＣＤＰ－コリンを製造し得る。
ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＶ）としては、例えば、前述した「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であり、好ましくは「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素であるか、又は上述の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、微生物である。そのような微生物は「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、製造できる。
酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法において、「酵素源」とは、ＣＤＰ－コリン生合成経路に関与する酵素の活性を有する、上述した本実施形態の遺伝子組換え微生物を培養して得られる培養物又は該培養物の処理物である。ＣＤＰ－コリン生合成経路に関与する酵素としては、例えば、ｐｙｒＧ、ＣＣＴ、ＣＫＩ等が挙げられる。
ＣＤＰ－コリン製造用組換え微生物（ＩＶ）の製造方法は、例えば、ＣＴＰとホスホリルコリンを基質としてＣＤＰ－コリンを生成する場合、酵素源としてのＣＣＴ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性を元来有する微生物であれば、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を親株に比べて低下又は欠失させる。酵素法によるＣＤＰ－コリンの製造方法は、この微生物の培養物または該培養物の処理物と、基質であるＣＴＰとホスホリルコリンを、水性媒体中に存在せしめ、ＣＤＰ－コリンを生成させたのち、蓄積せしめ、該水性媒体中からＣＤＰ－コリンを採取することを含んでいてもよい。シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株に比べて低下又は欠失した微生物であって、かつ、ＣＤＰ－コリンの生成反応に用いることの出来る酵素源としての遺伝子組換え微生物としては、上述のＣＣＴ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物であっても良いし、他の基質を用いる場合には該基質に対し反応し得る酵素活性を有する蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物であっても良い。
微生物を培養する方法及び培地としては、「（Ｉ）発酵法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」において上述したものと同様である。
培養物の処理物や反応条件としては、「（ＩＩ）酵素法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」において上述したものと同様である。
培養物の処理物や反応条件としては、「（ＩＩ）酵素法によりＣＤＰ－コリン配糖体を製造する方法」において上述したものと同様である。
水性媒体中に生成したＣＤＰ－コリンは、「（ＩＩＩ）発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」において上述した方法により定量及び採取できる。
［シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法］
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を調製することを含む。上記遺伝子組換え微生物は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物であってもよい。
シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する際に用いる微生物を、「シチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物」ともいう。
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失した遺伝子組換え微生物を調製することを含む。上記遺伝子組換え微生物は、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が、親株の該活性と比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物であってもよい。
シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する際に用いる微生物を、「シチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物」ともいう。
遺伝子組換え微生物において糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が低下又は欠失していることは、例えば該遺伝子組換え微生物及び、該活性が低下するように改変されていない対照微生物の、糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を比較することで確認できる。
具体的には、それぞれの微生物を培養し、適切な基質と糖供与体、例えば、蛋白質がＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を確認する場合には、ＣＤＰ－コリンとＵＤＰ－グルコースを供給し、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体を生成させる。最後に、後述する[分析例]に記載の分析方法等により反応液中のＣＤＰ－コリングルコース配糖体の製造量を分析し、該遺伝子組換え微生物及び、該活性が低下するように改変されていない対照微生物におけるＣＤＰ－コリングルコース配糖体の製造量を比較することにより、遺伝子組換え微生物において糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が低下又は欠失していることを確認できる。
具体的には、それぞれの微生物を培養し、適切な基質と糖供与体、例えば、蛋白質がＣＤＰ－コリンにＵＤＰ－グルコースからグルコースを転移する活性を確認する場合には、ＣＤＰ－コリンとＵＤＰ－グルコースを供給し、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体を生成させる。最後に、後述する[分析例]に記載の分析方法等により反応液中のＣＤＰ－コリングルコース配糖体の製造量を分析し、該遺伝子組換え微生物及び、該活性が低下するように改変されていない対照微生物におけるＣＤＰ－コリングルコース配糖体の製造量を比較することにより、遺伝子組換え微生物において糖ヌクレオチドから糖を転移する活性が低下又は欠失していることを確認できる。
「シチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物」としては、例えば、前述した「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」において、「目的の蛋白質」がシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であり、好ましくは「目的の蛋白質」が上述したＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素であるか、又は上述の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である微生物である。そのような微生物は「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」の製造方法として上記した方法により、製造できる。
また、本開示において「シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する」とは、「目的の蛋白質の活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物」を用いて製造した、ＣＤＰ－コリンを含む組成物に含まれる、ＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率が一定の値以下になることを意味しても良い。
本明細書では、このようにシチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物を用いて製造する組成物を、ＣＤＰ－コリンを含む組成物Ｂともいう。本開示の「ＣＤＰ－コリンを含む組成物Ｂ」とは、ＣＤＰ－コリンを含むものであればよく、更にＣＤＰ－コリン配糖体を含んでいてもよい。ＣＤＰ－コリンを含む組成物Ｂは、上述した「（ＩＩＩ） 発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」に記載の発酵法により、遺伝子組換え微生物を培地に培養しＣＤＰ－コリンを生成させた培養物や、該培養物を精製したものであっても良く、また、「（ＩＶ）酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」に記載の酵素法により、ＣＤＰ－コリンを生成させた該水性媒体や、該水性媒体を精製したものであっても良い。ここでの「精製」とは、ＣＤＰ－コリン又はＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体を含む該培養物又は該水性媒体から、ＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体以外の任意の組成物を除去する操作を指す。
本明細書では、このようにシチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物を用いて製造する組成物を、ＣＤＰ－コリンを含む組成物Ｂともいう。本開示の「ＣＤＰ－コリンを含む組成物Ｂ」とは、ＣＤＰ－コリンを含むものであればよく、更にＣＤＰ－コリン配糖体を含んでいてもよい。ＣＤＰ－コリンを含む組成物Ｂは、上述した「（ＩＩＩ） 発酵法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」に記載の発酵法により、遺伝子組換え微生物を培地に培養しＣＤＰ－コリンを生成させた培養物や、該培養物を精製したものであっても良く、また、「（ＩＶ）酵素法によりＣＤＰ－コリンを製造する方法」に記載の酵素法により、ＣＤＰ－コリンを生成させた該水性媒体や、該水性媒体を精製したものであっても良い。ここでの「精製」とは、ＣＤＰ－コリン又はＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体を含む該培養物又は該水性媒体から、ＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体以外の任意の組成物を除去する操作を指す。
本実施形態の方法によって製造される該組成物Ｂとしては、好ましくは、該組成物Ｂに含まれるＣＤＰ－コリンの製造量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の製造量の存在比率（例えば、ＨＰＬＣピーク強度比で評価ができる）が、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下であり、下限値は特に限られないが０．０００５％であることが好ましい。ＣＤＰ－コリン配糖体の製造量は、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物の種類や量が同じ条件下においては、基質であるＵＤＰ－Ｇｌｃ量に依存し、ＵＤＰ－Ｇｌｃ量が十分存在する場合はＣＤＰ－コリン配糖体の製造量は多くなる傾向にあり、ＵＤＰ－Ｇｌｃ量が不足している場合はＣＤＰ－コリン配糖体の製造量も減少する傾向がある。
「シチジン残基含有化合物の配糖体の生成抑制用組換え微生物」としては、特に限定されないが、シチジン残基含有化合物の生産能を有することが好ましい。シチジン残基含有化合物の生産能を有する微生物としては、基準株であってもよいし、基準株がシチジン残基含有化合物を生産する能力を有しない場合は、人工的にシチジン残基含有化合物を生産する能力を付与した株であってもよい。シチジン残基含有化合物を生産する能力を元来有する微生物に対し、更にシチジン残基含有化合物を生産する能力を付与しても良い。例えば、シチジン残基含有化合物であるシチジンジリン酸コリンの生産能を有する微生物は、[シチジンジリン酸コリンの製造方法]で上述した遺伝子組換え微生物を用いることが出来る。
シチジン残基含有化合物の配糖体の生成が抑制されたことは、該微生物を培地に培養し、シチジン残基含有化合物の配糖体を前述のＨＰＬＣ（例えば、島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ）を用いて検出・定量し、親株のそれと比較することで確認できる。
本開示のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法において、シチジン残基含有化合物の配糖体としてはＣＤＰ－コリン配糖体であることが好ましく、ＣＤＰ－コリングルコース配糖体であることがより好ましい。
以上説明したように、本明細書には以下の事項が開示されている。
＜＜１＞＞ 下記一般式（１）で示されるシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
＜＜１＞＞ 下記一般式（１）で示されるシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
（式（１）中、Ｒは糖残基である。）
＜＜２＞＞ 前記シチジンジリン酸コリン配糖体が、下記一般式（２）で示されるシチジンジリン酸コリングルコース配糖体である、上記＜＜１＞＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
＜＜３＞＞ 上記＜＜１＞＞又は＜＜２＞＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体及びその溶媒和物の少なくとも１つを含有する組成物。
＜＜４＞＞ シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用い、シチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜＜５＞＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、上記＜＜１＞＞又は＜＜２＞＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜＜６＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜＜４＞＞又は＜＜５＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜＜７＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜＜４＞＞又は＜＜５＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜＜８＞＞ 以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子組換え微生物。
（Ａ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物。
（Ｂ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失している、遺伝子組換え微生物。
＜＜９＞＞ 前記シチジン残基含有化合物が、シチジンジリン酸コリンである、上記＜＜８＞＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１０＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜
＜８＞＞又は＜＜９＞＞に記載の遺伝子組換え微生物。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜＜１１＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜＜８＞＞又は＜＜９＞＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１２＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質がＧｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｈである、上記＜＜８＞＞～＜＜１１＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１３＞＞ 前記遺伝子組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、上記＜＜８＞＞～＜＜１２＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１４＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にシチジン残基含有化合物を生産することを含む、シチジン残基含有化合物の製造方法。
＜＜１５＞＞ 前記シチジン残基含有化合物がシチジンジリン酸コリンである、上記＜＜１４＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の製造方法。
＜＜１６＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１つの遺伝子組換え微生物を調製することを含む、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
＜＜１７＞＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、下記一般式（１）に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜＜１６＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
＜＜４＞＞ シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質を用い、シチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜＜５＞＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、上記＜＜１＞＞又は＜＜２＞＞に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜４＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜＜６＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜＜４＞＞又は＜＜５＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
＜＜７＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜＜４＞＞又は＜＜５＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体を製造する方法。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜＜８＞＞ 以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子組換え微生物。
（Ａ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失しており、かつ、シチジン残基含有化合物の生産能を有する、遺伝子組換え微生物。
（Ｂ）シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失している、遺伝子組換え微生物。
＜＜９＞＞ 前記シチジン残基含有化合物が、シチジンジリン酸コリンである、上記＜＜８＞＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１０＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、以下の［１］～［３］から選ばれる少なくともいずれか１である、上記＜
＜８＞＞又は＜＜９＞＞に記載の遺伝子組換え微生物。
［１］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
［２］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号８又は１０で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつシチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する相同蛋白質。
＜＜１１＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質が、ＣＡＺｙ分類におけるＧＴ２酵素及びＧＴ２８酵素の少なくとも一方に分類される酵素である、上記＜＜８＞＞又は＜＜９＞＞に記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１２＞＞ 前記シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質がＧｌｕｃａｎｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｈである、上記＜＜８＞＞～＜＜１１＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１３＞＞ 前記遺伝子組換え微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、上記＜＜８＞＞～＜＜１２＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物。
＜＜１４＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び当該遺伝子組換え微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にシチジン残基含有化合物を生産することを含む、シチジン残基含有化合物の製造方法。
＜＜１５＞＞ 前記シチジン残基含有化合物がシチジンジリン酸コリンである、上記＜＜１４＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の製造方法。
＜＜１６＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１つの遺伝子組換え微生物を調製することを含む、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
＜＜１７＞＞ 前記シチジン残基含有化合物の配糖体が、下記一般式（１）に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体である、上記＜＜１６＞＞に記載のシチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制する方法。
（式（１）中、Ｒは糖残基である。）
＜＜１８＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物を用いて製造したシチジンジリン酸コリンを含む組成物であって、シチジンジリン酸コリンの製造量に対するシチジンジリン酸コリン配糖体の製造量の存在比率が３５％以下である、組成物。
＜＜１９＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１項の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び
前記微生物を用いて組成物を製造すること、を含み、
前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が３５％以下である、
組成物の製造方法。
＜＜２０＞＞ シチジンジリン酸コリンの製造量に対するシチジンジリン酸コリン配糖体の製造量の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１８＞に記載の組成物。
＜＜２１＞＞ 前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１９＞に記載の組成物の製造方法。
＜＜１９＞＞ 上記＜＜８＞＞～＜＜１３＞＞のいずれか１項の遺伝子組換え微生物を調製すること、及び
前記微生物を用いて組成物を製造すること、を含み、
前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が３５％以下である、
組成物の製造方法。
＜＜２０＞＞ シチジンジリン酸コリンの製造量に対するシチジンジリン酸コリン配糖体の製造量の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１８＞に記載の組成物。
＜＜２１＞＞ 前記組成物において、シチジンジリン酸コリンに対するシチジンジリン酸コリン配糖体の存在比率が０．０００５％以上３５％以下である、＜１９＞に記載の組成物の製造方法。
以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
［分析例］
実施例において、ＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体の分析は、島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを用いて以下の条件で行った。
・分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ
分析温度：５０℃
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液組成：３０ｍＭ リン酸二水素カリウム／１０％ アセトニトリル（ｐＨ３．５）
検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ
実施例において、ＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体の分析は、島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを用いて以下の条件で行った。
・分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ
分析温度：５０℃
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液組成：３０ｍＭ リン酸二水素カリウム／１０％ アセトニトリル（ｐＨ３．５）
検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ
［実施例１］ｏｐｇＨ非発現株の造成
（１）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を宿主に、ｏｐｇＨ遺伝子の破壊を行った。破壊に当たってはＫＥＩＯ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｍｏｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌ， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０．）のｏｐｇＨ破壊株のゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号１と配列番号２のプライマーを用いてｏｐｇＨの上下流を含むカナマイシン耐性遺伝子カセットを増幅させた。
（１）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を宿主に、ｏｐｇＨ遺伝子の破壊を行った。破壊に当たってはＫＥＩＯ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｍｏｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌ， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０．）のｏｐｇＨ破壊株のゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号１と配列番号２のプライマーを用いてｏｐｇＨの上下流を含むカナマイシン耐性遺伝子カセットを増幅させた。
この断片を用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のｏｐｇＨ遺伝子をＬａｍｂｄａ－Ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ ＢＬ （２０００） Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：６６４０－６６４５）を用いて破壊した。具体的にはｐＫＤ４６プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、この株をアラビノース存在下で培養することでｐＫＤ４６上のλファージ由来組換え酵素を発現させ、エレクトロポレーションでｏｐｇＨ上下領域を含むカナマイシン耐性遺伝子カセットを導入し、カナマイシン存在下で選抜することでｏｐｇＨ破壊株を得た。得られたｏｐｇＨ破壊株を３７℃で培養してｐＫＤ４６を脱落させることに拠り、ｏｐｇＨ遺伝子が欠損され、ｏｐｇＨが発現しないｏｐｇＨ非発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ）を得た。
［実施例２］ｏｐｇＨ発現プラスミドの造成
大腸菌のｏｐｇＨ遺伝子（配列番号３）を発現させるプラスミドを、以下の手順で作製した。
大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号４と配列番号５のプライマーを用いて増幅させることでｏｐｇＨ遺伝子断片を得た。
次にプラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を鋳型にして、配列番号６と配列番号７のプライマーにてＰＣＲを行った。得られた断片と先ほど調整した大腸菌ｏｐｇＨ遺伝子断片を用い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨを得た。
大腸菌のｏｐｇＨ遺伝子（配列番号３）を発現させるプラスミドを、以下の手順で作製した。
大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号４と配列番号５のプライマーを用いて増幅させることでｏｐｇＨ遺伝子断片を得た。
次にプラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を鋳型にして、配列番号６と配列番号７のプライマーにてＰＣＲを行った。得られた断片と先ほど調整した大腸菌ｏｐｇＨ遺伝子断片を用い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨを得た。
［実施例３］ｏｐｇＨ非発現株とｏｐｇＨ発現株の造成
実施例１で得られたｏｐｇＨ非発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ）に対し、一方の株にはコントロールとして空ベクターであるｐＥＴ２１ａを用い、もう一方の株には実施例２で造成したｏｐｇＨ発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨ）を用い、エレクトロポレーションにより形質転換しアンピシリンで選抜することに拠り、空ベクター導入済みのｏｐｇＨ非発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ ／ｐＥＴ２１ａ）と、ｏｐｇＨ発現プラスミド導入によるｏｐｇＨ発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ ／ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨ）を得た。
実施例１で得られたｏｐｇＨ非発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ）に対し、一方の株にはコントロールとして空ベクターであるｐＥＴ２１ａを用い、もう一方の株には実施例２で造成したｏｐｇＨ発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨ）を用い、エレクトロポレーションにより形質転換しアンピシリンで選抜することに拠り、空ベクター導入済みのｏｐｇＨ非発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ ／ｐＥＴ２１ａ）と、ｏｐｇＨ発現プラスミド導入によるｏｐｇＨ発現株（ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｏｐｇＨ：：ｋａｎ ／ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨ）を得た。
［実施例４］ｏｐｇＨ発現有無によるＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体量への影響の評価
上記ＢＬ２１（ＤＥ３）ｏｐｇＨ：：ｋａｎ／ｐＥＴ２１ａ並びにＢＬ２１（ＤＥ３）ｏｐｇＨ：：ｋａｎ／ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨをアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ］５ｍｌの入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。該培養液をアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含むＴＢ＋Ｇｌｃ培地（バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．３１ｇ／Ｌ、リン酸一水素二カリウム１２．５４ｇ／Ｌ）５０ｍｌの入ったバッフル付三角フラスコに５００μＬ接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで２４時間培養した。培養開始から２時間後に、ＩＰＴＧを終濃度が０．１ｍＭとなるよう添加した。該培養液５０ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。各菌株の培養液各５０ｍｌ分を、懸濁バッファー（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））５ｍｌに懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後、５，８００×ｇで１０分間遠心し、未破砕菌体を沈殿させた後、上清を採取した。上清はブラッドフォード法を用いて蛋白量を定量し、反応に用いた。
上記ＢＬ２１（ＤＥ３）ｏｐｇＨ：：ｋａｎ／ｐＥＴ２１ａ並びにＢＬ２１（ＤＥ３）ｏｐｇＨ：：ｋａｎ／ｐＥＴ２１ａ－ｏｐｇＨをアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ］５ｍｌの入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養した。該培養液をアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含むＴＢ＋Ｇｌｃ培地（バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／Ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．３１ｇ／Ｌ、リン酸一水素二カリウム１２．５４ｇ／Ｌ）５０ｍｌの入ったバッフル付三角フラスコに５００μＬ接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで２４時間培養した。培養開始から２時間後に、ＩＰＴＧを終濃度が０．１ｍＭとなるよう添加した。該培養液５０ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。各菌株の培養液各５０ｍｌ分を、懸濁バッファー（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））５ｍｌに懸濁し、超音波破砕を行った。破砕後、５，８００×ｇで１０分間遠心し、未破砕菌体を沈殿させた後、上清を採取した。上清はブラッドフォード法を用いて蛋白量を定量し、反応に用いた。
終濃度１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（富士フィルム和光純薬社製）、１０ｍＭのＣＤＰ－コリン（協和発酵バイオ社製）、１０ｍＭのＵＤＰ－グルコース（シグマアルドリッチ社製）、を含む反応液に前述した上清蛋白質液を可溶蛋白質の合計が終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３０℃で静置することによって反応を行った。反応開始後１６時間が経過した時点で９９℃１０分加熱することで反応を停止し、ＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－コリン配糖体の量を島津製作所社製の分析装置ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを用いて[分析例]に記載の方法で分析した。
結果を表１に示す。表１に示される通り、ｏｐｇＨ発現株によって、ＣＤＰ－コリン配糖体がＣＤＰ－コリンから生成することが示された。一方で、ｏｐｇＨが破壊された株ではＣＤＰ－コリン配糖体の生成は見られなかった。
したがって、微生物に大腸菌酵素であるｏｐｇＨを発現することによってＣＤＰ－コリンはＵＤＰ－グルコースから糖転移されることで配糖化されてＣＤＰ－コリン配糖体が生成し、微生物がｏｐｇＨを発現していないことでＣＤＰ－コリン配糖体の生成は抑制されることが明らかになった。この知見はＣＤＰ－コリン配糖体の生成や抑制に寄与するものと考えられる。
［実施例５］ＣＤＰ－コリン製造におけるｏｐｇＨ非発現株の利用
大腸菌を宿主とし、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０１： ２０１７， １４０９－１４１７等に記載の公知の方法に基づいて、ＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物を製造する。本ＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物はｏｐｇＨ発現株である。本微生物を宿主として用い、ｏｐｇＨの活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物である、ｏｐｇＨ非発現株を造成する。このｏｐｇＨ非発現株を培養し、培養終了後の培養液を分析すると、ＣＤＰ－コリンの生産及び、ＣＤＰ－コリン配糖体の生成が抑制されることを確認できる。
ｏｐｇＨ発現株を用いた場合、製造したＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は３６％であるが、ｏｐｇＨ非発現株を用いた場合、ＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は０％となる。
また別の実施形態においては、ｏｐｇＨ発現株を用いた場合、製造したＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は４．３％であるが、ｏｐｇＨ非発現株を用いた場合、ＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は０％となる。
大腸菌を宿主とし、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０１： ２０１７， １４０９－１４１７等に記載の公知の方法に基づいて、ＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物を製造する。本ＣＤＰ－コリンの生産能を有する微生物はｏｐｇＨ発現株である。本微生物を宿主として用い、ｏｐｇＨの活性が低下又は欠失した遺伝子組換え微生物である、ｏｐｇＨ非発現株を造成する。このｏｐｇＨ非発現株を培養し、培養終了後の培養液を分析すると、ＣＤＰ－コリンの生産及び、ＣＤＰ－コリン配糖体の生成が抑制されることを確認できる。
ｏｐｇＨ発現株を用いた場合、製造したＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は３６％であるが、ｏｐｇＨ非発現株を用いた場合、ＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は０％となる。
また別の実施形態においては、ｏｐｇＨ発現株を用いた場合、製造したＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は４．３％であるが、ｏｐｇＨ非発現株を用いた場合、ＣＤＰ－コリンの量に対するＣＤＰ－コリン配糖体の存在比率は０％となる。
すなわち、シチジン残基含有化合物の製造において、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質であるｏｐｇＨの活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失した株において、シチジン残基含有化合物の配糖体の生成を抑制できることが示される。
これにより、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失した株を用いることで、ＣＤＰ－コリンを効率的に製造できることが示される。
これにより、シチジン残基含有化合物に糖ヌクレオチドから糖を転移する活性を有する蛋白質の活性が親株の該活性に比べて低下又は欠失した株を用いることで、ＣＤＰ－コリンを効率的に製造できることが示される。
［実施例６］ＣＤＰ－コリン配糖体の構造解析
実施例４に記載の方法を参考にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させ、分析例に示す分析方法に従いＨＰＬＣで分離し精製を行った。なおその際のＨＰＬＣの保持時間から、分析を行う化合物をＲＴ２２と命名した。
実施例４に記載の方法を参考にＣＤＰ－コリン配糖体を生成させ、分析例に示す分析方法に従いＨＰＬＣで分離し精製を行った。なおその際のＨＰＬＣの保持時間から、分析を行う化合物をＲＴ２２と命名した。
後述する直接導入―質量分析（ＤＩ－ＭＳ）及び核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）の条件を以下に記載する。
・直接導入―質量分析（ＤＩ－ＭＳ）
液体クロマトグラフ部
装置：Ｗａｔｅｒｓ製 ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ型
移動相：水：アセトニトリル＝１：１
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
・直接導入―質量分析（ＤＩ－ＭＳ）
液体クロマトグラフ部
装置：Ｗａｔｅｒｓ製 ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ型
移動相：水：アセトニトリル＝１：１
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
質量分析部
装置：Ｗａｔｅｒｓ製 ＳｙｎａｐｔＧ２－Ｓ型
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
測定モード：ポジティブモード及びネガティブモード
測定質量範囲：ｍ／ｚ ５０～１０００
装置：Ｗａｔｅｒｓ製 ＳｙｎａｐｔＧ２－Ｓ型
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
測定モード：ポジティブモード及びネガティブモード
測定質量範囲：ｍ／ｚ ５０～１０００
・核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
装置：ブルカー・バイオスピン社製 ＡＶＡＮＣＥ ５００型
核種：１Ｈ、１３Ｃ
測定：１Ｄ－ＴＯＣＳＹ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴ
溶媒：重水
基準：ＴＳＰ（トリメチルシリルプロパン酸）を０ｐｐｍ（内部標準）とした
周波数：５００ＭＨｚ
装置：ブルカー・バイオスピン社製 ＡＶＡＮＣＥ ５００型
核種：１Ｈ、１３Ｃ
測定：１Ｄ－ＴＯＣＳＹ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＤＥＰＴ
溶媒：重水
基準：ＴＳＰ（トリメチルシリルプロパン酸）を０ｐｐｍ（内部標準）とした
周波数：５００ＭＨｚ
６－１．分子式の推定
ＲＴ２２の分子式を調べるため、直接導入―質量分析（ＤＩ－ＭＳ）を行った。その結果、ＥＳＩポジティブモード及びＥＳＩネガティブモードにて検出されたイオン（ｍ／ｚ ６５１及びｍ／ｚ ６４９）の制す質量差が２であったことより、前者がプロトン付加分子（［Ｍ＋Ｈ］＋）、後者が脱プロトン分子（［Ｍ－Ｈ］－）と推定された。プロトン付加分子及び脱プロトン分子からのＨの差分を考慮し、分子式はＣ２０Ｈ３６Ｎ４Ｏ１６Ｐ２と推定された。
ＲＴ２２の分子式を調べるため、直接導入―質量分析（ＤＩ－ＭＳ）を行った。その結果、ＥＳＩポジティブモード及びＥＳＩネガティブモードにて検出されたイオン（ｍ／ｚ ６５１及びｍ／ｚ ６４９）の制す質量差が２であったことより、前者がプロトン付加分子（［Ｍ＋Ｈ］＋）、後者が脱プロトン分子（［Ｍ－Ｈ］－）と推定された。プロトン付加分子及び脱プロトン分子からのＨの差分を考慮し、分子式はＣ２０Ｈ３６Ｎ４Ｏ１６Ｐ２と推定された。
６－２．ＭＳ／ＭＳ測定による構造推定
ＲＴ２２の構造を調べるため、ＲＴ２２（分子量：６５０）及びシチコリン（分子量：４８８）のＭＳ／ＭＳ分析を行った。その結果、ｍ／ｚ ４８９以下のプロダクトイオンのパターンが類似していることから、ＲＴ２２はシチコリン骨格を有していることが示唆された。また、ｍ／ｚ ４８９及びｍ／ｚ ６５１の質量差１６２を組成推定した結果、Ｃ６Ｈ１０Ｏ５が候補に挙がったことから、ＲＴ２２はシチコリン骨格に、単糖が付加した構造と推定された。
ＲＴ２２の構造を調べるため、ＲＴ２２（分子量：６５０）及びシチコリン（分子量：４８８）のＭＳ／ＭＳ分析を行った。その結果、ｍ／ｚ ４８９以下のプロダクトイオンのパターンが類似していることから、ＲＴ２２はシチコリン骨格を有していることが示唆された。また、ｍ／ｚ ４８９及びｍ／ｚ ６５１の質量差１６２を組成推定した結果、Ｃ６Ｈ１０Ｏ５が候補に挙がったことから、ＲＴ２２はシチコリン骨格に、単糖が付加した構造と推定された。
６－３．核磁気共鳴分析
ＲＴ２２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを評価したところ、下記の構造が推定された。
ＲＴ２２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを評価したところ、下記の構造が推定された。
１Ｄ－ＴＯＳＣＹスペクトルの結果から、単糖の１位と支持されるシグナルを選択励起したところ、２～６位と推定されるシグナルを検出し、単糖の存在が支持された。また、単糖以外のシグナルについて解析を行った結果、シチコリン骨格として矛盾はなかった。
また、ＨＭＢＣスペクトルにおける遠隔相関の解析を行ったところ、単糖のシグナルＡと、シチコリン骨格のシグナルＢとの間に遠隔相関があり、数結合以内で結合していることが示唆され、結合は以下と推定された。
また、ＨＭＢＣスペクトルにおける遠隔相関の解析を行ったところ、単糖のシグナルＡと、シチコリン骨格のシグナルＢとの間に遠隔相関があり、数結合以内で結合していることが示唆され、結合は以下と推定された。
1H-NMR(D2O)δppm:δ = 8.10 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.26 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.22 (1H, d, J = 4.5 Hz), 4.66 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.54 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.49 (1H, t, J = 5.0 Hz), 4.45-4.15 (5H, m), 3.80-3.60 (4H, m), 3.55-3.30 (4H, m), 3.23 (9H, s)
13C-NMR(D2O) δppm:164.7, 154.8, 146.5, 106.0, 98.8, 91.0, 85.9, 84.8, 78.9, 78.4, 76.1, 72.2, 71.8, 68.9, 67.5, 63.4, 62.9, 56.9
ESI+MS m/z 651([M+H]+)
ESI-MS m/z 649([M-H]-)
ESI+MS m/z 651([M+H]+)
ESI-MS m/z 649([M-H]-)
当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇内において、各種の変更例又は修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。また、発明の趣旨を逸脱しない範囲において、上記実施の形態における各構成要素を任意に組み合わせてもよい。
なお、本出願は、２０２４年４月８日出願の日本特許出願（特願２０２４－０６２２２４に基づくものであり、その内容は本出願の中に参照として援用される。
配列番号１：ｏｐｇＨ破壊用断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２：ｏｐｇＨ破壊用断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨの塩基配列（アクセッションNo.: CP081489.1 2449812-2452352）
配列番号４：ｏｐｇＨ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５：ｏｐｇＨ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号６：ｐＥＴ２１ａ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号７：ｐＥＴ２１ａ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨのアミノ酸配列（アクセッションNo.: WP_001295445.1）
配列番号９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰの塩基配列（アクセッションNo.: NC_000964.3 2306514-2307662）
配列番号１０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰのアミノ酸配列（アクセッションNo.: NP_390075.1）
配列番号２：ｏｐｇＨ破壊用断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨの塩基配列（アクセッションNo.: CP081489.1 2449812-2452352）
配列番号４：ｏｐｇＨ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５：ｏｐｇＨ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号６：ｐＥＴ２１ａ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号７：ｐＥＴ２１ａ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号８：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来ｏｐｇＨのアミノ酸配列（アクセッションNo.: WP_001295445.1）
配列番号９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰの塩基配列（アクセッションNo.: NC_000964.3 2306514-2307662）
配列番号１０：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＵｇｔＰのアミノ酸配列（アクセッションNo.: NP_390075.1）
Claims (3)
- 下記一般式（１）で示されるシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
- 前記シチジンジリン酸コリン配糖体が、下記一般式（２）で示されるシチジンジリン酸コリングルコース配糖体である、請求項１に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体又はその溶媒和物。
- 請求項１又は２に記載のシチジンジリン酸コリン配糖体、その塩、そのＮ－オキシド体及びその溶媒和物の少なくとも１つを含有する組成物。
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