JP7821773B2 - タンパク質発現を改善する方法 - Google Patents

Description

本開示は、目的のポリペプチドを発現する改善型の方法に関する。免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列と、イントロン欠失とを含む核酸は、免疫グロブリンの細胞比生産性を向上させるのに有用である。

ＤＮＡは、イントロン及びエクソンの配列で構成され、イントロンはスプライシングによるｍＲＮＡプロセシング中に除去される。このプロセスは、核膜孔複合体を通過するｍＲＮＡ核外輸送と密接に関連している。この輸送は発現の基本であり、文献に詳細に記載されている。非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照されたい。

発現ベクター中にコードされたコドン最適化重鎖定常領域内にイントロンが存在すると、この領域にイントロンが存在しない同じヌクレオチド配列と比較して、回収力価（ｈａｒｖｅｓｔ ｔｉｔｅｒ）が向上することが認められている。しかしながら、イントロンを含有する発現ベクターを使用することに伴うリスクは、抗体又は免疫グロブリンなどの目的のタンパク質の発現中に、イントロン保持（ｉｎｔｒｏｎ－ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）現象及びミススプライシング現象が発生し、精製中に除去する必要のある不所望な異常型タンパク質種が得られる可能性があることである。これは精製プロセスに余分な複雑性を追加し、下流プロセスの間にこれらの別の種を除去することができない場合、バッチ間変動が生じる可能性がある。

重鎖定常領域のイントロンを含有する非コドン最適化配列を使用すると、重鎖定常領域中のスプライスバリアントの発生を排除することができることが示されている。コドン最適化から発生するヌクレオチド配列の変化は、隠れたスプライシングを誘導してこのような別の種をもたらすと考えられる。また、イントロンの各々を個別に除去すると（それにより、３つのイントロンのうち２つを残したままにする）、回収力価における驚くべき向上が見られることが示されている。

免疫グロブリン重鎖定常領域から１つ又は２つのイントロンを除去すると、イントロン保持現象及びミススプライシング現象のリスクを低減し、一方で免疫グロブリン発現を増加させることができる。これは結果として発現ベクターの新規な生成につながり、抗体ベースの又は免疫グロブリンベースの組換えタンパク質の産生中に異常型タンパク質種が生成されるリスクを低く抑える。

Ｋｏｈｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：７６１－７７３（２００７） Ｂｊｏｒｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２：４７－５４（２０１４） Ｒｅｅｄ，Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：３２６－３３１（２００３）

本開示は、全般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及びイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸を対象とする。

本開示はまた、免疫グロブリン重鎖定常領域の１つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸も対象とする。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している。別の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が欠失している。別の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している。

本開示はまた、免疫グロブリン重鎖定常領域の２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸も対象とする。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及びイントロン２のヌクレオチド配列が欠失している。別の態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及びイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している。

本開示はまた、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失しており、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が欠失しており、イントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列がイントロン１のヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている。

本開示はまた、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列がイントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている。

本開示はまた、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸も対象とする。

本開示はまた、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している。

一態様において、核酸は、当該核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合、免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロン配列を含有する核酸よりも高力価で免疫グロブリンを発現する。別の態様において、核酸は、当該核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン配列を含有しない核酸よりも高力価で免疫グロブリンを発現する。別の態様において、免疫グロブリン軽鎖はカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である。別の態様において、核酸はコドン最適化されている。別の態様において、発現した免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。別の態様において、発現した免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）の免疫グロブリンである。別の態様において、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

別の態様において、本開示は、本開示の核酸を含むベクター又は発現ベクターを対象とする。別の態様において、本開示は、本開示のベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。一態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及びイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域の１つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している。別の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が欠失している。別の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域の２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２が欠失している。別の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び３が欠失している。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失し、免疫グロブリン重鎖のイントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が欠失し、イントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、イントロン１～３免疫グロブリン重鎖定常領域の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている。別の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、イントロン１～３免疫グロブリン重鎖定常領域の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている。別の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している。

本開示はまた、全般的に、免疫グロブリンを産生する方法であって、当該方法は、細胞が免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクロエチド（ｎｕｃｌｏｅｔｉｄｅｓ）を含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、方法も対象とする。一態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している。

一態様において、発現した免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。別の態様において、発現した免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである。

一態様において、クローンのプールから産生された、発現した免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。別の態様において、最高発現クローンから産生された、発現した免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。

一態様において、宿主細胞は真核細胞である。別の態様において、真核細胞はＣＨＯ細胞である。

ＭＡｂ１の高速サイズ排除クロマトグラフ及び産生された免疫グロブリンバリアントの描写図を示す。 図２Ａは、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）及びコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の略図を示す。図２Ｂは、ｇＤＮＡヌクレオチド配列又はｃＤＮＡヌクレオチド配列のいずれかを用いたＭＡｂ２産生の１４日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。 図３Ａは、免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のないｇＤＮＡ、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のないｇＤＮＡ、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のないｇＤＮＡ、及びＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｇＤＮＡの略図を示す。図３Ｂは、次のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｇＤＮＡの各々を使用したＭＡｂ２産生の１３日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。 図４Ａは、次のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｇＤＮＡの各々について平均生細胞数（ＶＣＮ）（×１０^６／ｍＬ）を表すグラフを示す。図４Ｂは、次のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｇＤＮＡの各々について細胞生存率（％）を表すグラフを示す。図４Ｃは、次のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｇＤＮＡの各々について生細胞濃度積分値（ＩＶＣ）（１０^９細胞 日／Ｌ）を表すグラフを示す。図４Ｄは、次のコンストラクト：（１）免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のコドン最適化相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のないｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のないｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のないｇＤＮＡ、及び（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｇＤＮＡの各々について細胞生産性（ｑＰ）（ｐｇ／（細胞 日））を表すグラフを示す。 図５Ａは、次のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、及び（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（コドン最適化）の各々を用いたＭＡｂ２産生の１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。図５Ｂは、次のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（コドン最適化）、及び（９）ＭＡｂ３（陽性対照）の各々について平均生細胞数（ＶＣＮ）（×１０^６／ｍｌ）を表すグラフを示す。図５Ｃは、次のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（コドン最適化）、及び（９）ＭＡｂ３（陽性対照）の各々の各々について生細胞濃度積分値（ＩＶＣ）（１０^９細胞 時／Ｌ）を表すグラフを示す。図５Ｄは、次のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域からイントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（コドン最適化）、及び（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ないｇＤＮＡ（コドン最適化）の各々について細胞生産性（ｑＰ）（ｐｇ／（細胞 日））を表すグラフを示す。 図６Ａは、次のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置にイントロン３を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置に、修飾されたイントロン３ヌクレオチド配列を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３の位置にイントロン１を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（９）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロン及び野生型ＩｇＧ１を有する非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（１０）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３がなく野生型ＩｇＧ１である非コドン最適化ｇＤＮＡ、（１１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２がなく野生型ＩｇＧ１である非コドン最適化ｇＤＮＡ、及び（１２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ｇＤＮＡ及び野生型ＩｇＧ１の略図を示す。図６Ｂは、次のコンストラクト：（１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（３）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（４）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（５）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置にイントロン３を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（６）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１の位置に、修飾されたイントロン３ヌクレオチド配列を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（７）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３の位置にイントロン１を有する非コドン最適化ｇＤＮＡ、（８）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域にイントロンが一切ない非コドン最適化ｇＤＮＡ、（９）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロン及び野生型ＩｇＧ１を有する非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、（１０）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３がなく野生型ＩｇＧ１である非コドン最適化ｇＤＮＡ、（１１）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２がなく野生型ＩｇＧ１である非コドン最適化ｇＤＮＡ、及び（１２）ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ｇＤＮＡ及び野生型ＩｇＧ１を用いたＭＡｂ２産生の１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。 ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、及びＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ない非コドン最適化ｇＤＮＡの略図を示す。 ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、及びＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ない非コドン最適化ｇＤＮＡの１１日目の免疫グロブリン力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。 ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域の非コドン最適化ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び３のない非コドン最適化ｇＤＮＡ、及びＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４の免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ない非コドン最適化ｇＤＮＡの力価レベルの経時変化を表すグラフを示す。 免疫グロブリン重鎖定常領域のゲノムＤＮＡ配列の略図を示す。

本開示の理解を促進するために、複数の用語及び表現が以下に定義される。

Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「免疫グロブリン」、「抗体」及び「複数の抗体」という用語は専門用語であり、本明細書において互換的に使用することができ、抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を有する分子又は分子の複合体を指す。

抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、組換えで産生される抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、表面再構成抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖分子及び２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖のペア、細胞内抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ科抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗－抗Ｉｄ抗体を含む）、二重特異性抗体、及び多特異性抗体を挙げることができる。ある特定の態様において、本明細書に記載される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、又はＩｇＡ_２）、又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａ又はＩｇＧ_２ｂ）のものとすることができる。ある特定の態様において、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ抗体、又はそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、又はＩｇＧ_４）又はそのサブクラスである。特定の態様において、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。別の特定の態様において、抗体はヒトモノクローナル抗体であり、例えば、それは免疫グロブリンである。ある特定の態様において、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、又はＩｇＧ_４抗体である。

本明細書で使用する場合、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」という用語及び類似の用語は、抗原に対する特異性を抗体分子に付与するアミノ酸残基を含む抗体分子の部分（例えば相補性決定領域（ＣＤＲ））を指す。抗原結合領域は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、又はハムスター）及びヒトなどの任意の動物種に由来し得る。

「モノクローナル」抗体は、単一の抗原決定基又はエピトープの、高度に特異的な認識及び結合に関与する、均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル」抗体という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子及び完全長免疫グロブリン分子の両方、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル」抗体は、以下に限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物によるものを含むいくつもの方法で作製されるような抗体を指す。

「キメラ」抗体という用語は、アミノ酸配列が２種以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖双方の可変領域は、所望される特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の１つの種に由来する抗体の可変領域に相当する一方、定常領域は、その種における免疫応答を誘発することを回避するために、別の種（通常ヒト）に由来する抗体中の配列に相同である。

「ヒト化」抗体という用語は、最小限の非ヒト（例えばマウスの）配列を含有する非ヒト（例えばマウスの）抗体の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲの残基によって置き換えられている（「ＣＤＲグラフト化」）ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８））。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられている。そのヒト化抗体は、Ｆｖフレームワーク領域内での、及び／又は置き換えられた非ヒト残基内でのさらなる残基の置換によってさらに修飾されて、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を精密化し、最適化することができる。概して、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する一方、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つ若しくは３つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部分も含み得る。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９－９７３（１９９４）、及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５－９０４（１９９６）に記載されている。

「表面再構成抗体」又は「複数の表面再構成抗体」という用語は、組換えＦＶの可変領域の表面で利用可能なアミノ酸のみをヒト化することによってヒト抗体に似るように再設計されているマウス抗体を意味する。マウスのモノクローナル抗体を表面再構成してその免疫原性を低減すると、天然のフレームワーク－ＣＤＲの相互作用は保持されるため、元のモノクローナル抗体の結合力を再構成型において維持するのに有益であり得る。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するアミノ酸配列を有する抗体を意味し、そのような抗体は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して作製される。

可変領域は、典型的には抗体の一部分、一般に、軽鎖又は重鎖の一部分、典型的には成熟重鎖中のアミノ末端の約１１０～１２５アミノ酸、及び成熟軽鎖中の約９０～１１５アミノ酸を指し、これらは抗体間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性において使用される。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域中に集中しており、一方、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。いかなる特定の機序にも理論にも縛られることを望むものではないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、主に抗体と抗原との相互作用及び特異性を担うものと考えられる。ある特定の態様において、可変領域はヒト可変領域である。ある特定の態様において、可変領域は、齧歯動物又はマウスのＣＤＲ、及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の態様において、可変領域は霊長類（例えば非ヒト霊長類）の可変領域である。ある特定の態様において、可変領域は、齧歯動物又はマウスのＣＤＲ、及び霊長類（例えば非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

本明細書で使用する場合、「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、互換性があり、当技術分野で一般的な意味を有する。定常領域は、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を発揮し得る抗体部分（例えば、軽鎖及び／又は重鎖のカルボキシル末端部分）である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比較してより保存されたアミノ酸配列を有する。免疫グロブリンの「定常領域」又は「定常ドメイン」は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、又はこれらのドメインのサブセット、例えば、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有することができる。本明細書で提供されるある特定の態様において、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１ドメインを含有しない。本明細書で提供されるある特定の態様において、免疫グロブリン定常領域は、ヒンジを含有しない。本明細書で提供されるある特定の態様において、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有しない。

「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、細胞の抗体受容体及び補体のＣ１ｑ成分への結合を担う、供給源抗体の部分に相当する、又はそれに由来するポリペプチド配列を指す。Ｆｃとは「結晶性断片」を意味し、タンパク質結晶を容易に形成する抗体の断片を指す。元来タンパク質消化によって説明された異なるタンパク質断片は、免疫グロブリンタンパク質の全体的な一般構造を規定することができる。「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び任意選択によりヒンジの全て又はその一部を含有する。「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、単一のポリペプチド又は２つのジスルフィド結合したポリペプチドを指すことができる。免疫グロブリンの構造及び機能のレビューについては、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．Ｖ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７），ｐｐ．４９－１４０；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９－２１７，１９９４を参照されたい。本明細書で使用する場合、Ｆｃという用語は、天然の配列のバリアントを含む。

「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、天然の抗体の重鎖中に見られるＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に入り、それらを連結する（ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤの場合）、又はＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインの間に入り、それらを連結する（ＩｇＥ及びＩｇＭの場合）天然の上部及び中間部のヒンジアミノ酸配列を指す。ある特定の態様において、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトのものであり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含むことができる。「改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域」又は「改変免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）３０％までのアミノ酸変化（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％までのアミノ酸置換又は欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は（ｂ）約５アミノ酸長から（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸）約１２０アミノ酸長までを有する（例えば、約１０～約４０アミノ酸長又は約１５～約３０アミノ酸長又は約１５～約２０アミノ酸長又は約２０～約２５アミノ酸長を有する）野生型免疫グロブリンヒンジ領域の部分を指し、約３０％までのアミノ酸変化（例えば、約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％までのアミノ酸置換若しくは欠失又はそれらの組み合わせ）を有し、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７２３号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／００９５０９７号明細書に開示されているＩｇＧコアヒンジ領域を有する。

本明細書で使用する場合、抗体に関して使用する場合の「重鎖」という用語は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、任意の別個のタイプ、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）を指すことができ、これらはそれぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの抗体のクラスを生じ、ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、及びＩｇＧ_４を含む。

本明細書で使用する場合、抗体に関して使用する場合の「軽鎖」という用語は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、任意の別個のタイプ、例えば、カッパ（κ）又はラムダ（λ）を指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野において周知である。特定の態様において、軽鎖はヒト軽鎖である。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の多量体を指す。多量体は直鎖でも分岐鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって、天然に又は介在により修飾されているアミノ酸多量体も包含する。また、例えばアミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）及び当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義の範囲に含まれる。当然のことながら、本発明のポリペプチドは抗体をベースとしているため、ある特定の態様において、ポリペプチドは一本鎖又は会合鎖として存在することができる。

本明細書で使用する場合、「核酸」、「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又は一本鎖形態若しくは二本鎖形態のそれらの多量体を指す。特に限定しない限り、これらの用語は、基準の核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列はまた、明確に指定された配列と同様に、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換体）及び相補的配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされているｍＲＮＡと互換的に使用される。本明細書で使用する場合、「核酸」、「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体、並びにそれらの誘導体、断片及び相同体を含むものとする。

「イントロン」という用語は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡに転写され、その後、典型的にはスプライシングによってＲＮＡから除去されて、成熟型のＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを作るヌクレオチドの配列を指す。典型的には、イントロンのヌクレオチド配列は、成熟ＲＮＡには組み入れられず、イントロン配列もその部分も、典型的にはポリペプチドに翻訳も組み入れもされない。スプライス供与体及びスプライス受容体などのスプライスシグナル配列が、細胞のスプライシング機構によって使用されて、イントロンをＲＮＡから除去する。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、目的の核酸によるセグメントを含む直鎖状又は環状の核酸を指す。

「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、１つ又は複数の発現単位を含む直鎖状又は環状の核酸分子を指す。１つ又は複数の発現単位に加えて、発現ベクターはまた、～などの追加の核酸セグメントを含むこともできる。発現ベクターは、一般に、プラスミド又はウイルスのＤＮＡに由来し、又は両方の要素を含有することができる。

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、任意の種類の細胞、例えば、一次細胞、培養細胞、又は細胞株由来細胞とすることができる。特定の態様において、「宿主細胞」という用語は、核酸分子をトランスフェクトした細胞、及びそのような細胞の後代又は潜在的後代を指す。そのような細胞の後代は、例えば、後続世代において、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みにおいて生じ得る変異又は環境の影響のため、核酸分子をトランスフェクトした親細胞と同一でない場合がある。

「生細胞数」という用語は、本明細書で使用する場合、培養中に存在する生（生存）細胞の数を指す。

「細胞生存率」という用語は、本明細書で使用する場合、培養細胞がある一定の培養条件一式又は実験変動の下で生存する能力を指す。この用語はまた、本明細書で使用する場合、培養中のある特定の時間の生存細胞及び死滅細胞の全数に対して、その時間に生存している細胞の一部も指す。

「回収力価」又は「力価」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞培養物中で産生された、発現したポリペプチド又は免疫グロブリンの総量を所定の量の培地体積で除したものを指す。

「ｑＰ」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞比生産性を指し、産生された総免疫グロブリンを生細胞濃度積分値で除したものから決定される。

「ＩＶＣ」という用語は、本明細書で使用する場合、生細胞濃度積分値を指し、
によって計算され、式中、Ｘは生細胞濃度であり、Ｖは培養物の体積であり、ｔは時間である。

「単離されている」ポリペプチド、抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物は、天然には見出されない形態のポリペプチド、抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物である。単離されているポリペプチド、抗体、核酸、ベクター、細胞又は組成物は、もはや天然に見出される形態ではなくなる程度まで精製されているものが含まれる。一部の態様において、単離されている抗体、核酸、ベクター、細胞、又は組成物は実質的に純粋である。本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋な（即ち夾雑物がない）材料を指す。一部の例では、材料は少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、又は少なくとも９９％純粋である。

当然のことながら、「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」という用語は、本明細書で使用する場合、他に指示がない限り、「１つ又は複数」の挙げられた構成要素を指す。

特に指定がなく、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「又は」という用語は、包括的であると理解される。「及び／又は」という用語は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」の両方、「Ａ」及び「Ｂ」を含むものとする。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」などの語句で使用される場合、以下の態様の各々を包含するものとする：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

当然のことながら、「含む」という語とともに態様が本明細書中に記載される場合は常に、「からなる」及び／又は「から実質的になる」という用語で記載される、他の点では類似の態様も提供され、それらは本願の開示の一部である。本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」及び「有する」などは、米国及び欧州の特許法においてそれらがもつ意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。「から実質的になる」又は「実質的になる」は、同様に、米国及び欧州の特許法に基づく意味を有する。当然のことながら、米国特許法に関する限り、その用語はオープンエンドであり、言及されていることの基本的又は新規な特徴が、言及されていることを超える存在によって変化させられない限り、言及されていることを超える存在が許容されるが、従来技術の態様は除外される。以下もまた当然のことながら、欧州特許法に関する限り、「から実質的になる」又は「実質的に含む」の使用は、特定のさらなる構成要素、即ち、化合物又は組成物の本質的特徴に実質的に影響しないものが存在することができることを意味する。

本明細書で使用する場合、「約」及び「およそ」という用語は、数値又は数範囲を修飾するために使用される場合、その値又は範囲の５％上まで又は５％下までの偏差が、記載された値又は範囲の意図される意味の内に留まることを示す。

ＩＩ．免疫グロブリンをコードする核酸
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含有し、それらは一緒になって免疫グロブリンを形成する。免疫グロブリン軽鎖は可変軽鎖を有し、これはエピトープへの結合を助ける可変軽鎖領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。免疫グロブリン軽鎖はまた、軽鎖定常領域も含有する。ＩｇＧ軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかとすることができる。

免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖を有し、これはエピトープへの結合を助ける可変重鎖領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。免疫グロブリン重鎖はまた、重鎖定常領域も含有する。ＩｇＧ重鎖定常領域中に、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）及びヒンジ領域がある。

ヒトＩｇＧ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、３つのイントロンを含有する（図１０を参照）。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中のイントロン１は、ＣＨ１領域をコードするエクソンとヒンジ領域をコードするエクソンとの間に位置している。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中のイントロン２は、ヒンジ領域をコードするエクソンとＣＨ２領域をコードするエクソンとの間に位置している。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域中のイントロン３は、ＣＨ２領域をコードするエクソンとＣＨ３領域をコードするエクソンとの間に位置している。

イントロンは、核膜孔複合体を通過するｍＲＮＡ核外輸送に関連していることが知られている。概括的には、Ｋｏｈｌｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：７６１－７７３（２００７）；Ｂｊｏｒｋ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２：４７－５４（２０１４）；Ｒｅｅｄ，Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：３２６－３３１（２００３）を参照されたい。したがって、組換え免疫グロブリン産生のための核酸を調製する場合、内因性イントロンは通常切除されない。なぜなら、イントロンを有する核酸は、通常、対応するｃＤＮＡバージョンと比較して免疫グロブリン産生力価を増加させるからである。例えば、図２を参照されたい。

ヒトＩｇＧ重鎖中に内因性イントロンを含有する核酸を用いる免疫グロブリン産生は、免疫グロブリン力価を増加させるが、イントロンは、免疫グロブリンの断片又はバリアントをもたらし得る不正確なスプライス部位を導入する可能性があり、このため産物の純度を低下させる。免疫グロブリンプール中に免疫グロブリンの断片又はバリアントが導入されると、これらの断片及びバリアントの精製において困難さが増す可能性があり、このため、精製プロセスに不当な負担がかかり、産物の純度の低下の一因となる。

一態様において、ＩｇＧ重鎖定常領域中の１つ又は２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失していると、免疫グロブリンの断片又はバリアントの産生が減少し、ＩｇＧ軽鎖をコードする適切な核酸と一緒に発現させる場合、免疫グロブリン力価の上昇が得られる。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第１のイントロンの配列を含み、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのみを含む、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域の第２のイントロンのみを含む、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域の第３のイントロンのみを含む、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域の３つの内因性イントロンのうち１つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第１のイントロンが欠失している。一部の例では、第２のイントロンが欠失している。一部の例では、第３のイントロンが欠失している。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第２及び第３のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第１及び第３のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第１及び第２のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の３つの内因性イントロンのうち２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第１及び第２のイントロンが欠失している。一部の例では、第１及び第３のイントロンが欠失している。一部の例では、第２及び第３のイントロンが欠失している。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第１のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第２のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１及び第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、ヌクレオチド配列が第３のイントロンの配列を含むが、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１及び第２のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

ある特定の態様において、本開示は、第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失し、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び／又は第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失し、第２及び／又は第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第２のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の例では、第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。ある特定の態様において、本開示は、第１及び第２のイントロンのヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域から欠失しており、第２のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、第１及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が免疫グロブリン重鎖定常領域から欠失しており、第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失し、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失し、第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で各々置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２及び／又は第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、第２のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の例では、第３のイントロンのヌクレオチド配列が、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されており、第１及び第３のイントロンの配列が欠失していない、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されており、第１及び第２のイントロンの配列が欠失していない、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されており、第１のイントロンの配列が欠失していない、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられており、第１及び／又は第２のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。一部の例では、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられており、第１及び／又は第３のイントロンの配列が欠失している、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。

上記の態様のいずれかにおいて、免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させることもできる。一部の例では、免疫グロブリン軽鎖はカッパ軽鎖である。一部の例では、免疫グロブリン軽鎖はラムダ軽鎖である。

上記の態様のいずれかにおいて、核酸は、当該核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合、重鎖定常領域中の全てのイントロン配列を含有する核酸よりも高力価で免疫グロブリンを発現する。

上記の態様のいずれかにおいて、核酸は、当該核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合、重鎖定常領域にイントロン配列を含有しない核酸よりも高力価で免疫グロブリンを発現する。

上記の態様のいずれかにおいて、核酸はコドン最適化されていない。上記の態様のいずれかにおいて、核酸はコドン最適化されている。

上記の態様のいずれかにおいて、発現された免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。

上記の態様のいずれかにおいて、発現された免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである。

本開示の核酸は、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態とすることができる。ＤＮＡはゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡを含み、二本鎖又は一本鎖とすることができ、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖とすることができる。一部の態様において、核酸はもう１つの内因性イントロンを欠くＤＮＡである。

一部の態様において、核酸は非天然のヌクレオチドを含む。一部の態様において、核酸は組換えで産生される。

ある特定の態様において、核酸は単離されている。

ＩＩＩ．細胞及びベクター
本明細書に記載される核酸を含むベクター及び細胞もまた提供される。

ある特定の態様において、免疫グロブリンをコードする本明細書に記載される核酸を発現する（例えば、組換えにより）発現ベクターを含む細胞（例えば宿主細胞）が、本明細書において提供される。宿主細胞、例えば哺乳動物の宿主細胞中での組換え発現のための免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクター（例えば発現ベクター）が、本明細書において提供される。免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を組換えにより発現するためのそのようなベクターを含む宿主細胞もまた、本明細書において提供される。

免疫グロブリンの組換え発現は、本明細書に記載される免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する発現ベクターを必要とする。一部の態様において、ベクターは、免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含有する、本明細書に記載される核酸を含む。一部の態様において、宿主細胞はベクターを含む。本開示はまた、本明細書に記載される核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセット又は発現カセットの形態のコンストラクトも提供する。一部の態様において、ベクターは、発現ベクター、宿主細胞中で組換え免疫グロブリン産生を助けるための追加のヌクレオチド配列（例えばプロモーター）である。

発現ベクターは、従来技術によって細胞（例えば宿主細胞）に導入することができ、その後、得られた細胞は、従来技術によって培養されて、本明細書に記載される免疫グロブリンを産生することができる。したがって、宿主細胞中でのそのような配列の発現のためのプロモーターに操作可能に連結される、本明細書に記載される免疫グロブリン又はそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が、本明細書において提供される。

ある特定の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載される免疫グロブリンの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含有する。ある特定の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載される免疫グロブリンのポリペプチドの全てをコードする核酸を含む複数の異なるベクターを含有する。

ベクター又はベクターの組み合わせは、相互作用して本明細書に記載される免疫グロブリンを形成する２つ以上のポリペプチドをコードする核酸：例えば、重鎖をコードする第１の核酸及び軽鎖をコードする第２の核酸を含むことができる。２つの別個のベクター中で２つのポリペプチドが核酸によってコードされている場合、それらのベクターは同じ宿主細胞中にトランスフェクトすることができる。

種々の宿主－発現ベクター系が、本明細書に記載される免疫グロブリン又はそのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域；重鎖又は軽鎖）を発現するために利用され得る。そのような宿主－発現系は、目的のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルであるか、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換された場合、又はそれをトランスフェクトされた場合に、本明細書に記載される免疫グロブリン又はそのポリペプチドを原位置で発現することができる細胞でもある。これらには、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクトされた細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターをトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロミセス・ピキア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、若しくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えばコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などの緑藻類）；又は哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１又はＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、及びＢＭＴ１０の各細胞）が含まれるが、それらに限定されない。

本明細書に記載される免疫グロブリン又はそのポリペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域；重鎖又は軽鎖）が、組換え発現によって産生されると、それは、当技術分野において公知の任意の抗体の精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡの後の特定の抗原に対する親和性によるアフィニティークロマトグラフィー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性差により、又は任意の他の標準的なタンパク質の精製技術により、精製することができる。さらに、本明細書に記載される抗体は、精製を容易にするための、本明細書に記載される、又はそれ以外では当技術分野において公知の、異種ポリペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧタグ、ｈｉｓタグ、又はアビジン）に融合することができる。

ＩＶ．免疫グロブリンの産生
免疫グロブリンは、当技術分野において公知の任意の免疫グロブリンの合成方法によって、例えば、組換え発現技術によって、産生することができる。本明細書に記載される方法は、他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、遺伝分析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、並びに当技術分野の技能の範囲内の関連分野における従来技術を使用する。これらの技術は、例えば、本明細書に引用されている参考文献に記載されており、文献に詳細に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７及び年次改訂版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７及び年次改訂版）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

一部の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されている核酸、及び任意選択により、本開示の免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、単離されている核酸が提供される。そのような核酸は、免疫グロブリンのＣ_Ｌを含むアミノ酸配列及び／又はＣ_Ｈを含むアミノ酸配列（例えば、免疫グロブリンの軽定常鎖及び／又は重定常鎖）をコードし得る。そのような核酸は、免疫グロブリンのＶ_Ｌを含むアミノ酸配列及び／又はＶ_Ｈを含むアミノ酸配列（例えば、免疫グロブリンの軽可変鎖及び／又は重可変鎖）をコードし得る。一部の態様において、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。一部の態様において、そのような核酸を含む宿主細胞もまた提供される。一部の態様において、宿主細胞は、（１）免疫グロブリンの軽鎖を含むアミノ酸配列及び免疫グロブリンの重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）免疫グロブリンの軽鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び免疫グロブリンの重鎖を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これらをトランスフェクトされている）。

一部の態様において、免疫グロブリンをコードする本開示の核酸を含む宿主細胞は、抗体の発現に適した条件下で培養される。本開示の核酸を使用する免疫グロブリンの組換え産生については、重鎖及び／又は軽鎖をコードする１つ又は複数の核酸が単離され、本明細書に記載される宿主細胞中でのさらなるクローニング及び／又は発現のため、１つ又は複数のベクターの中に挿入される。

ある特定の態様において、宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第２及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、当該宿主細胞は、全てのイントロン配列を含むか又はイントロン配列を含まない免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸を含む宿主細胞よりも高力価で免疫グロブリンを発現する。特定の態様において、細胞は単離されている細胞である。一部の態様において、第１のイントロンの核配列が欠失している。一部の態様において、第２のイントロンの核配列が欠失している。一部の態様において、第３のイントロンの核配列が欠失している。一部の態様において、第１及び第２のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。一部の態様において、第１及び第３のイントロンのヌクレオチド配列が欠失している。一部の態様において、第２のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の態様において、第３のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置換されている。一部の態様において、第２のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。一部の態様において、第３のイントロンのヌクレオチド配列は、第１のイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。ある特定の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第３のイントロンのヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。ある特定の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第２のイントロンのヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域の第１のイントロンのヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている。一部の態様において、免疫グロブリン重鎖定常領域中の第１のイントロンのヌクレオチド配列が欠失してもいる。

上記の態様のいずれかにおいて、免疫グロブリン軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である。

上記の態様のいずれかにおいて、核酸はコドン最適化されている。上記の態様のいずれかにおいて、核酸はコドン最適化されていない。

上記の態様のいずれかにおいて、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。

上記の態様のいずれかにおいて、免疫グロブリンは、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである。

上記の態様のいずれかにおいて、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、クローンのプールから産生された免疫グロブリンは、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。

上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。上記の態様のいずれかにおいて、最高発現クローンから産生された免疫グロブリンは、少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する。

上記の態様のいずれかにおいて、宿主細胞は真核細胞である。上記の態様のいずれかにおいて、真核細胞はＣＨＯ細胞である。

一部の態様において、外因性核酸が細胞中に導入されている。

一部の態様において、本方法は、細胞又は宿主細胞からの免疫グロブリンを精製するステップをさらに含む。

本開示の態様は、以下の非限定的な例を参照することによってさらに規定され得る。これらの例は、本開示のある特定の抗体の調製及び本開示の抗体の使用方法を詳細に記載するものである。材料及び方法の両方に対する多くの変更が、本開示の範囲を逸脱することなくなされ得ることは、当業者には明らかであるだろう。

当然のことながら、本明細書に記載される例及び態様は、例示のみを目的とし、それに照らして様々な変形又は変更が当業者に対して示唆され、それらは本願の趣旨及び範囲に含まれることになる。

実施例１．ミススプライシングされた免疫グロブリンバリアントの特性決定
イントロンは、選択的スプライシングの調整、遺伝子発現の増強、及びｍＲＮＡの核からの輸送の制御を含む複数の分野で重要である。このため、内因性イントロンを含有する、免疫グロブリンを産生するための発現ベクター中に使用される核酸。しかしながら、これは、ミススプライシングされた免疫グロブリンバリアントをもたらす可能性があり、それは精製が困難であり得、及び／又は免疫グロブリン産物の回収力価を減少させ得る。

ＭＡｂ１の細胞培養産生は、イントロンのスプライスバリアントが原因で、３つの免疫グロブリンバリアントをもたらした。重鎖定常領域中に内因性イントロン配列を含む、各免疫グロブリンの軽鎖配列及び重鎖配列を含有する発現ベクターを、線形化し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクトした。線形化した発現ベクターのトランスフェクションは、ヌクレオフェクションによって行い、細胞のプールを生成した。線形化した発現ベクターを、ランダムな組み込みによってＣＨＯゲノム中に組み込んだ。ＭＡｂ１を発現する細胞のプールをクローン化して、その時点で適切な細胞株開発プロセスを使用してクローンを製造する細胞株を生成した。

ＣＨＯ細胞を増殖させ、ＭＡｂ１の産生を開始するように誘導した。免疫グロブリンを回収し、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を使用して免疫グロブリンを精製した。ＨＰＳＥＣ分画については、ＭＡｂ１を、ＴＳＫ－ゲルＧ３０００ＳＷ×Ｌカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）にカラム周囲温度で注入した。試料を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ硫酸ナトリウムから構成される移動相、ｐＨ６．８、流速１．０ｍＬ／分で、均一濃度で溶離した。複数回の注入から回収した画分をプールし、濃縮した後で特性決定及び分析をした。Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ，１１：１４５２－１４６３（２０１９）を参照されたい。

図１に示すように、ＨＰＳＥＣは、３つのスプライスバリアント、即ち、伸長を有する単量体免疫グロブリン、及び２つの断片を明らかにしている。伸長を有する免疫グロブリンバリアントは、免疫グロブリンのＣ末端に追加のラムダ軽鎖定常ドメインを有することが確認された。これは、重鎖のＣ末端に追加のラムダ軽鎖定常ドメインを有する選択的重鎖転写物によってもたらされた。２つの断片は、ヒンジとＣＨ２領域との間のイントロン２に関連するスプライスバリアントであると判定された。具体的には、１つの断片は、インフレームの終止コドンが原因で切断型重鎖になり、他方は、フレームシフトが起こって終止コドンを作り、切断型重鎖になる、ミススプライシング現象である。このように、免疫グロブリン断片バリアントは、免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロンによって産生される。

実施例２．免疫グロブリンスプライスバリアントを減少させるための核酸の操作
実施例１において産生される免疫グロブリン断片を排除するため、コドン最適化したｃＤＮＡヌクレオチド配列を、ＭＡｂ２の免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロンを一切なくして作製した。ｃＤＮＡバージョンは、免疫グロブリン重鎖定常領域中のイントロン２を除去し、２つの断片の産生を防止した。

しかしながら、イントロンは、ＣＨＯ細胞中でタンパク質発現を増強するために必要であることがよく知られている。したがって、ＣＨＯ細胞に、ヌクレオフェクションによって、非コドン最適化ｇＤＮＡ又はコドン最適化ｃＤＮＡをトランスフェクトしてプールを生成し、増殖させ、振盪フラスコ中で、プール流加プロセスにおけるように、免疫グロブリンを産生するように誘導した。図２Ａを参照されたい。図２Ｂは、回収力価によって示されているように、ＭＡｂ２のｃＤＮＡバージョンは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）バージョンと比較して、免疫グロブリンの産生が有意に少ないことを示す。

２つの免疫グロブリン断片バリアントは、イントロン２におけるミススプライシングの結果として生じるため、個々のイントロンを免疫グロブリン重鎖定常領域から除去し、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロンが一切ないｃＤＮＡバージョン又はｇＤＮＡバージョンと比較した。次のコンストラクトを作製し、試験した：（１）重鎖定常領域中の３つ全てのイントロンを含有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）ｃＤＮＡ（コドン最適化）、（３）イントロン１を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）イントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）イントロン３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（６）全てのイントロンを除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）。図３Ａを参照されたい。

実施例１に記載されているように、核酸を調製し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、プール段階にした。Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｃｙｔｅｎａ）を使用して、単一細胞クローンを得るためにプールをスクリーニングした。これは単一細胞を含有する液滴を３８４ウェルプレートのウェルに沈着させるものである。単一細胞沈着は、Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ（登録商標）プレートリーダー（Ｓｙｎｅｎｔｅｃ）を使用して確認される。さらなる特性決定のために最高発現クローンを選択した。最高クローンを増殖させ、各コンストラクトについて、ＭＡｂ２を産生するように誘導した。ＭＡｂ２を１３日目に回収した。図３Ｂは、ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡ（イントロンを含まない）の回収力価が最低の回収力価であったことを示す。一方、イントロン１、イントロン２、又はイントロン３のいずれかのうち１つがないｇＤＮＡのコンストラクトは、３つ全てのイントロンを含有するｇＤＮＡ、ｇＤＮＡ（イントロンを含まない）、及びｃＤＮＡの各コンストラクトと比較して、回収力価が増加した。

図４Ａ～Ｃは、平均生細胞数（ＶＣＮ）、細胞生存率、及び生細胞濃度積分値（ＩＶＣ）が、全コンストラクト間でほぼ同じであったことを示すが、図４Ｄは、力価の増加が細胞生産性（ｑＰ）の増加に由来することを明らかにしている。イントロンが免疫グロブリン発現を増加させることが知られていたため、１つのイントロンを除去すると回収力価が増加したのは意外であった。

実施例３．回収力価を増加させるための核酸の操作
ＣＨＯ細胞が免疫グロブリンを産生する能力に対する各イントロンの重要性をさらに判定するために、次のＭＡｂ２コンストラクトを作製した：（１）イントロン２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１及び２を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）イントロン２及び３を除去したｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（４）イントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。コドン最適化したヌクレオチド配列を使用することの重要性を判定するために、コドン最適化した配列を使用すること以外は同じのコンストラクトの一式を作製した。

実施例２のように、コンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。同様に、実施例２のように、ＣＨＯ細胞を増殖させ、次いで免疫グロブリン産生の誘導を行った。１１日目に免疫グロブリン産物を回収し、回収力価、ｑＰ、ＶＣＮ、及びＩＶＣを全て決定した。図５Ａは、ヌクレオチド配列がコドン最適化されたか否かにかかわらず、イントロン２のないｇＤＮＡ並びにイントロン２及び３のないｇＤＮＡから産生された免疫グロブリンの回収力価が最も高かったことを明らかにしている。しかし、イントロン１及び２のないｇＤＮＡは、イントロンが一切ないｇＤＮＡと力価レベルが類似していた。図５Ｂ及び５Ｃは、各々についてＶＣＮ及びＩＶＣがほぼ同じであることを示す。しかし、細胞生産性（ｑＰ）は、イントロン２のないｇＤＮＡ並びにイントロン２及び３のないｇＤＮＡが、最も生産性が高かったことを明らかにした。図５Ｄを参照されたい。これは、イントロン１が、免疫グロブリンの産生の増加に重要であることを示唆する。

免疫グロブリンの産生の増加に対するイントロン１の重要性をさらに理解するために、複数の新規なＭＡｂ２コンストラクトを作製した。上記で作製した非コドン最適化コンストラクト（即ち、全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン２のないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、イントロン２及び３のないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及びイントロン１及び２のないｇＤＮＡ（非コドン最適化））に加えて、次のコンストラクトを作製した：（１）イントロン１の位置に移動したイントロン３を有し、イントロン１及び２が欠失しているｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１の位置に移動したイントロン３を有し、イントロン３のヌクレオチド配列は、イントロン配列に１ヌクレオチドの変化を作ることによって５’スプライス供与部位の強度を増すように修飾されており、イントロン１及び２が欠失している、ｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（３）イントロン３の位置に移動したイントロン１を有し、イントロン２及び３が欠失している、ｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（４）イントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（５）野生型ＩｇＧ１及び全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（６）野生型ＩｇＧ１を有し、イントロン２及び３がないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（７）野生型ＩｇＧ１を有し、イントロン１及び２がないｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（８）野生型ＩｇＧ１を有し、イントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。図６Ａを参照されたい。

実施例１に記載されているように、これらのコンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。実施例１に記載されているように、ＣＨＯ細胞を増殖させ、免疫グロブリンを産生するように誘導した。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定した。図６Ｂは、イントロン１をイントロン３の位置に移動させると、全てのイントロンを有するｇＤＮＡ及びイントロン１のみを有するｇＤＮＡと類似の回収力価をもたらすことを示す。図６Ｂはまた、３つ全てのイントロンを含有するコンストラクトと類似の力価を維持することにおけるイントロン１の効果は、型が野生型ＩｇＧ１であるか半減期延長ＩｇＧ１であるかには影響されないことも確証している。

実施例４．回収力価の増加があるかどうかを判定するための、追加の免疫グロブリンにおける核酸の操作
ＭＡｂ２において見られる結果が、当該免疫グロブリンに特異的であるのかどうかを判定するために、追加の免疫グロブリン分子が試験される。図７は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３、及びＭＡｂ４について作製された異なるコンストラクトを示す。各免疫グロブリンについて、次のコンストラクトを作製した：（１）全てのイントロンを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン１のみを有するｇＤＮＡ（非コドン最適化）、及び（３）イントロンが一切ないｇＤＮＡ（非コドン最適化）。ＭＡｂ２及びＭＡｂ３は、カッパ軽鎖を含有し、ＭＡｂ１及びＭＡｂ４はラムダ軽鎖を含有する。ラムダ軽鎖は、可変軽鎖と定常軽鎖との間に異なるイントロンを有し、異なるｐｏｌｙＡ尾部を有する。実施例１に既に記載されているようにこれらのコンストラクトを作製した。実施例２に記載されているように、これらのコンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトしてプールを生成した。実施例２に記載されているように、ＣＨＯ細胞を増殖させ、免疫グロブリンを産生するように誘導した。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定した。

図８は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ１、及びＭＡｂ４の重鎖定常領域にイントロン１のみが存在すると、重鎖定常領域の全てのイントロンを有する各コンストラクトと比較して、類似の免疫グロブリン力価をもたらすことを示す。加えて、イントロン１のみを有するコンストラクトは、免疫グロブリン重鎖定常領域中にイントロンが一切ないｇＤＮＡと比較して、力価を増加させた。さらに、図９は、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ１、及びＭＡｂ４について、重鎖定常領域の全てのイントロンを有するコンストラクト間では、重鎖定常領域中にイントロン１のみを有するコンストラクトと比較して、７日目～１１日目の免疫グロブリン力価が類似していることを示す。試験した全ての分子について、イントロンが一切ないｇＤＮＡは、重鎖定常領域中に全てのイントロンを有するコンストラクト及びイントロン１のみのコンストラクトより免疫グロブリン力価が有意に低かった。

これらのデータは、重鎖定常領域のイントロン１が、より高い免疫グロブリン力価レベルの維持において重要であることのさらなるエビデンスを提供する。さらに、このデータは、力価レベルの増加がＭＡｂ２に限定されないことを示す。さらに、免疫グロブリンのカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖の存在は、力価レベルに影響しない。

実施例５．イントロン３をイントロン１と同じサイズのイントロンで置き換えるための核酸の操作
なぜイントロン１は回収力価を増加させることができるのかを特定するために、この実施例は、その理由がイントロン１のヌクレオチド配列自体よりむしろそのサイズであることを実証することになる。ＭＡｂ２中のイントロン１は３９１ヌクレオチドであり、一方イントロン３は９７ヌクレオチドである。次のコンストラクトを作製することになる：（１）全てのイントロンを有するＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コドン最適化）、（２）イントロン２及び３がないＭＡｂ２（非コドン最適化）、（３）イントロン１及び２がないが、イントロン３中のヌクレオチドの数を、イントロン１とほぼ同じサイズに増加させているＭＡｂ２（非コドン最適化）、（４）ＭＡｂ２（非コドン最適化）であるが、イントロン１のサイズをほぼイントロン３のサイズに縮小させ、イントロン２及び３が欠失している、及び（５）イントロンが一切ないＭＡｂ２ ｇＤＮＡ（非コドン最適化）。

実施例２に既に記載されているように、これらのコンストラクトを作製することになる。実施例２に記載されているように、これらのコンストラクトをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトすることになる。実施例１に記載されているように、ＣＨＯ細胞を増殖させ、免疫グロブリンを産生するように誘導することになる。免疫グロブリンを１１日目に回収し、回収力価を決定することになる。その結果は、イントロン３のサイズを増大すると、回収力価の増加をもたらし、イントロン２及び３のないＭＡｂ２と同等になることを示すであろう。しかしながら、イントロン１のサイズを縮小すると、イントロン１及び２のないＭＡｂ２と同等の結果になるであろう。この実施例は、イントロン１のサイズが、そのヌクレオチド配列自体より重要であることを明らかにするであろう。

本発明の態様を以下の項にさらに記載する：
［項１］
免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及びイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項２］
免疫グロブリン重鎖定常領域の１つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項３］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している、上記項２に記載の核酸。
［項４］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が欠失している、上記項２に記載の核酸。
［項５］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している、上記項２に記載の核酸。
［項６］
免疫グロブリン重鎖定常領域の２つのイントロンのヌクレオチド配列が欠失している、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項７］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及びイントロン２のヌクレオチド配列が欠失している、上記項６に記載の核酸。
［項８］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及びイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している、上記項６に記載の核酸。
［項９］
免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失しており、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が欠失しており、前記イントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が前記イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項１０］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている、上記項９に記載の核酸。
［項１１］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている、上記項９に記載の核酸。
［項１２］
免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及び／又はイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項１３］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている、上記項１２に記載の核酸。
［項１４］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている、上記項１２に記載の核酸。
［項１５］
免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項１６］
免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列とほぼ同じ数のヌクレオチドを含むイントロンのヌクレオチド配列で置き換えられている、前記免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸。
［項１７］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している、上記項１５又は１６に記載の核酸。
［項１８］
前記核酸は、前記核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合、前記免疫グロブリン重鎖定常領域の全てのイントロン配列を含有する核酸よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、上記項１～１７のいずれか一項に記載の核酸。
［項１９］
前記核酸は、前記核酸を、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸と一緒に発現させた場合、前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン配列を含有しない核酸よりも高力価で免疫グロブリンを発現する、上記項１～１７のいずれか一項に記載の核酸。
［項２０］
前記免疫グロブリン軽鎖がカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である、上記項１８又は１９に記載の核酸。
［項２１］
コドン最適化されている、上記項１～２０のいずれか一項に記載の核酸。
［項２２］
前記発現した免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する、上記項１８～２１のいずれか一項に記載の核酸。
［項２３］
前記免疫グロブリンが、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである、上記項２２に記載の核酸。
［項２４］
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、上記項１～２３のいずれか一項に記載の核酸。
［項２５］
上記項１～２４のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
［項２６］
上記項１～２５のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
［項２７］
上記項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
［項２８］
上記項２６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項２９］
真核細胞である、上記項２７又は２８に記載の宿主細胞。
［項３０］
前記真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、上記項２９に記載の宿主細胞。
［項３１］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項１に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項３２］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項２に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項３３］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している、上記項３２に記載の方法。
［項３４］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が欠失している、上記項３２に記載の方法。
［項３５］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が欠失している、上記項３２に記載の方法。
［項３６］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項６に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項３７］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び２が欠失している、上記項３６に記載の方法。
［項３８］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１及び３が欠失している、上記項３６に記載の方法。
［項３９］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項９に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、イントロン１～３免疫グロブリン重鎖定常領域の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項４０］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている、上記項３９に記載の方法。
［項４１］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置換されている、上記項３９に記載の方法。
［項４２］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項１２に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、イントロン１～３免疫グロブリン重鎖定常領域の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項４３］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている、上記項４２に記載の方法。
［項４４］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン３のヌクレオチド配列が、イントロン１のヌクレオチド配列で置き換えられている、上記項４２に記載の方法。
［項４５］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項１５に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項４６］
免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、上記項１６に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１～３の全てが存在するか、又はそのいずれも存在しない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含む宿主細胞よりも高力価で前記免疫グロブリンを発現する、方法。
［項４７］
前記免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が欠失している、上記項４５又は４６に記載の方法。
［項４８］
前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、上記項３１～４７のいずれか一項に記載の方法。
［項４９］
前記免疫グロブリン軽鎖がカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である、上記項３１～４７のいずれか一項に記載の方法。
［項５０］
前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸がコドン最適化されている、上記項３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
［項５１］
前記発現した免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する、上記項３１～５０のいずれか一項に記載の方法。
［項５２］
前記発現した免疫グロブリンが、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである、上記項５１に記載の方法。
［項５３］
クローンのプールから産生された、前記発現した免疫グロブリンが、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する、上記項３１～５２のいずれか一項に記載の方法。
［項５４］
最高発現クローンから産生された、前記免疫グロブリンが、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する、上記項３１～５３のいずれか一項に記載の方法。
［項５５］
前記宿主細胞が真核細胞である、上記項３１～５４のいずれか一項に記載の方法。
［項５６］
前記真核細胞がＣＨＯ細胞である、上記項５５に記載の方法。
本発明は、本明細書に記載される特定の態様によってその範囲を限定されるものではない。実際、記載されたものだけではなく、本発明の様々な変更形態が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。

本明細書で引用されている全ての参考文献（例えば、刊行物、又は特許若しくは特許出願）は、個々の参考文献（例えば、刊行物、又は特許若しくは特許出願）があらゆる目的からその全体が参照により組み込まれると具体的且つ個別に示されているかのような場合と同程度に、あらゆる目的からその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

他の態様は以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (9)

1. 哺乳動物ＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離されている核酸であって、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン２及びイントロン３のヌクレオチド配列が欠失しており、免疫グロブリン重鎖定常領域のイントロン１のヌクレオチド配列が本来の位置から除かれ前記イントロン３のヌクレオチド配列の位置に置換されている、核酸。
2. 哺乳動物ＩｇＧ１免疫グロブリンを産生する方法であって、前記方法は、細胞が前記免疫グロブリンを発現する条件下において、培地中で哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞は、請求項１に記載の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸と、ＩｇＧ１免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸とを含み、前記宿主細胞は、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸のイントロン１～３の全てを含むか又はそのいずれも含まない免疫グロブリン重鎖をコードする核酸および免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸を含む宿主細胞よりも高力価でインタクトな免疫グロブリン重鎖を発現する、方法。
3. 前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２に記載の方法。
4. 前記免疫グロブリン軽鎖がカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖である、請求項２に記載の方法。
5. 前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸がコドン最適化されている、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記発現した免疫グロブリンが、ヒト、ヒト化、キメラ、又は表面再構成の免疫グロブリンである、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
7. クローンのプールから産生された、前記発現した免疫グロブリンが、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，５００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 最高発現クローンから産生された、前記免疫グロブリンが、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１，０００ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも１２，０００ｍｇ／Ｌの回収力価を有する、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。