JP7724010B2 - ケモカイン及び腫瘍関連／特異的抗原を送達する遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス - Google Patents

Description

本開示は、少なくとも１つのケモカイン及び／又は少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原をコードする遺伝子を保有するように遺伝子操作された腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、及びの様々な腫瘍を治療するための、ＣＡＲ－Ｔ、ＢｉＴＥ及びＡＤＣを含む腫瘍標的化治療薬との併用によるその使用に関する。

血液悪性腫瘍患者へのＣＡＲ－Ｔ細胞の養子移植は驚くべき結果を示している。しかし、この方法は、固形腫瘍患者において殆ど効果がない。殆どのがんにおいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法だけで完全応答を誘導するのに十分であることは不可能なようである。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、作用機序が異なり、Ｔ細胞と相乗効果を発揮する可能性のある他のがん治療と併用することで、腫瘍の逃避を低減し、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の成功率を高める可能性がある。

腫瘍溶解性ウイルス療法は、がん細胞内で選択的に複製する天然の又は遺伝子改変ウイルスを使用してがんを治療する治療法である。ＦＤＡがタリモジンラヘルパレプベク（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、Ｔ－ＶＥＣ）（ＧＭ－ＣＳＦを発現するように改変された腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１））を承認した後、腫瘍溶解性ウイルス療法分野は新たな注目を集めている。さらに、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）をさらに改変して、治療用導入遺伝子を腫瘍微小環境に選択的に送達することによって、その抗腫瘍効果を向上させ、又は抗腫瘍免疫応答を促進することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞と、サイトカイン、ケモカイン、ＢｉＴＥ又は免疫チェックポイント阻害剤を装備した腫瘍溶解性ウイルスを併用する前臨床研究では、治療効果が向上した。例えば、ＩＬ－１５及びＲＡＮＴＥＳ又はＩＬ－２及びＴＮＦ－αを発現するように改変された腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍微小環境におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の蓄積及び生存を増加させることが示されている。ＣＸＣＲ３リガンドであるＣＸＣＬ１１を発現するワクシニアウイルスは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍内輸送を向上させるために導入後にエフェクター細胞を誘引するために使用された。別の報告では、第２の腫瘍抗原を標的とするＢｉＴＥの腫瘍溶解性アデノウイルスの発現により、抗原発現の不均一性に対処できることが実証された。ＣＡＲ－Ｔ細胞と装備されたＯＶのこれらの全ての併用は、予想通り、各薬剤による単独療法に比べて、いずれも腫瘍制御の向上及び生存期間の延長をもたらした。

腫瘍選択的送達のために、非シグナル伝達性の切断されたＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質を発現するように腫瘍溶解性ウイルスを操作した最近の研究は、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞の標的化を可能にする。ＣＤ１９ｔ（ＯＶ１９ｔ）をコードする腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで腫瘍細胞を感染させる場合、ウイルスによって媒介される腫瘍溶解よりも先に、細胞表面に新たにＣＤ１９が産生された。共培養されたＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカインを分泌し、感染した腫瘍に対して効果的な細胞溶解活性を示した。いくつかのマウス腫瘍モデルを使用すると、ＯＶ１９ｔの送達により、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞の投与後に腫瘍制御が促進された。ＯＶ１９ｔは、内因性の及び養子移植されたＴ細胞の腫瘍浸潤を特徴とする局所免疫を誘導した。ＣＡＲ Ｔ細胞によって媒介される腫瘍の死滅は死亡途上の腫瘍細胞からのウイルスの放出も誘導し、これにより腫瘍におけるＣＤ１９ｔの発現を促進した。当該研究では、この併用療法で治療したマウスの５０％以上が治愈されたが、一部のマウスは一時的に反応したか反応しなかった（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１２，ｅａａｚ１８６３（２０２０））。

ＵＳ２０１９０２３３５３６Ａ１では、それぞれが、少なくとも２つの結合ドメインを含み、ドメインの少なくとも１つが、対象となる免疫細胞、例えば、対象となるＴ細胞上の表面抗原に特異的である少なくとも２つの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）によって装備された改変アデノウイルス、特にエナデノツシレフ（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、ＥｎＡｄ）が開示された。アデノウイルスにＢｉＴＥ分子を装備すると、二重特異性抗体断片分子は、アデノウイルスのがん細胞への選択的感染能力に「便乗」することができ、これによって腫瘍細胞へのＢｉＴＥの標的化送達が可能になる。アデノウイルスに感染すると、ＢｉＴＥ分子は腫瘍細胞によって合成され、分泌されて局所的に作用し、ウイルスの直接的なフットプリントを超えて広がる。したがって、これにより、ＢｉＴＥが直接的な感染部位を超えて広がることが可能になるが、感染した腫瘍細胞巣をはるかに超えてウイルスが広がることが制限された。これにより、望ましくないオフターゲット効果のリスクが最小限に抑えられる。

本開示の第１態様は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）に関し、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）少なくとも１つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び少なくとも１つのケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、腫瘍細胞における前記ｏＨＳＶの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために少なくとも１つのケモカインが発現及び放出される。

本開示の別の態様は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）に関し、前記ｏＨＳＶのゲノムには、少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、腫瘍細胞における前記ｏＨＳＶの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示される。

本開示の別の態様は、本明細書に記載の遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）と、腫瘍標的化治療薬とを別々に含むがんの治療のための医薬キットに関し、前記腫瘍標的化治療薬は、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。

本開示の別の態様は、対象に薬学的有効量の遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）及び腫瘍標的化治療薬を同時に又は連続して投与することを含む、対象におけるがんの治療のための方法に関し、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び、好ましくは（ｂ）少なくとも１つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体、及び、好ましくは少なくとも１つのケモカインの発現は、ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。

本開示の更なる態様は、図面を参照して以下に説明される詳細な説明から得やすいのだろう。

図１は、Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３、Ｔ７２０４、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３（以下、総じて「Ｔ７シリーズ」という）のｏＨＳＶバックボーンの模式図を示す。（Ａ）Ｔ３０１１の模式図であり、Ｔ３０１１は、ｈＰＤ－１抗体（ｈＰＤ－１－Ａｂ）（免疫チェックポイント阻害剤）、及び、内部逆方向反復領域（ｂ’ａ’及びａ’ｃ’）が、ｈＩＬ－１２をコードするポリヌクレオチドによって置き換えられる、サイトカインであるｈＩＬ－１２をコードする遺伝子改変ｏＨＳＶであり、ｈＰＤ－１－Ａｂの発現カセットがＵＬ断片の遺伝子ＵＬ３とＵＬ４との間に導入される。Ｔ３０１１のより詳細な説明は、ＷＯ２０１７／１８１４２０（ＩＭＭＶ５０３）より利用でき、当該開示の全体が引用で本明細書に組み込まれる。（Ｂ）本明細書に記載の例示的なＴ７シリーズウイルスの模式図である。これらの遺伝子改変ｏＨＳＶは、ｈＰＤ－１－Ａｂ、ｈＩＬ－１２、腫瘍関連抗原及びケモカインをコードし、その内部逆方向反復領域（ｂ’ａ’及びａ’ｃ’）がｈＩＬ－１２をコードするポリヌクレオチドによって置き換えられ、ｈＰＤ－１－Ａｂの発現カセットがＵＬ断片の遺伝子ＵＬ３とＵＬ４との間に導入され、ＴＡＡ＋ケモカイン発現カセットがＵＬ断片の遺伝子ＵＬ３７とＵＬ３８との間に導入される。（Ｃ）例示的な遺伝子改変ｏＨＳＶ Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３及びＴ７２０４の模式図であり、挿入図ＢでＴＡＡ＋ケモカイン発現カセットは、１つのＴＡＡ（腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ）の切断された非シグナル伝達性の変異体）及び１つのケモカインとして具体化される。（Ｄ）例示的な遺伝子改変ｏＨＳＶ Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３の模式図であり、挿入図ＢでＴＡＡ＋ケモカイン発現カセットは、２つの異なるＴＡＡプラス１つのケモカインとして具体化され、ＴＡＡ１＋ＴＡＡ２＋ケモカインとして指定される。ＨＳＶ－ＩＥ（最初期）プロモーター、ＰｏｌｙＡ尾部は、それぞれ、発現カセットの上流、下流に位置する。 図２は、Ｔ７シリーズｏＨＳＶ（即ち、上記のＴ７０１１～Ｔ７０１３及びＴ７２０１～Ｔ７２０４）の構築のフローチャートを示す。構築は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムを利用するクローニングのいくつかのステップに関する。 図３は、２９３Ｔ、ＨＥｐ－２及びＴｃａ８１１３細胞におけるＴ７０１１感染後のＣＣＬ５の放出を示す。ＣＣＬ５の発現及び放出は速くて強力であった。感染後４時間で既に、分泌されたＣＣＬ５が検出され、最大５０００ｐｇ／ｍＬに達した。Ｔ７０１１ウイルス感染後、分泌は安定しており、少なくとも４日間保持された。これでＣＣＬ５が分泌されることが示された。 図４は、細胞表面における切断された、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２、ＨＥＲ２の発現を示す。Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３によってそれぞれコードされる異なる切断された抗原が腫瘍細胞表面上に同時に発現された。 図５は、Ｔ７シリーズ（Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３）ｏＨＳＶウイルスの抗腫瘍効果を示す。Ｔ７シリーズｏＨＳＶウイルスのＩＣ_５０値はＴ３０１１と同等であり、これは、Ｔ３０１１と比べてＴ７シリーズウイルスが同様の広範な抗腫瘍活性を備えることを示している。 図６は、Ｔ７シリーズ（Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３）ｏＨＳＶウイルスがＣＡＲ－Ｔ細胞又は正常なＴ細胞のどちらにおいても感染活性を持たないことを示す。 図７は、Ｔ７シリーズ（Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３）ｏＨＳＶウイルスがＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９細胞又は正常なＴ細胞のどちらにおいても細胞殺傷活性を持たないことを示す。 図８は、Ｔ７０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用治療で抗腫瘍効果が著しく向上されることを示す。 図９は、Ｔ７０１１ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。 図１０は、Ｔ７０１２とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用治療で抗腫瘍効果が著しく向上されることを示す。 図１１は、Ｔ７０１２ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。 図１２は、Ｔ７０１３とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用治療で抗腫瘍効果が著しく向上されることを示す。 図１３は、Ｔ７０１３ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。 図１４は、Ｔ７シリーズ（Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３）ｏＨＳＶウイルスがＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９又はＮＫ細胞のどちらにおいても細胞殺傷能力を持たないことを示す。 図１５は、ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９及びＮＫ細胞におけるＨＳＶ－１（Ｆ）及びＴ７０１１のウイルス複製を示す。 図１６は、Ｔ７０１１がＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞の増殖に対して負の影響を及ぼさないことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１７は、Ｔ７０１１がＮＫ細胞の増殖に対して負の影響を及ぼさないことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１８は、Ｔ７０１１とＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９の併用治療で抗腫瘍効果が著しく向上されることを示す。 図１９は、Ｔ７０１１ウイルス感染が、ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。

「発明の詳細な説明」
定義：
用語「一」又は「１つの」実体とは、当該実体の１つ又は複数を指すことに留意されたい。例えば、「１つの切断された非シグナル伝達性の変異体」は、１つ又は複数の切断された非シグナル伝達性の変異体を表すように理解される。したがって、用語「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」は、本明細書で入れ替えて使用することができる。

本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。構造に関わらず、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体断片」には、アプタマー、シュピーゲルマー及びダイアボディが含まれる。用語「抗体断片」には、特定の抗原と結合して複合体を形成することによって抗体のように作用するいずれの合成の又は遺伝子操作されたタンパク質も含まれる。

本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、その変異体又は誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体又はキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ））、ＶＫ又はＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されているＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含み、ただしそれらに限定されない。本開示の免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。例えば、抗ＰＤ－１抗体は、その抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片又はそのｓｃＦｖを指してもよい。

「特異的に結合する」、「に特異的な」又は「に特異性を有する」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び、当該結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の何らかの相補性を伴うことを意味する。当該定義によれば、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するのが、ランダムで無関係なエピトープに結合するよりも容易である場合に、当該抗体はエピトープに「特異的結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、特定の抗体の特定のエピトープに結合する相対的親和性を定量化するために用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも与えられたエピトープに対して高い特異性を備えると見なされる場合もあれば、抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対してよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言ってもよい。

本明細書で使用される場合、本明細書で入れ替えて使用される「がん」又は「腫瘍」とは、本開示に従って治療することができ、体の他の部位に浸潤し又は広がる可能性のある異常な細胞増殖を伴う疾患群を意味する。全ての腫瘍ががん性であるわけではなく、良性腫瘍は体の他の部位に広がらない。可能な兆候及び症状は、新たなしこり、異常な出血、長引く咳、原因不明の体重減少、排便の変化などを含む。人間に影響を与える既知のがんは１００種類以上ある。本明細書で使用される場合、「がん」は、固形がん（例えば、腫瘍）、血液悪性腫瘍を含み、ただしそれらに限定されない。「血液悪性腫瘍」は、血液がんとしても知られ、例えば、骨髓又は免疫系の他の細胞などの造血組織に起源をもつがんである。血液悪性腫瘍は、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性混合系統白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病及び大顆粒リンパ球性白血病）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症及び慢性骨髄性白血病）、リンパ腫、多発性骨髄腫、ＭＧＵＳ及び類似する疾患、ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫及び他のＢ細胞悪性腫瘍を含み、ただしそれらに限定されない。「固形がん」は、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児腫瘍、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、類表皮がん、扁平上皮がん、アスベストによって誘発されるがんを含む環境誘発がんを含み、ただしそれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「処理」又は「治療」とは、治療的処理及び予防的手段の両方を指し、その目的は、例えば、がんの進行などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防し又は遅延させる（軽減する）ことである。有益な又は望ましい臨床結果は、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延又は減速、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的か完全かは問わない）を含み、ただしそれらに限定されず、検出可能か検出不能かは問わない。「治療」は、治療を受けない場合の予想される生存期間に比べて生存期間を延長させることも意味する。治療を必要とする対象は、既にその状態若しくは障害にかかっている者、及びその状態若しくは障害にかかりやすい者、又はその状態若しくは障害を予防すべき者を含む。

「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は治療が望まれるいずれの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、農場及び動物園の動物、競技動物、又はペット、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者に」又は「治療を必要とする対象」などの語句には、本開示の、例えば、検出、診断手順及び／又は治療のためのｏＨＳＶ－１又は組成物の投与から利益を得るだろう対象、例えば、哺乳動物対象が含まれる。

また、本明細書に開示されている改変ゲノムは、それらが由来する改変ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるように改変されてもよいということが当業者には理解されるだろう。例えば、指定されたＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、開始配列に類似するものであってもよく、例えば、開始配列に対して一定のパーセントの同一性を有し、例えば、それは開始配列に対して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同じであってもよい。

さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存的置換又は変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失又は挿入が行われてもよい。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、１つ又は複数の別個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上の別個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を除いて、開始配列と同じであってもよい。特定の実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、開始配列に対して１～５個、１～１０個、１～１５個又は１～２０個の別個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する。

「治療有効量」又は「有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、例えば、個体の疾患の状態、年齢、性別、個体の体重及び治療薬又は治療薬の併用の個体で所望の反応を引き出す能力などの要因に応じて変わってもよい。有効な治療薬又は治療薬の併用の例示的な指標は、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍負荷の軽減、腫瘍の成長の停止若しくは遅延、及び／又は体内の他の部位へのがん細胞の転移の欠如を含む。

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。ＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、又はガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞であってもよい。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１）細胞外リガンド結合ドメイン、即ち、抗原認識ドメイン、２）膜貫通ドメイン、及び３）シグナル伝達ドメインを含む組換え融合タンパク質である。細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドに結合できるオリゴ又はポリペプチドである。好ましくは、細胞外リガンド結合ドメインは、抗原、受容体、ペプチドリガンド、標的のタンパク質リガンド又は標的のポリペプチドであり得る細胞表面分子と相互作用することができる。本開示において、細胞外リガンド結合ドメインは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体と相互作用することができる。

一般的には、細胞外リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメインＩによってキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のシグナル伝達ドメインに連結される。膜貫通ドメインは、細胞膜を横断し、ＣＡＲをＴ細胞の表面に固定し、細胞外リガンド結合ドメインをシグナル伝達ドメインに接続させ、Ｔ細胞の表面におけるＣＡＲの発現に影響を与える。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域をさらに含んでもよい。用語「ヒンジ領域」とは、一般的に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能するいずれのオリゴ又はポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインにより高い柔軟性及びアクセシビリティを提供するために用いられる。ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含んでもよい。ヒンジ領域は、天然に存在する分子、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体α又はβ鎖、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４の全て若しくは一部に由来してもよいし、又は抗体定常領域の全て若しくは一部に由来してもよい。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、又はヒンジ領域は、完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞の活性化及び免疫応答をもたらす、標的への細胞外リガンド結合ドメインの結合後の細胞内シグナル伝達を担うＣＡＲのシグナル伝達ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパーＴ細胞活性であってもよい。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊な機能を実行するよう細胞に指示するタンパク質の部分を指す。ＣＡＲで使用するためのシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の結合後に協調して作用してシグナル伝達を開始させるＴ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、及びこれらの配列のいずれの誘導体又は変異体、並びに同じ機能を持ついずれの合成配列であってもよい。シグナル伝達ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、即ち、抗原依存性の一次活性化を開始させるもの、及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供するものを含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフであるＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼの結合部位として機能する、様々な受容体の細胞質内の尾部に見られる、明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本開示で使用することができるＩＴＡＭの非限定的な例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものを含んでもよい。一実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、少なくとも、８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性のアミノ酸配列を備えるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでもよい。本開示では、本明細書に記載の遺伝子操作されたｏＨＳＶといずれのＣＡＲ－Ｔの併用的使用が制限なく想定される。

典型的な抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）には、がん細胞の表面特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体には、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及びヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）など、免疫系Ｂ細胞及びＴ細胞の表面にあるいくつかのタンパク質が含まれる。これらの抗体は、切断可能なリンカーユニットによって毒性の高い薬物に接続される。薬物は、不可逆的なＤＮＡ損傷を誘導し、又は細胞分裂を妨害することによって、がん細胞のアポトーシスを引き起こすように設計される。ＡＤＣには、がん細胞の表面特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体には、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及びヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）など、免疫系Ｂ細胞及びＴ細胞の表面にあるいくつかのタンパク質が含まれる。これらの抗体は、切断可能なリンカーユニットによって毒性の高い薬物に接続される。薬物は、不可逆的なＤＮＡ損傷を誘導し、又は細胞分裂を妨害することによって、がん細胞のアポトーシスを引き起こすように設計される。

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）のメカニズムは、抗体によって特異的抗原を認識してそれと結合し、一連の反応を引き起こし、次にエンドサイトーシスにより細胞質に入り、そこで毒性の高い薬物がリソソーム酵素から解離されてがん細胞を死滅させることである。がん細胞と正常な組織の両方に無差別に損傷を引き起こす従来の化学療法と比べて、標的化薬物送達は、薬物をがん細胞に直接作用させ、正常な細胞への損傷を軽減することができる。典型的な抗体薬物複合体は、薬物、リンカーユニット及び抗体の３つの部分によって構成される。特定の抗体及び薬物の選択は、特定の疾患に依存し、複合体の安全性と有効性に重要な影響を与える。リンカーユニットの安定性と抗体への結合方式がＡＤＣ薬物の開発において決定的な役割を果たす。抗体薬物複合体の有効性を決定する要因には、リンカーユニットの安定性と破断感受性、細胞表面の興奮内部移行、輸送、及び細胞毒素の放出が含まれる。本開示では、本明細書に記載のＴ７シリーズｏＨＳＶといずれのＡＤＣの併用的使用が制限なく想定される。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、Ｔ細胞のＴＣＲ複合体のＣＤ３Ｅサブユニットに特異的であり、且つ、例えば、がん抗原など、対象となる抗原を標的とする比較的単純な二重特異性分子である。ＢｉＴＥがＴＣＲ複合体に特異的であるため、ＢｉＴＥは常在Ｔ細胞を活性化して、細胞表面に特定の標的抗原を発現する細胞、例えば、がん細胞を死滅させることができる。ＢｉＴＥの重要な特性は、ＣＤ４＋及び非活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞ががん細胞を標的とすることを可能とする能力である。換言すれば、ＢｉＴＥによって活性化されたＴ細胞に、細胞表面におけるＭＨＣ発現とは無関係に細胞を死滅させることができる。一部の腫瘍細胞はＭＨＣを下方制御し、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｉｍｍＴＡＣなどの薬剤に対する耐性を持たせるため、これが重要である。残念ながら、全長抗体に比べて、ＢｉＴＥの循環動態は劣る。これは、患者に投与される時、ＢｉＴＥの大部分が標的細胞に到達しないことを意味する。また、ＢｉＴＥの一部として高親和性の抗ＣＤ３ ＳｃＦｖを使用すると、血液中のＴ細胞との強い結合を引き起こす可能性があり、これも腫瘍への送達を妨げる。その結果、ＢｉＴＥは、腫瘍細胞に効果的に送達できないため、抗がん療法としてのその潜在能力を最大限に発揮できなくなる。本開示では、本明細書に記載のｏＨＳＶといずれのＢｉＴＥとの併用的使用が制限なく想定される。

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍関連／特異的抗原」とは、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、又はその両方を意味する。例えば、用語「少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原」とは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原又は少なくとも１つの腫瘍特異的抗原を意味し、腫瘍関連抗原と腫瘍特異的抗原の対を含んでもよい。例えば、用語「少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体」は、１つの腫瘍関連抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、２つ又は以上の腫瘍関連抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、１つの腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、２つ又は以上の腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、１つの腫瘍関連抗原と２つ又は以上の腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び２つ又は以上の腫瘍関連抗原と１つの腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体を含むことを意図する。例えば、用語「２つの腫瘍関連／特異的抗原」は、２つの腫瘍関連抗原、２つの腫瘍特異的抗原、及び１つの腫瘍関連抗原と１つの腫瘍特異的抗原の併用を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、特定の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の「バイオマーカー」、「切断された非シグナル伝達性の変異体」、「切断された変異体」又は「非シグナル伝達性の変異体」とは、シグナル伝達経路における野生型の対応物のシグナル伝達を無効にするために変異、欠失又は他の方式で改変された腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の変異体を指す。変異体は抗原の少なくとも一部のエピトープを露出させ、これにより変異体は野生型抗原に対して特異的に指向される抗体又はその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）によって結合され得る。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の一般的に知られる非シグナル伝達性の変異体は、抗原が膜貫通タンパク質である場合、抗原の細胞外ドメイン、抗原の細胞外－膜貫通ドメイン、又は細胞外ドメイン若しくは細胞外－膜貫通ドメインに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を備える等価物である。等価物は、シグナルを伝達できないが、抗原の細胞外ドメイン上のエピトープの少なくとも一部を露出させる。

例えば、ＣＤ１９の非シグナル伝達性の変異体（本明細書では非シグナル伝達性のＣＤ１９とも呼ばれる）は、野生型ＣＤ１９の３２３個のアミノ酸の細胞外－膜貫通ドメイン（配列番号１４）である。非シグナル伝達性のＢＣＭＡは、野生型ＢＣＭＡの７７個のアミノ酸の細胞外－膜貫通ドメイン（配列番号１５）である。非シグナル伝達性のＨＥＲ２は、野生型ＨＥＲ２の６７５個のアミノ酸の細胞外－膜貫通ドメイン（配列番号１６）である。非シグナル伝達性のＴｒｏｐ－２は、野生型Ｔｒｏｐ－２の２９７個のアミノ酸の細胞外－膜貫通ドメイン（配列番号１７）である。

細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインは、当分野における日常的な実践によって困難なく得ることができる。様々な腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の細胞外／膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む公的リソースより利用可能である。非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍細胞表面上に発現されると、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原に特異的な抗体又は抗体の抗原結合断片によって認識され、結合されることに留意されたい。抗原結合断片は、ＣＡＲ－免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞）又はＢｉＴＥの一部であってもよい。抗体は化学療法薬と結合してＡＤＣを形成する場合がある。しかし、非シグナル伝達性の変異体は、その野生型の対応物のようにシグナル伝達経路を誘発しない。当業者は、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の変異体が非シグナル伝達性であるかどうかをテスト及び検証することは容易であろう。例えば、野生型抗原について知られている正常なシグナル伝達経路における下流タンパク質のレベルを検出することによって決定されてもよい。

遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）：
本開示は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）を提供する。遺伝子改変ｏＨＳＶは、感受性細胞、例えば、固形腫瘍細胞における複製時、少なくとも１つの腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体を発現するように改変される。本発明者らは、腫瘍細胞における遺伝子改変ｏＨＳＶの感染及び複製後の細胞表面上での異なる切断された腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の発現に成功したことを示した。非シグナル伝達性の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原が発現され、次に腫瘍細胞の表面に提示されると、当該腫瘍細胞が様々な抗原指向性療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法の標的として標識される。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変ｏＨＳＶは、感受性細胞、例えば、固形腫瘍細胞における複製時、少なくとも１つのケモカインを発現するようにさらに改変される。本発明者らは、感染後４時間で既に分泌ケモカインが検出されたことを示し、それはｏＨＳＶウイルス感染後に少なくとも４日間保持された。ケモカインの発現及び放出は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞又はＣＡＲ Ｔ細胞の感受性細胞への走化性を誘導し、これは腫瘍塊への免疫細胞の輸送及び浸潤を促進する。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が提供され、前記ｏＨＳＶのゲノムには、少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が提供され、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）少なくとも１つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び少なくとも１つのケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が提供され、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）１つの腫瘍関連抗原又は１つの腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）１つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が提供され、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）２つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）１つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、２つの同じ又は異なる腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、２つの同じ又は異なる腫瘍特異的抗原を含む。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、１つの腫瘍関連抗原及び１つの腫瘍特異的抗原を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が提供され、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）２つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、２つのケモカインは同じである。いくつかの実施形態では、２つのケモカインは異なる。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が提供され、前記ｏＨＳＶのゲノムには、（ａ）２つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）２つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、２つのケモカインは同じである。いくつかの実施形態では、２つのケモカインは異なる。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、２つの同じ又は異なる腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、２つの同じ又は異なる腫瘍特異的抗原を含む。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、１つの腫瘍関連抗原及び１つの腫瘍特異的抗原を含む。

したがって、本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第１ポリヌクレオチド及び少なくとも１つのケモカインをコードする第２ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも１つのケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、第１腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第１ポリヌクレオチド、第２腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第２ポリヌクレオチド、及び１つのケモカインをコードする第３ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、腫瘍関連／特異的抗原、第１又は第２腫瘍関連／特異的抗原は、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＧＰＣ－３、ＣＥＡ、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＤ３８、Ｔｒｏｐ－２、ｃ－ＭＥＴ、ネクチン－４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、ＣＤ７９ｂ、ＣＣＫ４、ＧＰＡ３３、ＨＬＡ－Ａ２、ＣＬＥＣ１２Ａ、ｐ－カドヘリン（ｐ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＴＤＯ２、ＭＡＲＴ－１、Ｐｍｅｌ １７、ＭＡＧＥ－１、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ、ＰＳＡ、ＣＤＫ４、ＢＣＡ２２５、ＣＡ１２５、ＭＧ７－Ａｇ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡＡＬ６及びＴＡＧ７２からなる群から独立的に選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍関連／特異的抗原は、ＨＥＲ２、Ｔｒｏｐ－２、ＢＣＭＡ及びＣＤ１９からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ケモカインは、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７、ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２及びＣＸ３ＣＬ１からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ケモカインは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ケモカインはＣＣＬ５である。

いくつかの実施形態では、ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターは、ＨＳＶ－１又はＨＳＶ－２の最初期遺伝子プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターは、ＨＳＶ－１の、ＩＥ１（ＩＣＰ０プロモーター）、ＩＥ２（ＩＣＰ２７プロモーター）、ＩＥ３（ＩＣＰ４プロモーター）及びＩＥ４／５（ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７プロモーター）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターは、ＨＳＶ－１の最初期遺伝子プロモーターＩＥ４／５である。

いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍関連／特異的抗原の細胞外－膜貫通ドメインである。例えば、ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体は、ＣＤ１９の細胞外－膜貫通ドメインである。例えば、ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体は、ＢＣＭＡの細胞外－膜貫通ドメインである。例えば、ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体は、ＨＥＲ２の細胞外－膜貫通ドメインである。例えば、Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体は、Ｔｒｏｐ－２の細胞外－膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍関連／特異的抗原の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍関連／特異的抗原の膜貫通ドメインの一部に連結された細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、シグナル伝達ドメインの一部又は全体が欠如している野生型腫瘍関連／特異的抗原の変異体である。

好ましい実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＨＳＶ１型（ＨＳＶ－１）又はＨＳＶ２型（ＨＳＶ－２）に起源をもつ。好ましい実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＨＳＶ－１のＦ株に起源をもつ。

好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。

好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする。

いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原を発現しない。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原を発現する。

いくつかの実施形態では、上記のような遺伝子改変ｏＨＳＶは、ｏＨＳＶのゲノムの核酸の断片を欠失するようにさらに改変され、これによりｏＨＳＶは、その意図された使用という目的にとって望ましくない特定の特性が減弱されるか又は除去される。一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、内部逆方向反復領域、ウイルス遺伝子をコードする断片又はその両方を欠失している。一実施形態では、欠失しているｏＨＳＶの核酸の断片は、ＨＳＶ－１のＦ株のＰプロトタイプゲノムの位置１１７００５～１３２０９６である。一実施形態では、ウイルス遺伝子をコードする断片は、γ３４．５をコードする核酸の断片である。一実施形態では、遺伝子γ３４．５の両方のコピーが欠失される。

いくつかの実施形態では、上記のような遺伝子改変ｏＨＳＶは、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方をコードするようにさらに改変される。一実施形態では、免疫刺激剤は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７からなる群から選択される。一実施形態では、免疫治療剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片である。一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＩＬ－１２をコードする。一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片をコードする。一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＩＬ－１２及び抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片をコードする。

腫瘍関連／特異的抗原が、ウイルス感染直後、且つ、ウイルスの複製による腫瘍細胞の溶解前に発現されるよう、腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーター、例えば、ＩＥ４／５プロモーターによって制御されることが必要であるということに留意すべきである。切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチド及びケモカインをコードするポリヌクレオチドは、同じ最初期プロモーターに作動可能に連結されてもよい。別の実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチド及びケモカインをコードするポリヌクレオチドは、異なる最初期プロモーターに作動可能に連結されてもよい。ｏＨＳＶが、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方、例えば、ＩＬ－１２、抗ＰＤ－１抗体によってさらに装備される場合、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤の発現は必ずしも最初期プロモーターによって制御されるとは限らないが、好ましくは、異なる且つ相対的晩期のプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター又はＥｇｒ－１プロモーターによって制御される。一実施形態では、ＩＬ－１２をコードするポリヌクレオチドはＥｇｒ－１プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態では、ｓｃＦｖ－抗ｈＰＤ１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第２ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＢＣＭＡをコードする第１ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第２ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＢＣＭＡ及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＴｒｏｐ－２をコードする第１ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第２ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＴｒｏｐ－２及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＨＥＲ２をコードする第１ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第２ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＨＥＲ２及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、切断された非シグナル伝達性のＢＣＭＡ９をコードする第２ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９、前記切断された非シグナル伝達性のＢＣＭＡ９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、切断された非シグナル伝達性のＴｒｏｐ－２をコードする第２ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９、前記切断された非シグナル伝達性のＴｒｏｐ－２及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、切断された非シグナル伝達性のＨＥＲ２をコードする第２ポリヌクレオチド及びＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９、前記切断された非シグナル伝達性のＨＥＲ２及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２及びＨＥＲ２からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第１ポリヌクレオチド、ＣＣＬ５をコードする第２ポリヌクレオチド、抗ＰＤ－１抗体をコードする第３ポリヌクレオチド及びＩＬ－１２をコードする第４ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御され、前記ｏＨＳＶの内部逆方向反復領域が欠失される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２及びＨＥＲ２からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第２ポリヌクレオチド、ＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチド、抗ＰＤ－１抗体をコードする第４ポリヌクレオチド及びＩＬ－１２をコードする第５ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２及びＨＥＲ２からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第２ポリヌクレオチド、ＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチド、抗ＰＤ－１抗体をコードする第４ポリヌクレオチド及びＩＬ－１２をコードする第５ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御され、前記ｏＨＳＶの内部逆方向反復領域が欠失される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２及びＨＥＲ２からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第２ポリヌクレオチド、ＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチド、抗ＰＤ－１抗体をコードする第４ポリヌクレオチド及びＩＬ－１２をコードする第５ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御され、前記ｏＨＳＶの内部逆方向反復領域が欠失され、前記ｏＨＳＶの全ての単一コピー遺伝子が保持される。

一実施形態では、遺伝子改変ｏＨＳＶは、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９をコードする第１ポリヌクレオチド、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２及びＨＥＲ２からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第２ポリヌクレオチド、ＣＣＬ５をコードする第３ポリヌクレオチド、抗ＰＤ－１抗体をコードする第４ポリヌクレオチド及びＩＬ－１２をコードする第５ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９及び前記ＣＣＬ５の発現はＨＳＶ－１ ＩＥ４／５プロモーターによって制御され、前記ｏＨＳＶの内部逆方向反復領域及びγ３４．５の両方のコピーが欠失され、前記ｏＨＳＶの全ての単一コピー遺伝子が保持される。

一実施形態では、ＰｏｌｙＡ尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードするポリヌクレオチドの下流に位置する。例えば、切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインをコードするポリヌクレオチドは、５’－ＣＤ１９－ＣＣＬ５－ＰｏｌｙＡ－３’、５’－ＢＣＭＡ－ＣＣＬ５－ＰｏｌｙＡ－３’、５’－ＨＥＲ２－ＣＣＬ５－ＰｏｌｙＡ－３’、５’－ＣＤ１９－ＢＣＭＡ－ＣＣＬ５－ＰｏｌｙＡ－３’、５’－ＣＤ１９－Ｔｒｏｐ－２－ＣＣＬ５－ＰｏｌｙＡ－３’、又は５’－ＣＤ１９－ＨＥＲ２－ＣＣＬ５－ＰｏｌｙＡ－３’として配置される。

一実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体、免疫治療剤及びケモカインをコードするｏＨＳＶゲノムへのいずれのポリヌクレオチドを組み込むことは、ウイルス遺伝子の機能を破壊しない。例えば、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが、ウイルスのＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間に導入され、切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインをコードするポリヌクレオチドがウイルスのＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間に導入される。また、一実施形態では、ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドがウイルスゲノムの内部逆方向反復領域を置き換える。

本開示において、ｏＨＳＶによってコードされる腫瘍関連／特異的抗原は、ｏＨＳＶに感染した腫瘍細胞と異種であっても、同種であってもよい。一実施形態では、腫瘍細胞は、ｏＨＳＶによってコードされる腫瘍関連／特異的抗原とは異なる腫瘍関連／特異的抗原を発現する。例えば、腫瘍細胞はＣＤ２２を過剰発現するが、本開示の遺伝子改変ｏＨＳＶはＣＤ１９、ＨＥＲ２又はその両方を発現する。別の実施形態では、腫瘍細胞は、ｏＨＳＶによってコードされる腫瘍関連／特異的抗原と同じ腫瘍関連／特異的抗原を発現する。例えば、腫瘍細胞はＨＥＲ２を低レベルで発現し、本開示の遺伝子改変ｏＨＳＶはＨＥＲ２を発現する。別の実施形態では、腫瘍細胞は、既知の腫瘍関連／特異的抗原が検出されない。

本開示の遺伝子改変ｏＨＳＶに感染した腫瘍細胞は、血液腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞である。

有利なことに、腫瘍細胞表面上の非シグナル伝達性の腫瘍関連／特異的抗原の提示は、当該特定の腫瘍関連／特異的抗原に関して腫瘍細胞を陰性細胞から陽性細胞に変換し、これにより特定の腫瘍関連／特異的抗原又は腫瘍特異的抗原を標的とする療法に対して腫瘍を応答させる。異種ポリヌクレオチドの発現は、最初期遺伝子プロモーター、例えば、ＨＳＶ－１のＩＥ４／５によって制御され、これにより腫瘍細胞へのＨＳＶの侵入及び複製の極めて初期の段階で翻訳産物が産生される。例えば、ｏＨＳＶは、正常な及び殆どの腫瘍Ｂ細胞上で特異的に発現される膜貫通タンパク質である、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９を発現するように改変されてもよい。次に、切断された非シグナル伝達性のＣＤ１９は、ｏＨＳＶの感染による細胞溶解の前に腫瘍細胞表面に提示され、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ－Ｔ療法、例えば、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）又はテカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）の標的として機能する。換言すれば、非シグナル伝達性のＣＤ１９の発現は、腫瘍細胞にＣＤ１９抗原が欠如しているため、一般的にはＣＤ１９指向性ＣＡＲ－Ｔ療法の影響を受けにくい腫瘍細胞をＣＤ１９指向性ＣＡＲ－Ｔの影響を受けやすい腫瘍細胞に変換する。この場合において、腫瘍はＣＤ１９指向性ＣＡＲ－Ｔ療法に応答すると考えられる。

１つ以上の非シグナル伝達性の腫瘍関連／特異的抗原をコードする遺伝子改変ｏＨＳＶの重要な利点は、腫瘍抗原標的療法ごとにｏＨＳＶの設計、テスト及び製造を繰り返すことを必要としない、異なる腫瘍抗原標的療法との併用的使用のための多用途ツールを提供することである。２つの異なる非シグナル伝達性の腫瘍関連／特異的抗原が同じｏＨＳＶによってコードされる場合、それらは、ウイルスの感染により腫瘍細胞が溶解する前に、同時に腫瘍細胞表面に発現及び提示されることが可能であるということが示された。２つ以上の異なる非シグナル伝達性の腫瘍関連／特異的抗原の提示は、腫瘍細胞を二重、さらには三重陽性腫瘍細胞に変換し、これにより異なる腫瘍標的療法が腫瘍細胞に対して有効になることを可能にする。これは、対応する腫瘍標的療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の特異性及び有効性を向上させるのに役立つ。

本明細書に開示されている遺伝子改変ｏＨＳＶの一部のさらなる利点は、腫瘍関連／特異的抗原に加え、それは、発現及び放出が腫瘍細胞への免疫細胞の輸送及び浸潤を一層助ける少なくとも１つのケモカインをコードすることにある。したがって、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫなどを本明細書に記載のｏＨＳＶと併用する場合、特に有利である。しかし、いかなる理論にも束縛されないが、本明細書に開示されている遺伝子改変ｏＨＳＶは独立的に使用することができ、ケモカインの分泌は、身体の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の腫瘍への走化性を誘導し、ウイルスの抗腫瘍効果と共に腫瘍細胞を死滅させる。

ｏＨＳＶと腫瘍標的療法の併用：
本開示の別の態様は、様々ながんの治療のための、上記の遺伝子改変ｏＨＳＶのいずれかと、腫瘍標的化治療薬との併用に関する。上述したように、本明細書に開示されている遺伝子改変ｏＨＳＶは、非シグナル伝達性の腫瘍関連／特異的抗原を発現し、次に、当該抗原を腫瘍細胞の表面に提示する。これは、腫瘍関連／特異的抗原を標的とするように設計された治療薬に、ｏＨＳＶに感染した腫瘍細胞を標的する機会を提供する。

本開示において、腫瘍標的化治療薬は、ｏＨＳＶによってコードされる少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。標的化部分は、ｏＨＳＶの腫瘍細胞への侵入及び複製の時に、腫瘍細胞表面に発現される非シグナル伝達性の腫瘍関連／特異的抗原に特異性を有する。例えば、標的化部分は、例えば、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体部分など、腫瘍関連／特異的抗原に対する抗体の抗原結合ドメインである。エフェクター部分は、がんの細胞を死滅させ、又はその増殖を阻害するために有用である。例えば、エフェクター部分は、Ｔ細胞及びナチュラル・キラー細胞を含む免疫細胞、Ｔ細胞と結合できるＢｉＴＥの一部、又は抗体－薬物複合体の薬物部分である。

いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、キメラ抗原受容体ＮＫ（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＢｉＴＥである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＡＤＣである。

いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９又はＥｐＣＡＭ標的化ＢｉＴＥである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＨＥＲ２、Ｔｒｏｐ－２、ネクチン－４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２又はＣＤ７９ｂ標的化ＡＤＣである。

いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＪＷＣＡＲ－０２９、ＩＭ１９ＣＡＲ－Ｔ、ＣＮＣＴ１９、ＢＺ０１９、ＨＤ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ、ｐＣＡＲ－１９Ｂ、ＣＤ１９－ＣＡＲＴ、ＣＴ０３２、ｉＰＤ１ ＣＤ１９ ｅＣＡＲ－Ｔ、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ、ＣＴ１０３Ａ、ＣＡＲ－ＢＣＭＡ Ｔ、ＡＵ－１０１、４ＳＣＡＲ－ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ－ＣＡＲＴ、Ｐ－ＰＳＭＡ－１０１、Ｃ－ＣＡＲ０６６、ＭＢ－ＣＡＲＴ２０．１、ＰＢＣＡＲ２０Ａ、ＬＢ１０９５、ＬＢ１９０１、ＰＲＧＮ－３００６、ＡＭＧ５５３、ＣＴ０４１、ＣＤ３０．ＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＧＰＣ３ Ｔからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９又はＥｐＣＡＭ標的化ＢｉＴＥである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ビーリンサイト（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）（登録商標）、ＡＭＧ４２０、ＰＦ－３１３５及びＧＢＲ１３０２からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ＨＥＲ２、Ｔｒｏｐ－２、ネクチン－４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２又はＣＤ７９ｂ標的化ＡＤＣである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）、エンハーツ（Ｅｎｈｅｒｔｕ）（登録商標）、ＳＨＲ－Ａ１８１１、ＴＡＡ０１３、ＲＣ－４８、ＢＡＴ８００１、ＡＲＸ７８８、Ａ１６６、トロデルヴィ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（登録商標）、ＢＡＴ８００３、ＤＡＣ－００２、ＤＳ－１０６２、ＳＫＢ２６４、ＲＣ－１０８、ＴＲ１８０１－ＡＤＣ、パドセブ（Ｐａｄｃｃｖ）（登録商標）、ポライビー（Ｐｏｌｉｖｙ）（登録商標）、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）、ブレンレップ（Ｂｌｅｎｒｅｐ）（登録商標）、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ＡＤＣＴ－４０２、ＰＴＫ７－ＡＤＣ及びＴＲＳ００５からなる群から選択される。

好ましい実施形態では、上記の腫瘍標的化治療薬のいずれかとの併用的使用のための遺伝子改変ｏＨＳＶは、前記ｏＨＳＶのゲノムに、（ａ）２つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｂ）ケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれる遺伝子改変ｏＨＳＶであり、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインの発現は、ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、２つの同じ又は異なる腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、２つの同じ又は異なる腫瘍特異的抗原を含む。いくつかの実施形態では、２つの腫瘍関連／特異的抗原は、１つの腫瘍関連抗原及び１つの腫瘍特異的抗原を含む。

好ましい実施形態では、腫瘍標的化治療薬との併用的使用のための遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＣＤ１９及びＢＣＭＡの両方の切断された非シグナル伝達性の変異体、及びＣＣＬ５を発現する遺伝子改変ｏＨＳＶであり、前記腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）若しくはテカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、ＣＤ１９標的化ＢｉＴＥ、例えば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＢＣＭＡ標的化ＡＤＣ、例えば、ブレンレップ（Ｂｌｅｎｒｅｐ）（登録商標）、又はそれらのいずれの併用である。

好ましい実施形態では、腫瘍標的化治療薬との併用的使用のための遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＣＤ１９及びＨＥＲ２の両方の切断された非シグナル伝達性の変異体、及びＣＣＬ５を発現する遺伝子改変ｏＨＳＶであり、前記腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）又はテカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、ＣＤ１９標的化ＢｉＴＥ、例えば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＨＥＲ２標的化ＡＤＣ、例えば、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）若しくはエンハーツ（Ｅｎｈｅｒｔｕ）（登録商標）、又はそれらのいずれの併用である。

好ましい実施形態では、腫瘍標的化治療薬との併用的使用のための遺伝子改変ｏＨＳＶは、ＣＤ１９及びＴｒｏｐ－２の両方の切断された非シグナル伝達性の変異体、及びＣＣＬ５を発現する遺伝子改変ｏＨＳＶであり、前記腫瘍標的化治療薬は、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）若しくはテカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、ＣＤ１９標的化ＢｉＴＥ、例えば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、Ｔｒｏｐ－２標的化ＡＤＣ、例えば、トロデルヴィ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（登録商標）、又はそれらのいずれの併用である。

ｏＨＳＶと腫瘍標的療法の併用は、例えば、医薬キットとして具体化されてもよい。したがって、一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）と、腫瘍標的化治療薬とを別々に含むがんの治療のための医薬キットが提供され、前記腫瘍標的化治療薬は、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。

いくつかの実施形態では、がんの治療のための医薬キットは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）と、ＣＤ１９又はＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥとを別々に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９又はＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥは、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＡＤＣＴ－４０２（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＪＮＪ－６８２８４５２８（ＪＮＪ－４５２８、Ｌｅｇｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ブレンレップ（Ｂｌｅｎｒｅｐ）（又はＧＳＫ２８５７９１６）、ＡＭＧ４２０（Ａｍｇｅｎ）及びＰＦ－３１３５（Ｐｆｉｚｅｒ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、がんの治療のための医薬キットは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）と、ＣＤ１９又はＴｒｏｐ－２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥとを別々に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９又はＴｒｏｐ－２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥは、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＡＤＣＴ－４０２（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）及びトロデルヴィ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、がんの治療のための医薬キットは、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）と、ＣＤ１９又はＨＥＲ２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥとを別々に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９又はＨＥＲ２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥは、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＡＤＣＴ－４０２（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＡＵ－１０１（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）、エンハーツ（Ｅｎｈｅｒｔｕ）（登録商標）（第一三共）及びＧＢＲ１３０２（Ｉｃｈｎｏｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＡ）からなる群から選択される。

治療方法：
本開示の別の態様は、対象におけるがんの治療方法に関する。当該方法は、対象に治療有効量の本明細書に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ及び本明細書に記載の腫瘍標的化療法薬を投与することを含む。ｏＨＳＶ及び腫瘍標的化療法薬の両方の投与は、同時に又は連続して行われる。

いくつかの実施形態では、最初に対象に治療有効量の本明細書に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶを投与し、次に本明細書に記載の腫瘍標的化療法薬を投与する。当該実施形態では、投与間の間隔は、０．５～１２時間の範囲内であり、例えば、０．５～９時間、０．５～８時間、０．５～７時間、０．５～６時間、０．５～５時間、０．５～４時間、０．５～３時間、０．５～２時間、０．５～２．５時間、０．５～１．５時間又は０．５～１時間である。例えば、ｏＨＳＶの投与は、腫瘍標的化療法薬の投与前０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０、１１又は１２時間である。

いくつかの実施形態では、前記方法は、対象に治療有効量の、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）、及びＣＤ１９又はＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９又はＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥは、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＡＤＣＴ－４０２（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＪＮＪ－６８２８４５２８（ＪＮＪ－４５２８、Ｌｅｇｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ブレンレップ（Ｂｌｅｎｒｅｐ）（又はＧＳＫ２８５７９１６）、ＡＭＧ４２０（Ａｍｇｅｎ）及びＰＦ－３１３５（Ｐｆｉｚｅｒ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記方法は、対象に治療有効量の、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）、及びＣＤ１９又はＴｒｏｐ－２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９又はＴｒｏｐ－２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥは、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＡＤＣＴ－４０２（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）及びトロデルヴィ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、前記方法は、対象に治療有効量の、（ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、（ｉｉ）ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び（ｉｉｉ）ＣＣＬ５をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）、及びＣＤ１９又はＨＥＲ２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９又はＨＥＲ２標的化ＣＡＲ－Ｔ、ＡＤＣ又はＢｉＴＥは、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＡＤＣＴ－４０２（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＡＵ－１０１（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）、エンハーツ（Ｅｎｈｅｒｔｕ）（登録商標）（第一三共）及びＧＢＲ１３０２（Ｉｃｈｎｏｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＡ）からなる群から選択される。

本明細書に記載のｏＨＳＶと、様々な腫瘍抗原指向性ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＡＤＣ又はＢｉＴＥとの併用は、様々な腫瘍に対して著しく向上された抗腫瘍効果を提供する。ｏＨＳＶは、直接的な腫瘍細胞溶解により、直接バリアを破壊し腫瘍微小環境を操作する。ケモカインやサイトカインなどのペイロードが装備されたｏＨＳＶは、腫瘍塊へのＴ細胞の輸送及び浸潤をさらに改善する。また、固形腫瘍細胞表面上のｏＨＳＶによって送達される腫瘍特異性の高い抗原（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ）は、オフターゲットの腫瘍外毒性（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を軽減させることによって、腫瘍標的療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法の特異性及び安全性を改善する。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）であって、
前記ｏＨＳＶのゲノムには、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び
（ｂ）少なくとも１つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、
前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも１つのケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、
腫瘍細胞における前記ｏＨＳＶの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、前記腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために前記少なくとも１つのケモカインが発現及び放出される遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［２］
前記少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原が、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＧＰＣ－３、ＣＥＡ、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＤ３８、Ｔｒｏｐ－２、ｃ－ＭＥＴ、ネクチン－４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、ＣＤ７９ｂ、ＣＣＫ４、ＧＰＡ３３、ＨＬＡ－Ａ２、ＣＬＥＣ１２Ａ、ｐ－カドヘリン（ｐ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＴＤＯ２、ＭＡＲＴ－１、Ｐｍｅｌ １７、ＭＡＧＥ－１、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ、ＰＳＡ、ＣＤＫ４、ＢＣＡ２２５、ＣＡ１２５、ＭＧ７－Ａｇ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡＡＬ６及びＴＡＧ７２からなる群から選択される前記［１］に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［３］
前記少なくとも１つのケモカインが、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７、ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２及びＣＸ３ＣＬ１からなる群から選択される前記［１］又は［２］に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［４］
前記切断された非シグナル伝達性の変異体が、細胞外ドメイン、細胞外－膜貫通ドメイン又は前記細胞外ドメイン若しくは前記細胞外－膜貫通ドメインに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を備える等価物である前記［１］～［３］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［５］
前記ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターが、ＨＳＶ－１の、ＩＥ１（ＩＣＰ０プロモーター）、ＩＥ２（ＩＣＰ２７プロモーター）、ＩＥ３（ＩＣＰ４プロモーター）及びＩＥ４／５（ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７プロモーター）からなる群から選択される前記［１］～［４］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［６］
前記ポリヌクレオチドが、２つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び少なくとも１つのケモカインをコードする前記［１］～［５］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［７］
前記少なくとも１つのケモカインが、ＣＣＬ５を含む前記［１］～［６］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［８］
前記ポリヌクレオチドがＵＬ３７とＵＬ３８との間に挿入される前記［１］～［７］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［９］
前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
（ｂ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
（ｃ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
（ｄ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
（ｅ）Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
（ｆ）ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、又は
（ｇ）ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５をコードする前記［１］～［８］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１０］
前記ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターが、ＨＳＶ－１の最初期遺伝子プロモーターＩＥ４／５である前記［１］～［９］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１１］
ＰｏｌｙＡ尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードする前記ポリヌクレオチドの下流に位置する前記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１２］
前記腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である前記［１］～［１１］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１３］
前記腫瘍細胞は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記腫瘍関連／特異的抗原を発現しない前記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１４］
前記ｏＨＳＶが、前記ｏＨＳＶの核酸の断片が欠失されるようにさらに改変される前記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１５］
前記ｏＨＳＶの核酸の前記断片が、前記ｏＨＳＶの内部逆方向反復領域、ウイルス遺伝子をコードする断片又はその両方である前記［１］～［１４］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１６］
前記ｏＨＳＶの核酸の前記断片が、Ｆ株のＰプロトタイプゲノムの位置１１７００５～１３２０９６である前記［１４］に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１７］
前記ｏＨＳＶが、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方をコードするようにさらに改変される前記［１］～［１６］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１８］
前記免疫刺激剤が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４及びＩＬ－２７からなる群から選択される前記［１７］に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［１９］
前記免疫治療剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片である前記［１７］又は［１８］に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［２０］
前記免疫刺激剤が、ＩＬ－１２であり、前記免疫治療剤が、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片である前記［１７］～［１９］のいずれか一項に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［２１］
前記［１］～［２０］のいずれか一項に記載のｏＨＳＶと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
［２２］
前記腫瘍標的化治療薬が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＢｉＴＥ及びＡＤＣからなる群から選択される前記［２１］に記載の医薬キット。
［２３］
前記腫瘍標的化治療薬が、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ１９又はＥｐＣＡＭ標的化ＢｉＴＥからなる群から選択される前記［２２］に記載の医薬キット。
［２４］
前記腫瘍標的化治療薬が、ＨＥＲ２、Ｔｒｏｐ－２、ネクチン－４（Ｎｅｃｔｉｎ－４）、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２又はＣＤ７９ｂ標的化ＡＤＣである前記［２２］に記載の医薬キット。
［２５］
前記腫瘍標的化治療薬が、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ＪＷＣＡＲ－０２９、ＩＭ１９ＣＡＲ－Ｔ、ＣＮＣＴ１９、ＢＺ０１９、ＨＤ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ、ｐＣＡＲ－１９Ｂ、ＣＤ１９－ＣＡＲＴ、ＣＴ０３２、ｉＰＤ１ ＣＤ１９ ｅＣＡＲ－Ｔ、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ、ＣＴ１０３Ａ、ＣＡＲ－ＢＣＭＡ Ｔ、ＡＵ－１０１、４ＳＣＡＲ－ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ－ＣＡＲＴ、Ｐ－ＰＳＭＡ－１０１、Ｃ－ＣＡＲ０６６、ＭＢ－ＣＡＲＴ２０．１、ＰＢＣＡＲ２０Ａ、ＬＢ１０９５、ＬＢ１９０１、ＰＲＧＮ－３００６、ＡＭＧ５５３、ＣＴ０４１、ＣＤ３０．ＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＧＰＣ３ Ｔからなる群から選択される前記［２２］に記載の医薬キット。
［２６］
前記腫瘍標的化治療薬が、ビーリンサイト（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）（登録商標）、ＡＭＧ４２０、ＰＦ－３１３５及びＧＢＲ１３０２からなる群から選択される前記［２２］に記載の医薬キット。
［２７］
前記腫瘍標的化治療薬が、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）、エンハーツ（Ｅｎｈｅｒｔｕ）（登録商標）、ＳＨＲ－Ａ１８１１、ＴＡＡ０１３、ＲＣ－４８、ＢＡＴ８００１、ＡＲＸ７８８、Ａ１６６、トロデルヴィ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（登録商標）、ＢＡＴ８００３、ＤＡＣ－００２、ＤＳ－１０６２、ＳＫＢ２６４、ＲＣ－１０８、ＴＲ１８０１－ＡＤＣ、パドセブ（Ｐａｄｃｃｖ）（登録商標）、ポライビー（Ｐｏｌｉｖｙ）（登録商標）、アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）（登録商標）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）、ブレンレップ（Ｂｌｅｎｒｅｐ）（登録商標）、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ＡＤＣＴ－４０２、ＰＴＫ７－ＡＤＣ及びＴＲＳ００５からなる群から選択される前記［２２］に記載の医薬キット。
［２８］
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）であって、
前記ｏＨＳＶのゲノムには、少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、腫瘍細胞における前記ｏＨＳＶの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示される遺伝子改変ｏＨＳＶ。
［２９］
前記［２８］に記載のｏＨＳＶと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。

配列：
本開示に記載のアミノ酸又は核酸配列は、以下の表１において提供される。

（実施例）
ｏＨＳＶ－１ Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３、Ｔ７２０４、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３の構築：
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ－１）Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３及びＴ７２０４は、ＩＬ－１２、抗ＰＤ－１抗体、ＣＣＬ５、及びバイオマーカーとして機能する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の１つの切断された非シグナル伝達性の変異体のコード配列を保有している。Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３及びＴ７２０４によって発現されるバイオマーカーとしての切断された非シグナル伝達性の変異体は、それぞれ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２及びＨＥＲ２である。図１のＣは、Ｔ７２０１～Ｔ７２０４のウイルスバックボーンの模式図を示す。

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ－１）Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３は、ＩＬ－１２、抗ＰＤ－１抗体、ＣＣＬ５、及びバイオマーカーとして機能する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の２つの切断された非シグナル伝達性の変異体のコード配列を保有している。Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３によって発現されるバイオマーカーとしての切断された非シグナル伝達性の変異体は、それぞれ、ＣＤ１９プラスＢＣＭＡ、ＣＤ１９プラスＴｒｏｐ－２、及びＣＤ１９プラスＨＥＲ２である。図１のＤは、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３のウイルスバックボーンの模式図を示す。図２は、Ｔ７シリーズｏＨＳＶの構築のフローチャートを示す。

Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列（配列番号１）によって連結された２つのバイオマーカー及びＣＣＬ５のコード配列は、ＨＳＶ－１最初期遺伝子プロモーター（ＩＥ４／５プロモーター）によって駆動される１つのオープンリーディングフレーム内で翻訳される。発現カセットは、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子との間に挿入される。

また、Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３、Ｔ７２０４、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３は、ＵＬ３とＵＬ４との間の抗ヒトＰＤ－１抗体発現カセットの挿入と、ＩＬ－１２発現カセットによって置き換えられた、改変された内部反復（ＩＲ）領域とを含む。組換えウイルスは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムを利用していくつかのステップで構築された。ウイルス構築の詳細は、以下に説明されるとおりである。

それぞれ２セットのプライマー（（配列番号２、３）及び（配列番号４、５））によってＨＳＶ－１ウイルスゲノムからＰＣＲ増幅された野生型ゲノムの場合、上流にヌクレオチド１１７００５、下流にヌクレオチド１３２０９６に隣接するＩＬ－１２発現カセットを、遺伝子置換プラスミドｐＫＯ５に挿入してｐＫＯ１４０７を生成した。次に、電気穿孔法によりｐＫＯ１４０７を野生型ＢＡＣを備える大腸菌にトランスフェクトしてＢＡＣ－Ｔ２０１０を生成した。次に、それぞれ２セットのプライマー（（配列番号６、７）及び（配列番号８、９））によってＨＳＶ－１ウイルスゲノムからＰＣＲ増幅された野生型ゲノムの場合、上流にヌクレオチド１１６５８、下流にヌクレオチド１１６５９に隣接する抗ＰＤ－１抗体遺伝子を駆動するＣＭＶプロモーターのカセットを、ＢｇｌＩＩ及びＰａｃＩ部位でｐＫＯ５に連結して、ｐＫＯＥ１００２プラスミドを生成した。次に、電気穿孔法によりｐＫＯＥ１００２プラスミドをＢＡＣ－Ｔ２０１０を含有する大腸菌にトランスフェクトしてＢＡＣ－Ｔ３０１１を生成した。１つ又は２つのバイオマーカー（即ち、腫瘍関連／特異的抗原）及びＣＣＬ５遺伝子を含有する発現カセットは、野生型ゲノムの場合、上流にヌクレオチド８４２２０、下流にヌクレオチド８４２２１に隣接した。上流及び下流のフランキング配列をそれぞれ２セットのプライマー（（配列番号１０、１１）及び（配列番号１２、１３））によってＨＳＶ－１ウイルスゲノムからＰＣＲ増幅した。バイオマーカー、ＣＣＬ５、及びフランキング配列を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ及びＰａｃＩ部位でｐＫＯ５へ連結して、ｐＫＯ７２０１、ｐＫＯ７２０２、ｐＫＯ７２０３、ｐＫＯ７２０４、ｐＫＯ７０１１、ｐＫＯ７０１２及びｐＫＯ７０１３プラスミドを生成した。次に、電気穿孔法によりｐＫＯ７２０１、ｐＫＯ７２０２、ｐＫＯ７２０３、ｐＫＯ７２０４、ｐＫＯ７０１１、ｐＫＯ７０１２及びｐＫＯ７０１３プラスミドをＢＡＣ－Ｔ３０１１を含む大腸菌にトランスフェクトして、ＢＡＣ－Ｔ７２０１、ＢＡＣ－Ｔ７２０２、ＢＡＣ－Ｔ７２０３、ＢＡＣ－Ｔ７２０４、ＢＡＣ－Ｔ７０１１、ＢＡＣ－Ｔ７０１２、ＢＡＣ－Ｔ７０１３をそれぞれ生成した。Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３、Ｔ７２０４、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３ウイルスは、対応するＢＡＣプラスミドのトランスフェクションと、その後のベロ（Ｖｅｒｏ）細胞におけるプラーク精製及び増幅のいくつかのステップによって得られた。

ウイルス滴定：
プラーク形成アッセイによってウイルスの力価を測定した。簡単に説明すると、ウイルスストック溶液を段階的に希釈し、次にＴ２５フラスコに単層ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を接種した。２時間の吸収後、培地を、１％のＦＢＳプラス０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のヒトプール免疫グロブリンを補充したＤＭＥＭ培地と７２時間交換した。細胞を無水メタノールで５分間固定し、蒸留水ですすぎ、クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、感染性ウイルス粒子の力価を計算した。Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３の力価を以下の表２に示し、Ｔ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３及びＴ７２０４の力価を表４に示す。

ウイルス感染後のＣＣＬ５分泌の検出：
ヒト胎児腎臓２９３Ｔ、ヒト喉頭がんＨｅｐ－２及びヒト舌扁平上皮がんＴｃａ８１１３細胞を１×１０^６個の細胞／フラスコの密度でＴ２５フラスコに接種した。一晩インキュベートした後、細胞を模擬感染させたか又は１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１１で感染した。２時間のインキュベーション後、接種材料を新鮮な培地と交換した。ＣＣＬ５の分泌を定量するためのＥＬＩＳＡアッセイに備え、感染後０、４、８、１２、２４、４８、７２及び９６時間で細胞上清を収集した。図３は、２９３Ｔ、Ｈｅｐ－２及びＴｃａ８１１３細胞におけるＴ７０１１感染後のＣＣＬ５の放出を示す。ＣＣＬ５の発現及び放出は速くて強力であった。感染後４時間で既に、分泌されたＣＣＬ５が検出され、最大５０００ｐｇ／ｍＬに達した。Ｔ７０１１ウイルス感染後、分泌は安定しており、少なくとも４日間保持された。これでＣＣＬ５が分泌されることが示された。

ＥＬＩＳＡアッセイによるＩＬ－１２、抗ＰＤ－１抗体及びＣＣＬ５の発現：
ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞を６×１０^６個の細胞／フラスコの密度でＴ１５０フラスコに接種した。一晩インキュベートした後、０．０１ＰＦＵ／細胞でＴ７２０１、Ｔ７２０２、Ｔ７２０３、Ｔ７２０４、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３で細胞を感染した。感染後４８時間で回収された細胞上清は、ＩＬ－１２、抗ＰＤ－１抗体及びＣＣＬ５の発現レベルを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイに使用した。結果を表３及び表４に示した。表３に示されるように、ＣＣＬ５の発現は、テストされたウイルスにおいて高レベルであり、非常に安定していた。ＩＬ－１２及びＰＤ－１ Ａｂの発現は、Ｔ７０１１とＴ７０１３とで実質的に同じであったが、Ｔ７０１２は最も高いＩＬ－１２発現と最も低いＰＤ－１ Ａｂ発現を示した。

免疫蛍光アッセイによる細胞表面における切断されたＣＤ１９、ＢＣＭＡ、Ｔｒｏｐ－２、ＨＥＲ２の発現及び提示：
Ｈｅｐ－２細胞（４×１０^５）を６ウェルプレートの個々のウェルのカバーガラスに接種し、２４時間インキュベートして細胞を接着させた。次に、細胞を模擬感染させたか又はそれぞれ５ＰＦＵ／細胞でＴ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３ウイルスに１時間露出させた。接種材料を新鮮な培地と交換した。ＰＢＳで細胞をすすぎ、室温で指定された時間に、４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、次に５％のスキムミルクでブロックした。Ｔ７０１１に感染した細胞を、それぞれ、ＣＤ１９に対する抗体（カタログ番号３０２２０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＢＣＭＡに対する抗体（カタログ番号ＮＢＰ１－９７６３７、Ｎｏｖｕｓ）で共染色し、Ｔ７０１２に感染した細胞を、それぞれ、ＣＤ１９に対する抗体（カタログ番号３０２２０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＴｒｏｐ－２に対する抗体（カタログ番号ＰＡ５－４７０３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で共染色し、Ｔ７０１３に感染した細胞を、それぞれ、４℃でＣＤ１９に対する抗体（カタログ番号３０２２０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、一次ＨＥＲ２抗体（カタログ番号ＭＡＢ１１２９－１００、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩染色した。次に、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗マウス（カタログ番号Ａ３２７６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８結合抗ウサギ（カタログ番号Ａ１１０３６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８結合抗ヤギ（カタログ番号Ａ１１０５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体と室温で１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳで細胞を洗浄し、封入剤（カタログ番号８９６１Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に包埋した。ニコン共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＨＤ２５、倍率１２０倍）を使用して画像を取得及び処理し、図４に示す。図４から分かるように、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３によってそれぞれコードされる異なる切断された抗原が腫瘍細胞表面上に同時に発現された。

神経毒性研究：
６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを麻醉し、次に、ＨＳＶ－１（Ｆ）、Ｔ３０１１、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２又はＴ７０１３ウイルスの希釈ごとに、８匹のマウスの群で１０倍段階希釈液５０μＬを頭蓋内注射した。模擬治療対照群として同量の１０％のグリセリンを含有するＤＰＢＳを接種した。マウスを１４日間監視し、リード＆ミュンヒ（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ’ｓ）法に従って死亡率データから５０％致死量（ＬＤ_５０）を計算した。

以下の表５に示されるように、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２、Ｔ７０１３及びＴ３０１１のＬＤ_５０値は、それぞれ、ＨＳＶ－１（Ｆ）より１５８倍、３１６倍、１００倍、２６８倍高く、Ｔ３０１１ウイルスと同じように、ＨＳＶ－１（Ｆ）に比べて、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３の神経毒性が著しく減弱されたことが示された。

Ｔ７シリーズｏＨＳＶウイルスの抗腫瘍活性：
腫瘍細胞を１００００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、細胞を０．０１、０．１、１、５、１０、３３．３３及び１００ＰＦＵ／細胞でＴ３０１１、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３で感染し、３回繰り返した。感染後（ｐ．ｉ．）４８時間で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。メーカーの指示に従って細胞増殖阻害率を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを用量反応曲線に当てはめることによって、ウイルス感染による５０％の細胞増殖阻害をもたらす濃度（ＩＣ_５０）（ＰＦＵ／細胞）を計算した。

図５に示されるように、Ｔ７シリーズウイルスのＩＣ_５０値はＴ３０１１と同等であり、Ｔ７シリーズウイルスはＴ３０１１に比べて同様の広範な抗腫瘍活性を備えることが示された。一方、ＨＣＴ１１６、Ｈｅｐ－２、ＰＣ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ３７５細胞のＩＣ_５０値は他の腫瘍細胞株よりわずかに高いことから、これらの細胞株はＴ７シリーズウイルスの感染に対して比較的耐性があることが示され、更なるコンボ研究のために選択された。

Ｔ７シリーズｏＨＳＶウイルスの感染活性：
Ｈｅｐ－２細胞、形質導入されていない正常なＴ細胞及びＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を５×１０^５個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに接種し、１ＰＦＵ／細胞でＨＳＶ－１（Ｆ）、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３で感染した。感染後２４及び４８時間（ｈ）で細胞ペレットを収集し、次にＰＢＳで洗浄した。次に細胞ペレットをＤＰＢＳ＋１０％のグリセリンで再懸濁し、次に３つの凍結融解サイクルを行った。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞上でウイルス子孫を滴定した。

図６に示されるように、全てのウイルス感染Ｈｅｐ－２細胞におけるウイルス収量は、正常なＴ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞におけるウイルス収量より著しく高い。特に、正常なＴ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞の両方におけるＴ７シリーズウイルスの収量は、感染後２４時間又は４８時間でどちらも１０^３ＰＦＵ／ｍＬ以下である。これらの結果は、野生型ＨＳＶ－１（Ｆ）ウイルスがＣＡＲ－Ｔ又は正常なＴ細胞において感染活性が低いが、弱毒化Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３ウイルスは感染活性を持たないことを示している。

Ｔ７シリーズｏＨＳＶウイルスの細胞殺傷活性：
ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９）細胞及び形質導入されていない正常なＴ細胞を４×１０^４個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、０．０１、０．１、１及び１０ＰＦＵ／細胞でＴ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３で感染し、３回繰り返した。感染後（ｐ．ｉ．）２４及び４８時間で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図７に示されるように、Ｔ７シリーズウイルス感染時、細胞生存率は低下しておらず、Ｔ７シリーズウイルスはＣＡＲ－Ｔ又は正常なＴ細胞に対してどちらも細胞殺傷活性を持たないことが証明された。

Ｔ７０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用の抗腫瘍効果：
ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、０．０１、０．０３、０．１、０．３及び１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１１を用いるか又は用いずに細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比４：１で、４×１０^４細胞／ウェルでＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９又はＴ細胞を加えた。形質導入されていない正常なＴ細胞を対照とした。２４時間の共培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図８に示されるように、Ｔ７０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用は、単剤よりも６０％以上高い効果を示す。この結果は、抗腫瘍効果が、Ｔ７０１１及びＣＡＲ－Ｔ単独群に比べて、Ｔ７０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９併用処理群において著しく向上されることを実証している。対照的に、Ｔ７０１１と正常なＴ細胞の併用治療はわずかな抗腫瘍効果を示す。

さらに、ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１１又はＴ３０１１を用いるか又は用いずに細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、更なる２４時間の共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比４：１で、４×１０^４細胞／ウェルでＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９細胞を加えた。未処理の細胞を未処理対照とした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図９に示されるように、単一処理群及びＴ３０１１とＣＡＲ－Ｔ併用処理群に比べて、Ｔ７０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用治療だけが細胞生存率を著しく低下させた。対照として、Ｔ３０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用は効果がない。これらの結果の全ては、Ｔ７０１１ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。

Ｔ７０１２とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用の抗腫瘍効果：
ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、０．０１、０．０３、０．１、０．３及び１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１２を用いるか又は用いずに細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比４：１で、４×１０^４細胞／ウェルでＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９又はＴ細胞を加えた。形質導入されていない正常なＴ細胞を対照とした。２４時間の共培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１０に示されるように、Ｔ７０１２とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用は、単剤よりも５０％以上高い効果を示す。この結果は、抗腫瘍効果が、Ｔ７０１２及びＣＡＲ－Ｔ単独群に比べて、Ｔ７０１２とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９併用群において著しく向上されることを実証している。対照的に、Ｔ７０１２と正常なＴ細胞の併用はわずかな抗腫瘍効果を示す。

さらに、ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１２又はＴ３０１１を用いるか又は用いずに細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、更なる２４時間の共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比４：１で、４×１０^４細胞／ウェルでＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９細胞を加えた。未処理の細胞を未処理対照とした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１１に示されるように、単一処理群及びＴ３０１１とＣＡＲ－Ｔ併用処理群に比べて、Ｔ７０１２とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用治療だけが細胞生存率を著しく低下させた。対照として、Ｔ３０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用は効果がない。これらの結果の全ては、Ｔ７０１２ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。

Ｔ７０１３とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用の抗腫瘍効果：
ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、０．０１、０．０３、０．１、０．３及び１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１３を用いるか又は用いずに細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比４：１で、４×１０^４細胞／ウェルでＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９又はＴ細胞を加えた。形質導入されていない正常なＴ細胞を対照とした。２４時間の共培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１２に示されるように、Ｔ７０１３とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用は、単剤よりも６０％以上高い効果を示す。この結果は、抗腫瘍効果が、Ｔ７０１３及びＣＡＲ－Ｔ単独群に比べて、Ｔ７０１３とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９併用群において著しく向上されることを実証している。対照的に、Ｔ７０１３と正常なＴ細胞の併用はわずかな抗腫瘍効果を示す。

さらに、ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、１ＰＦＵ／細胞でＴ７０１３又はＴ３０１１を用いるか又は用いずに細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、更なる２４時間の共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比４：１で、４×１０^４細胞／ウェルでＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９細胞を加えた。未処理の細胞を未処理対照とした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１３に示されるように、単一処理群及びＴ３０１１とＣＡＲ－Ｔ併用処理群に比べて、Ｔ７０１３とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用治療だけが細胞生存率を著しく低下させた。対照として、Ｔ３０１１とＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の併用は効果がない。これらの結果の全ては、Ｔ７０１３ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。

ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞及びＮＫ細胞におけるＴ７シリーズ（Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３）ｏＨＳＶウイルスの細胞殺傷活性：
当分野で知られる方法に従ってＰＢＭＣからＮＫ細胞を分離した。ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＮＫ（ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９）細胞及び形質導入されていない正常なＮＫ細胞を４×１０^４個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、０．０１、０．１、１及び１０ＰＦＵ／細胞でＨＳＶ－１（Ｆ）、Ｔ７０１１、Ｔ７０１２及びＴ７０１３で感染し、３回繰り返した。感染後（ｐ．ｉ．）２４、４８時間及び７２時間で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１４に示されるように、Ｔ７シリーズウイルス感染時、細胞生存率は低下しておらず、Ｔ７シリーズウイルスはＣＡＲ－ＮＫ細胞又は正常なＮＫ細胞に対してどちらも細胞殺傷活性を持たないことが証明された。

ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞及びＮＫ細胞におけるＨＳＶ－１（Ｆ）及びＴ７０１１のウイルス複製：
ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞及びＮＫ細胞を５×１０^５個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに接種し、ＩＬ－２の存在下（＋ＩＬ－２）又はＩＬ－２の非存在下で、１ＰＦＵ／細胞で、ＨＳＶ－１（Ｆ）及びＴ７０１１で感染した。感染後２、２４、４８及び７２時間（ｈ）で細胞ペレットを収集した。次に、ＰＢＳで細胞ペレットを洗浄し、次にＤＰＢＳ＋１０％のグリセリンで再懸濁し、凍結融解を３回行った。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞上でウイルス子孫を滴定した。

図１５に示されるように、Ｔ７０１１ウイルスは、ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞又は正常なＮＫ細胞において感染活性を持たない。

ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞の増殖に対するＴ７０１１の影響：
ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞を５×１０^５個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに接種し、ＩＬ－２の存在下（＋ＩＬ－２）又はＩＬ－２の非存在下で、０．１又は１ＰＦＵ／細胞でＨＳＶ－１（Ｆ）及びＴ７０１１を用いるか又は用いずに感染した。感染後２４、４８及び７２時間（ｈ）で細胞ペレットを収集し、トリパンブルー染色によって生細胞を測定した。

図１６に示されるように、Ｔ７０１１は、ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞の増殖に対して負の影響を及ぼさない。

ＣＡＲ－ＮＫ細胞の増殖に対するＴ７０１１の影響：
ＮＫ細胞を５×１０^５個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに接種し、ＩＬ－２の存在下（＋ＩＬ－２）又はＩＬ－２の非存在下で、０．１又は１ＰＦＵ／細胞でＨＳＶ－１（Ｆ）及びＴ７０１１を用いるか又は用いずに感染した。感染後２４、４８及び７２時間（ｈ）で細胞ペレットを収集し、トリパンブルー染色によって生細胞を測定した。

図１７に示されるように、Ｔ７０１１は、ＮＫ細胞の増殖に対して負の影響を及ぼさない。

Ｔ７０１１とＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９の併用の細胞殺傷効果：
ヒト喉頭がん細胞Ｈｅｐ－２、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５及びヒト前立腺がんＰＣ－３細胞を９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、０．０１、０．１及び１ＰＦＵ／細胞で、Ｔ７０１１で細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比２：１でＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞を加えた。さらに２４時間又は４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１８に示されるように、Ｔ７０１１とＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９の併用は、単剤よりも高い効果を示した。

さらに、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５細胞を１×１０^４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、１ＰＦＵ／細胞で、ＮＫ、ＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９又はＴ７０１１で細胞を感染し、３回繰り返した。感染後２４時間で、更なる２４時間の共培養のために、エフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）の比２：１でＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９細胞又はＮＫ細胞を加えた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。

図１９に示されるように、単一処理群及びＴ７０１１とＮＫ併用処理群に比べて、Ｔ７０１１とＣＡＲ－ＮＫ^ＣＤ１９の併用治療は細胞生存率を著しく低下させている。これらの結果の全ては、Ｔ７０１１ウイルス感染が、ＣＡＲ－Ｔ^ＣＤ１９の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。

Claims (10)

1. 遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１型（ｏＨＳＶ－１）であって、
   前記ｏＨＳＶのゲノムには、
   （ａ）少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び
   （ｂ）少なくとも１つのケモカイン
   をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、
   前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも１つのケモカインの発現はＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、
   腫瘍細胞における前記ｏＨＳＶ－１の複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、前記腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために前記少なくとも１つのケモカインが発現及び放出され、
   前記ｏＨＳＶ－１が、前記ｏＨＳＶ－１の核酸の断片が欠失されるようにさらに改変され、前記ｏＨＳＶ－１の核酸の前記断片が、Ｆ株のＰプロトタイプゲノムの位置１１７００５～１３２０９６であり、
   前記ｏＨＳＶ－１が、ＩＬ－１２及び抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片をコードするためにさらに改変され、
   前記ポリヌクレオチドが、
   （ｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
   （ｉｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
   （ｉｉｉ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体、ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
   （ｉｖ）ＣＤ１９の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
   （ｖ）Ｔｒｏｐ－２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、
   （ｖｉ）ＢＣＭＡの切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５、又は
   （ｖｉｉ）ＨＥＲ２の切断された非シグナル伝達性の変異体及びＣＣＬ５をコードし、かつ
   前記切断された非シグナル伝達性の変異体が、細胞外ドメイン又は細胞外－膜貫通ドメインである、遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
2. 前記ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターが、ＨＳＶ－１の、ＩＥ１（ＩＣＰ０プロモーター）、ＩＥ２（ＩＣＰ２７プロモーター）、ＩＥ３（ＩＣＰ４プロモーター）及びＩＥ４／５（ＩＣＰ２２及びＩＣＰ４７プロモーター）からなる群から選択される請求項１に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
3. 前記ポリヌクレオチドがＵＬ３７とＵＬ３８との間に挿入される請求項１に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
4. 前記ＨＳＶの最初期遺伝子プロモーターが、ＨＳＶ－１の最初期遺伝子プロモーターＩＥ４／５である請求項１に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
5. ＰｏｌｙＡ尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードする前記ポリヌクレオチドの下流に位置する請求項１に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
6. 前記腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である請求項１に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
7. 前記腫瘍細胞は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記腫瘍関連／特異的抗原を発現しない請求項１に記載の遺伝子改変ｏＨＳＶ－１。
8. 請求項１に記載のｏＨＳＶ－１と、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも１つの腫瘍関連／特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キットであって、
   前記腫瘍標的化治療薬が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＢｉＴＥ及びＡＤＣからなる群から選択される医薬キット。
9. 前記腫瘍標的化治療薬が、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ－ＮＫ細胞及びＣＤ１９標的化ＢｉＴＥからなる群から選択される、又は
   前記腫瘍標的化治療薬が、ＨＥＲ２、Ｔｒｏｐ－２、又はＢＣＭＡ標的化ＡＤＣである請求項８に記載の医薬キット。
10. 前記腫瘍標的化治療薬が、テカルタス（Ｔｅｃａｒｔｕｓ）（登録商標）、キムリア（Ｋｙｍｒｉａｈ）（登録商標）、イエスカルタ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）（登録商標）、ビーリンサイト（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）（登録商標）、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）（登録商標）、エンハーツ（Ｅｎｈｅｒｔｕ）（登録商標）、トロデルヴィ（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ）（登録商標）、及びブレンレップ（Ｂｌｅｎｒｅｐ）（登録商標）からなる群から選択される請求項８に記載の医薬キット。