JP7805009B2

JP7805009B2 - 成熟化剤

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Publication number: JP7805009B2
Application number: JP2022563840A
Authority: JP
Inventors: 健介佐久間; 寛和松本; 太郎豊田; 周平小長谷
Original assignee: Orizuru Therapeutics Inc
Current assignee: Orizuru Therapeutics Inc
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2026-01-23
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: EP4249587A1; US20230399607A1; CN116391028A; WO2022107877A1; JPWO2022107877A1; TW202237818A; EP4249587A4

Description

本発明は、多能性幹細胞からのインスリン陽性細胞集団の製造方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、サイクリン依存キナーゼ８及び／又はサイクリン依存キナーゼ１９（以下、「ＣＤＫ８／１９」と記載する場合がある）に対する阻害活性を有する因子と作用させることを特徴とするインスリン陽性細胞集団の製造方法に関する。
［発明の背景］

ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、インスリン陽性細胞や膵β細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。

これまでに、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団へと分化誘導するために様々な手法が、開発・報告されている（非特許文献１）。しかしながら、分化誘導して得られるインスリン陽性細胞集団には、目的とするインスリン陽性細胞（特に、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞等）以外にも、様々な細胞が含まれている。インスリン陽性細胞集団を糖尿病治療に応用しようとした場合、細胞集団に含まれる細胞の種類を厳密に制御することは、安全性の観点から極めて重要である。そのため、目的とする細胞をより多く含むことを可能とする新たなインスリン陽性細胞集団の分化誘導方法が切望されていた。

ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７

本発明は、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を誘導する過程において、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団にＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子（以下、「ＣＤＫ８／１９阻害剤」と記載する場合がある）を作用させることによって、インスリン陽性細胞、特に、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞、を効率的に分化誘導することができ、従来法と比べて、当該細胞をより多く含むインスリン陽性細胞集団を得ることが可能であることを見出した。

本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］インスリン陽性細胞集団を製造する方法であって、
膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む培地中で分化させることを含む、方法。
［２］前記培地がＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない、［１］の方法。
［３］前記ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ₅₀が１μＭ以上である、［１］又は［２］の方法。
［４］ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導して製造されたものである、［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化培地。
［７］ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない、［６］の培地。
［８］ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ₅₀が１μＭ以上である、［６］又は［７］の培地。
［９］ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、［６］～［８］のいずれかの培地。
本明細書は本願の優先権の基礎である２０２０年１１月２０日に出願された日本国特許出願２０２０－１９３４５４号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。

本発明によれば、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することができる。すなわち、本発明によれば、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞集団を誘導する過程において、インスリン陽性細胞、特に、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞、を効率的に分化誘導することができ、従来法と比べて、当該細胞をより多く含むインスリン陽性細胞集団を得ることができる。

図１は、膵前駆細胞集団を、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を含む分化誘導培地で処理して得られたインスリン陽性細胞集団における、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性（「ＩＮＳ＋／ＮＫＸ＋」と表示）の細胞率、及びインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性（「ＩＮＳ＋／ＮＫＸ－」と表示）の細胞率を示すグラフ図である。図２は、膵前駆細胞集団を、所定濃度のＡＬＫ５インヒビターＩＩ、又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を含む分化誘導培地で処理して得られたインスリン陽性細胞集団の、インスリン及びＮＫＸ６．１のフローサイトメトリーによる発現解析結果を示す。

１．用語
以下、本明細書において記載される用語について説明する。

本明細書において、「約」又は「およそ」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。

本明細書において、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。

本明細書において、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。

本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。

なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。

本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。

本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。

本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。

本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。

本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。

本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。

マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、本明細書において、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ－ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。

本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。

本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」又は「ＣＤＫ８／１９阻害剤」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。

本明細書において、「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１８）、種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。

本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫＩとＲＯＣＫＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ－（４－ピリジニル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（本明細書中、Ｙ－２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン（Ｈ－１１５２）、４β－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－（４－ピリジル）ベンゼン－１α－カルボアミド（Ｗｆ－５３６）、Ｎ－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）－４ＰＥＲ（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（Ｙ－３０１４１）、Ｎ－（３－｛［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ｝フェニル）－４－｛［２－（４－モルホリニル）エチル］－オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－６－メチル－２－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－ピリジン－５－カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。

ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２－［［２－［（５－ニトロ－６－アミノピリジン－２－イル）アミノ］エチル］アミノ］－４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ－８（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＴＷＳ－１１９（３－［６－（３－アミノフェニル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）及びＡＲ－ＡＯ１４４－１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３βはこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

本明細書において「血清代替物」とは、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ^TM ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ－２７サプリメント、Ｎ２－サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ－Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ－２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ－Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１～１０重量％、好ましくは０．１～２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。

２．インスリン陽性細胞集団の製造方法
本発明は、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤の存在下で分化させることを含む、インスリン陽性細胞集団を製造する方法を提供する。

ＣＤＫ８／１９阻害剤は、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団に作用して、インスリン陽性細胞、特にインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞、が富化されたインスリン陽性細胞集団を生じる。

本発明で使用する「ＣＤＫ８／１９阻害剤」は、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するものであれば特に限定されず、ＣＤＫ８／１９の機能を直接的又は間接的に阻害するあらゆる因子を使用することができる。好ましくは、本発明において「ＣＤＫ８／１９阻害剤」とは、ＣＤＫ８／１９を５０％以上阻害する因子を指す。ＣＤＫ８／１９阻害活性の有無を見る方法としては、公知の方法から選択すればよく、例えば下記に詳述する本明細書実施例１の方法が挙げられる。

本発明において「ＣＤＫ８／１９阻害剤」は従来公知のものも使用することができ、このようなＣＤＫ８／１９阻害剤は、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。例えば、ＵＳ２０１２／００７１４７７、ＷＯ２０１５／１５９９３７、ＷＯ２０１５／１５９９３８、ＷＯ２０１３／１１６７８６、ＷＯ２０１４／００３８９５８、ＷＯ２０１４／１３４１６９、ＪＰ２０１５／５０６３７６、ＵＳ２０１５／０２７４７２６、ＵＳ２０１６／００００７８７、ＷＯ２０１６／００９０７６、ＷＯ２０１６／００１６９５１、ＷＯ２０１６／０１８５１１、ＷＯ２０１６／１００７８２及びＷＯ２０１６／１８２９０４に記載される化合物のうち、ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する化合物（又はその塩）を、本発明における「ＣＤＫ８／１９阻害剤」として利用することができる。特に、上記化合物のうち、ＣＤＫ８／１９に選択的に阻害活性を有する化合物（又はその塩）を好適に利用することができる。

「ＣＤＫ８／１９阻害剤」がＡＬＫ５（ａｃｔｉｖｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ５）に対する阻害活性を有する場合には、ＣＤＫ８／１９阻害剤はＡＬＫ５に対して阻害率５０％を示すのに必要な濃度（ＩＣ₅₀値）が１μＭ以上であるものが好ましい。このようなＣＤＫ８／１９阻害剤を利用することによって、ＣＤＫ８／１９阻害剤が添加された培地が、ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さないものとすることが可能となる。「ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない」とは、培地がＡＬＫ５阻害活性を全く有さない場合を意味するだけでなく、ＡＬＫ５に対する阻害率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下である場合も含まれる。

より具体的には、本発明において利用可能なＣＤＫ８／１９阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、下記の化合物又はその塩が挙げられる。また、これらの化合物はＣＤＫ８／１９阻害活性を有する限り一又は複数の置換基を有していてもよいし、一部の部分構造（置換基、環等）が変換されていてもよい。

また、本発明において利用可能なＣＤＫ８／１９阻害剤としては、特に限定されないが、たとえば、下記に記載の化合物７～１３又はその塩を使用することができる。化合物７～１１はフリー体が好ましく、化合物１２及び１３はトリフルオロ酢酸塩が好ましい。

本発明におけるＣＤＫ８／１９阻害剤は上記に示した化合物に限定されるものではなく、ＣＤＫ８／１９のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ８／１９に結合する抗体、ドミナントネガティブＣＤＫ８／１９変異体等もＣＤＫ８／１９阻害剤として使用することができる。

上記のＣＤＫ８／１９阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成されたものを利用することができる。

本発明における「インスリン陽性細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導して得られる、インスリン陽性細胞を含む細胞集団を意味する。「インスリン陽性細胞」は、インスリンのマーカーの発現が認められることによって特徴付けられる細胞を意味する。「インスリン陽性細胞」は、ＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）のマーカーを発現していてもよく、好ましくは、インスリン及びＮＫＸ６．１の両方のマーカーが発現している細胞（すなわち、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）である。

本発明における「インスリン陽性細胞集団」は、従来公知の手法（すなわち、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ）の存在下で培養する工程を含む手法（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：１１２１－１１３３等））に従い多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン陽性細胞集団と比べて、インスリン陽性細胞、特にインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞が富化された細胞集団である。本発明のインスリン陽性細胞集団における、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の含有率は、３３％以上、好ましくは３４％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは３６％以上、特に好ましくは３７％以上である。当該含有率の上限は特に限定されないが、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である。当該含有率は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該含有率は３３％～５０％、好ましくは３４％～５０％、より好ましくは３５％～５０％、さらに好ましくは３６％～５０％、特に好ましくは３７％～５０％である。

本発明における「インスリン陽性細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤で処理することにより得ることができる。膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階という所定の分化段階にある細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤で処理することによって、インスリン陽性細胞、好ましくはインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞が富化されたインスリン陽性細胞集団を得ることができる。インスリン陽性細胞集団には、インスリン陽性細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞；グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一つのマーカーを発現する他の膵ホルモン産生細胞；Ｋｉ６７陽性細胞；ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。

本発明において「膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団」とは、膵前駆細胞集団、あるいは、内分泌前駆細胞集団であるか、又は、膵前駆細胞集団及び内分泌前駆細胞集団の両細胞集団を意味する。

本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。

本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。

本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。

「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。

「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＹａｍａｎａｋａＳ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＹａｍａｎａｋａＳ．，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（ＮａｋａｇａｗａＭ，ＹａｍａｎａｋａＳ．，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（ＯｋｉｔａＫｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０１１Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，ＯｋｉｔａＫｅｔａｌ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（ＹｕＪ．，ＴｈｏｍｓｏｎＪＡ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（ＰａｒｋＩＨ，ＤａｌｅｙＧＱ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８－３０７００７号）等も用いることができる。

このほか、公開されているすべての論文（例えば、ＳｈｉＹ．，ＤｉｎｇＳ．，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ５，５６８－５７４；ＫｉｍＪＢ．，ＳｃｈｏｌｅｒＨＲ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；ＨｕａｎｇｆｕＤ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８－３０７００７号、特開２００８－２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。

人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学のＦｆ－ＷＪ－１８株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌｉＰＳＣｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌｉＰＳＣｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。

本明細書において「膵前駆細胞集団」とは、膵前駆細胞を含む細胞集団を意味する。本明細書において、膵前駆細胞は、マーカーであるＮＫＸ６．１の発現によって特徴付けられる（すなわち、ＮＫＸ６．１陽性である）。膵前駆細胞は、さらに、ＰＤＸ－１、ＰＴＦ－１α、ＧＡＴＡ４およびＳＯＸ９の少なくとも一つのマーカーが発現していてもよい。好ましくは、膵前駆細胞は、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ－１の発現によって特徴付けられる（すなわち、ＮＫＸ６．１陽性かつＰＤＸ－１陽性である）。

一実施形態において、本発明における「膵前駆細胞集団」は、下記に詳述する多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する工程において、工程４）終了後の培養物、又は工程５）における培養物に該当する細胞集団である。

本発明における「膵前駆細胞集団」には、膵前駆細胞が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、よりさらに好ましくは７０％以上の割合で含まれる。膵前駆細胞集団には、膵前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞、インスリン陽性細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。

なお、本明細書中に記載する細胞集団中の特定の細胞の割合は、フローサイトメトリーのような細胞数を算出可能な公知の手法に基づいて求めることができる。

本明細書において「内分泌前駆細胞集団」とは、内分泌前駆細胞を含む細胞集団を意味する。本明細書において、内分泌前駆細胞は、ＣＨＧＡ、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ３の少なくとも一つのマーカーの発現、および膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ－４、ＮＫＸ２．２、Ｉｓｌｅｔ－１、ＰＤＸ－１などのマーカーが発現していてもよい。

一実施形態において、本発明における「内分泌前駆細胞集団」は、下記に詳述する多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する工程において、工程５）終了後の培養物、又は工程６）における培養物に該当する細胞集団である。

本発明における「内分泌前駆細胞集団」には、内分泌前駆細胞が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、よりさらに好ましくは７０％以上の割合で含まれる。内分泌前駆細胞集団には、内分泌前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵前駆細胞、インスリン陽性細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。

多能性幹細胞からインスリン陽性細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン陽性細胞に大きく分類することができる。

膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、多能性幹細胞をインスリン陽性細胞へと分化誘導する公知の手法を用いて得ることができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用して各目的の分化段階にある細胞集団を得ることができる：
工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
工程３）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
工程４）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
工程５）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
工程６）内分泌前駆細胞からインスリン陽性細胞へと分化誘導する。
以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。

工程１）胚体内胚葉細胞への分化
多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地、より好ましくはアクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、２２０００～１５００００細胞／ｃｍ²、好ましくは２２０００～１０００００細胞／ｃｍ²、より好ましくは２２０００～８００００細胞／ｃｍ²である。培養期間は１日～４日、好ましくは１日～３日、特に好ましくは３日である。

培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭ／１％Ｂ－２７／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭＧｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ₃／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／ＧｌｕｔａＭＡＸ^TM／アスコルビン酸／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。

アクチビンＡの培地中の濃度は、通常３０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０～１２０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
別の態様として、アクチビンＡは培地中に低用量にて、例えば、５～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５～１０ｎｇ／ｍＬの量にて含めることができる。
さらに別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬである。

ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２～５μＭ、好ましくは２～４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。

ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。

培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に０．０１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ－２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。

特定の態様では、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で１日培養した後、アクチビンＡのみを含む培地で１日毎に培地を交換しながらさらに２日培養する。あるいは、低用量のアクチビンＡの存在下、多能性幹細胞を、インスリンを０．０１～２０μＭ含む培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンを含まない培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。

工程２）原腸管細胞への分化
工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日～８日、好ましくは約４日である。

培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。

増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。

増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。

工程３）後方前腸細胞への分化
工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日～５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５～１．５μＭ、好ましくは０．３～１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。

ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。

工程４）膵前駆細胞への分化
工程３）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日～１０日、好ましくは約５日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

２次元培養の場合には、既報（Ｔｏｙｏｄａｅｔａｌ．，ＳｔｅｍｃｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５－１９７）に従い、工程３）で得られた後方前腸細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、ピペッティングにより当該液中に分散させて細胞分散液を得、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程４）の新しい培地に再播種する。

ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ～５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ～１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。

増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。

増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。

工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。

また、培地にはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤を含めても良い。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰＤＢｕ（ＰＫＣａｃｔｉｖａｔｏｒＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣａｃｔｏｖａｔｏｒＶ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬで添加する。

また、培地にはジメチルスルホキシド、及び／又はアクチビン（１～５０ｎｇ／ｍＬ）を添加してもよい。

いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ－２７サプリメント、ＩＴＳ－Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１～２０重量％、好ましくは０．１～１０重量％である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

また細胞培養は、２次元培養の場合は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｉ型コラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ－Ｄ－リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ－Ｄ－リジンでコートされた培養容器がより好ましい。

工程４）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。

工程５）内分泌前駆細胞への分化
工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程４）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液で処理し、ピペッティングすることにより当該液中に分散させて細胞分散液を得、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程５）の新しい培地に再播種する。培養期間は２日～３日、好ましくは約２日である。

培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。なお、本発明においては、工程５）にてＣＤＫ８／１９阻害剤を使用する場合、ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）は使用しなくてもよく、好ましくはＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）を使用しない。

培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。

工程５）で得られた内分泌前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。

工程６）インスリン陽性細胞への分化
工程５）で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン陽性細胞に分化誘導する。培養期間は１０日～３０日、好ましくは約１０～２０日である。

培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ₄、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。なお、本発明においては、工程６）にてＣＤＫ８／１９阻害剤を使用する場合、ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）は使用しなくてもよく、好ましくはＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）を使用しない。

培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養は、フィーダー細胞を使用しない。３次元培養の場合、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。

ＣＤＫ８／１９阻害剤による、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の処理は、当該細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤と接触させることにより行うことができる。例えば、ＣＤＫ８／１９阻害剤を添加した培地で当該細胞集団を培養することにより行うことができる。ＣＤＫ８／１９阻害剤は培地に、ＣＤＫ８／１９活性を阻害することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、１０μＭ以下、５μＭ以下、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、又は１μＭ以下の量にて含めることができる。特に、ＣＤＫ８／１９阻害剤がＡＬＫ５に対する阻害活性を有し、ＡＬＫ５に対して阻害率５０％を示すのに必要な濃度（ＩＣ₅₀値）が１μＭ以上である場合には、１μＭ未満の量にて含めることができる。ＣＤＫ８／１９阻害剤の添加量の下限は、特に限定されないが、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．３μＭ以上、０．４μＭ以上、又は０．５μＭ以上とすることができる。例えば、ＣＤＫ８／１９阻害剤の添加量は、１０μＭ以下０．１μＭ以上であり、好ましくは５μＭ以下０．１μＭ以上、より好ましくは１μＭ以下０．１μＭ以上、例えば、１μＭ未満０．１μＭ以上、である。

また、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団のＣＤＫ８／１９阻害剤の存在下における培養は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、２日以上、４日以上、８日以上、１０日以上、又は１５日以上行うことができる。ＣＤＫ８／１９阻害剤の存在下における培養は、４日以上行うことが好ましい。ＣＤＫ８／１９阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、ＣＤＫ８／１９阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。

多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理すると共に、目的の細胞集団へとさらに分化させる工程に付すことができる。ここで「ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理すると共に」とは、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理する工程と分化させる工程とを同時に行う場合、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理した後に分化させる工程に付す場合、ならびに、分化させる工程に付した後にＣＤＫ８／１９阻害剤で処理する工程に付す場合も含む。したがって、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理するのに用いる培地と細胞集団を分化させるのに用いる培地とは別々のものであってもよいし、分化させる工程に用いる培地にＣＤＫ８／１９阻害剤がさらに添加されてもよい。

本発明の一実施形態において、ＣＤＫ８／１９阻害剤は、多能性幹細胞からインスリン陽性細胞を分化誘導する工程において、工程５以降の培地、すなわち、工程５の培地、又は工程６の培地、あるいは、工程５の培地及び工程６の培地に含めて、細胞に作用させる。

本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、膵β細胞を含む細胞集団（以下、「膵β細胞集団」と記載する）に分化誘導することができる。本明細書において「膵β細胞」は、「インスリン陽性細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。膵β細胞集団には、膵β細胞に加えて、その他の細胞（例えば、インスリン陽性細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。

膵β細胞集団は、インスリン陽性細胞集団を分化・成熟させることによって、好ましくは動物生体内で分化・成熟させることによって得ることができる。

「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。

移植は、細胞集団を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、１０×１０⁴細胞個～１０×１０¹¹細胞個程度とすることができる。移植された細胞集団は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞集団、好ましくは膵β細胞集団へと分化することができ、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。

移植に際して、細胞集団は、生体適合性材料を含むゲル中に包埋して移植してもよく、例えば、生体適合性材料を含むゲル中に包埋された細胞集団をカプセル、バッグ、チャンバーなどのデバイスに封入して生体内に移植することもできる。

本明細書において「包埋」とは、生体適合性材料を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、散在させ収容することを意味する。

本明細書において「生体適合性材料」とは生体内に移植し、短期又は長期留置した場合に、顕著な免疫応答や有害な生体反応（例えば、毒性反応、凝血等）を誘導しない任意の材料を意味する。また、「生体適合性材料」は生分解性材料であることが好ましい。このような材料としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンアミン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリフマル酸プロピレン、ポリアクリル酸、ポリｅ－カプロラクトン、ポリメタクリル酸、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、キチン、キトサン、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、アルギン酸塩、アルギン酸エステル、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、フィブリン、プルラン、ラミニン、ゲラン、シリコン、ウレタン、エラスチン等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。「生体適合性材料」の表面は必要に応じて、細胞の接着を可能とする表面修飾（例えば、細胞接着用基質（コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン等）によるコーティング）や、細胞の増殖、分化や機能を制御することが知られている官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メタクリル酸基、アクリル酸基等）での改変、が施されていてもよい。特定の態様において、「生体適合性材料」として、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを好適に用いることができる。

アルギン酸塩は水溶性の塩であればよく、金属塩、アンモニウム塩等を利用することができる。例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等を好適に用いることができる。

アルギン酸エステル（アルギン酸プロピレングリコールとも称される）はアルギン酸のカルボキシル基にプロピレングルコールがエステル結合した誘導体である。

アルギン酸塩に含まれるマンヌロン酸とグルロン酸の割合（Ｍ／Ｇ比）は任意であり、一般的に、Ｍ＞Ｇである場合には柔軟性に富んだゲルを形成することができ、Ｍ＜Ｇである場合には強固なゲルを形成することができる。本発明においては、グルロン酸を１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、又は、４０～６０％の割合で含むものを利用することができる。

アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを用いたゲルの作製は、公知の手法（ＷＯ２０１０／０３２２４２、ＷＯ２０１１／１５４９４１）に準じて作製することができ、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液に架橋剤を添加してゲル化させることにより得ることができる。

アルギン酸塩又はアルギン酸エステルは溶媒中に、０．０５～１０重量％、好ましくは、０．１～５重量％、より好ましくは０．５～３重量％の量で含めることができる。溶媒はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルを溶解可能なものであればよく、水、生理食塩水等を利用することができる。

架橋剤はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液をゲル化できるものであればよく、特に限定されないが、多価の金属カチオンを利用することができる。多価の金属カチオンとしては、２価の金属カチオンが好ましく、より好ましくは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンである。架橋剤は塩の形態で利用することができ、本発明においては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウムから選択される少なくとも一つを架橋剤として利用することができる。

アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルにはナノファイバーを含めることができる。ナノファイバーは、ナノメートル領域の直径を有する天然又は合成ファイバーである。天然ナノファイバーとしては、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、キトサンなどの多糖類の一又は複数を含むものが挙げられる。合成ナノファイバーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）などが挙げられる。ナノファイバーはアルギン酸を含むゲル中に１重量％未満、例えば、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又はそれ未満の量にて含めることができる。アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲル中に含めるナノファイバーの量の下限は特に限定されないが、０．０５重量％以上、好ましくは０．１重量％以上とすることができる。

アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルへの細胞集団の包埋は任意の手段で行うことができ、特に限定されるものではないが例えば、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に細胞集団を混合し、ゲル化させることにより行うことができる。

細胞集団はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に１×１０⁴細胞～１×１０⁹細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０⁷細胞～１×１０⁸細胞／ｍＬから選択される量にて含めることができる。

細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液のゲル化は、当該溶液に架橋剤を添加して行うことができる。添加する架橋剤の量は、当該溶液に対し０．１～５重量％、例えば、０．１～１重量％、から選択される量とすることができる。ゲル化は、細胞培養や細胞移植に用いられる所定の構成及び／又は形状を有する容器内にて、あるいは当該容器に適合するゲルが得られるように設計された鋳型内で行うことができる。

あるいは、公知の手法（ＷＯ２０１０／０１０９０２）に準じてアルギン酸を含むゲルカプセルを形成することにより行われてもよい。すなわち、架橋剤の溶液に対し、細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液を滴下して行ってもよい。滴下する際のノズルの形状や滴下方法に応じて、液滴のサイズを調整することができ、ひいてはアルギン酸を含むゲルカプセルの大きさを規定することができる。滴下方法は特に限定されないが、エアスプレー法、エアレススプレー方式、静電スプレー法等の手法により行うことができる。アルギン酸を含むゲルカプセルの大きさは特に限定されないが、直径が５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、５００μｍ以下とすることができる。架橋剤溶液には、０．１～１０重量％、例えば、０．１～５重量％、から選択される量の架橋剤を含めることができる。

本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、動物生体内に移植して、動物生体内で分化させた場合にはそのまま留置して、インスリンを産生・分泌する細胞として利用することが可能である。

本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にＩ型糖尿病を治療するための細胞医薬として有用である。

また、本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、プロドラッグであってもよい。本明細書において、プロドラッグとは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞集団をいう。

本発明により得られたインスリン陽性細胞集団は、毒性（例、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性）が低く、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に対して、安全に投与することができる。

３．分化培地
本発明は、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化培地、を提供する。

本発明の分化培地は、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化誘導に用いることができる。本発明の分化培地は、上述の多能性幹細胞をインスリン陽性細胞へと分化誘導する方法における、工程５）、又は工程６）にて使用することができる。

本発明の分化培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭ／１％Ｂ－２７／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭＧｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ₃／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／ＧｌｕｔａＭＡＸ^TM／アスコルビン酸／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地に、上記ＣＤＫ８／１９阻害剤をＣＤＫ８／１９活性を阻害することが可能な任意の量にて含んでなる。培地に含まれるＣＤＫ８／１９阻害剤の量は上記定義のとおりである。

本発明の分化培地はＣＤＫ８／１９阻害剤に加えてさらに、工程５）、及び工程６）にてそれぞれ要求される増殖因子、各種阻害剤、血清代替物、抗生物質、ビタミン等のその他の因子を含む。既報（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、例えば、工程５）にて使用される培地には、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、Ｔ３、ＬＤＮ、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を所定の量にて添加することができる。また、工程６）にて使用される培地には、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質、ＺｎＳＯ₄、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｒ４２８等を所定の量にて添加することができる。

本発明の分化培地は、ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さないものである。「ＡＬＫ５阻害活性を実質的に有さない」とは、上記定義のとおりであり、ＡＬＫ５阻害活性を全く有さない場合を意味するだけでなく、ＡＬＫ５に対する阻害率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下である場合も含まれ、ＡＬＫ５阻害活性を有する化合物（例えば、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ等）が上記定義を満たす限りにおいて含まれていてもよい。

本発明の分化培地は、基本培地、ＣＤＫ８／１９阻害剤及び上記その他の因子は全て混合され一つの形態で提供されてもよいし、あるいは任意の組み合わせで、又はそれぞれ別々に複数の形態で提供され用事調製されてもよい。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＡＬＫ４阻害活性、ＡＬＫ５阻害活性、ＣＤＫ８阻害活性及びＣＤＫ１９阻害活性の評価
以下の方法により、試験化合物である、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート（化合物１）、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（化合物２（ＢＩ－１３４７））、及び、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル（化合物３（ＳｅｎｅｘｉｎＢ））のＡＬＫ４阻害活性、ＡＬＫ５阻害活性、ＣＤＫ８阻害活性及びＣＤＫ１９阻害活性を評価した。
キナーゼパネル試験にて、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＣＤＫ８、及びＣＤＫ１９の各キナーゼに対し、試験化合物を０．１μＭ、１μＭ（すなわち－Ｌｏｇ₁₀値７乗、６乗）で添加し、その結合阻害活性を０～１００％で測定した。得られた２つの値から推定ｐＩＣ₅₀を算出し、６－８の値で表示した。表中ｐＩＣ₅₀＝６とは、本測定試験において０．１μＭ、１μＭのいずれの添加濃度においても結合阻害活性が示されず、該当化合物は阻害活性を持たないか、ｐＩＣ₅₀≦６の弱い結合阻害活性しか持たないと考えられたことを意味する。同様にｐＩＣ₅₀＝８とは０．１μＭ、１μＭの結合阻害活性から求められた推定ｐＩＣ₅₀値が８以上、ｐＩＣ₅₀≧８の強い結合活性を示したことを意味する。

ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＣＤＫ８、及びＣＤＫ１９に対して阻害率５０％を示すのに必要な各試験化合物の濃度（推定ｐＩＣ₅₀値）を表３に示す。

表３より、化合物１、化合物２、及び化合物３は、ＣＤＫ８及びＣＤＫ１９を強く阻害することが確認された。

実施例２：膵前駆細胞集団をＣＤＫ８／１９阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的細胞（インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）の増加
１．方法
ｉＰＳ細胞から膵前駆細胞集団への分化誘導は、上記工程１）－４）、既報（ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７）等に従い実施した。インスリン陽性細胞への分化誘導は、上記工程５）、６）等に従い実施した。
ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団を分化因子（ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、Ｔ３、ＬＤＮ、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ２）と共に、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）、又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地（ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭ／１％Ｂ－２７／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で２日間培養して内分泌前駆細胞集団に分化誘導した。

次いで、分化因子（Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、ＦＧＦ受容体１阻害剤ＰＤ－１６６８６６）と共に、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地（ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭ／１％Ｂ－２７／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で７日間培養後、既報（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－アセチルシステイン、ＡＸＬ阻害剤Ｒ４２８、アスコルビン酸、ＲＯＣＫ阻害剤、ＺｎＳＯ４、ヘパリン、Ｔｒｏｌｏｘと共にＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）又はＣＤＫ８／１９阻害剤を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭＧｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ３／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／ＰｅｎｉｓｉｌｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地）で４日間培養してインスリン陽性細胞集団に分化誘導した。

上記方法で得られたインスリン陽性細胞集団中のインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞数、ならびにインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各細胞集団中における目的細胞、すなわちインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞率、ならびに目的外細胞、すなわちインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞率を求めた。

２．結果
ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）又はＣＤＫ８／１９阻害剤（化合物１、化合物２もしくは化合物３）を所定の濃度にて含む、又はＡＬＫ５インヒビターＩＩ及びＣＤＫ８／１９阻害剤のいずれも含まない分化誘導培地で処理した場合に得られた、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞率、及びインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞率の結果を図１に示す。また、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）、０．３μＭにて化合物１、３ｎＭにて化合物２、及び０．１μＭにて化合物３を用いた場合に得られた細胞集団のフローサイトメトリーの結果を図２に示す。

分化誘導培地にＣＤＫ８／１９阻害剤を含めた場合、目的とするインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合が、目的外であるインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性細胞の割合以上である細胞集団を製造できることが確認された。

特に、ＣＤＫ８／１９阻害剤として、０．３μＭにて化合物１、３ｎＭにて化合物２、及び０．１μＭにて化合物３を用いた場合には、従来、膵前駆細胞集団よりインスリン陽性細胞集団を分化誘導する際に一般的に用いられていたＡＬＫ５インヒビターＩＩ（１０μＭ）を用いた場合よりも、目的とするインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合が高い細胞集団を製造することができた。

ＡＬＫ５インヒビターＩＩを利用した場合、得られた細胞集団における目的とするインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合は３３％程度であった。これは培地に加えるＡＬＫ５インヒビターＩＩの濃度を３０μＭまで高めた場合であっても、その割合は同程度又はそれ以下であった（データ示さず）。

一方、膵前駆細胞集団よりインスリン陽性細胞集団を分化誘導する製造過程でＣＤＫ８／１９阻害剤の処理を行うことによって、細胞集団中の目的細胞（インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）の割合は、３３％を超えて高められることが確認された。

以上の結果より、膵前駆細胞集団よりインスリン陽性細胞集団を分化誘導する過程にある細胞集団を、ＡＬＫ５インヒビターＩＩに代えて、ＣＤＫ８／１９阻害剤で処理することによって、従来法よりも高い割合で目的細胞（インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞）を含むインスリン陽性細胞集団を製造できることが明らかとなった。

Claims

インスリン陽性細胞集団を製造する方法であって、
膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む培地中で分化させることを含む、方法。
前記培地がＡＬＫ５インヒビターＩＩを含まない、請求項１に記載の方法。
前記ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ_５０が１μＭ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導して製造されたものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、膵前駆細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の分化培地。
ＡＬＫ５インヒビターＩＩを含まない、請求項６に記載の培地。
ＣＤＫ８／１９阻害剤のＡＬＫ５に対するＩＣ_５０が１μＭ以上である、請求項６又は７に記載の培地。
ＣＤＫ８／１９阻害剤が、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、及び（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミドからなる群より選択される一又は複数である、請求項６～８のいずれか一項に記載の培地。