CN117178053A - 递送趋化因子和肿瘤相关性/特异性抗原的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其编码至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体和至少一种趋化因子。所述截短的非信号传导的变体和所述趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制，并且所述oHSV在肿瘤细胞中复制时所述截短的非信号传导的变体被表达和呈递在所述肿瘤细胞表面上作为生物标志物，并且所述趋化因子被表达和释放以诱导免疫细胞对肿瘤细胞的趋化性。经基因修饰的oHSV可以与CAR‑T、ADC和/或BiTE疗法组合使用。

Description

递送趋化因子和肿瘤相关性/特异性抗原的经基因修饰的溶 瘤性单纯疱疹病毒
技术领域
本发明涉及经基因工程化以携带编码至少一种趋化因子和/或至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的基因的溶瘤性单纯疱疹病毒，以及其与肿瘤靶向治疗剂(包括CAR-T、BiTE和ADC)组合用于治疗各种肿瘤的应用。
背景技术
CAR-T细胞在血液恶性肿瘤患者中的过继转移已显示出惊人的结果。然而，这种方法在实体瘤患者中几乎没有效果。单独的CAR-T细胞疗法似乎不太可能足以在大多数癌症中诱导完全反应。将CAR-T细胞与其他具有不同作用机制且具有与T细胞协同作用潜能的癌症治疗组合，可能会降低肿瘤逃逸并提高CAR-T细胞疗法的成功率。
溶瘤病毒疗法是一种治疗癌症的治疗方法，其使用在癌细胞内选择性复制的天然的或经基因修饰的病毒。在FDA批准Talimogene laherparepvec(T-VEC)(一种经修饰以表达GM-CSF的溶瘤性1型单纯疱疹病毒(HSV-1))后，溶瘤病毒疗法领域再次受到关注。此外，溶瘤病毒(OV)可以进一步被修饰以选择性地传递治疗性转基因至肿瘤微环境，以增强其抗肿瘤效力或增强抗肿瘤免疫反应。将CAR-T细胞与携带细胞因子、趋化因子、BiTE或免疫检查点抑制剂的溶瘤病毒组合的临床前研究导致增强的治疗效果。例如，经修饰以表达IL-15和RANTES或IL-2和TNF-α的溶瘤腺病毒已被证明可以增加CAR-T细胞在肿瘤微环境中的积累和存活。表达CXCL11(一种CXCR3配体)的牛痘病毒被用于在转移后吸引效应细胞，以增强CAR-T细胞的肿瘤内运输。另一份研究表明，通过靶向第二种肿瘤抗原的BiTE的溶瘤腺病毒的表达可以解决抗原表达的异质性。正如预期的那样，与作为单一疗法的每种药物相比，CAR-T细胞和经武装的OV的所有这些组合都能增强肿瘤控制并延长生存期。
最近的一项研究工程化溶瘤病毒来表达非信号传导的、截短的CD19(CD19t)蛋白用于肿瘤选择性递送，从而能够被CD19-CAR T细胞靶向。在病毒介导的肿瘤裂解之前，用编码CD19t(OV19t)的溶瘤牛痘病毒感染肿瘤细胞在细胞表面产生重头合成的CD19。共培养的CD19-CAR T细胞分泌细胞因子并对感染的肿瘤表现出有效的细胞溶解活性。使用几种小鼠肿瘤模型，OV19t的递送在CD19-CAR T细胞施用后促进肿瘤控制。OV19t诱导局部免疫，其特征在于内源性的和过继转移的T细胞的肿瘤浸润。CAR T细胞介导的肿瘤杀伤还诱导死亡肿瘤细胞释放病毒，从而促进CD19t的肿瘤表达。虽然该研究治愈了超过50％的用这种组合疗法治疗的小鼠，但有一些小鼠要么有短暂的反应，要么没有反应(Park et al.,Sci.Transl.Med.12,eaaz1863(2020))。
US20190233536A1公开了一种经修饰的腺病毒，特别是Enadenotucirev(EnAd)，其武装有至少两个双特异性T细胞接合器(BiTE)，每个都包含至少两个结合结构域，其中至少一个结构域对感兴趣的免疫细胞(如感兴趣的T细胞)上的表面抗原是特异性的。用BiTE分子武装腺病毒允许双特异性抗体片段分子“搭载”腺病毒的能力以选择性感染癌细胞，从而能够将BiTE靶向递送至肿瘤细胞。一旦被腺病毒感染，BiTE分子由肿瘤细胞合成、分泌并在局部发挥作用，从而扩散到病毒的直接覆盖区之外。因此，这允许BiTE传播到感染的直接部位之外，但同时限制了病毒传播的太远超出受感染的肿瘤细胞巢。这最大限度地减少了不希望的脱靶效应的风险。
发明内容
本公开的第一方面涉及一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体和(b)至少一种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和至少一种趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制，并且其中所述oHSV在肿瘤细胞中复制时所述截短的非信号传导的变体被表达和呈递在肿瘤细胞表面上作为生物标志物，并且至少一种趋化因子被表达和释放以诱导免疫细胞对肿瘤细胞的趋化性。
本公开的另一个方面涉及一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，其中所述截短的非信号传导的变体的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制，并且其中所述oHSV在肿瘤细胞中复制时所述截短的非信号传导的变体被表达和呈递在肿瘤细胞表面上作为生物标志物。
本公开的另一个方面涉及一种用于治疗癌症的药物药盒，其单独地包含：如本文所述的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)和肿瘤靶向治疗剂，其中所述肿瘤靶向治疗剂具有对由多核苷酸编码的至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体有特异性的靶向部分和用于杀死或抑制癌症细胞增殖的效应部分。
本公开的另一个方面涉及一种用于治疗对象中的癌症的方法，其包含同时或按顺序施用药学有效量的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)和肿瘤靶向治疗剂至所述对象，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及优选地(b)至少一种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和优选地至少一种趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制，并且其中所述肿瘤靶向治疗剂具有对由所述多核苷酸编码的至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体有特异性的靶向部分和用于杀死或抑制癌症细胞增殖的效应部分。
本公开的其他方面将容易地从以下参照附图描述的详细描述中看出。
附图说明
图1示出了T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012和T7013(以下统称“T7系列”)的oHSV骨架的示意图。(A)T3011的示意图，T3011是一种经基因修饰的oHSV，其编码hPD-1抗体(hPD-1-Ab)(一种免疫检查点抑制剂)和hIL-12(一种细胞因子)，其内部反向重复区(b'a'a'c')被编码hIL-12的多核苷酸替代，并且hPD-1-Ab的表达盒被引入UL片段的基因UL3和UL4之间。T3011的更详细描述可以在WO 2017/181420(IMMV503)(其全部内容通过引用并入本文)中找到。(B)本文所述的示例性T7系列病毒的示意图。这些经基因修饰的oHSV编码hPD-1-Ab、hIL-12、肿瘤相关性抗原和趋化因子，其内部反向重复区(b'a'和a'c')被编码hIL-12的多核苷酸替代，hPD-1-Ab的表达盒被引入UL片段的基因UL3和UL4之间，以及TAA+趋化因子表达盒被引入UL片段的基因UL37和UL38之间。(C)示例性经基因修饰的oHSVT7201、T7202、T7203和T7204的示意图，其中图B中的TAA+趋化因子表达盒体现为一种TAA(肿瘤相关性抗原(Tumor Associated Antigen)的截短的非信号传导的变体)和一种趋化因子。(D)示例性经基因修饰的oHSV T7011、T7012和T7013的示意图，其中图B中的TAA+趋化因子表达盒具体为两种不同的TAA加一种趋化因子，表示为TAA1+TAA2+趋化因子。HSV-IE(即刻早期)启动子和PolyA尾分别位于表达盒的上游和下游。
图2示出了T7系列oHSV(即如上所述的T7011至T7013和T7201至T7204)的构建的流程图。构建涉及借助细菌人工染色体(BAC)系统进行克隆的多个步骤。
图3示出了T7011感染293T、HEp-2和Tca8113细胞后CCL5的释放。CCL5的表达和释放快速且强烈。感染后4小时即检测到分泌的CCL5，峰值高达5,000pg/ml。在T7011病毒感染后，分泌物稳定并保持至少4天。从而表明CCL5分泌。
图4示出了细胞表面上截短的CD19、BCMA、Trop-2、HER2的表达。分别由T7011、T7012和T7013编码的不同的截短的抗原同时在肿瘤细胞表面上表达。
图5示出了T7系列(T7011、T7012和T7013)oHSV病毒的抗肿瘤作用。T7系列oHSV病毒的IC50值与T3011相当，表明与T3011相比T7系列病毒具有相似的广谱抗肿瘤活性。
图6示出了T7系列(T7011、T7012和T7013)oHSV病毒在CAR-T细胞或正常T细胞中没有感染活性。
图7示出了T7系列(T7011、T7012和T7013)oHSV病毒在CAR-TCD19细胞或正常T细胞中没有细胞杀伤活性。
图8示出了在T7011和CAR-TCD19组合治疗中抗肿瘤作用显著增强。
图9示出了T7011病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19抗肿瘤活性。
图10示出了在T7012和CAR-TCD19组合治疗中抗肿瘤作用显著增强。
图11示出了T7012病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19抗肿瘤活性。
图12示出了在T7013和CAR-TCD19组合治疗中抗肿瘤作用显著增强。
图13示出了T7013病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19抗肿瘤活性。
图14示出了T7系列(T7011、T7012和T7013)oHSV病毒在CAR-NKCD19或NK细胞中没有细胞杀伤能力。
图15示出了HSV-1(F)和T7011在CAR-NKCD19和NK细胞中的病毒复制。
图16示出了T7011对CAR-NKCD19细胞增殖没有负面影响。*p<0.05，***p<0.001。
图17示出了T7011对NK细胞增殖没有负面影响。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图18示出了在T7011和CAR-NKCD19组合治疗中抗肿瘤作用显著增强。
图19示出了T7011病毒感染能够特异性协同CAR-NKCD19抗肿瘤活性。
发明的详细说明
定义
要注意的是，术语“一”或“一个”或“一种”实体是指该实体中的一个或多个或一种或多种；例如，“截短的非信号传导的变体”被理解为表示一种或多种截短的非信号传导的变体。因此，术语“一个”或“一种”、“一个或多个”或“一种或多种”和“至少一个”或“至少一种”可以在本文中互换使用。
如本文所使用的，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等等。不管结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物而起到类似抗体的作用的任何合成的或基因工程化的蛋白质。
本公开的抗体、抗原结合多肽或其变体或衍生物包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类化或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段(例如Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv))、包含VK或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段以及抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，针对本文公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、或亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。例如，抗PD-1抗体可以指其抗原结合片段，例如Fab片段或其scFv。
“特异性结合”、“特异性”或“具有特异性”通常是指抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域结合至表位比结合至随机的、不相关的表位更容易时，则该抗体被认为与表位“特异性结合”。术语“特异性”在本文中用于定量某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，抗体“A”可以被认为具有比抗体“B”对给定表位更高的特异性，或者抗体“A”可以被认为与表位“C”的结合比它对相关表位“D”的特异性更高。
如本文所使用的，如本文中可互换使用的“癌症”或“肿瘤”是指可根据本公开内容治疗并涉及异常细胞生长的一组疾病，其可能侵入或扩散至身体的其他部位。并非所有的肿瘤都是癌性的；良性肿瘤不会扩散到身体的其他部位。可能的体征和症状包括：新的肿块、不正常的出血、长时间的咳嗽、不明原因的体重减轻和排便改变等等。有超过100种不同的已知癌症影响人类。如本文所使用的，“癌症”包括但不限于实体癌(例如，肿瘤)和血液系统恶性肿瘤。“血液系统恶性肿瘤”，也称为血癌，是一种起源于造血组织(例如骨髓或免疫系统的其他细胞)的癌症。血液系统恶性肿瘤包括但不限于白血病(例如急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性混合性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和大颗粒淋巴细胞白血病)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性疾病(真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化和慢性粒细胞白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、MGUS和类似疾病、霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和其他B细胞恶性肿瘤。“实体癌”包括但不限于骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童肿瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮癌、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)。
如本文所使用的，术语“处理”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或紊乱，例如癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，缓解症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延缓或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、以及症状消失(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是无法检测的。“治疗”也意味着与不接受治疗时所预期的生存期相比延长生存期。需要治疗的对象包括那些已经患有疾病或病症的对象，以及那些容易患有疾病或病症的对象，或者那些预防疾病或病症的对象。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
如本文所使用的，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的对象”等短语包括受益于施用本发明的用于例如检测、诊断程序和/或治疗的oHSV-1或组合物的对象，例如哺乳动物对象。
本领域普通技术人员还应该理解，如本文所公开的经修饰的基因组可以被修饰，使得它们在核苷酸序列上与它们所来源的经修饰的多核苷酸不同。例如，来源于指定的DNA序列的多核苷酸或核苷酸序列可以是相似的，例如与起始序列具有一定的百分比同一性，例如其可以与起始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
此外，可以进行核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入，以在“非必需”氨基酸区域进行保守取代或改变。例如，来源于自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列，除了一个或多个单独的氨基酸取代、插入或缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个单个氨基酸取代、插入或缺失)之外，其余部分可以与起始序列相同。在某些实施方案中，来源于指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个单独的氨基酸取代、插入或缺失。
“治疗有效量”或“有效量”是指在所需的剂量和必要的时间段内有效达到所需治疗结果的量。治疗有效量可以根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括：例如，改善患者的健康状况、减少肿瘤负担、阻止或减缓肿瘤的生长和/或癌细胞不转移到身体的其他部位。
CAR-T细胞是表达嵌合抗原受体的T细胞。表达CAR分子的T细胞可以是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、病毒特异性细胞毒性T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。嵌合抗原受体(CAR)是一种重组融合蛋白，其包含：1)细胞外配体结合结构域，即抗原识别结构域，2)跨膜结构域，以及3)信号转导结构域。细胞外配体结合结构域是能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，细胞外配体结合结构域能够与细胞表面分子相互作用，所述细胞表面分子可以是抗原、受体、肽配体、靶标的蛋白质配体或靶标的多肽。在本公开中，细胞外配体结合结构域将能够与肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的截短的非信号传导的变体相互作用。
通常，细胞外配体结合结构域通过跨膜结构域I连接至嵌合抗原受体(CAR)的信号转导结构域。跨膜结构域穿过细胞膜，将CAR锚定在T细胞表面，将细胞外配体结合结构域连接至信号转导结构域，影响T细胞表面上CAR的表达。跨膜结构域可以进一步包含细胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。术语“铰链区”通常是指起到将跨膜结构域连接至细胞外配体结合结构域的功能的任何寡肽或多肽。特别是，铰链区被用于为细胞外配体结合结构域提供更多的灵活性和可及性。铰链区可以包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。铰链区可以来源于天然存在的分子如CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、CD3ζ、T细胞受体α或β链、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154的全部或部分，或者来源于抗体恒定区的全部或部分。替代地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或者铰链区可以是完全合成的铰链序列。
嵌合抗原受体(CAR)还包含CAR的信号转导结构域或细胞内信号传导结构域，其负责在细胞外配体结合结构域与靶标结合后的细胞内信号传导，从而导致免疫细胞的激活和免疫反应。也就是说，信号转导结构域负责表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能的激活。例如，T细胞的效应功能可以是溶细胞活性或辅助T细胞活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号转导结构域”是指转导效应信号功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质部分。用于CAR的信号转导结构域的实施例可以是协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两类不同的细胞质信号传导序列，即启动抗原依赖性初级激活的那些，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级细胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，其被称为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的激活基序。ITAM是定义明确的信号传导基序，存在于多种受体的胞质内尾部，可作为syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。可被用于本公开的ITAM的非限制性实施例可包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个实施方案中，CAR的信号转导结构域可以包含与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。本公开设想了本文所述的基因工程化的oHSV与任何CAR-T的组合使用，但不限于此。
典型的抗体-药物偶联物(ADC)含有能够与癌细胞的表面特异性抗原结合的单克隆抗体。这些抗体包括免疫系统B细胞和T细胞的表面上的一些蛋白质，如CD20、CD22和人表皮生长因子受体2(Her2)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。这些抗体通过可切割的连接子单元与高毒性的药物相连。药物被设计来诱导不可逆的DNA损伤或干扰细胞分裂，从而导致癌细胞的凋亡。ADC含有能够与癌细胞的表面特异性抗原结合的单克隆抗体。这些抗体包括免疫系统B细胞和T细胞的表面上的一些蛋白质，如CD20、CD22和人表皮生长因子受体2(Her2)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。这些抗体通过可切割的连接子单元与高毒性的药物相连。药物被设计来诱导不可逆的DNA损伤或干扰细胞分裂，从而导致癌细胞的凋亡。
抗体药物偶联物(ADC)的机制是通过抗体识别并结合特异性抗原，引发一系列反应，然后通过内吞作用进入细胞质，其中高毒性的药物与溶酶体酶解离以杀死癌细胞。与对癌细胞和正常组织不加选择地引起损伤的传统化疗相比，靶向药物递送可以使药物直接作用于癌细胞，减少对正常细胞的损伤。典型的抗体药物偶联物由药物、连接子单元和抗体三部分组成。特异性抗体和药物的选择取决于具体疾病，对偶联物的安全性和有效性有重要影响。连接子单元的稳定性和与抗体的偶联方式对ADC药物的开发起着决定性的作用。决定抗体药物偶联物功效的因素包括连接子单元的稳定性和断裂敏感性、细胞表面激发内化、转运和细胞毒素的释放。本公开设想了本文所述的T7系列oHSV与任何ADC的组合使用，但不限于此。
双特异性T细胞接合剂(BiTE)是相对简单的双特异性分子，其对T细胞的TCR复合物的CD3E亚基具有特异性，并且还靶向感兴趣的抗原，例如癌症抗原。由于BiTE对TCR复合物具有特异性，这使得BiTE能够激活驻留的T细胞以杀死在其细胞表面表达特定靶抗原的细胞，例如癌细胞。BiTE的一个重要特性是它们能够使CD4+和未激活的CD8+T细胞靶向癌细胞。也就是说，BiTE激活的T细胞可以独立于细胞表面的MHC表达来杀死细胞。这是很重要的，因为一些肿瘤细胞下调MHC，使得它们对CAR-T细胞和immTAC等药物产生抗药性。不幸的是，与全长抗体相比，BiTE的循环动力学较差。这意味着当施用于患者时，大部分BiTE不会到达其靶细胞。此外，使用高亲和力抗CD3 ScFv作为BiTE的一部分会导致在血液中与T细胞强结合，这也会干扰向肿瘤的递送。因此，BiTE无法充分发挥其作为抗癌疗法的潜力，因为它们无法有效地递送至肿瘤细胞。本公开设想了本文所述的oHSV与任何BiTE的组合使用，但不限于此。
如本文所使用的，术语“肿瘤相关性/特异性抗原”是指肿瘤相关性抗原、肿瘤特异性抗原或两者。例如，术语“至少一种肿瘤相关性/特异性抗原”是指至少一种肿瘤相关性抗原或至少一种肿瘤特异性抗原，并且可以包括一对肿瘤相关性抗原和肿瘤特异性抗原。例如，术语“至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体”旨在包括一种肿瘤相关性抗原的截短的非信号传导的变体、两种或更多种肿瘤相关性抗原的截短的非信号传导的变体、一种肿瘤特异性抗原的截短的非信号传导的变体、两种或更多种肿瘤特异性抗原的截短的非信号传导的变体、一种肿瘤相关性抗原和两种或更多种肿瘤特异性抗原的截短的非信号传导的变体、以及两种或更多种肿瘤相关性抗原和一种肿瘤特异性抗原的截短的非信号传导的变体。例如，术语“两种肿瘤相关性/特异性抗原”可以包括两种肿瘤相关性抗原、两种肿瘤特异性抗原以及一种肿瘤相关性抗原和一种肿瘤特异性抗原的组合。
如本文所使用的，特定的肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的“生物标志物”、“截短的非信号传导的变体”、“截短的变体”或“非信号传导的变体”是指肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的变体，其被突变、缺失或以其他方式修饰以关闭其野生型对应物在信号传导通路中的信号转导。变体暴露抗原的至少一些表位，使得变体能够被特异性针对野生型抗原的抗体或其抗原结合片段(例如scFv)结合。在抗原是跨膜蛋白的情况下，通常已知的肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的非信号传导的变体是抗原的细胞外结构域、抗原的细胞外-跨膜结构域或与细胞外结构域或细胞外-跨膜结构域具有至少90％氨基酸序列同一性的其等效物。等效物不能转导信号，但暴露抗原的细胞外结构域上的至少一些表位。
例如，CD19的非信号传导的变体(本文也称为非信号传导CD19)是野生型CD19的323个氨基酸的细胞外-跨膜结构域(SEQ ID NO：14)。非信号传导的BCMA是野生型BCMA的77个氨基酸的细胞外-跨膜结构域(SEQ ID NO:15)。非信号传导的HER2是野生型HER2的675个氨基酸的细胞外-跨膜结构域(SEQ ID NO:16)。非信号传导的Trop-2是野生型Trop-2的297个氨基酸的细胞外-跨膜结构域(SEQ ID NO:17)。
细胞外结构域和跨膜结构域可以通过本领域的常规实践毫无困难地获得。各种肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的细胞外/跨膜结构域的氨基酸序列可以从包括NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)在内的公共资源获得。需要指出的是，非信号传导的变体一旦在肿瘤细胞表面上表达，就会被对肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原有特异性的抗体或抗体的抗原结合片段识别和结合。抗原结合片段可以是CAR-免疫细胞(例如，CAR-T细胞或CAR-NK细胞)或BiTE的一部分。抗体可以与化学治疗药物缀合以形成ADC。然而，非信号传导的变体不会像其野生型对应物那样触发信号传导通路。本领域技术人员将容易测试和验证肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的变体是否是非信号传导的。例如，可以通过检测野生型抗原已知的正常信号传导通路中下游蛋白质的水平来确定。
经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)
本公开提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)。经基因修饰的oHSV被修饰，使得其在易感细胞(例如实体瘤细胞)中复制时表达至少一种肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的截短的非信号变传导体。本发明人展示了经基因修饰的oHSV在肿瘤细胞中感染和复制后，细胞表面上不同的截短的肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原的成功表达。表达并且然后呈递在肿瘤细胞的表面上的非信号传导的肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原标记该肿瘤细胞作为各种抗原导向疗法(例如CAR-T疗法)的靶标。在一些实施方案中，本公开的经基因修饰的oHSV被进一步修饰，使得其在易感细胞(例如实体瘤细胞)中复制时表达至少一种趋化因子。本发明人展示了在感染后4小时就可以检测到分泌的趋化因子，并且在oHSV病毒感染后保留至少4天。趋化因子的表达和释放诱导免疫细胞(例如T细胞或CAR T细胞)对易感细胞的趋化性，这有助于免疫细胞转运和浸润到肿瘤块中。
在一些实施方案中，提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，其中所述截短的非信号传导的变体的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。
在一些实施方案中，提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及(b)至少一种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和至少一种趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。
在一些实施方案中，提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)一种肿瘤相关性抗原或一种肿瘤特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及(b)一种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和所述趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。
在一些实施方案中，提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)两种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及(b)一种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和所述趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含两种相同的或不同的肿瘤相关性抗原。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含两种相同的或不同的肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含一种肿瘤相关性抗原和一种肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及(b)两种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和所述趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。在一些实施方案中，两种趋化因子是相同的。在一些实施方案中，两种趋化因子是不同的。
在一些实施方案中，提供了一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码(a)两种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及(b)两种趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和所述趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。在一些实施方案中，两种趋化因子是相同的。在一些实施方案中，两种趋化因子是不同的。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含两种相同的或不同的肿瘤相关性抗原。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含两种相同的或不同的肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含一种肿瘤相关性抗原和一种肿瘤特异性抗原。
因此，在本公开的一些实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体的第一多核苷酸和编码至少一种趋化因子的第二多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的变体和所述至少一种趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。
在一些实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码第一肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体的第一多核苷酸、编码第二肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体的第二多核苷酸、以及编码一种趋化因子的第三多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的变体和所述趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。
在一些实施方案中，肿瘤相关性/特异性抗原、第一或第二肿瘤相关性/特异性抗原独立地选自HER2、PSMA、BCMA、CD20、CD33、CD19、CD22、CD123、CD30、GPC-3、CEA、Claudin18.2、EpCAM、GD2、MSLN、EGFR、MUC1、EGFRVIII、CD38、Trop-2、c-MET、Nectin-4、CD79b、CCK4、GPA33、HLA-A2、CLEC12A、p-钙粘蛋白、TDO2、MART-1、Pmel 17、MAGE-1、AFP、CA125、TRP-1、TRP-2、NY-ESO、PSA、CDK4、BCA225、CA125、MG7-Ag、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TAAL6和TAG72。在一些实施方案中，肿瘤相关性/特异性抗原选自HER2、Trop-2、BCMA和CD19。
在一些实施方案中，趋化因子选自CXCL1至CXCL17、CCL1至CCL 28、XCL1、XCL2和CX3CL1。在优选的实施方案中，趋化因子选自CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL3、CCL4、CCL5、CCL19、CCL21。在优选的实施方案中，趋化因子是CCL5。
在一些实施方案中，HSV的即刻早期基因启动子是HSV-1或HSV-2的即刻早期基因启动子。在一些实施方案中，HSV的即刻早期基因启动子选自HSV-1的IE 1(ICP0启动子)、IE2(ICP27启动子)、IE 3(ICP4启动子)和IE 4/5(ICP22和ICP47启动子)。在优选的实施方案中，HSV的即刻早期基因启动子是HSV-1的即刻早期基因启动子IE4/5。
在一些实施方案中，截短的非信号传导的变体是肿瘤相关性/特异性抗原的细胞外-跨膜结构域。例如，CD19的截短的非信号传导的变体是CD19的细胞外-跨膜结构域。例如，BCMA的截短的非信号传导的变体是BCMA的细胞外-跨膜结构域。例如，HER2的截短的非信号传导的变体是HER2的细胞外-跨膜结构域。例如，Trop-2的截短的非信号传导的变体是Trop-2的细胞外-跨膜结构域。在一些实施方案中，截短的非信号传导的变体是肿瘤相关性/特异性抗原的细胞外结构域。在一些实施方案中，截短的非信号传导的变体是连接至肿瘤相关性/特异性抗原的跨膜结构域的一部分的细胞外结构域。在一些实施方案中，截短的非信号传导的变体是缺少部分或整个信号转导结构域的野生型肿瘤相关性/特异性抗原的变体。
在优选的实施方案中，经基因修饰的oHSV源自1型HSV(HSV-1)或2型HSV(HSV-2)。在优选的实施方案中，经基因修饰的oHSV源自HSV-1的F株。
在优选的实施方案中，本文所述的多核苷酸编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，以及(ii)CCL5。在优选的实施方案中，多核苷酸编码(i)Trop-2的截短的非信号传导的变体，以及(ii)CCL5。在优选的实施方案中，多核苷酸编码(i)HER2的截短的非信号传导的变体，以及(ii)CCL5。在优选的实施方案中，多核苷酸编码(i)BCMA的截短的非信号传导的变体，以及(ii)CCL5。
在优选的实施方案中，本文所述的多核苷酸编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)BCMA的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5。在优选的实施方案中，本文所述的多核苷酸编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)Trop-2的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5。在优选的实施方案中，本文所述的多核苷酸编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)HER2的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5。
在一些实施方案中，肿瘤细胞是实体瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞不表达由多核苷酸编码的肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达由多核苷酸编码的肿瘤相关性抗原或肿瘤特异性抗原。
在一些实施方案中，如上所述的经基因修饰的oHSV被进一步修饰以缺失oHSV的基因组的核酸的片段，从而使oHSV被减毒或去除对于其预期用途的目的不需要的某些特性。在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV缺失内部反向重复区、编码病毒性基因的片段或两者。在一个实施方案中，缺失的oHSV的核酸的片段是HSV-1的F株的P原型基因组中的位置117005至132096。在一个实施方案中，编码病毒性基因的片段是编码γ34.5的核酸的片段。在一个实施方案中，基因γ34.5的两个拷贝都被缺失。
在一些实施方案中，如上所述的经基因修饰的oHSV被进一步修饰以编码免疫刺激剂、免疫治疗剂或两者。在一个实施方案中，免疫刺激剂选自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、或者其抗原结合片段。在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV编码IL-12。在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV编码抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV编码IL-12和抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
应当注意，需要肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体和趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子(例如IE4/5启动子)的控制，使得肿瘤相关性/特异性抗原在病毒感染后不久且病毒复制导致肿瘤细胞裂解之前表达。编码截短的非信号传导的变体的多核苷酸和编码趋化因子的多核苷酸可以被可操作地连接至相同的即刻早期启动子。在另一个实施方案中，编码截短的非信号传导的变体的多核苷酸和编码趋化因子的多核苷酸可以被可操作地连接至不同的即刻早期启动子。当oHSV进一步武装有免疫刺激剂、免疫治疗剂或两者，例如IL-12和抗PD-1抗体时，免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的表达不一定受即刻早期启动子的控制，但优选地受不同的和相对晚的启动子(例如CMV启动子或Egr-1启动子)的控制。在一个实施方案中，编码IL-12的多核苷酸被可操作地连接至Egr-1启动子。在另一个实施方案中，编码scFv-抗-hPD1的多核苷酸被可操作地连接至CMV启动子。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸和编码CCL5的第二多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的BCMA的第一多核苷酸和编码CCL5的第二多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的BCMA和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的Trop-2的第一多核苷酸和编码CCL5的第二多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的Trop-2和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的HER2的第一多核苷酸和编码CCL5的第二多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的HER2和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码截短的非信号传导的BCMA9的第二多核苷酸和编码CCL5的第三多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19、所述截短的非信号传导的BCMA9和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码截短的非信号传导的Trop-2的第二多核苷酸和编码CCL5的第三多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19、所述截短的非信号传导的Trop-2和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码截短的非信号传导的HER2的第二多核苷酸和编码CCL5的第三多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19、所述截短的非信号传导的HER2和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码选自CD19、BCMA、Trop-2和HER2中的任一种的截短的非信号传导的变体的第一多核苷酸、编码CCL5的第二多核苷酸、编码抗PD-1抗体的第三多核苷酸和编码IL-12的第四多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制，以及其中所述oHSV的内部反向重复区缺失。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码选自BCMA、Trop-2和HER2中的任一种的截短的非信号传导的变体的第二多核苷酸、编码CCL5的第三多核苷酸、编码抗PD-1抗体的第四多核苷酸和编码IL-12的第五多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码选自BCMA、Trop-2和HER2中的任一种的截短的非信号传导的变体的第二多核苷酸、编码CCL5的第三多核苷酸、编码抗PD-1抗体的第四多核苷酸和编码IL-12的第五多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制，以及其中所述oHSV的内部反向重复区缺失。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码选自BCMA、Trop-2和HER2中的任一种的截短的非信号传导的变体的第二多核苷酸、编码CCL5的第三多核苷酸、编码抗PD-1抗体的第四多核苷酸和编码IL-12的第五多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制，以及其中所述oHSV的内部反向重复区缺失，以及其中所述oHSV的所有单拷贝基因被保留。
在一个实施方案中，经基因修饰的oHSV的基因组中并入编码截短的非信号传导的CD19的第一多核苷酸、编码选自BCMA、Trop-2和HER2中的任一种的截短的非信号传导的变体的第二多核苷酸、编码CCL5的第三多核苷酸、编码抗PD-1抗体的第四多核苷酸和编码IL-12的第五多核苷酸，其中所述截短的非信号传导的CD19和所述CCL5的表达受HSV-1IE4/5启动子的控制，其中所述oHSV的内部反向重复区和γ34.5的两个拷贝缺失，以及其中所述oHSV的所有单拷贝基因被保留。
在一个实施方案中，PolyA尾位于编码截短的抗原和趋化因子的多核苷酸的下游。例如，编码截短的非信号传导的变体和趋化因子的多核苷酸排列为5’-CD19-CCL5-PolyA-3’、5’-BCMA-CCL5-PolyA-3’、5’-HER2-CCL5-PolyA-3’、5’-CD19-BCMA-CCL5-PolyA-3’、5’-CD19-Trop-2-CCL5-PolyA-3’或5’-CD19-HER2-CCL5-PolyA-3’。
在一个实施方案中，将编码截短的非信号传导的变体、免疫治疗剂和趋化因子的任何多核苷酸并入oHSV基因组中不会破坏病毒基因的功能。例如，将编码抗PD-1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸引入病毒的UL3和UL4基因之间，以及将编码截短的非信号传导的变体和趋化因子的多核苷酸引入病毒的UL37和UL38基因之间。此外，在一个实施方案中，编码IL2的多核苷酸替代了病毒基因组的内部反向重复区。
在本公开中，由oHSV编码的肿瘤相关性/特异性抗原可以与oHSV感染的肿瘤细胞异源或同源。在一个实施方案中，肿瘤细胞表达与由oHSV编码的肿瘤相关性/特异性抗原不同的肿瘤相关性/特异性抗原。例如，肿瘤细胞过表达CD22，而本公开的经基因修饰的oHSV表达CD19、HER2或两者。在另一个实施方案中，肿瘤细胞表达与由oHSV编码的肿瘤相关性/特异性抗原相同的肿瘤相关性/特异性抗原。例如，肿瘤细胞以低水平表达HER2，而本公开的经基因修饰的oHSV表达HER2。在另一个实施方案中，肿瘤细胞未被检测到已知的肿瘤相关性/特异性抗原。
本公开的经基因修饰的oHSV感染的肿瘤细胞为血液肿瘤细胞或实体肿瘤细胞。
有利地，肿瘤细胞表面上非信号传导的肿瘤相关性/特异性抗原的呈递将肿瘤细胞从相对于该特定肿瘤相关性/特异性抗原的阴性细胞转变为阳性细胞，从而使肿瘤对靶向特定肿瘤相关性/特异性抗原或肿瘤特异性抗原的疗法产生反应。异源多核苷酸的表达受即刻早期基因启动子(例如HSV-1的IE4/5)的控制，使得翻译产物在oHSV进入肿瘤细胞和复制的极早期阶段产生。例如，oHSV可以被修饰，使得其表达截短的非信号传导的CD19，一种在正常和大多数肿瘤B细胞上特异性表达的跨膜蛋白。然后，截短的非信号传导的CD19在细胞通过oHSV感染裂解之前被呈递在肿瘤细胞表面上，并作为CD19导向的CAR-T疗法(例如或/>)的靶标。也就是说，由于肿瘤细胞上缺乏CD19抗原，非信号传导的CD19的表达将通常对CD19导向的CAR-T疗法不敏感的肿瘤细胞转化为对CD19导向的CAR-T敏感的肿瘤细胞。在这种情况下，肿瘤将对CD19导向的CAR-T疗法产生反应。
编码多于一种非信号传导的肿瘤相关性/特异性抗原的经基因修饰的oHSV的一个关键优势在于提供了一种多功能工具，用于与不同的肿瘤抗原靶向疗法组合使用，而无需为每种肿瘤抗原靶向疗法重复设计、测试和制造oHSV。结果表明，当两种不同的非信号传导的肿瘤相关性/特异性抗原由相同的oHSV编码时，它们可以在肿瘤细胞因病毒感染而被裂解之前，同时成功地被表达并呈递在肿瘤细胞表面上。两种或更多种不同的非信号传导的肿瘤相关性/特异性抗原的呈递会将肿瘤细胞转变为双重或甚至三重阳性肿瘤细胞，从而使不同的肿瘤靶向疗法对肿瘤细胞有效。这将有助于提高相应肿瘤靶向疗法(例如CAR-T细胞疗法)的特异性和功效。
本文公开的一些经基因修饰的oHSV的进一步优势在于，除了肿瘤相关性/特异性抗原之外，其编码至少一种趋化因子，所述趋化因子的表达和释放进一步帮助免疫细胞向肿瘤细胞转运和浸润。因此当CAR-T、CAR-NK等与本文所述的oHSV组合使用时特别有利。然而，不受任何理论束缚，本文公开的经基因修饰的oHSV可以单独使用，趋化因子的分泌会诱导机体免疫细胞(如T细胞)对肿瘤的趋化性，并与病毒的抗肿瘤作用一起杀死肿瘤细胞。
oHSV和肿瘤靶向疗法的组合
本公开的另一方面涉及用于治疗各种癌症的如上所述的任何经基因修饰的oHSV与肿瘤靶向治疗剂的组合。如上所述，本文公开的经基因修饰的oHSV表达非信号传导的肿瘤相关性/特异性抗原，然后将该抗原呈递在肿瘤细胞的表面上。这为设计来靶向肿瘤相关性/特异性抗原的治疗剂以靶向被oHSV感染的肿瘤细胞提供了机会。
在本公开中，肿瘤靶向治疗剂具有对由oHSV编码的至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体有特异性的靶向部分，以及用于杀死或抑制癌症细胞增殖的效应部分。当oHSV进入肿瘤细胞中并复制时，靶向部分对肿瘤细胞表面上表达的非信号传导的肿瘤相关/特异性抗原具有特异性。例如，靶向部分是针对肿瘤相关性/特异性抗原的抗体的抗原结合结构域，例如抗体、scFv、Fab或CAR-T细胞的嵌合抗原受体部分。效应部分可用于杀死癌症细胞或抑制癌症细胞的增殖。例如，效应部分是免疫细胞，包括T细胞和自然杀伤细胞、可与T细胞接合的BiTE的一部分、或者抗体-药物偶联物的药物部分。
在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂选自嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞、嵌合抗原受体NK(CAR-NK)细胞、双特异性T细胞接合剂(BiTE)和抗体药物偶联物(ADC)。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是CAR-T细胞。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是CAR-NK细胞。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是BiTE。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是ADC。
在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19的CAR-T细胞。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19或EpCAM的BiTE。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是靶向HER2、Trop-2、Nectin-4、BCMA、CD33、CD30、CD22或CD79b的ADC。
在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19的CAR-T细胞。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂选自JWCAR-029、IM19CAR-T、CNCT19、BZ019、HD CD19 CAR-T、pCAR-19B、CD19-CART、CT032、iPD1 CD19 eCAR-T、LCAR-B38M、CT103A、CAR-BCMAT、AU-101、4SCAR-PSMA、PSMA-CART、P-PSMA-101、C-CAR066、MB-CART20.1、PBCAR20A、LB1095、LB1901、PRGN-3006、AMG553、CT041、CD30.CAR-T和CAR-GPC3T。
在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19或EpCAM的BiTE。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂选自AMG420、PF-3135和GBR1302。
在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂是靶向HER2、Trop-2、Nectin-4、BCMA、CD33、CD30、CD22或CD79b的ADC。在一些实施方案中，肿瘤靶向治疗剂选自SHR-A1811、TAA013、RC-48、BAT8001、ARX788、A166、/>BAT8003、DAC-002、DS-1062、SKB264、RC-108、TR1801-ADC、/>PSMAADC、ADCT-402、PTK7-ADC和TRS005。
在优选的实施方案中，用于与上述任何肿瘤靶向治疗剂组合使用的经基因修饰的oHSV是一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组的经基因修饰的oHSV，所述多核苷酸编码(a)两种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体和(b)趋化因子，其中所述截短的非信号传导的变体和趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含两种相同的或不同的肿瘤相关性抗原。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包含两种相同的或不同的肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，两种肿瘤相关性/特异性抗原包括一种肿瘤相关性抗原和一种肿瘤特异性抗原。
在优选的实施方案中，用于与肿瘤靶向治疗剂组合使用的经基因修饰的oHSV是一种表达CD19和BCMA的截短的非信号传导的变体和CCL5的经基因修饰的oHSV，并且所述肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19的CAR-T细胞(例如或/>)、靶向CD19的BiTE(例如Blinatumomab)、靶向BCMA的ADC(例如/>)、或其任何组合。
在优选的实施方案中，用于与肿瘤靶向治疗剂组合使用的经基因修饰的oHSV是一种表达CD19和HER2的截短的非信号传导的变体和CCL5的经基因修饰的oHSV，并且所述肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19的CAR-T细胞(例如或/>)、靶向CD19的BiTE(例如Blinatumomab)、靶向HER2的ADC(例如/>或/>)、或其任何组合。
在优选的实施方案中，用于与肿瘤靶向治疗剂组合使用的经基因修饰的oHSV是一种表达CD19和Trop-2的截短的非信号传导的变体和CCL5的经基因修饰的oHSV，并且所述肿瘤靶向治疗剂是靶向CD19的CAR-T细胞(例如或/>)、靶向CD19的BiTE(例如Blinatumomab)、靶向Trop-2的ADC(例如/>)、或其任何组合。
oHSV和肿瘤靶向疗法的组合可以体现为例如药物药盒。因此，在一个方面，提供了一种用于治疗癌症的药物药盒，其单独地包含如本文所述的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)和肿瘤靶向治疗剂，其中所述肿瘤靶向治疗剂具有对由多核苷酸编码的至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体有特异性的靶向部分和用于杀死或抑制癌症细胞增殖的效应部分。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的药物药盒单独地包含：经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)BCMA的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5；以及靶向CD19或BCMA的CAR-T、ADC或BiTE。在一些实施方案中，靶向CD19或BCMA的CAR-T、ADC或BiTE选自ADCT-402(ADC Therapeutics)、Blinatumomab、JNJ-68284528(JNJ-4528，Legend Biotech)、Blenrep(或GSK2857916)、AMG420(Amgen)和PF-3135(Pfizer)。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的药物药盒单独地包含：经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)Trop-2的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5；以及靶向CD19或Trop-2的CAR-T、ADC或BiTE。在一些实施方案中，靶向CD19或Trop-2的CAR-T、ADC或BiTE选自ADCT-402(ADC Therapeutics)、Blinatumomab和/>(Immunomedics)。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的药物药盒单独地包含：经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其编码(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)HER2的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5；以及靶向CD19或HER2的CAR-T、ADC或BiTE。在一些实施方案中，靶向CD19或HER2的CAR-T、ADC或BiTE选自ADCT-402(ADC Therapeutics)、Blinatumomab、AU-101(Aurora Biopharma)、/>(Roche)、(Daiichi Sankyo)和GBR1302(Ichnos Sciences SA)。
治疗方法
本公开的另一方面涉及一种用于治疗对象的癌症的方法。所述方法包含向对象施用治疗有效量的如本文所述的经基因修饰的oHSV和如本文所述的肿瘤靶向治疗剂。oHSV和肿瘤靶向治疗剂的施用同时或按顺序进行。
在一些实施方案中，向对象首先施用治疗有效量的如本文所述的经基因修饰的oHSV，然后施用如本文所述的肿瘤靶向治疗剂。在该实施方案中，施用之间的间隔在0.5-12小时的范围内，例如0.5-9小时、0.5-8小时、0.5-7小时、0.5-6小时、0.5-5小时、0.5-4小时、0.5-3小时、0.5-2小时、0.5-2.5小时、0.5-1.5小时或0.5-1小时。例如，oHSV的施用是在肿瘤靶向治疗剂施用前0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、11或12小时。
在一些实施方案中，所述方法包含向对象施用治疗有效量的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，所述oHSV编码：(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)BCMA的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5；以及靶向CD19或BCMA的CAR-T、ADC或BiTE。在一些实施方案中，靶向CD19或BCMA的CAR-T、ADC或BiTE选自ADCT-402(ADC Therapeutics)、Blinatumomab、JNJ-68284528(JNJ-4528，LegendBiotech)、Blenrep(或GSK2857916)、AMG420(Amgen)和PF-3135(Pfizer)。
在一些实施方案中，所述方法包含向对象施用治疗有效量的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，所述oHSV编码：(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)Trop-2的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5；以及靶向CD19或Trop-2的CAR-T、ADC或BiTE。在一些实施方案中，靶向CD19或Trop-2的CAR-T、ADC或BiTE选自ADCT-402(ADC Therapeutics)、Blinatumomab和(Immunomedics)。
在一些实施方案中，所述方法包含向对象施用治疗有效量的经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，所述oHSV编码：(i)CD19的截短的非信号传导的变体，(ii)HER2的截短的非信号传导的变体，以及(iii)CCL5；以及靶向CD19或HER2的CAR-T、ADC或BiTE。在一些实施方案中，靶向CD19或HER2的CAR-T、ADC或BiTE选自ADCT-402(ADC Therapeutics)、Blinatumomab、AU-101(Aurora Biopharma)、/>(Roche)、/>(Daiichi Sankyo)和GBR1302(Ichnos Sciences SA)。
本文所述的oHSV与多种肿瘤抗原导向的CAR-T细胞、ADC或BiTE的组合使用提供了针对多种肿瘤的显著增强的抗肿瘤作用。oHSV通过直接的肿瘤细胞裂解直接破坏屏障并操作肿瘤微环境。武装有趋化因子和细胞因子等有效负载的oHSV进一步改善了T细胞转运和向肿瘤块的浸润。此外，oHSV在实体瘤细胞表面上递送的高肿瘤特异性抗原(例如CD19、BCMA)还通过降低靶向脱瘤毒性(on-target off-tumor toxicity)改善肿瘤靶向疗法(例如CAR-T疗法)的特异性和安全性。
序列
本公开中描述的氨基酸或核酸序列被提供在下表1中。
表1本公开中描述的氨基酸或核酸序列
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实施例
oHSV-1 T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012和T7013的构建
溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV-1)T7201、T7202、T7203和T7204携带IL-12、抗PD-1抗体、CCL5和作为生物标志物的肿瘤相关性抗原(TAA)的一种截短的非信号传导的变体的编码序列。T7201、T7202、T7203和T7204表达的生物标志物的截短的非信号传导的变体分别是CD19、BCMA、Trop-2和HER2。图1C示出了T7201至T7204的病毒骨架的示意图。
溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV-1)T7011、T7012和T7013携带IL-12、抗PD-1抗体、CCL5和作为生物标志物的肿瘤相关性抗原(TAA)的两种截短的非信号传导的变体的编码序列。T7011、T7012和T7013表达的生物标志物的截短的非信号传导的变体分是CD19加BCMA、CD19加Trop-2、以及CD19加HER2。图1D示出了T7011、T7012和T7013的病毒骨架的示意图。图2示出了T7系列oHSV的构建的流程图。
由T2A自切割肽序列(SEQ ID NO.1)连接的两个生物标志物和CCL5编码序列在由HSV-1即刻早期基因启动子(IE4/5启动子)驱动的一个开放阅读框中翻译。表达盒插入在UL37和UL38基因之间。
此外，T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012和T7013包含在UL3和UL4之间抗人PD-1抗体表达盒的插入，以及经修饰的内部重复(IR)区域被IL-12表达盒替换。借助细菌人工染色体(BAC)系统分几步构建重组病毒。病毒构建的细节描述如下。
IL-12表达盒的侧翼是在野生型基因组的背景下分别通过两组引物((SEQ IDNos:2-3)和(SEQ ID Nos:4-5))从HSV-1病毒基因组PCR扩增的核苷酸117005的上游和核苷酸132096的下游，并插入基因替换质粒pKO5以产生pKO1407。然后通过电穿孔将pKO1407转染到具有野生型BAC的大肠杆菌中以产生BAC-T2010。然后，驱动抗PD-1抗体基因的CMV启动子盒的侧翼是在野生型基因组的背景下分别通过两组引物((SEQ ID Nos:6-7)和(SEQ IDNos:8-9))从HSV-1病毒基因组PCR扩增的核苷酸11658的上游和核苷酸11659的下游，并在BglII和PacI位点连接到pKO5中以产生pKOE1002质粒。然后通过电穿孔将pKOE1002质粒转染到含有BAC-T2010的大肠杆菌中以产生BAC-T3011。含有一个或两个生物标志物(即肿瘤相关性/特异性抗原)和CCL5基因的表达盒的侧翼是在野生型基因组的背景下的核苷酸84220的上游和核苷酸84221的下游。上游和下游侧翼序列分别通过两组引物((SEQ IDNos:10-11)和(SEQ ID Nos:12-13))从HSV-1病毒基因组PCR扩增。DNA片段包含生物标志物CCL5，以及侧翼序列在XbaI和PacI位点连接到pKO5中，以生成pKO7201、pKO7202、pKO7203、pKO7204、pKO7011、pKO7012和pKO7013质粒。然后通过电穿孔将pKO7201、pKO7202、pKO7203、pKO7204、pKO7011、pKO7012和pKO7013质粒转染到含有BAC-T3011的大肠杆菌中，分别产生BAC-T7201、BAC-T7202、BAC-T7203、BAC-T7204、BAC-T7011、BAC-T7012、BAC-T7013。T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012和T7013病毒是通过转染相应的BAC质粒，然后在Vero细胞中进行噬斑纯化和扩增的几个步骤获得的。
病毒滴定
通过噬斑形成测定测量病毒滴度。简而言之，将病毒原液系列稀释，然后在T25烧瓶中接种单层Vero细胞。吸附2小时后，用补充有1％ FBS加0.05％(wt/vol)人混合免疫球蛋白的DMEM培养基替换培养基72小时。将细胞用无水甲醇固定5分钟，用蒸馏水冲洗并用结晶紫染色。对噬斑进行计数以计算感染性病毒颗粒滴度。T7011、T7012和T7013的滴度见下表2，T7201、T7202、T7203和T7204的滴度见表4。
表2 T7011、T7012和T7013 oHSV病毒滴度
病毒 病毒滴度
T7011 5.60×107PFU/mL
T7012 3.05×107PFU/mL
T7013 9.25×107PFU/mL
病毒感染后CCL5分泌检测
将人胚肾293T、人喉癌Hep-2和人舌鳞癌Tca8113细胞以1×106个细胞/瓶的密度接种到T25瓶中。在孵育过夜后，细胞被模拟感染或以1PFU/细胞的T7011感染。孵育2小时后，用新鲜培养基替换接种物。在感染后0、4、8、12、24、48、72和96小时收获细胞上清液用于ELISA测定以量化CCL5分泌。图3示出了293T、Hep-2和Tca8113细胞中T7011感染后CCL5的释放。CCL5的表达和释放快速且强烈。感染后4小时即检测到分泌的CCL5，峰值高达5,000pg/ml。在T7011病毒感染后，分泌物稳定并保持至少4天。从而表明CCL5的分泌。
ELISA测定IL-12、抗PD-1抗体和CCL5的表达
将Vero细胞以6×106个细胞/瓶的密度接种到T150瓶中。孵育过夜后，以0.01PFU/细胞的T7201、T7202、T7203、T7204、T7011、T7012和T7013感染细胞。感染后48小时收集的细胞上清液用于ELISA测定以检测IL-12、抗PD-1抗体和CCL5的表达水平。结果如表3和表4所示。如表3所示，CCL5的表达在被测病毒中处于高水平且非常稳定。T7011和T7013之间IL-12和PD-1Ab的表达基本相同，而T7012的IL-12表达最高且PD-1Ab表达最低。
表3病毒感染后IL-12、抗PD-1抗体和CCL5的表达水平
病毒 IL-12浓度(pg/mL) PD-1Ab浓度(pg/mL) CCL5浓度(pg/mL)
T7011 547 2897 5453
T7012 787 1923 5394
T7013 500 3055 5496
表4T7201、T7202、T7203和T7204 oHSV病毒滴度和病毒感染后IL-12、抗PD-1 Fab和CCL5的表达水平
病毒 滴度(PFU/mL) IL-12(pg/mL) 抗PD-1 Fab(pg/mL) CCL5(pg/mL)
T7201 1.08×108 731.37 749.33 9811.34
T7202 9.70×107 544.79 671.69 42267.47
T7203 9.58×107 541.90 882.49 44351.20
T7204 3.90×107 387.92 356.72 33275.46
免疫荧光测定细胞表面上截短的CD19、BCMA、Trop-2、HER2的表达和呈递
将Hep-2细胞(4×105)接种在6孔板的各个孔中的玻片中，并孵育24小时以使细胞粘附。然后将细胞模拟感染或分别暴露于5PFU/细胞的T7011、T7012和T7013病毒1小时。用新鲜培养基替换接种物。用PBS冲洗细胞，并在室温下在指定时间用4％多聚甲醛固定10分钟，然后用5％脱脂牛奶封闭。T7011感染的细胞分别与CD19(Cat.302204，Biolegend)抗体以及BCMA(Cat.NBP1-97637，Novus)抗体共同染色；T7012感染的细胞分别与CD19(Cat.302204，Biolegend)抗体以及Trop-2(Cat.PA5-47030，Invitrogen)抗体共同染色；T7013感染的细胞分别在4℃与CD19抗体(Cat.302204，Biolegend)和HER2一抗(Cat.MAB1129-100，R&D systems)染色过夜。然后将细胞与Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠(Cat.A32766，Invitrogen)、Alexa Fluor 568偶联的抗兔(Cat.A11036，Invitrogen)和Alexa Fluor 568偶联的抗山羊(Cat.A11057，Invitrogen)二抗在室温孵育1小时。然后用PBS洗涤细胞并包埋在封固剂中(Cat.8961S，Cell Signaling Technology)。使用尼康共聚焦激光扫描显微镜(HD25，放大倍数，120倍)捕获和处理图像，如图4所示。从图4可以看出，分别由T7011、T7012和T7013编码的不同的截短的抗原同时在肿瘤细胞表面上表达。
神经毒力研究
将6周龄的雌性BALB/c小鼠麻醉，然后每组8只小鼠颅内注射50μL的HSV-1(F)、T3011、T7011、T7012或T7013病毒的稀释液的10倍系列稀释液。接种相同体积的含有10％甘油的DPBS作为模拟处理对照组。监测小鼠14天，根据Reed and Muench’s方法从死亡率数据计算50％致死剂量(LD50)。
如下表5所示，T7011、T7012、T7013和T3011的LD50值分别比HSV-1(F)高158倍、316倍、100倍和268倍，表明与T3011病毒相同，与HSV-1(F)相比，T7011、T7012和T7013的神经毒性显著减弱。
表5 T7011、T7012、T7013、T3011的LD50值
药物 Log10(LD50) LD50 与HSV-1(F)相比的LD50比值
T7011 4.376 2.38×104PFU 158
T7012 4.676 4.74×104PFU 316
T7013 4.176 1.50×104PFU 100
T3011 4.605 4.02×104PFU 268
HSV-1(F) 2.176 1.50×102PFU NA
T7系列oHSV病毒的抗肿瘤活性
将肿瘤细胞以10000细胞/孔的密度接种到96孔板上。孵育过夜后，细胞以0.01、0.1、1、5、10、33.33和100PFU/细胞的T3011、T7011、T7012和T7013感染，一式三份。感染48小时后(p.i.)，通过CellTiter-Glo测定细胞活力。根据制造商的说明计算细胞生长抑制率。通过使用GraphPad Prism软件将数据拟合到剂量反应曲线中来计算由病毒感染导致50％的细胞生长抑制的浓度(IC50)(PFU/细胞)。
如图5所示，T7系列病毒的IC50值与T3011相当，说明T7系列病毒与T3011相比具有相似的广谱抗肿瘤活性。同时，HCT116、Hep-2、PC-3、MDA-MB-231和A375细胞的IC50值略高于其他肿瘤细胞系，表明这些细胞系对T7系列病毒的感染具有相对抗性，然后被选择用于进一步的组合研究。
T7系列oHSV病毒的感染活性
Hep-2细胞、未经转导的正常T细胞和CD19 CAR-T(CAR-T)细胞以5×105个细胞/孔的密度接种到12孔板上，并以1PFU/细胞的HSV-1(F)、T7011、T7012和T7013感染。在感染后24和48小时(h)收获细胞沉淀，然后用PBS洗涤。然后将细胞沉淀重新悬浮在DPBS+10％甘油中，然后进行三个冻融循环。在Vero细胞上滴定病毒后代。
如图6所示，所有病毒感染的Hep-2细胞中的病毒产量均显著高于正常T细胞和CAR-T细胞中的病毒产量。特别是，T7系列病毒在正常T细胞和CAR-T细胞中的产量在感染后24小时或48小时均不超过103PFU/mL。这些结果表明，野生型HSV-1(F)病毒在CAR-T或正常T细胞中具有低感染活性，而减毒的T7011、T7012和T7013病毒没有感染活性。
T7系列oHSV病毒的细胞杀伤活性
CD19 CAR-T(CAR-TCD19)细胞和未经转导的正常T细胞以4×104个细胞/孔接种到96孔板上，并以0.01、0.1、1和10PFU/细胞的T7011、T7012和T7013感染，一式三份。通过CellTiter-Glo在感染后(p.i.)24和48小时测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图7所示，T7系列病毒感染后细胞活力没有降低，证明T7系列病毒对CAR-T或正常T细胞没有细胞杀伤活性。
T7011与CAR-TCD19组合的抗肿瘤作用
将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，不用或用0.01、0.03、0.1、0.3和1PFU/细胞的T7011感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以4：1效应物与靶标(E：T)比值加入4×104细胞/孔的CAR-TCD19或T细胞用于与肿瘤细胞共培养。未经转导的正常T细胞用作对照。共培养24小时后，通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图8所示，T7011与CAR-TCD19的组合显示出比单一药剂高≥60％的效果。结果表明，与单独的T7011和CAR-T组相比，T7011和CAR-TCD19组合治疗组的抗肿瘤作用显著增强。相比之下，T7011和正常T细胞组合治疗显示出轻微的抗肿瘤作用。
进一步地，将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，不用或用1PFU/细胞的T7011或T3011感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以4：1效应物与靶标(E：T)比值加入4×104细胞/孔的CAR-TCD19细胞，用于共培养另外的24小时。未经处理细胞用作未经处理对照。通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图9所示，与单一治疗组以及T3011和CAR-T组合治疗组相比，只有T7011和CAR-TCD19组合治疗显著降低了细胞活力。作为对照，T3011与CAR-TCD19的组合没有效果。所有这些结果表明，T7011病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19的抗肿瘤活性。
T7012与CAR-TCD19组合的抗肿瘤作用
将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，不用或用0.01、0.03、0.1、0.3和1PFU/细胞的T7012感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以4：1效应物与靶标(E：T)比值加入4×104细胞/孔的CAR-TCD19或T细胞用于与肿瘤细胞共培养。未经转导的正常T细胞用作对照。共培养24小时后，通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图10所示，T7012与CAR-TCD19的组合显示出比单一药剂高≥50％的效果。结果表明，与单独的T7012和CAR-T组相比，T7012和CAR-TCD19组合组的抗肿瘤作用显著增强。相比之下，T7012和正常T细胞组合显示出轻微的抗肿瘤作用。
进一步地，将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，不用或用1PFU/细胞的T7012或T3011感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以4：1效应物与靶标(E：T)比值加入4×104细胞/孔的CAR-TCD19细胞，用于共培养另外的24小时。未经处理细胞用作未经处理对照。通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图11所示，与单一治疗组以及T3011和CAR-T组合治疗组相比，只有T7012和CAR-TCD19组合治疗显著降低了细胞活力。作为对照，T3011与CAR-TCD19的组合没有效果。所有这些结果表明，T7012病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19的抗肿瘤活性。
T7013与CAR-TCD19组合的抗肿瘤作用
将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，不用或用0.01、0.03、0.1、0.3和1PFU/细胞的T7013感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以4：1效应物与靶标(E：T)比值加入4×104细胞/孔的CAR-TCD19或T细胞用于与肿瘤细胞共培养。未经转导的正常T细胞用作对照。共培养24小时后，通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图12所示，T7013与CAR-TCD19的组合显示出比单一药剂高≥60％的效果。结果表明，与单独的T7013和CAR-T组相比，T7013和CAR-TCD19组合组的抗肿瘤作用显著增强。相比之下，T7013和正常T细胞组合显示出轻微的抗肿瘤作用。
进一步地，将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，不用或用1PFU/细胞的T7013或T3011感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以4：1效应物与靶标(E：T)比值加入4×104细胞/孔的CAR-TCD19细胞，用于共培养另外的24小时。未经处理细胞用作未经处理对照。通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图13所示，与单一治疗组以及T3011和CAR-T组合治疗组相比，只有T7013和CAR-TCD19组合治疗显著降低了细胞活力。作为对照，T3011与CAR-TCD19的组合没有效果。所有这些结果表明，T7013病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19的抗肿瘤活性。
T7系列(T7011、T7012和T7013)oHSV病毒在CAR-NKCD19细胞和NK细胞中的细胞杀伤 活性
根据本领域已知的方法从PBMC中分离出NK细胞。CD19 CAR-NK(CAR-NKCD19)细胞和未经转导的正常NK细胞以4×104个细胞/孔接种到96孔板上，并以0.01、0.1、1和10PFU/细胞的HSV-1(F)、T7011、T7012和T7013感染，一式三份。通过CellTiter-Glo在感染后(p.i.)24、48小时和72小时测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图14所示，T7系列病毒感染后细胞活力没有降低，证明T7系列病毒对CAR-NK细胞或正常NK细胞没有细胞杀伤活性。
HSV-1(F)和T7011在CAR-NKCD19细胞和NK细胞中的病毒复制
CAR-NKCD19细胞和NK细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并在IL-2存在(+IL-2)或在IL-2不存在的情况下以1PFU/细胞的HSV-1(F)和T7011感染。在感染后2、24、48和72小时(h)收获细胞沉淀。然后用PBS洗涤细胞沉淀，然后重新悬浮在DPBS+10％甘油中，冻融3次。在Vero细胞上滴定病毒后代。
如图15所示，T7011病毒对CAR-NKCD19细胞或正常NK细胞没有感染活性。
T7011对CAR-NKCD19细胞的增殖的影响
CAR-NKCD19细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并在IL-2存在(+IL-2)或在IL-2不存在的情况下感染或没有感染0.1或1PFU/细胞的HSV-1(F)和T7011。在感染后24、48和72小时(h)收获细胞沉淀，并用台盼蓝染色测定活细胞。
如图16所示，T7011对CAR-NKCD19细胞增殖没有负面影响。
T7011对CAR-NK细胞的增殖的影响
NK细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并在IL-2存在(+IL-2)或在IL-2不存在的情况下感染或没有感染0.1或1PFU/细胞的HSV-1(F)和T7011。在感染后24、48和72小时(h)收获细胞沉淀，并用台盼蓝染色测定活细胞。
如图17所示，T7011对NK细胞增殖没有负面影响。
T7011与CAR-NKCD19组合的细胞杀伤作用
将人喉癌细胞Hep-2、人黑色素瘤细胞A375和人前列腺癌PC-3细胞接种到96孔板上。在孵育过夜后，用0.01、0.1和1PFU/细胞的T7011感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以2：1效应物与靶标(E：T)比值加入CAR-NKCD19细胞用于与肿瘤细胞共培养。另外的24小时或48小时后，通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图18所示，T7011与CAR-NKCD19的组合显示出比单一药剂更高的效果。
进一步地，将人黑色素瘤细胞A375细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板上。在孵育过夜后，以1PFU/细胞的NK、CAR-NKCD19或T7011感染细胞，一式三份。在感染后24小时，以2：1效应物与靶标(E：T)比值加入CAR-NKCD19细胞或NK细胞用于共培养另外的24小时。通过CellTiter-Glo测定细胞活力。相对细胞活力计算为未经处理细胞的百分比。
如图19所示，与单一治疗组以及T7011和NK组合治疗组相比，T7011和CAR-NKCD19组合治疗显著降低了细胞活力。所有这些结果表明，T7011病毒感染能够特异性协同CAR-TCD19的抗肿瘤活性。

Claims (29)

1.一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，
其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码
(a)至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，以及
(b)至少一种趋化因子，
其中所述截短的非信号传导的变体和所述至少一种趋化因子的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制，并且
其中所述oHSV在肿瘤细胞中复制时所述截短的非信号传导的变体被表达和呈递在所述肿瘤细胞表面上作为生物标志物，并且所述至少一种趋化因子被表达和释放以诱导免疫细胞对所述肿瘤细胞的趋化性。
2.根据权利要求1所述的经基因修饰的oHSV，其中所述至少一种肿瘤相关性/特异性抗原选自HER2、PSMA、BCMA、CD20、CD33、CD19、CD22、CD123、CD30、GPC-3、CEA、Claudin18.2、EpCAM、GD2、MSLN、EGFR、MUC1、EGFRVIII、CD38、Trop-2、c-MET、Nectin-4、CD79b、CCK4、GPA33、HLA-A2、CLEC12A、p-钙粘蛋白、TDO2、MART-1、Pmel 17、MAGE-1、AFP、CA125、TRP-1、TRP-2、NY-ESO、PSA、CDK4、BCA225、CA 125、MG7-Ag、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TAAL6和TAG72。
3.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的oHSV，其中所述至少一种趋化因子选自CXCL1至CXCL17、CCL1至CCL 28、XCL1、XCL2和CX3CL1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述截短的非信号传导的变体是细胞外结构域、细胞外-跨膜结构域或与所述细胞外结构域或所述细胞外-跨膜结构域具有至少90％氨基酸序列同一性的其等效物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述HSV的即刻早期基因启动子选自HSV-1的IE 1(ICP0启动子)、IE 2(ICP27启动子)、IE 3(ICP4启动子)和IE 4/5(ICP22和ICP47启动子)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述多核苷酸编码两种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体；以及至少一种趋化因子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述至少一种趋化因子包含CCL5。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述多核苷酸被插入UL37和UL38之间。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述多核苷酸编码：
(a)CD19的截短的非信号传导的变体、BCMA的截短的非信号传导的变体和CCL5；
(b)CD19的截短的非信号传导的变体、Trop-2的截短的非信号传导的变体和CCL5；
(c)CD19的截短的非信号传导的变体、HER2的截短的非信号传导的变体和CCL5；
(d)CD19的截短的非信号传导的变体和CCL5；
(e)Trop-2的截短的非信号传导的变体和CCL5；
(f)BCMA的截短的非信号传导的变体和CCL5；或
(g)HER2的截短的非信号传导的变体和CCL5。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述HSV的即刻早期基因启动子是HSV-1的即刻早期基因启动子IE4/5。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中PolyA尾位于编码截短的抗原和趋化因子的所述多核苷酸的下游。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述肿瘤细胞是实体瘤细胞。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述肿瘤细胞不表达由所述多核苷酸编码的所述肿瘤相关性/特异性抗原。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述oHSV被进一步修饰使得所述oHSV的核酸的片段被缺失。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述oHSV的核酸的所述片段是所述oHSV的内部反向重复区、编码病毒性基因的片段或两者。
16.根据权利要求14所述的经基因修饰的oHSV，其中所述oHSV的核酸的所述片段是F株的P原型基因组中的位置117005至132096。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述oHSV被进一步修饰以编码免疫刺激剂、免疫治疗剂或两者。
18.根据权利要求17所述的经基因修饰的oHSV，其中所述免疫刺激剂选自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15、IL-24和IL-27。
19.根据权利要求17或18所述的经基因修饰的oHSV，其中所述免疫治疗剂是抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、或者其抗原结合片段。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的经基因修饰的oHSV，其中所述免疫刺激剂是IL-12并且所述免疫治疗剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
21.一种用于治疗癌症的药物药盒，其单独地包含：权利要求1至20中任一项所述的oHSV和肿瘤靶向治疗剂，其中所述肿瘤靶向治疗剂具有对由所述多核苷酸编码的所述至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体有特异性的靶向部分和用于杀死或抑制癌症细胞增殖的效应部分。
22.根据权利要求21所述的药物药盒，其中所述肿瘤靶向治疗剂选自CAR-T细胞、CAR-NK细胞、BiTE和ADC。
23.根据权利要求22所述的药物药盒，其中所述肿瘤靶向治疗剂选自靶向CD19的CAR-T细胞、靶向CD19的CAR-NK细胞和靶向CD19或EpCAM的BiTE。
24.根据权利要求22所述的药物药盒，其中所述肿瘤靶向治疗剂是靶向HER2、Trop-2、Nectin-4、BCMA、CD33、CD30、CD22或CD79b的ADC。
25.根据权利要求22所述的药物药盒，其中所述肿瘤靶向治疗剂选自 JWCAR-029、IM19CAR-T、CNCT19、BZ019、HD CD19CAR-T、pCAR-19B、CD19-CART、CT032、iPD1 CD19 eCAR-T、LCAR-B38M、CT103A、CAR-BCMA T、AU-101、4SCAR-PSMA、PSMA-CART、P-PSMA-101、C-CAR066、MB-CART20.1、PBCAR20A、LB1095、LB1901、PRGN-3006、AMG553、CT041、CD30.CAR-T和CAR-GPC3 T。
26.根据权利要求22所述的药物药盒，其中所述肿瘤靶向治疗剂选自AMG420、PF-3135和GBR1302。
27.根据权利要求22所述的药物药盒，其中所述肿瘤靶向治疗剂选自SHR-A1811、TAA013、RC-48、BAT8001、ARX788、A166、/>BAT8003、DAC-002、DS-1062、SKB264、RC-108、TR1801-ADC、 PSMA ADC、ADCT-402、PTK7-ADC和TRS005。
28.一种经基因修饰的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其中一种多核苷酸并入所述oHSV的基因组，所述多核苷酸编码至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体，其中所述截短的非信号传导的变体的表达受HSV的即刻早期基因启动子的控制，并且其中所述oHSV在肿瘤细胞中复制时所述截短的非信号传导的变体被表达和呈递在所述肿瘤细胞表面上作为生物标志物。
29.一种用于治疗癌症的药物药盒，其单独地包含：如权利要求28所述的oHSV和肿瘤靶向治疗剂，其中所述肿瘤靶向治疗剂具有对由所述多核苷酸编码的所述至少一种肿瘤相关性/特异性抗原的截短的非信号传导的变体有特异性的靶向部分和用于杀死或抑制癌症细胞增殖的效应部分。
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