JP2024511211A - ケモカイン及び腫瘍関連/特異的抗原を送達する遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス - Google Patents
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Abstract
少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体及び少なくとも1つのケモカインをコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が開示される。前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために前記ケモカインが発現及び放出される。遺伝子改変oHSVは、CAR-T、ADC及び/又はBiTE療法と併用できる。【選択図】なし
Description
本開示は、少なくとも1つのケモカイン及び/又は少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原をコードする遺伝子を保有するように遺伝子操作された腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、及びの様々な腫瘍を治療するための、CAR-T、BiTE及びADCを含む腫瘍標的化治療薬との併用によるその使用に関する。
血液悪性腫瘍患者へのCAR-T細胞の養子移植は驚くべき結果を示している。しかし、この方法は、固形腫瘍患者において殆ど効果がない。殆どのがんにおいて、CAR-T細胞療法だけで完全応答を誘導するのに十分であることは不可能なようである。CAR-T細胞を、作用機序が異なり、T細胞と相乗効果を発揮する可能性のある他のがん治療と併用することで、腫瘍の逃避を低減し、CAR-T細胞療法の成功率を高める可能性がある。
腫瘍溶解性ウイルス療法は、がん細胞内で選択的に複製する天然の又は遺伝子改変ウイルスを使用してがんを治療する治療法である。FDAがタリモジンラヘルパレプベク(Talimogene laherparepvec、T-VEC)(GM-CSFを発現するように改変された腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1))を承認した後、腫瘍溶解性ウイルス療法分野は新たな注目を集めている。さらに、腫瘍溶解性ウイルス(OV)をさらに改変して、治療用導入遺伝子を腫瘍微小環境に選択的に送達することによって、その抗腫瘍効果を向上させ、又は抗腫瘍免疫応答を促進することができる。CAR-T細胞と、サイトカイン、ケモカイン、BiTE又は免疫チェックポイント阻害剤を装備した腫瘍溶解性ウイルスを併用する前臨床研究では、治療効果が向上した。例えば、IL-15及びRANTES又はIL-2及びTNF-αを発現するように改変された腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍微小環境におけるCAR-T細胞の蓄積及び生存を増加させることが示されている。CXCR3リガンドであるCXCL11を発現するワクシニアウイルスは、CAR-T細胞の腫瘍内輸送を向上させるために導入後にエフェクター細胞を誘引するために使用された。別の報告では、第2の腫瘍抗原を標的とするBiTEの腫瘍溶解性アデノウイルスの発現により、抗原発現の不均一性に対処できることが実証された。CAR-T細胞と装備されたOVのこれらの全ての併用は、予想通り、各薬剤による単独療法に比べて、いずれも腫瘍制御の向上及び生存期間の延長をもたらした。
腫瘍選択的送達のために、非シグナル伝達性の切断されたCD19(CD19t)タンパク質を発現するように腫瘍溶解性ウイルスを操作した最近の研究は、CD19-CAR T細胞の標的化を可能にする。CD19t(OV19t)をコードする腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで腫瘍細胞を感染させる場合、ウイルスによって媒介される腫瘍溶解よりも先に、細胞表面に新たにCD19が産生された。共培養されたCD19-CAR T細胞は、サイトカインを分泌し、感染した腫瘍に対して効果的な細胞溶解活性を示した。いくつかのマウス腫瘍モデルを使用すると、OV19tの送達により、CD19-CAR T細胞の投与後に腫瘍制御が促進された。OV19tは、内因性の及び養子移植されたT細胞の腫瘍浸潤を特徴とする局所免疫を誘導した。CAR T細胞によって媒介される腫瘍の死滅は死亡途上の腫瘍細胞からのウイルスの放出も誘導し、これにより腫瘍におけるCD19tの発現を促進した。当該研究では、この併用療法で治療したマウスの50%以上が治愈されたが、一部のマウスは一時的に反応したか反応しなかった(Park et al., Sci.Transl.Med.12,eaaz1863(2020))。
US20190233536A1では、それぞれが、少なくとも2つの結合ドメインを含み、ドメインの少なくとも1つが、対象となる免疫細胞、例えば、対象となるT細胞上の表面抗原に特異的である少なくとも2つの二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)によって装備された改変アデノウイルス、特にエナデノツシレフ(Enadenotucirev、EnAd)が開示された。アデノウイルスにBiTE分子を装備すると、二重特異性抗体断片分子は、アデノウイルスのがん細胞への選択的感染能力に「便乗」することができ、これによって腫瘍細胞へのBiTEの標的化送達が可能になる。アデノウイルスに感染すると、BiTE分子は腫瘍細胞によって合成され、分泌されて局所的に作用し、ウイルスの直接的なフットプリントを超えて広がる。したがって、これにより、BiTEが直接的な感染部位を超えて広がることが可能になるが、感染した腫瘍細胞巣をはるかに超えてウイルスが広がることが制限された。これにより、望ましくないオフターゲット効果のリスクが最小限に抑えられる。
本開示の第1態様は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)に関し、前記oHSVのゲノムには、(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)少なくとも1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び少なくとも1つのケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために少なくとも1つのケモカインが発現及び放出される。
本開示の別の態様は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)に関し、前記oHSVのゲノムには、少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示される。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)と、腫瘍標的化治療薬とを別々に含むがんの治療のための医薬キットに関し、前記腫瘍標的化治療薬は、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。
本開示の別の態様は、対象に薬学的有効量の遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)及び腫瘍標的化治療薬を同時に又は連続して投与することを含む、対象におけるがんの治療のための方法に関し、前記oHSVのゲノムには、(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び、好ましくは(b)少なくとも1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体、及び、好ましくは少なくとも1つのケモカインの発現は、HSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。
本開示の更なる態様は、図面を参照して以下に説明される詳細な説明から得やすいのだろう。
「発明の詳細な説明」
定義:
用語「一」又は「1つの」実体とは、当該実体の1つ又は複数を指すことに留意されたい。例えば、「1つの切断された非シグナル伝達性の変異体」は、1つ又は複数の切断された非シグナル伝達性の変異体を表すように理解される。したがって、用語「1つ又は複数」及び「少なくとも1つ」は、本明細書で入れ替えて使用することができる。
定義:
用語「一」又は「1つの」実体とは、当該実体の1つ又は複数を指すことに留意されたい。例えば、「1つの切断された非シグナル伝達性の変異体」は、1つ又は複数の切断された非シグナル伝達性の変異体を表すように理解される。したがって、用語「1つ又は複数」及び「少なくとも1つ」は、本明細書で入れ替えて使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、抗体の一部であり、例えば、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFvなどである。構造に関わらず、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。用語「抗体断片」には、アプタマー、シュピーゲルマー及びダイアボディが含まれる。用語「抗体断片」には、特定の抗原と結合して複合体を形成することによって抗体のように作用するいずれの合成の又は遺伝子操作されたタンパク質も含まれる。
本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、その変異体又は誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体又はキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab’及びF(ab’)2、Fd、Fvs、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs(sdFv))、VK又はVHドメインを含む断片、Fab発現ライブラリーによって産生される断片、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細書に開示されているLIGHT抗体に対する抗Id抗体を含む)を含み、ただしそれらに限定されない。本開示の免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであってもよい。例えば、抗PD-1抗体は、その抗原結合断片、例えば、Fab断片又はそのscFvを指してもよい。
「特異的に結合する」、「に特異的な」又は「に特異性を有する」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び、当該結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の何らかの相補性を伴うことを意味する。当該定義によれば、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するのが、ランダムで無関係なエピトープに結合するよりも容易である場合に、当該抗体はエピトープに「特異的結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、特定の抗体の特定のエピトープに結合する相対的親和性を定量化するために用いられる。例えば、抗体「A」は、抗体「B」よりも与えられたエピトープに対して高い特異性を備えると見なされる場合もあれば、抗体「A」は、関連するエピトープ「D」に対してよりも高い特異性でエピトープ「C」に結合すると言ってもよい。
本明細書で使用される場合、本明細書で入れ替えて使用される「がん」又は「腫瘍」とは、本開示に従って治療することができ、体の他の部位に浸潤し又は広がる可能性のある異常な細胞増殖を伴う疾患群を意味する。全ての腫瘍ががん性であるわけではなく、良性腫瘍は体の他の部位に広がらない。可能な兆候及び症状は、新たなしこり、異常な出血、長引く咳、原因不明の体重減少、排便の変化などを含む。人間に影響を与える既知のがんは100種類以上ある。本明細書で使用される場合、「がん」は、固形がん(例えば、腫瘍)、血液悪性腫瘍を含み、ただしそれらに限定されない。「血液悪性腫瘍」は、血液がんとしても知られ、例えば、骨髓又は免疫系の他の細胞などの造血組織に起源をもつがんである。血液悪性腫瘍は、白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML)、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、急性混合系統白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病(CLL)、有毛細胞白血病及び大顆粒リンパ球性白血病)、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性疾患(真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症及び慢性骨髄性白血病)、リンパ腫、多発性骨髄腫、MGUS及び類似する疾患、ホジキン(Hodgkin’s)リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、T細胞リンパ腫及び他のB細胞悪性腫瘍を含み、ただしそれらに限定されない。「固形がん」は、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児腫瘍、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎盂がん、中枢神経系(CNS)腫瘍、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫(Kaposi’s sarcoma)、類表皮がん、扁平上皮がん、アスベストによって誘発されるがんを含む環境誘発がんを含み、ただしそれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「処理」又は「治療」とは、治療的処理及び予防的手段の両方を指し、その目的は、例えば、がんの進行などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防し又は遅延させる(軽減する)ことである。有益な又は望ましい臨床結果は、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化(即ち、悪化しないこと)、疾患進行の遅延又は減速、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解(部分的か完全かは問わない)を含み、ただしそれらに限定されず、検出可能か検出不能かは問わない。「治療」は、治療を受けない場合の予想される生存期間に比べて生存期間を延長させることも意味する。治療を必要とする対象は、既にその状態若しくは障害にかかっている者、及びその状態若しくは障害にかかりやすい者、又はその状態若しくは障害を予防すべき者を含む。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は治療が望まれるいずれの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、農場及び動物園の動物、競技動物、又はペット、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療を必要とする患者に」又は「治療を必要とする対象」などの語句には、本開示の、例えば、検出、診断手順及び/又は治療のためのoHSV-1又は組成物の投与から利益を得るだろう対象、例えば、哺乳動物対象が含まれる。
また、本明細書に開示されている改変ゲノムは、それらが由来する改変ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なるように改変されてもよいということが当業者には理解されるだろう。例えば、指定されたDNA配列に由来するポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、開始配列に類似するものであってもよく、例えば、開始配列に対して一定のパーセントの同一性を有し、例えば、それは開始配列に対して60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%同じであってもよい。
さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存的置換又は変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失又は挿入が行われてもよい。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、1つ又は複数の別個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個又はそれ以上の別個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を除いて、開始配列と同じであってもよい。特定の実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、開始配列に対して1~5個、1~10個、1~15個又は1~20個の別個のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する。
「治療有効量」又は「有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、例えば、個体の疾患の状態、年齢、性別、個体の体重及び治療薬又は治療薬の併用の個体で所望の反応を引き出す能力などの要因に応じて変わってもよい。有効な治療薬又は治療薬の併用の例示的な指標は、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍負荷の軽減、腫瘍の成長の停止若しくは遅延、及び/又は体内の他の部位へのがん細胞の転移の欠如を含む。
CAR-T細胞は、キメラ抗原受容体を発現するT細胞である。CAR分子を発現するT細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、又はガンマデルタ(γδ)T細胞であってもよい。キメラ抗原受容体(CAR)は、1)細胞外リガンド結合ドメイン、即ち、抗原認識ドメイン、2)膜貫通ドメイン、及び3)シグナル伝達ドメインを含む組換え融合タンパク質である。細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドに結合できるオリゴ又はポリペプチドである。好ましくは、細胞外リガンド結合ドメインは、抗原、受容体、ペプチドリガンド、標的のタンパク質リガンド又は標的のポリペプチドであり得る細胞表面分子と相互作用することができる。本開示において、細胞外リガンド結合ドメインは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体と相互作用することができる。
一般的には、細胞外リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメインIによってキメラ抗原受容体(CAR)のシグナル伝達ドメインに連結される。膜貫通ドメインは、細胞膜を横断し、CARをT細胞の表面に固定し、細胞外リガンド結合ドメインをシグナル伝達ドメインに接続させ、T細胞の表面におけるCARの発現に影響を与える。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域をさらに含んでもよい。用語「ヒンジ領域」とは、一般的に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能するいずれのオリゴ又はポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインにより高い柔軟性及びアクセシビリティを提供するために用いられる。ヒンジ領域は、最大300個のアミノ酸、好ましくは10~100個のアミノ酸、最も好ましくは25~50個のアミノ酸を含んでもよい。ヒンジ領域は、天然に存在する分子、例えば、CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、CD3ζ、T細胞受容体α又はβ鎖、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154の全て若しくは一部に由来してもよいし、又は抗体定常領域の全て若しくは一部に由来してもよい。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、又はヒンジ領域は、完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。
キメラ抗原受容体(CAR)は、免疫細胞の活性化及び免疫応答をもたらす、標的への細胞外リガンド結合ドメインの結合後の細胞内シグナル伝達を担うCARのシグナル伝達ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパーT細胞活性であってもよい。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、特殊な機能を実行するよう細胞に指示するタンパク質の部分を指す。CARで使用するためのシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の結合後に協調して作用してシグナル伝達を開始させるT細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、及びこれらの配列のいずれの誘導体又は変異体、並びに同じ機能を持ついずれの合成配列であってもよい。シグナル伝達ドメインは、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、即ち、抗原依存性の一次活性化を開始させるもの、及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供するものを含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフであるITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。ITAMは、syk/zap70クラスのチロシンキナーゼの結合部位として機能する、様々な受容体の細胞質内の尾部に見られる、明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本開示で使用することができるITAMの非限定的な例は、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dに由来するものを含んでもよい。一実施形態では、CARのシグナル伝達ドメインは、少なくとも、80%、90%、95%、97%又は99%の配列同一性のアミノ酸配列を備えるCD3ζシグナル伝達ドメインを含んでもよい。本開示では、本明細書に記載の遺伝子操作されたoHSVといずれのCAR-Tの併用的使用が制限なく想定される。
典型的な抗体-薬物複合体(ADC)には、がん細胞の表面特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体には、CD20、CD22、及びヒト上皮成長因子受容体2(Her2)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)など、免疫系B細胞及びT細胞の表面にあるいくつかのタンパク質が含まれる。これらの抗体は、切断可能なリンカーユニットによって毒性の高い薬物に接続される。薬物は、不可逆的なDNA損傷を誘導し、又は細胞分裂を妨害することによって、がん細胞のアポトーシスを引き起こすように設計される。ADCには、がん細胞の表面特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体には、CD20、CD22、及びヒト上皮成長因子受容体2(Her2)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)など、免疫系B細胞及びT細胞の表面にあるいくつかのタンパク質が含まれる。これらの抗体は、切断可能なリンカーユニットによって毒性の高い薬物に接続される。薬物は、不可逆的なDNA損傷を誘導し、又は細胞分裂を妨害することによって、がん細胞のアポトーシスを引き起こすように設計される。
抗体薬物複合体(ADC)のメカニズムは、抗体によって特異的抗原を認識してそれと結合し、一連の反応を引き起こし、次にエンドサイトーシスにより細胞質に入り、そこで毒性の高い薬物がリソソーム酵素から解離されてがん細胞を死滅させることである。がん細胞と正常な組織の両方に無差別に損傷を引き起こす従来の化学療法と比べて、標的化薬物送達は、薬物をがん細胞に直接作用させ、正常な細胞への損傷を軽減することができる。典型的な抗体薬物複合体は、薬物、リンカーユニット及び抗体の3つの部分によって構成される。特定の抗体及び薬物の選択は、特定の疾患に依存し、複合体の安全性と有効性に重要な影響を与える。リンカーユニットの安定性と抗体への結合方式がADC薬物の開発において決定的な役割を果たす。抗体薬物複合体の有効性を決定する要因には、リンカーユニットの安定性と破断感受性、細胞表面の興奮内部移行、輸送、及び細胞毒素の放出が含まれる。本開示では、本明細書に記載のT7シリーズoHSVといずれのADCの併用的使用が制限なく想定される。
二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)は、T細胞のTCR複合体のCD3Eサブユニットに特異的であり、且つ、例えば、がん抗原など、対象となる抗原を標的とする比較的単純な二重特異性分子である。BiTEがTCR複合体に特異的であるため、BiTEは常在T細胞を活性化して、細胞表面に特定の標的抗原を発現する細胞、例えば、がん細胞を死滅させることができる。BiTEの重要な特性は、CD4+及び非活性化CD8+ T細胞ががん細胞を標的とすることを可能とする能力である。換言すれば、BiTEによって活性化されたT細胞に、細胞表面におけるMHC発現とは無関係に細胞を死滅させることができる。一部の腫瘍細胞はMHCを下方制御し、例えば、CAR-T細胞、immTACなどの薬剤に対する耐性を持たせるため、これが重要である。残念ながら、全長抗体に比べて、BiTEの循環動態は劣る。これは、患者に投与される時、BiTEの大部分が標的細胞に到達しないことを意味する。また、BiTEの一部として高親和性の抗CD3 ScFvを使用すると、血液中のT細胞との強い結合を引き起こす可能性があり、これも腫瘍への送達を妨げる。その結果、BiTEは、腫瘍細胞に効果的に送達できないため、抗がん療法としてのその潜在能力を最大限に発揮できなくなる。本開示では、本明細書に記載のoHSVといずれのBiTEとの併用的使用が制限なく想定される。
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍関連/特異的抗原」とは、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、又はその両方を意味する。例えば、用語「少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原」とは、少なくとも1つの腫瘍関連抗原又は少なくとも1つの腫瘍特異的抗原を意味し、腫瘍関連抗原と腫瘍特異的抗原の対を含んでもよい。例えば、用語「少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体」は、1つの腫瘍関連抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、2つ又は以上の腫瘍関連抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、1つの腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、2つ又は以上の腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、1つの腫瘍関連抗原と2つ又は以上の腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び2つ又は以上の腫瘍関連抗原と1つの腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体を含むことを意図する。例えば、用語「2つの腫瘍関連/特異的抗原」は、2つの腫瘍関連抗原、2つの腫瘍特異的抗原、及び1つの腫瘍関連抗原と1つの腫瘍特異的抗原の併用を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、特定の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の「バイオマーカー」、「切断された非シグナル伝達性の変異体」、「切断された変異体」又は「非シグナル伝達性の変異体」とは、シグナル伝達経路における野生型の対応物のシグナル伝達を無効にするために変異、欠失又は他の方式で改変された腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の変異体を指す。変異体は抗原の少なくとも一部のエピトープを露出させ、これにより変異体は野生型抗原に対して特異的に指向される抗体又はその抗原結合断片(例えば、scFv)によって結合され得る。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の一般的に知られる非シグナル伝達性の変異体は、抗原が膜貫通タンパク質である場合、抗原の細胞外ドメイン、抗原の細胞外-膜貫通ドメイン、又は細胞外ドメイン若しくは細胞外-膜貫通ドメインに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を備える等価物である。等価物は、シグナルを伝達できないが、抗原の細胞外ドメイン上のエピトープの少なくとも一部を露出させる。
例えば、CD19の非シグナル伝達性の変異体(本明細書では非シグナル伝達性のCD19とも呼ばれる)は、野生型CD19の323個のアミノ酸の細胞外-膜貫通ドメイン(配列番号14)である。非シグナル伝達性のBCMAは、野生型BCMAの77個のアミノ酸の細胞外-膜貫通ドメイン(配列番号15)である。非シグナル伝達性のHER2は、野生型HER2の675個のアミノ酸の細胞外-膜貫通ドメイン(配列番号16)である。非シグナル伝達性のTrop-2は、野生型Trop-2の297個のアミノ酸の細胞外-膜貫通ドメイン(配列番号17)である。
細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインは、当分野における日常的な実践によって困難なく得ることができる。様々な腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の細胞外/膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)を含む公的リソースより利用可能である。非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍細胞表面上に発現されると、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原に特異的な抗体又は抗体の抗原結合断片によって認識され、結合されることに留意されたい。抗原結合断片は、CAR-免疫細胞(例えば、CAR-T細胞又はCAR-NK細胞)又はBiTEの一部であってもよい。抗体は化学療法薬と結合してADCを形成する場合がある。しかし、非シグナル伝達性の変異体は、その野生型の対応物のようにシグナル伝達経路を誘発しない。当業者は、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の変異体が非シグナル伝達性であるかどうかをテスト及び検証することは容易であろう。例えば、野生型抗原について知られている正常なシグナル伝達経路における下流タンパク質のレベルを検出することによって決定されてもよい。
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV):
本開示は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)を提供する。遺伝子改変oHSVは、感受性細胞、例えば、固形腫瘍細胞における複製時、少なくとも1つの腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体を発現するように改変される。本発明者らは、腫瘍細胞における遺伝子改変oHSVの感染及び複製後の細胞表面上での異なる切断された腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の発現に成功したことを示した。非シグナル伝達性の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原が発現され、次に腫瘍細胞の表面に提示されると、当該腫瘍細胞が様々な抗原指向性療法、例えば、CAR-T療法の標的として標識される。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変oHSVは、感受性細胞、例えば、固形腫瘍細胞における複製時、少なくとも1つのケモカインを発現するようにさらに改変される。本発明者らは、感染後4時間で既に分泌ケモカインが検出されたことを示し、それはoHSVウイルス感染後に少なくとも4日間保持された。ケモカインの発現及び放出は、免疫細胞、例えば、T細胞又はCAR T細胞の感受性細胞への走化性を誘導し、これは腫瘍塊への免疫細胞の輸送及び浸潤を促進する。
本開示は、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)を提供する。遺伝子改変oHSVは、感受性細胞、例えば、固形腫瘍細胞における複製時、少なくとも1つの腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体を発現するように改変される。本発明者らは、腫瘍細胞における遺伝子改変oHSVの感染及び複製後の細胞表面上での異なる切断された腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原の発現に成功したことを示した。非シグナル伝達性の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原が発現され、次に腫瘍細胞の表面に提示されると、当該腫瘍細胞が様々な抗原指向性療法、例えば、CAR-T療法の標的として標識される。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変oHSVは、感受性細胞、例えば、固形腫瘍細胞における複製時、少なくとも1つのケモカインを発現するようにさらに改変される。本発明者らは、感染後4時間で既に分泌ケモカインが検出されたことを示し、それはoHSVウイルス感染後に少なくとも4日間保持された。ケモカインの発現及び放出は、免疫細胞、例えば、T細胞又はCAR T細胞の感受性細胞への走化性を誘導し、これは腫瘍塊への免疫細胞の輸送及び浸潤を促進する。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が提供され、前記oHSVのゲノムには、少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が提供され、前記oHSVのゲノムには、(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)少なくとも1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び少なくとも1つのケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が提供され、前記oHSVのゲノムには、(a)1つの腫瘍関連抗原又は1つの腫瘍特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が提供され、前記oHSVのゲノムには、(a)2つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、2つの同じ又は異なる腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、2つの同じ又は異なる腫瘍特異的抗原を含む。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、1つの腫瘍関連抗原及び1つの腫瘍特異的抗原を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が提供され、前記oHSVのゲノムには、(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)2つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、2つのケモカインは同じである。いくつかの実施形態では、2つのケモカインは異なる。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)が提供され、前記oHSVのゲノムには、(a)2つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)2つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、2つのケモカインは同じである。いくつかの実施形態では、2つのケモカインは異なる。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、2つの同じ又は異なる腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、2つの同じ又は異なる腫瘍特異的抗原を含む。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、1つの腫瘍関連抗原及び1つの腫瘍特異的抗原を含む。
したがって、本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子改変oHSVは、少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第1ポリヌクレオチド及び少なくとも1つのケモカインをコードする第2ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも1つのケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変oHSVは、第1腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第1ポリヌクレオチド、第2腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第2ポリヌクレオチド、及び1つのケモカインをコードする第3ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記ケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、腫瘍関連/特異的抗原、第1又は第2腫瘍関連/特異的抗原は、HER2、PSMA、BCMA、CD20、CD33、CD19、CD22、CD123、CD30、GPC-3、CEA、クローディン18.2(Claudin18.2)、EpCAM、GD2、MSLN、EGFR、MUC1、EGFRVIII、CD38、Trop-2、c-MET、ネクチン-4(Nectin-4)、CD79b、CCK4、GPA33、HLA-A2、CLEC12A、p-カドヘリン(p-cadherin)、TDO2、MART-1、Pmel 17、MAGE-1、AFP、CA125、TRP-1、TRP-2、NY-ESO、PSA、CDK4、BCA225、CA125、MG7-Ag、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TAAL6及びTAG72からなる群から独立的に選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍関連/特異的抗原は、HER2、Trop-2、BCMA及びCD19からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ケモカインは、CXCL1~CXCL17、CCL1~CCL28、XCL1、XCL2及びCX3CL1からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ケモカインは、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL21からなる群から選択される。好ましい実施形態では、ケモカインはCCL5である。
いくつかの実施形態では、HSVの最初期遺伝子プロモーターは、HSV-1又はHSV-2の最初期遺伝子プロモーターである。いくつかの実施形態では、HSVの最初期遺伝子プロモーターは、HSV-1の、IE1(ICP0プロモーター)、IE2(ICP27プロモーター)、IE3(ICP4プロモーター)及びIE4/5(ICP22及びICP47プロモーター)からなる群から選択される。好ましい実施形態では、HSVの最初期遺伝子プロモーターは、HSV-1の最初期遺伝子プロモーターIE4/5である。
いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍関連/特異的抗原の細胞外-膜貫通ドメインである。例えば、CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体は、CD19の細胞外-膜貫通ドメインである。例えば、BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体は、BCMAの細胞外-膜貫通ドメインである。例えば、HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体は、HER2の細胞外-膜貫通ドメインである。例えば、Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体は、Trop-2の細胞外-膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍関連/特異的抗原の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、腫瘍関連/特異的抗原の膜貫通ドメインの一部に連結された細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体は、シグナル伝達ドメインの一部又は全体が欠如している野生型腫瘍関連/特異的抗原の変異体である。
好ましい実施形態では、遺伝子改変oHSVは、HSV1型(HSV-1)又はHSV2型(HSV-2)に起源をもつ。好ましい実施形態では、遺伝子改変oHSVは、HSV-1のF株に起源をもつ。
好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(ii)CCL5をコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、(i)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(ii)CCL5をコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、(i)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(ii)CCL5をコードする。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、(i)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(ii)CCL5をコードする。
好ましい実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする。
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原を発現しない。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原を発現する。
いくつかの実施形態では、上記のような遺伝子改変oHSVは、oHSVのゲノムの核酸の断片を欠失するようにさらに改変され、これによりoHSVは、その意図された使用という目的にとって望ましくない特定の特性が減弱されるか又は除去される。一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、内部逆方向反復領域、ウイルス遺伝子をコードする断片又はその両方を欠失している。一実施形態では、欠失しているoHSVの核酸の断片は、HSV-1のF株のPプロトタイプゲノムの位置117005~132096である。一実施形態では、ウイルス遺伝子をコードする断片は、γ34.5をコードする核酸の断片である。一実施形態では、遺伝子γ34.5の両方のコピーが欠失される。
いくつかの実施形態では、上記のような遺伝子改変oHSVは、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方をコードするようにさらに改変される。一実施形態では、免疫刺激剤は、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選択される。一実施形態では、免疫治療剤は、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、又はその抗原結合断片である。一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、IL-12をコードする。一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片をコードする。一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、IL-12及び抗PD-1抗体又はその抗原結合断片をコードする。
腫瘍関連/特異的抗原が、ウイルス感染直後、且つ、ウイルスの複製による腫瘍細胞の溶解前に発現されるよう、腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーター、例えば、IE4/5プロモーターによって制御されることが必要であるということに留意すべきである。切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチド及びケモカインをコードするポリヌクレオチドは、同じ最初期プロモーターに作動可能に連結されてもよい。別の実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチド及びケモカインをコードするポリヌクレオチドは、異なる最初期プロモーターに作動可能に連結されてもよい。oHSVが、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方、例えば、IL-12、抗PD-1抗体によってさらに装備される場合、免疫刺激剤及び/又は免疫治療剤の発現は必ずしも最初期プロモーターによって制御されるとは限らないが、好ましくは、異なる且つ相対的晩期のプロモーター、例えば、CMVプロモーター又はEgr-1プロモーターによって制御される。一実施形態では、IL-12をコードするポリヌクレオチドはEgr-1プロモーターに作動可能に連結される。別の実施形態では、scFv-抗hPD1をコードするポリヌクレオチドは、CMVプロモーターに作動可能に連結される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第2ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のBCMAをコードする第1ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第2ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のBCMA及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のTrop-2をコードする第1ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第2ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のTrop-2及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のHER2をコードする第1ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第2ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のHER2及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、切断された非シグナル伝達性のBCMA9をコードする第2ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第3ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19、前記切断された非シグナル伝達性のBCMA9及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、切断された非シグナル伝達性のTrop-2をコードする第2ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第3ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19、前記切断された非シグナル伝達性のTrop-2及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、切断された非シグナル伝達性のHER2をコードする第2ポリヌクレオチド及びCCL5をコードする第3ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19、前記切断された非シグナル伝達性のHER2及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、CD19、BCMA、Trop-2及びHER2からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第1ポリヌクレオチド、CCL5をコードする第2ポリヌクレオチド、抗PD-1抗体をコードする第3ポリヌクレオチド及びIL-12をコードする第4ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御され、前記oHSVの内部逆方向反復領域が欠失される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、BCMA、Trop-2及びHER2からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第2ポリヌクレオチド、CCL5をコードする第3ポリヌクレオチド、抗PD-1抗体をコードする第4ポリヌクレオチド及びIL-12をコードする第5ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、BCMA、Trop-2及びHER2からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第2ポリヌクレオチド、CCL5をコードする第3ポリヌクレオチド、抗PD-1抗体をコードする第4ポリヌクレオチド及びIL-12をコードする第5ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御され、前記oHSVの内部逆方向反復領域が欠失される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、BCMA、Trop-2及びHER2からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第2ポリヌクレオチド、CCL5をコードする第3ポリヌクレオチド、抗PD-1抗体をコードする第4ポリヌクレオチド及びIL-12をコードする第5ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御され、前記oHSVの内部逆方向反復領域が欠失され、前記oHSVの全ての単一コピー遺伝子が保持される。
一実施形態では、遺伝子改変oHSVは、切断された非シグナル伝達性のCD19をコードする第1ポリヌクレオチド、BCMA、Trop-2及びHER2からなる群から選択されるいずれかの切断された非シグナル伝達性の変異体をコードする第2ポリヌクレオチド、CCL5をコードする第3ポリヌクレオチド、抗PD-1抗体をコードする第4ポリヌクレオチド及びIL-12をコードする第5ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性のCD19及び前記CCL5の発現はHSV-1 IE4/5プロモーターによって制御され、前記oHSVの内部逆方向反復領域及びγ34.5の両方のコピーが欠失され、前記oHSVの全ての単一コピー遺伝子が保持される。
一実施形態では、PolyA尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードするポリヌクレオチドの下流に位置する。例えば、切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインをコードするポリヌクレオチドは、5’-CD19-CCL5-PolyA-3’、5’-BCMA-CCL5-PolyA-3’、5’-HER2-CCL5-PolyA-3’、5’-CD19-BCMA-CCL5-PolyA-3’、5’-CD19-Trop-2-CCL5-PolyA-3’、又は5’-CD19-HER2-CCL5-PolyA-3’として配置される。
一実施形態では、切断された非シグナル伝達性の変異体、免疫治療剤及びケモカインをコードするoHSVゲノムへのいずれのポリヌクレオチドを組み込むことは、ウイルス遺伝子の機能を破壊しない。例えば、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが、ウイルスのUL3とUL4遺伝子の間に導入され、切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインをコードするポリヌクレオチドがウイルスのUL37とUL38遺伝子の間に導入される。また、一実施形態では、IL2をコードするポリヌクレオチドがウイルスゲノムの内部逆方向反復領域を置き換える。
本開示において、oHSVによってコードされる腫瘍関連/特異的抗原は、oHSVに感染した腫瘍細胞と異種であっても、同種であってもよい。一実施形態では、腫瘍細胞は、oHSVによってコードされる腫瘍関連/特異的抗原とは異なる腫瘍関連/特異的抗原を発現する。例えば、腫瘍細胞はCD22を過剰発現するが、本開示の遺伝子改変oHSVはCD19、HER2又はその両方を発現する。別の実施形態では、腫瘍細胞は、oHSVによってコードされる腫瘍関連/特異的抗原と同じ腫瘍関連/特異的抗原を発現する。例えば、腫瘍細胞はHER2を低レベルで発現し、本開示の遺伝子改変oHSVはHER2を発現する。別の実施形態では、腫瘍細胞は、既知の腫瘍関連/特異的抗原が検出されない。
本開示の遺伝子改変oHSVに感染した腫瘍細胞は、血液腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞である。
有利なことに、腫瘍細胞表面上の非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原の提示は、当該特定の腫瘍関連/特異的抗原に関して腫瘍細胞を陰性細胞から陽性細胞に変換し、これにより特定の腫瘍関連/特異的抗原又は腫瘍特異的抗原を標的とする療法に対して腫瘍を応答させる。異種ポリヌクレオチドの発現は、最初期遺伝子プロモーター、例えば、HSV-1のIE4/5によって制御され、これにより腫瘍細胞へのHSVの侵入及び複製の極めて初期の段階で翻訳産物が産生される。例えば、oHSVは、正常な及び殆どの腫瘍B細胞上で特異的に発現される膜貫通タンパク質である、切断された非シグナル伝達性のCD19を発現するように改変されてもよい。次に、切断された非シグナル伝達性のCD19は、oHSVの感染による細胞溶解の前に腫瘍細胞表面に提示され、CD19指向性CAR-T療法、例えば、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)又はテカルタス(Tecartus)(登録商標)の標的として機能する。換言すれば、非シグナル伝達性のCD19の発現は、腫瘍細胞にCD19抗原が欠如しているため、一般的にはCD19指向性CAR-T療法の影響を受けにくい腫瘍細胞をCD19指向性CAR-Tの影響を受けやすい腫瘍細胞に変換する。この場合において、腫瘍はCD19指向性CAR-T療法に応答すると考えられる。
1つ以上の非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原をコードする遺伝子改変oHSVの重要な利点は、腫瘍抗原標的療法ごとにoHSVの設計、テスト及び製造を繰り返すことを必要としない、異なる腫瘍抗原標的療法との併用的使用のための多用途ツールを提供することである。2つの異なる非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原が同じoHSVによってコードされる場合、それらは、ウイルスの感染により腫瘍細胞が溶解する前に、同時に腫瘍細胞表面に発現及び提示されることが可能であるということが示された。2つ以上の異なる非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原の提示は、腫瘍細胞を二重、さらには三重陽性腫瘍細胞に変換し、これにより異なる腫瘍標的療法が腫瘍細胞に対して有効になることを可能にする。これは、対応する腫瘍標的療法、例えば、CAR-T細胞療法の特異性及び有効性を向上させるのに役立つ。
本明細書に開示されている遺伝子改変oHSVの一部のさらなる利点は、腫瘍関連/特異的抗原に加え、それは、発現及び放出が腫瘍細胞への免疫細胞の輸送及び浸潤を一層助ける少なくとも1つのケモカインをコードすることにある。したがって、CAR-T、CAR-NKなどを本明細書に記載のoHSVと併用する場合、特に有利である。しかし、いかなる理論にも束縛されないが、本明細書に開示されている遺伝子改変oHSVは独立的に使用することができ、ケモカインの分泌は、身体の免疫細胞、例えば、T細胞の腫瘍への走化性を誘導し、ウイルスの抗腫瘍効果と共に腫瘍細胞を死滅させる。
oHSVと腫瘍標的療法の併用:
本開示の別の態様は、様々ながんの治療のための、上記の遺伝子改変oHSVのいずれかと、腫瘍標的化治療薬との併用に関する。上述したように、本明細書に開示されている遺伝子改変oHSVは、非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原を発現し、次に、当該抗原を腫瘍細胞の表面に提示する。これは、腫瘍関連/特異的抗原を標的とするように設計された治療薬に、oHSVに感染した腫瘍細胞を標的する機会を提供する。
本開示の別の態様は、様々ながんの治療のための、上記の遺伝子改変oHSVのいずれかと、腫瘍標的化治療薬との併用に関する。上述したように、本明細書に開示されている遺伝子改変oHSVは、非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原を発現し、次に、当該抗原を腫瘍細胞の表面に提示する。これは、腫瘍関連/特異的抗原を標的とするように設計された治療薬に、oHSVに感染した腫瘍細胞を標的する機会を提供する。
本開示において、腫瘍標的化治療薬は、oHSVによってコードされる少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。標的化部分は、oHSVの腫瘍細胞への侵入及び複製の時に、腫瘍細胞表面に発現される非シグナル伝達性の腫瘍関連/特異的抗原に特異性を有する。例えば、標的化部分は、例えば、抗体、scFv、Fab、又はCAR-T細胞のキメラ抗原受容体部分など、腫瘍関連/特異的抗原に対する抗体の抗原結合ドメインである。エフェクター部分は、がんの細胞を死滅させ、又はその増殖を阻害するために有用である。例えば、エフェクター部分は、T細胞及びナチュラル・キラー細胞を含む免疫細胞、T細胞と結合できるBiTEの一部、又は抗体-薬物複合体の薬物部分である。
いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞、キメラ抗原受容体NK(CAR-NK)細胞、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)及び抗体薬物複合体(ADC)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、CAR-T細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、CAR-NK細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、BiTEである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ADCである。
いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、CD19標的化CAR-T細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、CD19又はEpCAM標的化BiTEである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、HER2、Trop-2、ネクチン-4(Nectin-4)、BCMA、CD33、CD30、CD22又はCD79b標的化ADCである。
いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、CD19標的化CAR-T細胞である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、JWCAR-029、IM19CAR-T、CNCT19、BZ019、HD CD19 CAR-T、pCAR-19B、CD19-CART、CT032、iPD1 CD19 eCAR-T、LCAR-B38M、CT103A、CAR-BCMA T、AU-101、4SCAR-PSMA、PSMA-CART、P-PSMA-101、C-CAR066、MB-CART20.1、PBCAR20A、LB1095、LB1901、PRGN-3006、AMG553、CT041、CD30.CAR-T及びCAR-GPC3 Tからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、CD19又はEpCAM標的化BiTEである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、ビーリンサイト(Blincyto)(登録商標)、AMG420、PF-3135及びGBR1302からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、HER2、Trop-2、ネクチン-4(Nectin-4)、BCMA、CD33、CD30、CD22又はCD79b標的化ADCである。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化治療薬は、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)、エンハーツ(Enhertu)(登録商標)、SHR-A1811、TAA013、RC-48、BAT8001、ARX788、A166、トロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)、BAT8003、DAC-002、DS-1062、SKB264、RC-108、TR1801-ADC、パドセブ(Padccv)(登録商標)、ポライビー(Polivy)(登録商標)、アドセトリス(Adcetris)(登録商標)、マイロターグ(Mylotarg)(登録商標)、ブレンレップ(Blenrep)(登録商標)、PSMA ADC、ADCT-402、PTK7-ADC及びTRS005からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、上記の腫瘍標的化治療薬のいずれかとの併用的使用のための遺伝子改変oHSVは、前記oHSVのゲノムに、(a)2つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(b)ケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれる遺伝子改変oHSVであり、前記切断された非シグナル伝達性の変異体及びケモカインの発現は、HSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、2つの同じ又は異なる腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、2つの同じ又は異なる腫瘍特異的抗原を含む。いくつかの実施形態では、2つの腫瘍関連/特異的抗原は、1つの腫瘍関連抗原及び1つの腫瘍特異的抗原を含む。
好ましい実施形態では、腫瘍標的化治療薬との併用的使用のための遺伝子改変oHSVは、CD19及びBCMAの両方の切断された非シグナル伝達性の変異体、及びCCL5を発現する遺伝子改変oHSVであり、前記腫瘍標的化治療薬は、CD19標的化CAR-T細胞、例えば、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)若しくはテカルタス(Tecartus)(登録商標)、CD19標的化BiTE、例えば、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、BCMA標的化ADC、例えば、ブレンレップ(Blenrep)(登録商標)、又はそれらのいずれの併用である。
好ましい実施形態では、腫瘍標的化治療薬との併用的使用のための遺伝子改変oHSVは、CD19及びHER2の両方の切断された非シグナル伝達性の変異体、及びCCL5を発現する遺伝子改変oHSVであり、前記腫瘍標的化治療薬は、CD19標的化CAR-T細胞、例えば、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)又はテカルタス(Tecartus)(登録商標)、CD19標的化BiTE、例えば、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、HER2標的化ADC、例えば、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)若しくはエンハーツ(Enhertu)(登録商標)、又はそれらのいずれの併用である。
好ましい実施形態では、腫瘍標的化治療薬との併用的使用のための遺伝子改変oHSVは、CD19及びTrop-2の両方の切断された非シグナル伝達性の変異体、及びCCL5を発現する遺伝子改変oHSVであり、前記腫瘍標的化治療薬は、CD19標的化CAR-T細胞、例えば、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)若しくはテカルタス(Tecartus)(登録商標)、CD19標的化BiTE、例えば、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、Trop-2標的化ADC、例えば、トロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)、又はそれらのいずれの併用である。
oHSVと腫瘍標的療法の併用は、例えば、医薬キットとして具体化されてもよい。したがって、一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)と、腫瘍標的化治療薬とを別々に含むがんの治療のための医薬キットが提供され、前記腫瘍標的化治療薬は、ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備える。
いくつかの実施形態では、がんの治療のための医薬キットは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)と、CD19又はBCMA標的化CAR-T、ADC又はBiTEとを別々に含む。いくつかの実施形態では、CD19又はBCMA標的化CAR-T、ADC又はBiTEは、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、ADCT-402(ADC Therapeutics)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、JNJ-68284528(JNJ-4528、Legend Biotech)、ブレンレップ(Blenrep)(又はGSK2857916)、AMG420(Amgen)及びPF-3135(Pfizer)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、がんの治療のための医薬キットは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)と、CD19又はTrop-2標的化CAR-T、ADC又はBiTEとを別々に含む。いくつかの実施形態では、CD19又はTrop-2標的化CAR-T、ADC又はBiTEは、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、ADCT-402(ADC Therapeutics)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)及びトロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)(Immunomedics)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、がんの治療のための医薬キットは、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)と、CD19又はHER2標的化CAR-T、ADC又はBiTEとを別々に含む。いくつかの実施形態では、CD19又はHER2標的化CAR-T、ADC又はBiTEは、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、ADCT-402(ADC Therapeutics)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、AU-101(Aurora Biopharma)、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)(Roche)、エンハーツ(Enhertu)(登録商標)(第一三共)及びGBR1302(Ichnos Sciences SA)からなる群から選択される。
治療方法:
本開示の別の態様は、対象におけるがんの治療方法に関する。当該方法は、対象に治療有効量の本明細書に記載の遺伝子改変oHSV及び本明細書に記載の腫瘍標的化療法薬を投与することを含む。oHSV及び腫瘍標的化療法薬の両方の投与は、同時に又は連続して行われる。
本開示の別の態様は、対象におけるがんの治療方法に関する。当該方法は、対象に治療有効量の本明細書に記載の遺伝子改変oHSV及び本明細書に記載の腫瘍標的化療法薬を投与することを含む。oHSV及び腫瘍標的化療法薬の両方の投与は、同時に又は連続して行われる。
いくつかの実施形態では、最初に対象に治療有効量の本明細書に記載の遺伝子改変oHSVを投与し、次に本明細書に記載の腫瘍標的化療法薬を投与する。当該実施形態では、投与間の間隔は、0.5~12時間の範囲内であり、例えば、0.5~9時間、0.5~8時間、0.5~7時間、0.5~6時間、0.5~5時間、0.5~4時間、0.5~3時間、0.5~2時間、0.5~2.5時間、0.5~1.5時間又は0.5~1時間である。例えば、oHSVの投与は、腫瘍標的化療法薬の投与前0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、11又は12時間である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、対象に治療有効量の、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)、及びCD19又はBCMA標的化CAR-T、ADC又はBiTEを投与することを含む。いくつかの実施形態では、CD19又はBCMA標的化CAR-T、ADC又はBiTEは、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、ADCT-402(ADC Therapeutics)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、JNJ-68284528(JNJ-4528、Legend Biotech)、ブレンレップ(Blenrep)(又はGSK2857916)、AMG420(Amgen)及びPF-3135(Pfizer)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、対象に治療有効量の、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)、及びCD19又はTrop-2標的化CAR-T、ADC又はBiTEを投与することを含む。いくつかの実施形態では、CD19又はTrop-2標的化CAR-T、ADC又はBiTEは、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、ADCT-402(ADC Therapeutics)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)及びトロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)(Immunomedics)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、対象に治療有効量の、(i)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、(ii)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び(iii)CCL5をコードする遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)、及びCD19又はHER2標的化CAR-T、ADC又はBiTEを投与することを含む。いくつかの実施形態では、CD19又はHER2標的化CAR-T、ADC又はBiTEは、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、ADCT-402(ADC Therapeutics)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、AU-101(Aurora Biopharma)、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)(Roche)、エンハーツ(Enhertu)(登録商標)(第一三共)及びGBR1302(Ichnos Sciences SA)からなる群から選択される。
本明細書に記載のoHSVと、様々な腫瘍抗原指向性CAR-T細胞、ADC又はBiTEとの併用は、様々な腫瘍に対して著しく向上された抗腫瘍効果を提供する。oHSVは、直接的な腫瘍細胞溶解により、直接バリアを破壊し腫瘍微小環境を操作する。ケモカインやサイトカインなどのペイロードが装備されたoHSVは、腫瘍塊へのT細胞の輸送及び浸潤をさらに改善する。また、固形腫瘍細胞表面上のoHSVによって送達される腫瘍特異性の高い抗原(例えば、CD19、BCMA)は、オフターゲットの腫瘍外毒性(on-target off-tumor toxicity)を軽減させることによって、腫瘍標的療法、例えば、CAR-T療法の特異性及び安全性を改善する。
配列:
本開示に記載のアミノ酸又は核酸配列は、以下の表1において提供される。
本開示に記載のアミノ酸又は核酸配列は、以下の表1において提供される。
(実施例)
oHSV-1 T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012及びT7013の構築:
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV-1)T7201、T7202、T7203及びT7204は、IL-12、抗PD-1抗体、CCL5、及びバイオマーカーとして機能する腫瘍関連抗原(TAA)の1つの切断された非シグナル伝達性の変異体のコード配列を保有している。T7201、T7202、T7203及びT7204によって発現されるバイオマーカーとしての切断された非シグナル伝達性の変異体は、それぞれ、CD19、BCMA、Trop-2及びHER2である。図1のCは、T7201~T7204のウイルスバックボーンの模式図を示す。
oHSV-1 T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012及びT7013の構築:
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV-1)T7201、T7202、T7203及びT7204は、IL-12、抗PD-1抗体、CCL5、及びバイオマーカーとして機能する腫瘍関連抗原(TAA)の1つの切断された非シグナル伝達性の変異体のコード配列を保有している。T7201、T7202、T7203及びT7204によって発現されるバイオマーカーとしての切断された非シグナル伝達性の変異体は、それぞれ、CD19、BCMA、Trop-2及びHER2である。図1のCは、T7201~T7204のウイルスバックボーンの模式図を示す。
腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV-1)T7011、T7012及びT7013は、IL-12、抗PD-1抗体、CCL5、及びバイオマーカーとして機能する腫瘍関連抗原(TAA)の2つの切断された非シグナル伝達性の変異体のコード配列を保有している。T7011、T7012及びT7013によって発現されるバイオマーカーとしての切断された非シグナル伝達性の変異体は、それぞれ、CD19プラスBCMA、CD19プラスTrop-2、及びCD19プラスHER2である。図1のDは、T7011、T7012及びT7013のウイルスバックボーンの模式図を示す。図2は、T7シリーズoHSVの構築のフローチャートを示す。
T2A自己切断ペプチド配列(配列番号1)によって連結された2つのバイオマーカー及びCCL5のコード配列は、HSV-1最初期遺伝子プロモーター(IE4/5プロモーター)によって駆動される1つのオープンリーディングフレーム内で翻訳される。発現カセットは、UL37とUL38遺伝子との間に挿入される。
また、T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012及びT7013は、UL3とUL4との間の抗ヒトPD-1抗体発現カセットの挿入と、IL-12発現カセットによって置き換えられた、改変された内部反復(IR)領域とを含む。組換えウイルスは、細菌人工染色体(BAC)システムを利用していくつかのステップで構築された。ウイルス構築の詳細は、以下に説明されるとおりである。
それぞれ2セットのプライマー((配列番号2、3)及び(配列番号4、5))によってHSV-1ウイルスゲノムからPCR増幅された野生型ゲノムの場合、上流にヌクレオチド117005、下流にヌクレオチド132096に隣接するIL-12発現カセットを、遺伝子置換プラスミドpKO5に挿入してpKO1407を生成した。次に、電気穿孔法によりpKO1407を野生型BACを備える大腸菌にトランスフェクトしてBAC-T2010を生成した。次に、それぞれ2セットのプライマー((配列番号6、7)及び(配列番号8、9))によってHSV-1ウイルスゲノムからPCR増幅された野生型ゲノムの場合、上流にヌクレオチド11658、下流にヌクレオチド11659に隣接する抗PD-1抗体遺伝子を駆動するCMVプロモーターのカセットを、BglII及びPacI部位でpKO5に連結して、pKOE1002プラスミドを生成した。次に、電気穿孔法によりpKOE1002プラスミドをBAC-T2010を含有する大腸菌にトランスフェクトしてBAC-T3011を生成した。1つ又は2つのバイオマーカー(即ち、腫瘍関連/特異的抗原)及びCCL5遺伝子を含有する発現カセットは、野生型ゲノムの場合、上流にヌクレオチド84220、下流にヌクレオチド84221に隣接した。上流及び下流のフランキング配列をそれぞれ2セットのプライマー((配列番号10、11)及び(配列番号12、13))によってHSV-1ウイルスゲノムからPCR増幅した。バイオマーカー、CCL5、及びフランキング配列を含むDNA断片をXbaI及びPacI部位でpKO5へ連結して、pKO7201、pKO7202、pKO7203、pKO7204、pKO7011、pKO7012及びpKO7013プラスミドを生成した。次に、電気穿孔法によりpKO7201、pKO7202、pKO7203、pKO7204、pKO7011、pKO7012及びpKO7013プラスミドをBAC-T3011を含む大腸菌にトランスフェクトして、BAC-T7201、BAC-T7202、BAC-T7203、BAC-T7204、BAC-T7011、BAC-T7012、BAC-T7013をそれぞれ生成した。T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012及びT7013ウイルスは、対応するBACプラスミドのトランスフェクションと、その後のベロ(Vero)細胞におけるプラーク精製及び増幅のいくつかのステップによって得られた。
ウイルス滴定:
プラーク形成アッセイによってウイルスの力価を測定した。簡単に説明すると、ウイルスストック溶液を段階的に希釈し、次にT25フラスコに単層ベロ(Vero)細胞を接種した。2時間の吸収後、培地を、1%のFBSプラス0.05%(wt/vol)のヒトプール免疫グロブリンを補充したDMEM培地と72時間交換した。細胞を無水メタノールで5分間固定し、蒸留水ですすぎ、クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、感染性ウイルス粒子の力価を計算した。T7011、T7012及びT7013の力価を以下の表2に示し、T7201、T7202、T7203及びT7204の力価を表4に示す。
プラーク形成アッセイによってウイルスの力価を測定した。簡単に説明すると、ウイルスストック溶液を段階的に希釈し、次にT25フラスコに単層ベロ(Vero)細胞を接種した。2時間の吸収後、培地を、1%のFBSプラス0.05%(wt/vol)のヒトプール免疫グロブリンを補充したDMEM培地と72時間交換した。細胞を無水メタノールで5分間固定し、蒸留水ですすぎ、クリスタルバイオレットで染色した。プラークを計数して、感染性ウイルス粒子の力価を計算した。T7011、T7012及びT7013の力価を以下の表2に示し、T7201、T7202、T7203及びT7204の力価を表4に示す。
ウイルス感染後のCCL5分泌の検出:
ヒト胎児腎臓293T、ヒト喉頭がんHep-2及びヒト舌扁平上皮がんTca8113細胞を1×106個の細胞/フラスコの密度でT25フラスコに接種した。一晩インキュベートした後、細胞を模擬感染させたか又は1PFU/細胞でT7011で感染した。2時間のインキュベーション後、接種材料を新鮮な培地と交換した。CCL5の分泌を定量するためのELISAアッセイに備え、感染後0、4、8、12、24、48、72及び96時間で細胞上清を収集した。図3は、293T、Hep-2及びTca8113細胞におけるT7011感染後のCCL5の放出を示す。CCL5の発現及び放出は速くて強力であった。感染後4時間で既に、分泌されたCCL5が検出され、最大5000pg/mLに達した。T7011ウイルス感染後、分泌は安定しており、少なくとも4日間保持された。これでCCL5が分泌されることが示された。
ヒト胎児腎臓293T、ヒト喉頭がんHep-2及びヒト舌扁平上皮がんTca8113細胞を1×106個の細胞/フラスコの密度でT25フラスコに接種した。一晩インキュベートした後、細胞を模擬感染させたか又は1PFU/細胞でT7011で感染した。2時間のインキュベーション後、接種材料を新鮮な培地と交換した。CCL5の分泌を定量するためのELISAアッセイに備え、感染後0、4、8、12、24、48、72及び96時間で細胞上清を収集した。図3は、293T、Hep-2及びTca8113細胞におけるT7011感染後のCCL5の放出を示す。CCL5の発現及び放出は速くて強力であった。感染後4時間で既に、分泌されたCCL5が検出され、最大5000pg/mLに達した。T7011ウイルス感染後、分泌は安定しており、少なくとも4日間保持された。これでCCL5が分泌されることが示された。
ELISAアッセイによるIL-12、抗PD-1抗体及びCCL5の発現:
ベロ(Vero)細胞を6×106個の細胞/フラスコの密度でT150フラスコに接種した。一晩インキュベートした後、0.01PFU/細胞でT7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012及びT7013で細胞を感染した。感染後48時間で回収された細胞上清は、IL-12、抗PD-1抗体及びCCL5の発現レベルを検出するためのELISAアッセイに使用した。結果を表3及び表4に示した。表3に示されるように、CCL5の発現は、テストされたウイルスにおいて高レベルであり、非常に安定していた。IL-12及びPD-1 Abの発現は、T7011とT7013とで実質的に同じであったが、T7012は最も高いIL-12発現と最も低いPD-1 Ab発現を示した。
ベロ(Vero)細胞を6×106個の細胞/フラスコの密度でT150フラスコに接種した。一晩インキュベートした後、0.01PFU/細胞でT7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012及びT7013で細胞を感染した。感染後48時間で回収された細胞上清は、IL-12、抗PD-1抗体及びCCL5の発現レベルを検出するためのELISAアッセイに使用した。結果を表3及び表4に示した。表3に示されるように、CCL5の発現は、テストされたウイルスにおいて高レベルであり、非常に安定していた。IL-12及びPD-1 Abの発現は、T7011とT7013とで実質的に同じであったが、T7012は最も高いIL-12発現と最も低いPD-1 Ab発現を示した。
免疫蛍光アッセイによる細胞表面における切断されたCD19、BCMA、Trop-2、HER2の発現及び提示:
Hep-2細胞(4×105)を6ウェルプレートの個々のウェルのカバーガラスに接種し、24時間インキュベートして細胞を接着させた。次に、細胞を模擬感染させたか又はそれぞれ5PFU/細胞でT7011、T7012及びT7013ウイルスに1時間露出させた。接種材料を新鮮な培地と交換した。PBSで細胞をすすぎ、室温で指定された時間に、4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定し、次に5%のスキムミルクでブロックした。T7011に感染した細胞を、それぞれ、CD19に対する抗体(カタログ番号302204、Biolegend)及びBCMAに対する抗体(カタログ番号NBP1-97637、Novus)で共染色し、T7012に感染した細胞を、それぞれ、CD19に対する抗体(カタログ番号302204、Biolegend)及びTrop-2に対する抗体(カタログ番号PA5-47030、Invitrogen)で共染色し、T7013に感染した細胞を、それぞれ、4℃でCD19に対する抗体(カタログ番号302204、Biolegend)、一次HER2抗体(カタログ番号MAB1129-100、R&D systems)で一晩染色した。次に、細胞をAlexa Fluor 488結合抗マウス(カタログ番号A32766、Invitrogen)、Alexa Fluor 568結合抗ウサギ(カタログ番号A11036、Invitrogen)及びAlexa Fluor 568結合抗ヤギ(カタログ番号A11057、Invitrogen)二次抗体と室温で1時間インキュベートした。次に、PBSで細胞を洗浄し、封入剤(カタログ番号8961S、Cell Signaling Technology)に包埋した。ニコン共焦点レーザー走査型顕微鏡(HD25、倍率120倍)を使用して画像を取得及び処理し、図4に示す。図4から分かるように、T7011、T7012及びT7013によってそれぞれコードされる異なる切断された抗原が腫瘍細胞表面上に同時に発現された。
Hep-2細胞(4×105)を6ウェルプレートの個々のウェルのカバーガラスに接種し、24時間インキュベートして細胞を接着させた。次に、細胞を模擬感染させたか又はそれぞれ5PFU/細胞でT7011、T7012及びT7013ウイルスに1時間露出させた。接種材料を新鮮な培地と交換した。PBSで細胞をすすぎ、室温で指定された時間に、4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定し、次に5%のスキムミルクでブロックした。T7011に感染した細胞を、それぞれ、CD19に対する抗体(カタログ番号302204、Biolegend)及びBCMAに対する抗体(カタログ番号NBP1-97637、Novus)で共染色し、T7012に感染した細胞を、それぞれ、CD19に対する抗体(カタログ番号302204、Biolegend)及びTrop-2に対する抗体(カタログ番号PA5-47030、Invitrogen)で共染色し、T7013に感染した細胞を、それぞれ、4℃でCD19に対する抗体(カタログ番号302204、Biolegend)、一次HER2抗体(カタログ番号MAB1129-100、R&D systems)で一晩染色した。次に、細胞をAlexa Fluor 488結合抗マウス(カタログ番号A32766、Invitrogen)、Alexa Fluor 568結合抗ウサギ(カタログ番号A11036、Invitrogen)及びAlexa Fluor 568結合抗ヤギ(カタログ番号A11057、Invitrogen)二次抗体と室温で1時間インキュベートした。次に、PBSで細胞を洗浄し、封入剤(カタログ番号8961S、Cell Signaling Technology)に包埋した。ニコン共焦点レーザー走査型顕微鏡(HD25、倍率120倍)を使用して画像を取得及び処理し、図4に示す。図4から分かるように、T7011、T7012及びT7013によってそれぞれコードされる異なる切断された抗原が腫瘍細胞表面上に同時に発現された。
神経毒性研究:
6週齢の雌BALB/cマウスを麻醉し、次に、HSV-1(F)、T3011、T7011、T7012又はT7013ウイルスの希釈ごとに、8匹のマウスの群で10倍段階希釈液50μLを頭蓋内注射した。模擬治療対照群として同量の10%のグリセリンを含有するDPBSを接種した。マウスを14日間監視し、リード&ミュンヒ(Reed and Muench’s)法に従って死亡率データから50%致死量(LD50)を計算した。
6週齢の雌BALB/cマウスを麻醉し、次に、HSV-1(F)、T3011、T7011、T7012又はT7013ウイルスの希釈ごとに、8匹のマウスの群で10倍段階希釈液50μLを頭蓋内注射した。模擬治療対照群として同量の10%のグリセリンを含有するDPBSを接種した。マウスを14日間監視し、リード&ミュンヒ(Reed and Muench’s)法に従って死亡率データから50%致死量(LD50)を計算した。
以下の表5に示されるように、T7011、T7012、T7013及びT3011のLD50値は、それぞれ、HSV-1(F)より158倍、316倍、100倍、268倍高く、T3011ウイルスと同じように、HSV-1(F)に比べて、T7011、T7012及びT7013の神経毒性が著しく減弱されたことが示された。
T7シリーズoHSVウイルスの抗腫瘍活性:
腫瘍細胞を10000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、細胞を0.01、0.1、1、5、10、33.33及び100PFU/細胞でT3011、T7011、T7012及びT7013で感染し、3回繰り返した。感染後(p.i.)48時間で、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。メーカーの指示に従って細胞増殖阻害率を計算した。GraphPad Prismソフトウェアを使用してデータを用量反応曲線に当てはめることによって、ウイルス感染による50%の細胞増殖阻害をもたらす濃度(IC50)(PFU/細胞)を計算した。
腫瘍細胞を10000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、細胞を0.01、0.1、1、5、10、33.33及び100PFU/細胞でT3011、T7011、T7012及びT7013で感染し、3回繰り返した。感染後(p.i.)48時間で、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。メーカーの指示に従って細胞増殖阻害率を計算した。GraphPad Prismソフトウェアを使用してデータを用量反応曲線に当てはめることによって、ウイルス感染による50%の細胞増殖阻害をもたらす濃度(IC50)(PFU/細胞)を計算した。
図5に示されるように、T7シリーズウイルスのIC50値はT3011と同等であり、T7シリーズウイルスはT3011に比べて同様の広範な抗腫瘍活性を備えることが示された。一方、HCT116、Hep-2、PC-3、MDA-MB-231及びA375細胞のIC50値は他の腫瘍細胞株よりわずかに高いことから、これらの細胞株はT7シリーズウイルスの感染に対して比較的耐性があることが示され、更なるコンボ研究のために選択された。
T7シリーズoHSVウイルスの感染活性:
Hep-2細胞、形質導入されていない正常なT細胞及びCD19 CAR-T(CAR-T)細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、1PFU/細胞でHSV-1(F)、T7011、T7012及びT7013で感染した。感染後24及び48時間(h)で細胞ペレットを収集し、次にPBSで洗浄した。次に細胞ペレットをDPBS+10%のグリセリンで再懸濁し、次に3つの凍結融解サイクルを行った。ベロ(Vero)細胞上でウイルス子孫を滴定した。
Hep-2細胞、形質導入されていない正常なT細胞及びCD19 CAR-T(CAR-T)細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、1PFU/細胞でHSV-1(F)、T7011、T7012及びT7013で感染した。感染後24及び48時間(h)で細胞ペレットを収集し、次にPBSで洗浄した。次に細胞ペレットをDPBS+10%のグリセリンで再懸濁し、次に3つの凍結融解サイクルを行った。ベロ(Vero)細胞上でウイルス子孫を滴定した。
図6に示されるように、全てのウイルス感染Hep-2細胞におけるウイルス収量は、正常なT細胞及びCAR-T細胞におけるウイルス収量より著しく高い。特に、正常なT細胞及びCAR-T細胞の両方におけるT7シリーズウイルスの収量は、感染後24時間又は48時間でどちらも103PFU/mL以下である。これらの結果は、野生型HSV-1(F)ウイルスがCAR-T又は正常なT細胞において感染活性が低いが、弱毒化T7011、T7012及びT7013ウイルスは感染活性を持たないことを示している。
T7シリーズoHSVウイルスの細胞殺傷活性:
CD19 CAR-T(CAR-TCD19)細胞及び形質導入されていない正常なT細胞を4×104個の細胞/ウェルで96ウェルプレートに接種し、0.01、0.1、1及び10PFU/細胞でT7011、T7012及びT7013で感染し、3回繰り返した。感染後(p.i.)24及び48時間で、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
CD19 CAR-T(CAR-TCD19)細胞及び形質導入されていない正常なT細胞を4×104個の細胞/ウェルで96ウェルプレートに接種し、0.01、0.1、1及び10PFU/細胞でT7011、T7012及びT7013で感染し、3回繰り返した。感染後(p.i.)24及び48時間で、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図7に示されるように、T7シリーズウイルス感染時、細胞生存率は低下しておらず、T7シリーズウイルスはCAR-T又は正常なT細胞に対してどちらも細胞殺傷活性を持たないことが証明された。
T7011とCAR-TCD19の併用の抗腫瘍効果:
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.03、0.1、0.3及び1PFU/細胞でT7011を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19又はT細胞を加えた。形質導入されていない正常なT細胞を対照とした。24時間の共培養後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.03、0.1、0.3及び1PFU/細胞でT7011を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19又はT細胞を加えた。形質導入されていない正常なT細胞を対照とした。24時間の共培養後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図8に示されるように、T7011とCAR-TCD19の併用は、単剤よりも60%以上高い効果を示す。この結果は、抗腫瘍効果が、T7011及びCAR-T単独群に比べて、T7011とCAR-TCD19併用処理群において著しく向上されることを実証している。対照的に、T7011と正常なT細胞の併用治療はわずかな抗腫瘍効果を示す。
さらに、ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、1PFU/細胞でT7011又はT3011を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、更なる24時間の共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19細胞を加えた。未処理の細胞を未処理対照とした。CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図9に示されるように、単一処理群及びT3011とCAR-T併用処理群に比べて、T7011とCAR-TCD19の併用治療だけが細胞生存率を著しく低下させた。対照として、T3011とCAR-TCD19の併用は効果がない。これらの結果の全ては、T7011ウイルス感染が、CAR-TCD19の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。
T7012とCAR-TCD19の併用の抗腫瘍効果:
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.03、0.1、0.3及び1PFU/細胞でT7012を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19又はT細胞を加えた。形質導入されていない正常なT細胞を対照とした。24時間の共培養後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.03、0.1、0.3及び1PFU/細胞でT7012を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19又はT細胞を加えた。形質導入されていない正常なT細胞を対照とした。24時間の共培養後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図10に示されるように、T7012とCAR-TCD19の併用は、単剤よりも50%以上高い効果を示す。この結果は、抗腫瘍効果が、T7012及びCAR-T単独群に比べて、T7012とCAR-TCD19併用群において著しく向上されることを実証している。対照的に、T7012と正常なT細胞の併用はわずかな抗腫瘍効果を示す。
さらに、ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、1PFU/細胞でT7012又はT3011を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、更なる24時間の共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19細胞を加えた。未処理の細胞を未処理対照とした。CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図11に示されるように、単一処理群及びT3011とCAR-T併用処理群に比べて、T7012とCAR-TCD19の併用治療だけが細胞生存率を著しく低下させた。対照として、T3011とCAR-TCD19の併用は効果がない。これらの結果の全ては、T7012ウイルス感染が、CAR-TCD19の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。
T7013とCAR-TCD19の併用の抗腫瘍効果:
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.03、0.1、0.3及び1PFU/細胞でT7013を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19又はT細胞を加えた。形質導入されていない正常なT細胞を対照とした。24時間の共培養後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.03、0.1、0.3及び1PFU/細胞でT7013を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19又はT細胞を加えた。形質導入されていない正常なT細胞を対照とした。24時間の共培養後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図12に示されるように、T7013とCAR-TCD19の併用は、単剤よりも60%以上高い効果を示す。この結果は、抗腫瘍効果が、T7013及びCAR-T単独群に比べて、T7013とCAR-TCD19併用群において著しく向上されることを実証している。対照的に、T7013と正常なT細胞の併用はわずかな抗腫瘍効果を示す。
さらに、ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、1PFU/細胞でT7013又はT3011を用いるか又は用いずに細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、更なる24時間の共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比4:1で、4×104細胞/ウェルでCAR-TCD19細胞を加えた。未処理の細胞を未処理対照とした。CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図13に示されるように、単一処理群及びT3011とCAR-T併用処理群に比べて、T7013とCAR-TCD19の併用治療だけが細胞生存率を著しく低下させた。対照として、T3011とCAR-TCD19の併用は効果がない。これらの結果の全ては、T7013ウイルス感染が、CAR-TCD19の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。
CAR-NKCD19細胞及びNK細胞におけるT7シリーズ(T7011、T7012及びT7013)oHSVウイルスの細胞殺傷活性:
当分野で知られる方法に従ってPBMCからNK細胞を分離した。CD19 CAR-NK(CAR-NKCD19)細胞及び形質導入されていない正常なNK細胞を4×104個の細胞/ウェルで96ウェルプレートに接種し、0.01、0.1、1及び10PFU/細胞でHSV-1(F)、T7011、T7012及びT7013で感染し、3回繰り返した。感染後(p.i.)24、48時間及び72時間で、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
当分野で知られる方法に従ってPBMCからNK細胞を分離した。CD19 CAR-NK(CAR-NKCD19)細胞及び形質導入されていない正常なNK細胞を4×104個の細胞/ウェルで96ウェルプレートに接種し、0.01、0.1、1及び10PFU/細胞でHSV-1(F)、T7011、T7012及びT7013で感染し、3回繰り返した。感染後(p.i.)24、48時間及び72時間で、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図14に示されるように、T7シリーズウイルス感染時、細胞生存率は低下しておらず、T7シリーズウイルスはCAR-NK細胞又は正常なNK細胞に対してどちらも細胞殺傷活性を持たないことが証明された。
CAR-NKCD19細胞及びNK細胞におけるHSV-1(F)及びT7011のウイルス複製:
CAR-NKCD19細胞及びNK細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、IL-2の存在下(+IL-2)又はIL-2の非存在下で、1PFU/細胞で、HSV-1(F)及びT7011で感染した。感染後2、24、48及び72時間(h)で細胞ペレットを収集した。次に、PBSで細胞ペレットを洗浄し、次にDPBS+10%のグリセリンで再懸濁し、凍結融解を3回行った。ベロ(Vero)細胞上でウイルス子孫を滴定した。
CAR-NKCD19細胞及びNK細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、IL-2の存在下(+IL-2)又はIL-2の非存在下で、1PFU/細胞で、HSV-1(F)及びT7011で感染した。感染後2、24、48及び72時間(h)で細胞ペレットを収集した。次に、PBSで細胞ペレットを洗浄し、次にDPBS+10%のグリセリンで再懸濁し、凍結融解を3回行った。ベロ(Vero)細胞上でウイルス子孫を滴定した。
図15に示されるように、T7011ウイルスは、CAR-NKCD19細胞又は正常なNK細胞において感染活性を持たない。
CAR-NKCD19細胞の増殖に対するT7011の影響:
CAR-NKCD19細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、IL-2の存在下(+IL-2)又はIL-2の非存在下で、0.1又は1PFU/細胞でHSV-1(F)及びT7011を用いるか又は用いずに感染した。感染後24、48及び72時間(h)で細胞ペレットを収集し、トリパンブルー染色によって生細胞を測定した。
CAR-NKCD19細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、IL-2の存在下(+IL-2)又はIL-2の非存在下で、0.1又は1PFU/細胞でHSV-1(F)及びT7011を用いるか又は用いずに感染した。感染後24、48及び72時間(h)で細胞ペレットを収集し、トリパンブルー染色によって生細胞を測定した。
図16に示されるように、T7011は、CAR-NKCD19細胞の増殖に対して負の影響を及ぼさない。
CAR-NK細胞の増殖に対するT7011の影響:
NK細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、IL-2の存在下(+IL-2)又はIL-2の非存在下で、0.1又は1PFU/細胞でHSV-1(F)及びT7011を用いるか又は用いずに感染した。感染後24、48及び72時間(h)で細胞ペレットを収集し、トリパンブルー染色によって生細胞を測定した。
NK細胞を5×105個の細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに接種し、IL-2の存在下(+IL-2)又はIL-2の非存在下で、0.1又は1PFU/細胞でHSV-1(F)及びT7011を用いるか又は用いずに感染した。感染後24、48及び72時間(h)で細胞ペレットを収集し、トリパンブルー染色によって生細胞を測定した。
図17に示されるように、T7011は、NK細胞の増殖に対して負の影響を及ぼさない。
T7011とCAR-NKCD19の併用の細胞殺傷効果:
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.1及び1PFU/細胞で、T7011で細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比2:1でCAR-NKCD19細胞を加えた。さらに24時間又は48時間後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
ヒト喉頭がん細胞Hep-2、ヒト黒色腫細胞A375及びヒト前立腺がんPC-3細胞を96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、0.01、0.1及び1PFU/細胞で、T7011で細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、腫瘍細胞との共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比2:1でCAR-NKCD19細胞を加えた。さらに24時間又は48時間後、CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図18に示されるように、T7011とCAR-NKCD19の併用は、単剤よりも高い効果を示した。
さらに、ヒト黒色腫細胞A375細胞を1×104個の細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに接種した。一晩インキュベートした後、1PFU/細胞で、NK、CAR-NKCD19又はT7011で細胞を感染し、3回繰り返した。感染後24時間で、更なる24時間の共培養のために、エフェクターと標的(E:T)の比2:1でCAR-NKCD19細胞又はNK細胞を加えた。CellTiter-Gloによって細胞生存率を測定した。相対的細胞生存率を未処理の細胞のパーセントとして計算した。
図19に示されるように、単一処理群及びT7011とNK併用処理群に比べて、T7011とCAR-NKCD19の併用治療は細胞生存率を著しく低下させている。これらの結果の全ては、T7011ウイルス感染が、CAR-TCD19の抗腫瘍活性との特異的相乗ができることを示す。
本明細書に記載のoHSVと、様々な腫瘍抗原指向性CAR-T細胞、ADC又はBiTEとの併用は、様々な腫瘍に対して著しく向上された抗腫瘍効果を提供する。oHSVは、直接的な腫瘍細胞溶解により、直接バリアを破壊し腫瘍微小環境を操作する。ケモカインやサイトカインなどのペイロードが装備されたoHSVは、腫瘍塊へのT細胞の輸送及び浸潤をさらに改善する。また、固形腫瘍細胞表面上のoHSVによって送達される腫瘍特異性の高い抗原(例えば、CD19、BCMA)は、オフターゲットの腫瘍外毒性(on-target off-tumor toxicity)を軽減させることによって、腫瘍標的療法、例えば、CAR-T療法の特異性及び安全性を改善する。
本開示は、例えば、以下に関する。
[1]
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)であって、
前記oHSVのゲノムには、
(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び
(b)少なくとも1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、
前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも1つのケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、
腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、前記腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために前記少なくとも1つのケモカインが発現及び放出される遺伝子改変oHSV。
[2]
前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原が、HER2、PSMA、BCMA、CD20、CD33、CD19、CD22、CD123、CD30、GPC-3、CEA、クローディン18.2(Claudin18.2)、EpCAM、GD2、MSLN、EGFR、MUC1、EGFRVIII、CD38、Trop-2、c-MET、ネクチン-4(Nectin-4)、CD79b、CCK4、GPA33、HLA-A2、CLEC12A、p-カドヘリン(p-cadherin)、TDO2、MART-1、Pmel 17、MAGE-1、AFP、CA125、TRP-1、TRP-2、NY-ESO、PSA、CDK4、BCA225、CA125、MG7-Ag、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TAAL6及びTAG72からなる群から選択される前記[1]に記載の遺伝子改変oHSV。
[3]
前記少なくとも1つのケモカインが、CXCL1~CXCL17、CCL1~CCL28、XCL1、XCL2及びCX3CL1からなる群から選択される前記[1]又は[2]に記載の遺伝子改変oHSV。
[4]
前記切断された非シグナル伝達性の変異体が、細胞外ドメイン、細胞外-膜貫通ドメイン又は前記細胞外ドメイン若しくは前記細胞外-膜貫通ドメインに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を備える等価物である前記[1]~[3]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[5]
前記HSVの最初期遺伝子プロモーターが、HSV-1の、IE1(ICP0プロモーター)、IE2(ICP27プロモーター)、IE3(ICP4プロモーター)及びIE4/5(ICP22及びICP47プロモーター)からなる群から選択される前記[1]~[4]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[6]
前記ポリヌクレオチドが、2つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び少なくとも1つのケモカインをコードする前記[1]~[5]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[7]
前記少なくとも1つのケモカインが、CCL5を含む前記[1]~[6]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[8]
前記ポリヌクレオチドがUL37とUL38との間に挿入される前記[1]~[7]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[9]
前記ポリヌクレオチドが、
(a)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(b)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(c)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(d)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(e)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(f)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、又は
(g)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5をコードする前記[1]~[8]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[10]
前記HSVの最初期遺伝子プロモーターが、HSV-1の最初期遺伝子プロモーターIE4/5である前記[1]~[9]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[11]
PolyA尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードする前記ポリヌクレオチドの下流に位置する前記[1]~[10]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[12]
前記腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である前記[1]~[11]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[13]
前記腫瘍細胞は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記腫瘍関連/特異的抗原を発現しない前記[1]~[12]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[14]
前記oHSVが、前記oHSVの核酸の断片が欠失されるようにさらに改変される前記[1]~[13]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[15]
前記oHSVの核酸の前記断片が、前記oHSVの内部逆方向反復領域、ウイルス遺伝子をコードする断片又はその両方である前記[1]~[14]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[16]
前記oHSVの核酸の前記断片が、F株のPプロトタイプゲノムの位置117005~132096である前記[14]に記載の遺伝子改変oHSV。
[17]
前記oHSVが、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方をコードするようにさらに改変される前記[1]~[16]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[18]
前記免疫刺激剤が、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選択される前記[17]に記載の遺伝子改変oHSV。
[19]
前記免疫治療剤が、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、又はその抗原結合断片である前記[17]又は[18]に記載の遺伝子改変oHSV。
[20]
前記免疫刺激剤が、IL-12であり、前記免疫治療剤が、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片である前記[17]~[19]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[21]
前記[1]~[20]のいずれか一項に記載のoHSVと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
[22]
前記腫瘍標的化治療薬が、CAR-T細胞、CAR-NK細胞、BiTE及びADCからなる群から選択される前記[21]に記載の医薬キット。
[23]
前記腫瘍標的化治療薬が、CD19標的化CAR-T細胞、CD19標的化CAR-NK細胞及びCD19又はEpCAM標的化BiTEからなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[24]
前記腫瘍標的化治療薬が、HER2、Trop-2、ネクチン-4(Nectin-4)、BCMA、CD33、CD30、CD22又はCD79b標的化ADCである前記[22]に記載の医薬キット。
[25]
前記腫瘍標的化治療薬が、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、JWCAR-029、IM19CAR-T、CNCT19、BZ019、HD CD19 CAR-T、pCAR-19B、CD19-CART、CT032、iPD1 CD19 eCAR-T、LCAR-B38M、CT103A、CAR-BCMA T、AU-101、4SCAR-PSMA、PSMA-CART、P-PSMA-101、C-CAR066、MB-CART20.1、PBCAR20A、LB1095、LB1901、PRGN-3006、AMG553、CT041、CD30.CAR-T及びCAR-GPC3 Tからなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[26]
前記腫瘍標的化治療薬が、ビーリンサイト(Blincyto)(登録商標)、AMG420、PF-3135及びGBR1302からなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[27]
前記腫瘍標的化治療薬が、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)、エンハーツ(Enhertu)(登録商標)、SHR-A1811、TAA013、RC-48、BAT8001、ARX788、A166、トロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)、BAT8003、DAC-002、DS-1062、SKB264、RC-108、TR1801-ADC、パドセブ(Padccv)(登録商標)、ポライビー(Polivy)(登録商標)、アドセトリス(Adcetris)(登録商標)、マイロターグ(Mylotarg)(登録商標)、ブレンレップ(Blenrep)(登録商標)、PSMA ADC、ADCT-402、PTK7-ADC及びTRS005からなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[28]
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)であって、
前記oHSVのゲノムには、少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示される遺伝子改変oHSV。
[29]
前記[28]に記載のoHSVと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
本開示は、例えば、以下に関する。
[1]
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)であって、
前記oHSVのゲノムには、
(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び
(b)少なくとも1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、
前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも1つのケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、
腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、前記腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために前記少なくとも1つのケモカインが発現及び放出される遺伝子改変oHSV。
[2]
前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原が、HER2、PSMA、BCMA、CD20、CD33、CD19、CD22、CD123、CD30、GPC-3、CEA、クローディン18.2(Claudin18.2)、EpCAM、GD2、MSLN、EGFR、MUC1、EGFRVIII、CD38、Trop-2、c-MET、ネクチン-4(Nectin-4)、CD79b、CCK4、GPA33、HLA-A2、CLEC12A、p-カドヘリン(p-cadherin)、TDO2、MART-1、Pmel 17、MAGE-1、AFP、CA125、TRP-1、TRP-2、NY-ESO、PSA、CDK4、BCA225、CA125、MG7-Ag、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TAAL6及びTAG72からなる群から選択される前記[1]に記載の遺伝子改変oHSV。
[3]
前記少なくとも1つのケモカインが、CXCL1~CXCL17、CCL1~CCL28、XCL1、XCL2及びCX3CL1からなる群から選択される前記[1]又は[2]に記載の遺伝子改変oHSV。
[4]
前記切断された非シグナル伝達性の変異体が、細胞外ドメイン、細胞外-膜貫通ドメイン又は前記細胞外ドメイン若しくは前記細胞外-膜貫通ドメインに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を備える等価物である前記[1]~[3]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[5]
前記HSVの最初期遺伝子プロモーターが、HSV-1の、IE1(ICP0プロモーター)、IE2(ICP27プロモーター)、IE3(ICP4プロモーター)及びIE4/5(ICP22及びICP47プロモーター)からなる群から選択される前記[1]~[4]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[6]
前記ポリヌクレオチドが、2つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び少なくとも1つのケモカインをコードする前記[1]~[5]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[7]
前記少なくとも1つのケモカインが、CCL5を含む前記[1]~[6]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[8]
前記ポリヌクレオチドがUL37とUL38との間に挿入される前記[1]~[7]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[9]
前記ポリヌクレオチドが、
(a)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(b)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(c)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(d)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(e)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(f)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、又は
(g)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5をコードする前記[1]~[8]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[10]
前記HSVの最初期遺伝子プロモーターが、HSV-1の最初期遺伝子プロモーターIE4/5である前記[1]~[9]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[11]
PolyA尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードする前記ポリヌクレオチドの下流に位置する前記[1]~[10]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[12]
前記腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である前記[1]~[11]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[13]
前記腫瘍細胞は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記腫瘍関連/特異的抗原を発現しない前記[1]~[12]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[14]
前記oHSVが、前記oHSVの核酸の断片が欠失されるようにさらに改変される前記[1]~[13]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[15]
前記oHSVの核酸の前記断片が、前記oHSVの内部逆方向反復領域、ウイルス遺伝子をコードする断片又はその両方である前記[1]~[14]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[16]
前記oHSVの核酸の前記断片が、F株のPプロトタイプゲノムの位置117005~132096である前記[14]に記載の遺伝子改変oHSV。
[17]
前記oHSVが、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方をコードするようにさらに改変される前記[1]~[16]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[18]
前記免疫刺激剤が、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選択される前記[17]に記載の遺伝子改変oHSV。
[19]
前記免疫治療剤が、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、又はその抗原結合断片である前記[17]又は[18]に記載の遺伝子改変oHSV。
[20]
前記免疫刺激剤が、IL-12であり、前記免疫治療剤が、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片である前記[17]~[19]のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
[21]
前記[1]~[20]のいずれか一項に記載のoHSVと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
[22]
前記腫瘍標的化治療薬が、CAR-T細胞、CAR-NK細胞、BiTE及びADCからなる群から選択される前記[21]に記載の医薬キット。
[23]
前記腫瘍標的化治療薬が、CD19標的化CAR-T細胞、CD19標的化CAR-NK細胞及びCD19又はEpCAM標的化BiTEからなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[24]
前記腫瘍標的化治療薬が、HER2、Trop-2、ネクチン-4(Nectin-4)、BCMA、CD33、CD30、CD22又はCD79b標的化ADCである前記[22]に記載の医薬キット。
[25]
前記腫瘍標的化治療薬が、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、JWCAR-029、IM19CAR-T、CNCT19、BZ019、HD CD19 CAR-T、pCAR-19B、CD19-CART、CT032、iPD1 CD19 eCAR-T、LCAR-B38M、CT103A、CAR-BCMA T、AU-101、4SCAR-PSMA、PSMA-CART、P-PSMA-101、C-CAR066、MB-CART20.1、PBCAR20A、LB1095、LB1901、PRGN-3006、AMG553、CT041、CD30.CAR-T及びCAR-GPC3 Tからなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[26]
前記腫瘍標的化治療薬が、ビーリンサイト(Blincyto)(登録商標)、AMG420、PF-3135及びGBR1302からなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[27]
前記腫瘍標的化治療薬が、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)、エンハーツ(Enhertu)(登録商標)、SHR-A1811、TAA013、RC-48、BAT8001、ARX788、A166、トロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)、BAT8003、DAC-002、DS-1062、SKB264、RC-108、TR1801-ADC、パドセブ(Padccv)(登録商標)、ポライビー(Polivy)(登録商標)、アドセトリス(Adcetris)(登録商標)、マイロターグ(Mylotarg)(登録商標)、ブレンレップ(Blenrep)(登録商標)、PSMA ADC、ADCT-402、PTK7-ADC及びTRS005からなる群から選択される前記[22]に記載の医薬キット。
[28]
遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)であって、
前記oHSVのゲノムには、少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示される遺伝子改変oHSV。
[29]
前記[28]に記載のoHSVと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
Claims (29)
- 遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)であって、
前記oHSVのゲノムには、
(a)少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び
(b)少なくとも1つのケモカインをコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、
前記切断された非シグナル伝達性の変異体及び前記少なくとも1つのケモカインの発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、且つ、
腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示され、且つ、前記腫瘍細胞に対する免疫細胞の走化性を誘導するために前記少なくとも1つのケモカインが発現及び放出される遺伝子改変oHSV。 - 前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原が、HER2、PSMA、BCMA、CD20、CD33、CD19、CD22、CD123、CD30、GPC-3、CEA、クローディン18.2(Claudin18.2)、EpCAM、GD2、MSLN、EGFR、MUC1、EGFRVIII、CD38、Trop-2、c-MET、ネクチン-4(Nectin-4)、CD79b、CCK4、GPA33、HLA-A2、CLEC12A、p-カドヘリン(p-cadherin)、TDO2、MART-1、Pmel 17、MAGE-1、AFP、CA125、TRP-1、TRP-2、NY-ESO、PSA、CDK4、BCA225、CA125、MG7-Ag、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TAAL6及びTAG72からなる群から選択される請求項1に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記少なくとも1つのケモカインが、CXCL1~CXCL17、CCL1~CCL28、XCL1、XCL2及びCX3CL1からなる群から選択される請求項1又は2に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記切断された非シグナル伝達性の変異体が、細胞外ドメイン、細胞外-膜貫通ドメイン又は前記細胞外ドメイン若しくは前記細胞外-膜貫通ドメインに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を備える等価物である請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記HSVの最初期遺伝子プロモーターが、HSV-1の、IE1(ICP0プロモーター)、IE2(ICP27プロモーター)、IE3(ICP4プロモーター)及びIE4/5(ICP22及びICP47プロモーター)からなる群から選択される請求項1~4のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記ポリヌクレオチドが、2つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体、及び少なくとも1つのケモカインをコードする請求項1~5のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記少なくとも1つのケモカインが、CCL5を含む請求項1~6のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記ポリヌクレオチドがUL37とUL38との間に挿入される請求項1~7のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記ポリヌクレオチドが、
(a)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(b)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(c)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体、HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(d)CD19の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(e)Trop-2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、
(f)BCMAの切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5、又は
(g)HER2の切断された非シグナル伝達性の変異体及びCCL5をコードする請求項1~8のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。 - 前記HSVの最初期遺伝子プロモーターが、HSV-1の最初期遺伝子プロモーターIE4/5である請求項1~9のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- PolyA尾部は、切断された抗原及びケモカインをコードする前記ポリヌクレオチドの下流に位置する請求項1~10のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞である請求項1~11のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記腫瘍細胞は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記腫瘍関連/特異的抗原を発現しない請求項1~12のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記oHSVが、前記oHSVの核酸の断片が欠失されるようにさらに改変される請求項1~13のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記oHSVの核酸の前記断片が、前記oHSVの内部逆方向反復領域、ウイルス遺伝子をコードする断片又はその両方である請求項1~14のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記oHSVの核酸の前記断片が、F株のPプロトタイプゲノムの位置117005~132096である請求項14に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記oHSVが、免疫刺激剤、免疫治療剤又はその両方をコードするようにさらに改変される請求項1~16のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記免疫刺激剤が、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24及びIL-27からなる群から選択される請求項17に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記免疫治療剤が、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、又はその抗原結合断片である請求項17又は18に記載の遺伝子改変oHSV。
- 前記免疫刺激剤が、IL-12であり、前記免疫治療剤が、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片である請求項17~19のいずれか一項に記載の遺伝子改変oHSV。
- 請求項1~20のいずれか一項に記載のoHSVと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
- 前記腫瘍標的化治療薬が、CAR-T細胞、CAR-NK細胞、BiTE及びADCからなる群から選択される請求項21に記載の医薬キット。
- 前記腫瘍標的化治療薬が、CD19標的化CAR-T細胞、CD19標的化CAR-NK細胞及びCD19又はEpCAM標的化BiTEからなる群から選択される請求項22に記載の医薬キット。
- 前記腫瘍標的化治療薬が、HER2、Trop-2、ネクチン-4(Nectin-4)、BCMA、CD33、CD30、CD22又はCD79b標的化ADCである請求項22に記載の医薬キット。
- 前記腫瘍標的化治療薬が、テカルタス(Tecartus)(登録商標)、キムリア(Kymriah)(登録商標)、イエスカルタ(Yescarta)(登録商標)、JWCAR-029、IM19CAR-T、CNCT19、BZ019、HD CD19 CAR-T、pCAR-19B、CD19-CART、CT032、iPD1 CD19 eCAR-T、LCAR-B38M、CT103A、CAR-BCMA T、AU-101、4SCAR-PSMA、PSMA-CART、P-PSMA-101、C-CAR066、MB-CART20.1、PBCAR20A、LB1095、LB1901、PRGN-3006、AMG553、CT041、CD30.CAR-T及びCAR-GPC3 Tからなる群から選択される請求項22に記載の医薬キット。
- 前記腫瘍標的化治療薬が、ビーリンサイト(Blincyto)(登録商標)、AMG420、PF-3135及びGBR1302からなる群から選択される請求項22に記載の医薬キット。
- 前記腫瘍標的化治療薬が、カドサイラ(Kadcyla)(登録商標)、エンハーツ(Enhertu)(登録商標)、SHR-A1811、TAA013、RC-48、BAT8001、ARX788、A166、トロデルヴィ(Trodelvy)(登録商標)、BAT8003、DAC-002、DS-1062、SKB264、RC-108、TR1801-ADC、パドセブ(Padccv)(登録商標)、ポライビー(Polivy)(登録商標)、アドセトリス(Adcetris)(登録商標)、マイロターグ(Mylotarg)(登録商標)、ブレンレップ(Blenrep)(登録商標)、PSMA ADC、ADCT-402、PTK7-ADC及びTRS005からなる群から選択される請求項22に記載の医薬キット。
- 遺伝子改変腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)であって、
前記oHSVのゲノムには、少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体をコードするポリヌクレオチドが組み込まれ、前記切断された非シグナル伝達性の変異体の発現はHSVの最初期遺伝子プロモーターによって制御され、腫瘍細胞における前記oHSVの複製時、前記切断された非シグナル伝達性の変異体が前記腫瘍細胞表面上にバイオマーカーとして発現及び提示される遺伝子改変oHSV。 - 請求項28に記載のoHSVと、腫瘍標的化治療薬とを別々に含み、前記腫瘍標的化治療薬は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記少なくとも1つの腫瘍関連/特異的抗原の切断された非シグナル伝達性の変異体に特異的な標的化部分と、がんの細胞を死滅させ又はその増殖を阻害するためのエフェクター部分とを備えるがんの治療のための医薬キット。
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