KR102931002B1 - 개선된 t 세포 수용체-공동자극 분자 키메라 - Google Patents

개선된 t 세포 수용체-공동자극 분자 키메라

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Abstract

본 발명은 생명의학 분야에서 개선된 T 세포 수용체 공동자극 분자 키메라에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 공동자극 분자를 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR 복합체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 TCR 또는 TCR 복합체를 포함하는 T 세포 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

개선된 T 세포 수용체-공동자극 분자 키메라
본 발명은 생명의학 분야에 있어서 개선된 T 세포 수용체 공동자극 분자 키메라에 관한 것으로, 특히 공동자극 분자를 포함하는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 또는 TCR 복합체, TCR 또는 TCR 복합체를 포함하는 면역 세포, 및 그 용도에 관한 것이다.
올해 들어 세포 요법, 특히 T 세포 관련 요법은 급속도로 발전하였으며, 그 중에서도 키메라 항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T cell, CAR-T) 요법 및 TCR-T 요법이 많은 관심을 받고 있다.
CAR-T 요법은 T 세포 내에서의 CAR 분자의 발현을 기반으로 한다. CAR 분자는 세 부분, 즉, 항체에서 유래된 항원 인식 도메인이면서 표적 항원 인식을 담당하는 엑토도메인; 막관통 도메인; 및 T 세포 수용체로부터 유래된 신호 분자 및 공동자극 신호 분자이며 자극을 받은 후 T 세포 활성화 신호를 전달하는 역할을 하는 엔도도메인으로 구성된다. CAR 분자가 그에 상응하는 항원에 결합할 때, CAR 분자들은 응집하고, T 세포의 효과기 기능을 수행하기 시작하고, 표적 종양 세포를 사멸시킨다.
TCR-T 요법은 T 세포 수용체(TCR)를 기반으로 한다. TCR은 T 세포의 정체성이다. T 세포는 TCR의 종류에 따라 αβ T 세포 및 γδ T 세포로 나뉜다. 발달 과정에서, T 전구체 세포는 TCR γ 및 TCR δ 사슬에서 VDJ 재배열을 거치게 되며, 재배열이 성공하게 되면, γδ T 세포로 발달하며, 재배열이 실패로 끝나면, TCR α 및 TCR β 사슬에서의 VDJ 재조합을 거쳐서 αβ T 세포로 발달한다. αβ T 세포는 말초 혈액 T 세포의 90% 내지 95%를 차지하는 반면, γδ T 세포는 말초 혈액 T 세포의 5% 내지 10%를 차지한다. 두 가지 유형의 T 세포는 병원체 및 종양에 대한 면역에 있어서 중요한 역할을 하는 MHC 제한 및 MHC 비제한 방식으로 항원을 각각 인식한다.
T 세포 수용체(TCR) 복합 분자는 다수의 사슬을 포함하며, 여기서 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬(또는 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬)은 MHC 폴리펩티드 분자를 인식하는 역할을 하고, 다른 6개의 CD3 서브유닛은 TCR α/β 사슬(또는 TCR γ/δ 사슬)에 결합하여 신호를 전달하는 역할을 한다. 천연 TCR 복합체는 이론적으로 CAR보다 강한 신호를 전송할 수 있는 10개의 ITAM 신호 서열을 포함한다. 천연 TCR의 신호 전달 기능을 이용함으로써, T 세포 장애를 완화시키는 새로운 수용체를 구축할 수 있으며, 이는 더 나은 항-고형종양 역할을 할 수 있다. TCR의 엑토도메인은 항체의 Fab 도메인과 매우 유사하므로, TCR의 가변 영역 서열은 항체의 가변 영역 서열로 대체하여, 항체 특이성을 가질 뿐만 아니라 T 세포 활성화를 매개하는 천연 TCR의 우수한 신호 전달 기능을 갖는 다합성 TCR 및 항원 수용체(STAR)를 얻을 수 있다.
그러나, 천연 TCR로부터 유래된 STAR-T에는 T 세포 활성화에 대한 공동자극 신호가 결여되어 있기 때문에, 그 증식 및 활성화 능력이 영향을 받게 된다. 따라서, 개선된 TCR 및 그에 상응하는 TCR-T 요법이 이 분야에서 여전히 필요하다.
도 1은 불변 영역 시스테인 변형 및 막관통 도메인 및 엔도도메인 변형에 의한 STAR 최적화의 개략도이다.
도 2는 α 및/또는 β 사슬에 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 추가하여 STAR를 최적화하는 개략도이다.
도 3은 α 및/또는 β 사슬 엔도도메인의 결실한 후 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 직접 또는 링커를 통해 추가하여 STAR를 최적화하는 개략도이다.
도 4는 CD3 서브유닛에 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 추가하여 STAR를 최적화하는 개략도이다.
도 5는 α 및/또는 β 사슬에 사이토카인 수용체 신호 전달 도메인을 추가하여 STAR를 최적화하는 개략도이다.
도 6은 WT-STAR T 세포와 mut-STAR T 세포 사이의 종양 표적 세포 사멸 능력의 비교를 나타낸다.
도 7은 상이한 효과기 대 표적(E:T)비에서 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 8은 상이한 공동 배양 시간에서 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 9는 상이한 E:T비에서 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한 α 사슬, β 사슬, 또는 α 사슬 및 β 사슬에 첨가된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 10은 상이한 공동배양 시간에서 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한, α 사슬, β 사슬, 또는 α 사슬 및 β 사슬에 첨가된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 11은 STAR-T 세포의 사이토카인 분비에 대한 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 12는 STAR-T 세포의 증식에 대한 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 13는 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한, α 사슬, β 사슬, 또는 α 사슬 및 β 사슬에 첨가된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 14는 TCR α 사슬에 연결된 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인을 갖는 mut-STAR의 종양 사멸 능력을 나타낸다.
도 15는 STAR-T 세포의 표적 사멸능력에 대한, 상이한 CD3 서브유닛에 추가된 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 16은 STAR-T 세포의 증식에 대한, 상이한 CD3 서브유닛에 첨가된 상이한 공동자극 수용체 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 17은 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한, 엔도도메인-결실된 α 사슬에 상이한 G4S 링커를 통해 연결된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 18는 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한, 엔도도메인-결실된 β 사슬에 상이한 G4S 링커를 통해 연결된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 19는 STAR-T 세포의 IL-2 분비에 대한, 엔도도메인-결실된 α 및/또는 β 사슬에 상이한 G4S 링커를 통해 연결된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 20은 STAR-T 세포의 IFN-γ 분비에 대한, 엔도도메인-결실된 α 및/또는 β 사슬에 연결된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 21은 중심 기억 T 세포 분화에 대한, 엔도도메인-결실된 α 사슬에 상이한 G4S 링커를 통해 연결된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 22는 T 세포 분화에 대한, 엔도도메인-결실된 α 사슬에 상이한 G4S 링커를 통해 연결된 OX40 엔도도메인의 효과를 나타낸다.
도 23은 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한, 막관통 도메인 또는 엔도도메인 내에서의 라이신 변형의 효과를 나타낸다.
도 24는 STAR-T 세포의 IFN-γ 분비에 대한, 막관통 도메인 또는 엔도도메인 내의 라이신 변형의 효과를 나타낸다.
도 25는 STAR-T 세포의 IL-2 분비에 대한, 막관통 도메인 또는 엔도도메인 내에서의 라이신 변형의 효과를 나타낸다.
도 26은 중심 기억 T 세포 분화에 대한, 막관통 도메인 또는 엔도도메인 내에서의 라이신 변형의 효과를 나타낸다.
도 27은 T 세포 분화에 대한, 막관통 도메인 또는 엔도도메인 내에서의 라이신 변형의 효과를 나타낸다.
도 28은 STAR-T 세포의 표적 사멸 능력에 대한, α 사슬 및/또는 β 사슬에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 신호 전달 도메인의 효과를 나타낸다.
도 29는 α-델-(G4S) 3-OX40-STAR와, 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인이 연결된 돌연변이 STAR의 사멸 효과의 비교를 나타낸다.
도 30은 STAR-T 세포의 IL-2 분비에 대한, α 및/또는 β 사슬에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 신호전달 도메인의 효과를 나타낸다.
도 31은 STAR-T 세포의 IFN-γ 분비에 대한, α 사슬 및/또는 β 사슬에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 신호 전달 도메인의 효과를 나타낸다.
도 32는 중심 기억 T 세포 분화에 대한, α 사슬 및/또는 β 사슬에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 신호 전달 도메인의 효과를 나타낸다.
도 33은 T 세포 분화에 대한, α 및/또는 β 사슬에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 신호전달 도메인의 효과를 나타낸다.
도 34는 생체내 마우스 종양 모델에서 αβ OX40-STAR T, mut-STAR T 및 CAR-T의 생체내 항종양 효과를 나타낸다.
도 35는 αβ OX40-STAR T, mut-STAR T 및 CAR-T를 투여한 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
도 36은 마우스에서 αβ OX40-STAR T, mut-STAR T 및 CAR-T의 생체 내 증식을 나타낸다.
도 37은 마우스 종양 모델에서, 상이한 STAR 구조 및 CAR-T의 생체내 항종양 효과를 나타낸다.
도 38은 불변영역 돌연변이체 및 αβ TCR의 패턴도이다.
도 39는 장갑(armored)-TCR의 예시적인 패턴도이다.
도 40은 장갑-CD3의 예시적인 패턴도이다.
도 41은 시험관 내 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 조건에서, 상이한 TCR 불변 영역에서 공동자극 엔도도메인이 통합된 장갑-TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 나타낸다.
도 42는 시험관 내 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 조건하에서, 상이한 공동자극 도메인에 의해 변형된 장갑-TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 나타낸다. A: E141-TCR; B: E315-TCR.
도 43은 시험관 내에서 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 조건에 있지 않았거나, TCR 분자 엔도도메인이 결실되지 않은(G4S)n링커-함유 장갑-TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 나타낸다.
도 44는 시험관 내 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 하에서, 4-1BB 엔도도메인에 TCR α 사슬, TCR β 사슬, 또는 TCR α 및 β 사슬이 연결된 장갑-TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 나타낸다. A: E141-TCR; B: E315-TCR.
도 45는 시험관 내 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 하에서, OX40 엔도도메인에 TCR α 사슬, TCR β 사슬, 또는 TCR α 및 β 사슬이 연결된 장갑-TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 나타낸다. A: E141-TCR; B: E315-TCR.
도 46은 시험관 내에서 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 하에서, TCR α 또는 TCR αβ가 결실되거나 결실되지 않은 또는 CD3 δ 분자가 첨가되거나 첨가되지 않은 TCR-T 세포의 증식 및 표적 세포 사멸 능력에 대한, G4S 링커를 통해 연결된 OX40 및 CD40 세포 내 도메인의 효과를 나타낸다.
도 47은 장갑-TCR T 세포의 기능을 평가를 위한 마우스 종양 모델의 실험적 도식 및 생체내 종양 진행 영상화 결과이다.
도 48은 마우스에서 인간 TCR T 세포의 증식을 보여주는 통계 그래프이다.
도 49는 장갑-TCR T 세포의 재주입 후 종양 보유 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
도 50은 시험관 내 과도한 표적 세포에 의한 장기간 자극 하에서, 장갑-CD3 분자를 발현하는 TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 나타낸다.
도 51은 시험관 내 과도한 표적 세포 자극 7일 후, 장갑-CD3 분자를 발현하는 TCR T 세포의 사멸 능력의 검출을 나타낸다.
도 52는 시험관 내 과도한 표적 세포 자극 7일 후, 장갑-CD3 분자를 발현하는 TCR T 세포의 IFN γ 방출을 나타낸다.
도 53은 장갑-CD3 분자를 발현하는 TCR T 세포의 기능을 평가하기 위한 마우스 종양 모델의 실험적 도식 및 생체내 종양 진행 영상화 결과를 나타낸다.
도 54는 마우스에서 인간 장갑-CD3을 발현하는 TCR T 세포의 증식의 통계 그래프이다.
도 55는 장갑-TCR T 세포의 재주입 후 종양 보유 마우스의 생존 곡선이다.
도 56. TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, 또는 TCR γ 및 δ 사슬의 불변 영역 C-말단에 직접 연결되거나, G4S 링커를 통해 TCR γ 및 δ 사슬의 C-말단에 직접 연결되거나, 세포 내 아미노산이 결실된 TCR γ 및 δ 사슬의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 가진 γδ TCR T 세포의 사멸 능력에 대한 효과를 나타낸다.
도 57은 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, TCR γ 및 δ 사슬의 불변 영역 C-말단에 직접 연결되거나, G4S 링커를 통해 TCR γ 및 δ 사슬의 C-말단에 직접 연결되거나, 세포 내 아미노산이 결실된 TCR γ 및 δ 사슬의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 가진 γδ TCR T 세포의 IFN γ 분비에 대한 효과를 나타낸다.
도 58은 불변 영역 시스테인 변형 및 막관통 도메인 및 N-말단 재배열에 의한 STAR 최적화의 개략도이다.
도 59는 공동자극 분자 도메인과 STAR 구조 사이의 연결 위치의 예를 나타낸다. α 사슬에 대한 연결만 도시되어 있다.
도 60은 공동자극 분자 도메인을 포함하는 STAR 구조의 예이다.
도 61은 공동자극 인자를 포함하는 STAR 및 STAR의 사멸 능력을 나타낸다.
도 62는 공동자극 인자를 포함하는 STAR 및 STAR의 증식 신호와 관련된 핵 RELB 수준을 수시한다.
도 63은 상이한 STAR의 항-CD19 결과를 나타낸다.
도 64는 상이한 STAR의 항-CD19 및 항-CD20의 결과를 나타낸다.
달리 나타내거나 정의하지 않는 한, 사용된 모든 용어는 당업자가 이해할 수 있는 일반적인 의미를 가진다. 예를 들어, 표준 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., “Molecular cloning: a laboratory manual”; Lewin, “Genes VIII", 및 Roitt et al., “Immunology”(제8 판)], 및 본 명세서에 인용된 일반적인 선행 기술; 또한, 달리 언급되지 않는 한, 구체적으로 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 동작은 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 또한, 예를 들어, 표준 매뉴얼, 상기 일반적인 종래 기술 및 본 명세서에 인용된 다른 참고문헌을 참조한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는" 은 그 용어에 의해 연결된 항목의 모든 조합을 포함하며, 본 명세서에서 별도로 열거된 것으로 간주한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 "A", "A 및 B", 및 "B"를 의미한다. 예를 들어, "A, B 및/또는 C"는 "A", "B", "C", "A 및 B", "A 및 C", "B 및 C", 및 "A 및 B 및 C"를 의미한다.
용어 "포함하는"은 단백질 또는 핵산의 서열을 설명하기 위해 본 명세서에서 사용되며, 이는 상기 서열만으로 구성될 수도 있으며, 상기 단백질 또는 핵산의 한쪽 또는 양쪽 말단에 아미노산 또는 뉴클레오티드를 추가로 가질 수 있으며, 본 명세서에 기재된 활성을 여전히 보유한다. 또한, 당업자는 폴리펩티드의 N-말단에서 개시 코돈에 의해 암호화된 메티오닌이 특정 실제 상황(예를 들어, 특정 발현 시스템에서 발현될 때)에서 유지되지만, 폴리펩티드의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 특정 폴리펩티드 아미노산 서열의 설명에서, N-말단에 개시 코돈에 의해 암호화된 메티오닌을 함유하지 않을 수 있고, 시간에 따라서 메티오닌을 포함하는 서열을 커버하며, 따라서 그 코딩 뉴클레오티드 서열은 개시 코돈을 보유할 수 있다. 그 반대 역시 성립한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "서열번호: x를 참조하는 아미노산 번호"(서열번호: x는 본 명세서에 나열된 특정 서열임)는 설명된 특정 아미노산의 위치 번호가 서열번호: x에서 해당 아미노산에 해당하는 아미노산의 위치 번호임을 의미한다. 상이한 아미노산 서열 사이의 아미노산 대응은 당업계에 공지된 서열 정렬 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 대응은 EMBL-EBI 온라인 정렬 도구(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 2개의 서열은 디폴트 파라미터를 갖는 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단에서 시작하는 위치 46번 위치의 알라닌이 서열번호: x의 48번 위치에 있는 아미노산과 서열 정렬에 의해 정렬된다면, 폴리펩티드 내의 아미노산은 또한 본 명세서에서 "폴리펩티드의 48번 위치의 알라닌으로 설명될 수 있고, 아미노산 위치는 서열번호: x를 참조한다" 본 발명에서, α 사슬 불변 영역과 관련된 아미노산 위치에 대해 서열번호: 3을 참조한다. 본 발명에서, β 사슬 불변 영역과 관련된 아미노산 위치에 대해 서열번호: 4을 참조한다.
일 측면에서, 변형된 T 세포수용체(TCR) 복합체가 제공되고, 여기서 TCR은 αβ TCR이고, TCR αβ 복합체는 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ를 포함하며; 적어도 하나의 기능성 도메인은, TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나의 C-말단에 연결되고; TCR α 사슬은 제1 불변영역을 포함하고 TCR β 사슬은 제2 불변영역을 포함한다. 또는,
TCR은 γδ TCR이고, γδ TCR 복합체는 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ를 포함하며; 적어도 하나의 기능성 도메인은 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나의 C-말단에 연결되고; TCR γ 사슬은 제1 불변영역을 포함하고 TCR δ 사슬은 제2 불변영역을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR α 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR β 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR α 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함하고, TCR β 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, TCR γ 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR δ 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR γ 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함하고, TCR δ 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다.
일반적으로, TCR에서, 표적 결합 영역은 불변 영역의 N-말단에 위치하며, 이들 둘은 직접 연결되거나 링커를 통해 연결될 수 있다.
일 양태에서, 변형된 T 세포 수용체(TCR) 가 제공되며, 여기서 TCR은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하는 αβ TCR일 수 있고, 여기서 적어도 하나의 기능적 도메인은 TCR α 사슬 및/또는 TCR β 사슬의 C-말단에 연결되고; 여기서 TCR α 사슬은 제1 불변 영역을 포함하고, TCR β 사슬은 제2 불변 영역을 포함한다. 또는,
TCR은 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬을 포함하는 γδ TCR일 수 있고, 여기서 적어도 하나의 기능적 도메인은 TCR γ 사슬 및/또는 TCR δ 사슬의 C-말단에 연결되고; 여기서, TCR γ 사슬은 제1 불변 영역을 포함하고, TCR δ 사슬은 제2 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR α 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR β 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR α 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함하고, TCR β 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, TCR γ 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR δ 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR γ 사슬은 제1 표적 결합 영역을 추가로 포함하고, TCR δ 사슬은 제2 표적 결합 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, αβ TCR 복합체 내 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나에 있어서 천연 엔도도메인이 결실되거나, 또는 γ δ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나의 천연 엔도도메인이 결실된다.
일부 구현예에서, αβ TCR 내 TCR α 사슬 및/또는 TCR β 사슬의 천연 엔도도메인이 결실되거나, γδ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬 및/또는 TCR δ 사슬의 천연 엔도도메인이 결실된다.
일부 구체예에서, αβ TCR 복합체에서, 기능적 도메인은 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 최소한 하나의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되며, 이때 천연 엔도도메인은 결실된다.
일부 구체예에서, αβ TCR 복합체에서, 기능적 도메인은 TCR α 사슬의 C-말단 및 TCR β 사슬의 C-말단에 연결되며 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되며, 이때 천연 엔도도메인은 결실된다.
일부 구체예에서, γδ TCR 복합체에서, 기능적 도메인은 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 최소한 하나의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되며, 이때 천연 엔도도메인은 결실된다.
일부 구체예에서, γδ TCR 복합체에서, 기능적 도메인은 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬 중 적어도 하나의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되며, 상기 사슬들은 천연 엔도도메인이 결실되어 있다.
일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수를 나타낸다. 바람직하게는 n은 1 내지 6의 정수이고, 더 바람직하게는 n은 2 내지 5의 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은, αβ TCR 복합체 내의 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 내의 TCR α 사슬 및/또는 TCR β 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은, γδ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 어느 하나의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 내의 TCR γ 사슬 및/또는 TCRδ 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCR 복합체 내의 CD3 δ, CD3 γ, CD3 ε 및 CD3 ζ는, 자신의 C-말단에 부가적으로 연결되어 있는 최소한 하나의 기능적 도메인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 복합체 내의 TCR α 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 내의 TCR α 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCR α 사슬의 천연 엔도도메인이 결실되어 있다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR α 사슬의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 5 내의 정수를 나타내고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 복합체 내의 TCR β 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 내의 TCR β 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCR β 사슬의 천연 엔도도메인이 결실된다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR β 사슬의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 5 내의 정수를 나타내고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 내의 TCR γ 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCR γ 사슬의 천연 엔도도메인이 결실되어 있다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR γ 사슬의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 5 내의 정수를 나타내고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 복합체 내의 TCR δ 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 내의 TCR δ 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCR δ 사슬의 천연 엔도도메인이 결실되어 있다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR δ 사슬의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 5 내의 정수를 나타내고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은, αβ TCR 복합체 내의 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 두개의 각 C-말단들에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은, γδ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 두개의 각 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 복합체 내의 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬의 각각의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 αβ TCR 내의 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬의 각각의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCRα 사슬 및 TCR β 사슬 둘 다의 천연 엔도도메인이 결실된다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR α 사슬 TCR β 사슬의 각각의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 5 내의 정수를 나타내고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬 및 TCRδ 사슬의 각각의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 기능적 도메인은 γδ TCR 내의 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬의 각각의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬 각각에서 천연 엔도도메인이 결실된다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR γ 사슬 TCR δ 사슬의 각각의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 2 내지 5 내의 정수를 나타내고, 가장 바람직하게는 n은 3이다.
일부 구현예에서, αβ TCR 복합체 내 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 2개 이상이 동일하거나 상이한 기능적 도메인과 연결된다.
일부 구현예에서, αβ TCR 내 TCR α 사슬 및/또는 TCR β 사슬은 동일하거나 상이한 기능적 도메인에 연결된다.
일부 구현예에서, γδ TCR 복합체 내의 TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 2개 이상은 동일하거나 상이한 기능적 도메인에 연결된다.
일부 구현예에서, γδ TCR 내 TCR γ 사슬 및/또는 TCR δ 사슬은 동일하거나 상이한 기능적 도메인에 연결된다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과하는 수의 기능적 도메인은, αβ TCR 복합체 내의 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과하는 수의 기능적 도메인은, αβ TCR 내의 TCR α 사슬 및/또는 TCR β 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과하는 수의 기능적 도메인은, γδ TCR 복합체 내의 γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 적어도 하나의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과하는 수의 기능적 도메인은, γδ TCR 내의 TCR γ 사슬 및/또는 TCR δ 사슬의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인과 같은 적어도 하나의 기능적 도메인은 복합체 내의 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인과 같은 적어도 하나의 기능적 도메인은 복합체 내의 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 하나의 C-말단에 연결된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인과 같은 적어도 하나의 기능적 도메인은 복합체 내의 TCR α 사슬의 C-말단에 연결된다. 일부 바람직한 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인은 OX40 이거나 ICOS이다. 일부 구현예에서, TCR β 사슬, CD3 δ, CD3 γ, CD3 ε 및 CD3 ζ는 그 C-말단에 부가적으로 연결된 최소한 하나의 기능적 도메인, 예를 들면, 공동자극 분자 엔도도메인을 함유하지 않는다.
대안적으로, 일부 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인과 같은 적어도 하나의 기능적 도메인은 복합체 내의 CD3δ 사슬의 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, TCRα, TCR β, CD3 γ, CD3 ε 및 CD3 ζ는 자신의 C-말단에 부가적으로 연결된 최소한 하나의 기능적 도메인, 예를 들면, 공동자극 분자 엔도도메인을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인과 같은 적어도 하나의 기능적 도메인은 복합체 내의 TCR α 사슬, TCR β 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ζ 중 선택된 두개의 각각의 C-말단에 연결된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인과 같은 적어도 하나의 기능적 도메인은 복합체 내의 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬의 각각의 C-말단에 연결된다. 일부 바람직한 구현예에서, 공동자극 분자 엔도도메인은 OX40 이거나 ICOS이다. 일부 구현예에서, CD3 δ, CD3 γ, CD3 ε 및 CD3 ζ는 자신의 C-말단에 추가로 연결된 최소한 하나의 기능적 도메인, 예를 들면, 공동자극 분자 엔도도메인을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 기능적 도메인은 외인성 기능적 도메인이다. 일부 구현예에서, 기능적 도메인은 외인성 엔도도메인, 예를 들면, 세포 내 형질도입 기능을 담당하는 도메인이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "외인성" 은 외래 종으로부터 유래된 단백질 또는 핵산 서열을 의미하거나, 동일한 종으로부터 유래된 경우, 의도적인 인간 개입에 의해 그의 천연 형태로부터 조성 및/또는 위치에 있어서 상당한 변화를 겪은 단백질 또는 핵산 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “기능적 도메인”은 공동자극 분자, 예컨대 CD40, OX40, ICOS, CD28, 4-1BB, CD27, 및 CD137의 엔도도메인; 또는 공동 억제 분자, 예컨대 TIM3, PD1, CTLA4, 및 LAG3의 엔도도메인; 또는 사이토카인 수용체, 예컨대 인터루킨 수용체(예컨대 IL-2 수용체, IL-7α 수용체, 또는 IL-21 수용체), 인터페론 수용체, 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리 수용체, 집락(colony)-자극 인자 수용체, 케모카인 수용체, 성장 인자 수용체, 또는 다른 막 단백질의 엔도도메인, 또는 세포 내 단백질, 예컨대 NIK의 도메인으로부터 선택된다. 기능적 도메인은 직접적으로 또는 링커(예를 들어(G4S)n, 여기서 n은 1 내지 10 범위내의 정수를 나타낸다)를 통한 사이토카인 수용체 엔도도메인과 인간 STAT5 활성화 모이어티(서열번호: 35로 나타내는 아미노산 서열)와의 융합일 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 기능적 도메인은 공동자극 분자 엔도도메인이고, 바람직하게는 OX40 또는 ICOS 엔도도메인이고, 보다 바람직하게는 OX40 엔도도메인이다.
예시적인 CD40 엔도도메인은 서열번호: 10으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 OX40 엔도도메인은 서열번호: 11으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 ICOS 엔도도메인은 서열번호: 12으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 CD28 엔도도메인은 서열번호: 13으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 4-1BB 엔도도메인은 서열번호: 14으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 CD27 엔도도메인은 서열번호: 15으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 IL- 2β 수용체 엔도도메인은 서열번호: 32으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 IL- 17α 수용체 엔도도메인은 서열번호: 33으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 예시적인 IL-21 수용체 엔도도메인은 서열번호: 34으로 나타낸 아미노산 서열을 내포한다. 인간 STAT5 활성화 모이어티를 갖는 IL-2β 수용체 엔도도메인의 예시적인 융합 아미노산 서열은 서열번호 36으로 나타낸다. 인간 STAT5 활성화 모이어티를 갖는 IL-17α 수용체 엔도도메인의 예시적인 융합 아미노산 서열은 서열번호 37으로 나타낸다.
일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 천연 TCR α 사슬 불변 영역, 예를 들어, 천연 인간 TCR α 사슬 불변 영역(예시적인 인간 TCR α 사슬 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호: 1로 나타냄) 또는 천연 마우스 TCR α 사슬 불변 영역(예시적인 마우스 TCR α 사슬 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호: 3으로 나타냄); 또는 제1 불변 영역은 천연 TCR γ 사슬 불변 영역, 예를 들면, 천연 인간 TCR γ 사슬 불변 영역(예시적인 인간 TCR γ 사슬 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 58으로 나타냄) 또는 천연 마우스 TCR γ 사슬 불변 영역(예시적인 마우스 TCR γ 사슬 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 59로 나타냄) 이다.
일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 변형된 TCR α 사슬 불변 영역 또는 변형된 TCR γ 사슬 불변 영역이다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되며, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여 트레오닌(T)와 같은 48번 위치의 아미노산이 시스테인(C)으로 돌연변이 된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되며, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 세린(S)와 같은 112번 위치의 아미노산이 류신(L)으로 돌연변이되고, 메티오닌(M)과 같은 114번 위치의 아미노산이 이소류신(I)으로 돌연변이 되고, 글리신(G)와 같은 115번 위치의 아미노산이 발린(V)으로 돌연변이 된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되며, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 6번 위치의 아미노산(예를 들어, E)은 D로 치환되고, 13번 위치의 K는 R로 치환되며, 15번 내지 18번 위치의 아미노산은 결실된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되며, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 트레오닌(T)와 같은 48번 위치의 아미노산은 시스테인(C)으로 돌연변이되고, 세린(S)과 같은 112번 위치의 아미노산은 류신(L)으로 돌연변이 되고, 메티오닌(T)와 같은 114번 위치의 아미노산은 이소류신(I)으로 돌연변이되고, 글리신(G)와 같은 115번 위치의 아미노산은 발린(V)으로 돌연변이 된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되며, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 6번 위치의 아미노산(예를 들어, E)은 D로 치환되고, 13번 위치의 K는 R로 치환되고, 15번 내지 18번 위치의 아미노산은 결실되고, 트레오닌(T)과 같은 48번 위치의 아미노산은 시스테인(C)으로 돌연변이되고, 세린(S)과 같은 112번 위치의 아미노산은 류신(L)으로 돌연변이 되고, 메티오닌(M)과 같은 114번 위치의 아미노산은 이소류신(I)으로 돌연변이 되고, 글리신(G)과 같은 115번 위치의 아미노산은 발린(V)으로 돌연변이 된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR α 사슬 불변 영역은 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되며, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 불변 영역 엔도도메인, 예컨대 136번 내지 137번 위치의 아미노산이 결실된다.
일부 구현예에서, 제1 불변 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 8, 26, 41, 42 및 56 중 하나로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 불변 영역은 천연 TCR β 사슬 불변 영역, 예를 들어, 천연 인간 TCR β 사슬 불변 영역(예시적인 인간 TCR β 사슬 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 2로 나타냄) 또는 천연 마우스 TCR β 사슬 불변 영역(예시적인 마우스 TCR β 사슬 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 4으로 나타냄)이다. 또는 제2 불변 영역은 천연 TCR δ 사슬 불변 영역, 예를 들면, 천연 인간 TCR δ 사슬 불변 영역(예시적인 인간 TCR δ 사슬 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 60으로 나타냄) 또는 천연 마우스 TCR δ 사슬 불변 영역(예시적인 마우스 TCR δ 사슬 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 61로 나타냄)이다.
일부 구현예에서, 제2 불변 영역은 변형된 TCR β 사슬 불변 영역이거나 변형된 TCR δ 사슬 불변 영역이다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR β사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 것으로, 여기서, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여. 트레오닌(T)과 같은 56번 위치의 아미노산은 시스테인(C)으로 돌연변이 된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 것이고, 여기서, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여, 6번 위치의 아미노산(예를 들어, R)은 K로 치환되고, 6번 위치의 아미노산(예를 들어, T)은 F로 치환되고, 9번 위치의 K는 E로 치환되고, 11번 위치의 S는 A로 치환되고, 12번 위치의 L은 V로 치환되고, 17번 및 21번 내지 25번 위치의 아미노산은 결실된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 것으로, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여, 56번 위치의 아미노산, 예를 들면, 세린(S)은 시스테인(C)으로 돌연변이되고, 3번 위치의 아미노산(예를 들면, R)은 K로 치환되고, 6번 위치의 아미노산(예를 들면, T)은 F로 치환되고, 9번 위치의 K는 E로 치환되고, 11번 위치의 S는 A로 치환되고, 12번 위치의 L은 V로 치환되고, 17번 및 21번 내지 25번 위치의 아미노산은 결실된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래된 것으로, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여, 불변 영역 엔도도메인은 결실된다, 예컨대, 167번 내지 172번 위치의 아미노산은 결실된다.
일부 구현예에서, 변형된 TCR β 사슬 불변 영역은 서열번호 2, 4, 6, 9, 27, 43 및 57 중 하나로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "표적 결합 영역"은 표적 분자에 결합할 수 있는(바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는) 도메인을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적은 항원이다. 따라서, 일부 구현예에서, 표적 결합 영역은 "항원 결합 영역"이다.
일부 구현예에서, 표적 결합 영역(바람직하게는 항원 결합 영역)은 단독으로 또는 또 다른 표적 결합 영역(바람직하게는 항원 결합 영역)과 조합하여 표적 분자(바람직하게는 표적 항원)에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 서로 조합하여 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된다. 일부 구현예에서 항원 결합 영역은, 리간드가 표적 항원으로 작용하는 특정 수용체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 수용체는 천연 T 세포 수용체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 천연 T 세포 수용체의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 특히 표적 항원이 수용체인 리간드로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 천연의 특정 T 세포 수용체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 44로 나타낸 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 45로 나타낸 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 46으로 나타낸 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 47로 나타낸 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 48: 로 나타낸 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 49로 나타낸 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 항원은 질환 관련 항원, 바람직하게는 암 관련 항원이. 예컨대 다음 중에서 선택되는 암 관련 항원이다: 포스파티딜이노시톨 프로테오글리칸 3(GPC3), CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123, CD138, ERbB2(HER2/neu), 암 배아 항원(CEA), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디시알로강글리오시드 GD2, 관 상피 뮤신, gp36, TAG-72, 당지질(glycosphingolipids), 신경교종 관련 항원, β-인간 융모성 성선 자극 호르몬, α 태아 글로불린(AFP), 외인성 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70-2. M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스테인, PSMA, 생존 및 텔로머라제, 전립선암 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메소텔린, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 제시 종양-특이적 펩티드 에피토프, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 매트릭스 항원, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 A(EDA) 및 엑스트라 도메인 B(EDB), 테나신-C의 A1 도메인(TnC A1), 섬유아세포 관련 단백질(fap), CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD343, CD133, CD138, Foxp3, B7-1(CD80), B7-2(CD86), GM-CSF, 사이토킨 수용체, 내피인자, 주요 조직적합 복합체(MHC) 분자, BCMA(CD269, TNFRSF17), TNFRSF17(UNIPROT Q02223), SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1), FKBP11(UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8(UNIPROT P53708) 및 FCRL5(UNIPROT Q68SN8).
일부 구현예에서, 표적 항원은 병원체로부터 유래한 항원이거나, RSVF(호흡기 합포체 바이러스 예방), PA(흡입 탄저병), CD4(HIV 감염) 등과 같은 병원체에 의해 감염된 세포의 표면 항원이다.
일부 구현예에서, 표적 항원은, CD3(이식 거부 관련), CD25(신장 이식 급성 거부 관련), C5(발작성 야간 혈색소뇨증 관련), IL-1β(크라이오피린 관련 주기 증후군), RANKL(암 연관 뼈 손상 관련), von Willebrand 인자(성인 후천성 혈전성 혈소판 자반증 관련), 혈장 칼리크레인(혈관부종 관련), 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 수용체(성인의 편두통 관련), FGF23(X-연관 저인산혈증 관련) 등의 질환 유발 세포이거나 그 세포들에 의해 생성되어 분비되는 분자이다.
항원 결합 영역은, FMC63, 리툭시맙, 알렘투주맙, 에프라투주맙, 트라스투주맙, 비바투주맙, 세툭시맙, 라베투주맙, 팔리비주맙, 세비루맙, 투비루맙, 바실리시맙, 다클리주맙, 인플릭시맙, 오말리주맙, 에팔리주맙, 켈릭시맙, 시플리주맙, 나탈리주맙, 클레노릭시맙, 펨투모맙, 에드레콜로맙, 칸투주맙 등과 같은 임의의 상업적으로 이용가능한 항체를 포함하는, 하나 이상의 공지된 항체로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 항체의 경쇄 가변 영역을 포함한다; 대안적으로, 제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 또는 단일 사슬 항체를 포함하고; 및/또는 제2 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 또는 단일 사슬 항체를 포함한다.
일부 구현예에서,(G4S)n과 같은 링커에 의해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 1 또는 3이다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 동일한 표적 항원에 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 동일한 표적 항원의 상이한 영역(예를 들어, 상이한 에피토프)에 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 상이한 표적 항원에 결합한다.
예를 들어, 일부 예시적인 구현예에서, 2개의 항원 결합 영역은 각각 CD19 및 CD20에 결합하거나, 각각 CD19 및 CD22에 결합하거나, 각각 CD38 및 BCMA에 결합하거나, 각각 PDL1 및 EGFR에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 CD19에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 51에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하거나; 대안적으로, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 51에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하며, 이에 의해 TCR 또는 TCR 복합체는 CD19에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 52:에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 영역은 서열번호: 53에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고; 대안적으로, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 53에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 52에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 이에 의해 TCR 또는 TCR 복합체는 GPC3에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원-결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 55에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고; 대안적으로, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 55에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 이에 의해 TCR 또는 TCR 복합체는 CD19에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 62에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 63에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고; 대안적으로, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 63에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 62에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 이에 의해 TCR 또는 TCR 복합체는 CD20에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 51에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고, 이에 의해 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 CD19에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 1 이거나 3이다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 62에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 63에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고, 이에 의해 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 CD20에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 62에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 63에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 1 이거나 3이다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 52에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 53에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고, 이에 의해 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 GPC3에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 52에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 53에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 1 이거나 3이다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고, 이에 의해 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 CD19에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는(G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내고, 바람직하게는 n은 1 이거나 3이다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 38에 나타낸 scFv 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 39에 나타낸 scFv 아미노산 서열을 포함하며; 대안적으로, 제1 항원 결합 영역은 서열번호: 39에 나타낸 scFv 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호: 38에 나타낸 scFv 아미노산 서열을 포함하며, 이에 의해 TCR 또는 TCR 복합체는 CD19 및 CD20 둘 다에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및/또는 CD3ξ는 인간화 된다. 일부 구현예에서, 인간 Cd3γ는 서열번호: 28로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 Cd3γ는 서열번호: 29로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 Cd3γ는 서열번호: 30으로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 Cd3γ는 서열번호: 31로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 변형된 T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR 복합체를 포함하는 단리된 치료적 면역 세포가 본 명세서에서 제공된다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 TCR α 사슬, TCR β 사슬, TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ξ 중 적어도 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 적어도 하나의 외인성 기능적 엔도도메인은 TCR α 사슬, TCR β 사슬, TCR γ 사슬, TCR δ 사슬, CD3 ε, CD3 γ, CD3 δ 및 CD3 ξ 중 적어도 하나의 C-말단에 연결된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는, C-말단이 최소한 하나의 공동자극 분자 엔도도메인에 연결된 TCR α 사슬 및/또는 TCR β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 i) α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, ii) β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 그리고 iii) 동일한 해독틀(reading frame)내에서 i) 와 ii) 사이에 위치하는 자가 절단 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. α 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 β 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5’ 말단 또는 3’ 말단에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 그의 C-말단이 적어도 하나의 공동자극 분자 엔도도메인에 연결된 TCR γ 사슬 및/또는 TCR δ 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 i) γ 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, ii) δ 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 iii) 동일한 해독틀내에서 i)와 ii) 사이에 위치하는 자가 절단 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. γ 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 δ 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “자가 절단 펩티드”는 세포에서 자가 절단을 수행할 수 있는 펩티드를 의미한다. 예를 들어, 자가 절단 펩티드는 세포 내에서 프로테아제에 의해 인식되고 특이적으로 절단되도록 프로테아제 인식 부위를 포함할 수 있다.
대안적으로, 자가 절단 펩티드는 2A 폴리펩티드일 수 있다. 2A 폴리펩티드는 바이러스의 짧은 펩티드의 일종이고, 번역 동안에서 자가 절단이 일어난다. 상이한 표적 단백질이 2A 폴리펩티드에 의해 연결되어 동일한 해독틀내에서 발현될 때, 두 표적 단백질은 거의 1:1의 비율로 생성된다. 일반적인 2A 폴리펩티드는 돼지 테코바이러스-1의 P2A, 토세아 아시그나 바이러스의 T2A, 말 비염 A 바이러스의 E2A 및 구제역 바이러스의 F2A일 수 있다. 그 중에서 P2A가 절단 효율이 가장 높으므로 바람직하다. 이들 2A 폴리펩티드의 다양한 기능적 변이체는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 "발현 벡터"는 선형 핵산 단편, 환형 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 번역이 가능한 RNA(예를 들어 mRNA)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다.
용어 "조절 서열" 및 "조절 요소"는 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 중간 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 관련 코딩 서열의 전사, RNA 처리 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 발현 조절 요소는 관심 뉴클레오티드 서열의 전사, RNA 처리 또는 안정성, 또는 번역을 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 인핸서, 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은, 조절 요소(예를 들어, 프로모터 서열, 전사 종결 서열 등에 제한되지 않음)가 핵산 서열(예를 들어, 코딩 서열 또는 열린 해독틀)에 연결되어 뉴클레오티드 서열 전사가 전사 조절 요소에 의해 제어되고 조절된다는 것을 의미한다. 조절 요소 영역을 핵산 분자에 작동 가능하게 연결하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료적 면역 세포를 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 다수의 비제한적인 공급원으로부터 다양한 비제한적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 공여자로부터 또는 암으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 뚜렷한 표현형 프로파일을 보여주는 혼합 세포 집단의 일부일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리한 다음, 특정 항체로 활성화 및 증폭하여 얻을 수 있다.
본 발명의 양태의 일부 구현예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 대상체의 자가 세포로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "자가"는 대상체를 치료하기 위해 사용되는 세포, 세포주, 또는 세포 집단이 그 대상체로부터 유래된다는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 동종이계 세포, 예를 들면, 그 대상 인간 백혈구 항원(HLA)과 양립 가능한 공여자와 같은 동종이형 세포로부터 유래된다. 공여자로부터 얻은 세포는 표준 프로토콜에 따라 비-부유성 세포로 전환될 수 있고, 필요에 따라 복제되어 한 명 이상의 환자에게 투여될 수 있는 세포를 생산할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료적 면역 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 모든 생리학적으로 양립 가능한 용매, 분산매, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척추, 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 질환 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 치료적 면역 세포의 용도를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 본 발명의 세포, 방법 또는 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환(예를 들어, 암)을 앓고 있거나 앓기 쉬운 유기체를 지칭한다. 비제한적인 예는 인간, 소, 랫트, 마우스, 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴, 및 다른 비-포유류를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료학적 면역 세포 또는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암과 같은 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여 된 후 치료 효과를 생성하기에 충분한 물질(substance), 화합물(compound), 재료(material) 또는 세포(cell)의 양을 의미한다. 따라서, 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 차단 또는 부분적으로 차단하는 데 필요한 양이다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 약제학적 조성물의 "유효량"은 바람직하게는 장애 증상의 중증도 감소, 장애의 무증상 기간의 빈도 및 지속시간의 증가, 또는 장애로 인한 손상 또는 상해를 예방할 수 있게 한다. 예를 들어, 종양 치료를 위해, 본 발명의 세포 또는 약제학적 조성물의 "유효량"은 바람직하게는, 미치료 대상체와 비교하여, 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 30%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 적어도 약 50%, 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더 바람직하게는 적어도 약 70%, 및 더 바람직하게는 적어도 약 80% 만큼, 종양 세포 성장 또는 종양 성장을 저해할 수 있다. 종양 성장 억제 능력은, 인간 종양에 대한 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템을 이용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 당업자에게 공지된 시험법을 이용하여 시험관 내에서 측정할 수 있는, 종양 세포 성장 억제 능력을 조사함으로써 평가를 수행할 수 있다.
실제로, 본 발명의 약제학적 조성물에서 세포의 용량 수준은 특정 환자, 조성물 및 투여 경로에 따라, 환자에게 독성을 가하지 않고 원하는 치료 반응을 효과적으로 달성할 수 있는 활성 성분의 양을 수득하기 위해 달라질 수 있다. 선택된 용량 수준은 본 발명이 적용된 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 적용된 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 적용된 특정 조성물과 조합된 적용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 연령, 성별, 체중, 병태, 치료될 환자의 일반적인 건강 및 병력, 및 의료 분야에 알려진 유사한 요인을 비롯한 다양한 약동학적 인자에 따라 달라진다.
본 발명에 따른 치료적 면역 세포 또는 약제학적 조성물 또는 약물의 투여는 주사, 주입, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 세포 또는 조성물의 투여는 정맥 내, 림프 내, 진피 내, 종양 내, 골수 내, 근육 내 또는 복강 내 투여일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포 또는 조성물은 바람직하게는 정맥 내 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 다양한 양태의 구현예에서, 질환은, 예를 들면, 암이고, 그와 같은 암의 비제한 적인 예는 폐암, 난소암, 결장암, 직장암, 흑색종, 신장암, 방광암, 유방암, 간암, 림프종, 악성 혈액 질환, 두경부암, 신경교종, 위암, 비인두 암종, 후두암, 자궁경부암, 자궁체 종양, 골육종, 골암, 췌장암, 피부암, 전립선암, 자궁암, 항문암, 고환암, 난관암, 자궁내막암종, 질암, 외음부암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암종, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 성기암, 만성 또는 급성 백혈병(급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 포함), 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신장 골반암, 중추신경계(CNS) 종양, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수 종양, 뇌줄기 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암종, 편평세포암종, T-세포 림프종, 환경 유도 암(석면 유도 암 포함), 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 다양한 양태의 구현예에서, 질환은 예를 들어 병원체 감염이며, 병원체의 예로는 호흡기 세포융합 바이러스, 바실러스 안트라시스, 인간 면역결핍 바이러스 등이 있으며, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다양한 양태의 구현예에 있어서, 질환은, 예를 들어, 심혈관 질환, 당뇨병, 신경 질환, 이식 후 거부 방지 등이다.
실시예
실시예 1: STAR의 개선
1. 야생형 T 세포 수용체 및 그것의 불변 영역-돌연변이 STAR 분자의 설계
1.1 STAR 프로토타입 설계
B 세포에 의해 생산된 B-세포 수용체(BCR) 또는 분비된 항체(항체, Ab)는, 단백질 구조 및 공간적 형태 측면에서 T-세포 수용체(TCR)와 매우 유사하다. 항체 및 TCR 둘 다 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어지고, 가변 영역은 항원을 인식하고 및 결합하는 역할을 하는 반면, 불변 영역 도메인은 구조적 상호작용 및 신호전달의 역할을 한다. TCR α 및 β 사슬의 가변 영역(또는 TCR γ 및 δ 사슬)을 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)으로 대체함으로써, 합성 T-세포 수용체 및 항체 수용체(STAR/WT-STAR)로 지칭되는 인공 합성 키메라 분자를 도 1(좌측)에 도시된 구조로 제작될 수 있다.
STAR 분자는 2개의 사슬을 가진다. 여기서, 제1 사슬은 항원 인식 서열(예컨대 항체 중쇄 가변 영역)과 T 세포 수용체 α 사슬(TCR α)의 불변 영역(C α)을 융합시켜 얻고, 제2 사슬은 항원 인식 서열(예컨대 항체 경쇄 가변 영역)과 T 세포 수용체 β 사슬(TCR β)의 불변 영역(C β)을 융합하여 얻는다. 작제물 내의 항원 인식 도메인(예컨대 VH, VL 또는 scFv) 및 불변 도메인(TCR α, β, γ 및 δ의 불변 도메인)을 배열하고 조합하여, 구성은 상이하지만 기능은 유사한 다양한 작제물을 형성할 수 있다.
STAR 분자의 제1 및 제2 사슬은, T 세포에서 발현된 후, 소포체에서 내인성 CD3 ε δ, CD3 γ ε 및 CD3 ζ 사슬과 조합되어 세포막의 표면상에 복합체 형태의 8개의 서브유닛 복합체를 형성한다. 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)는 TCR 분자에서 신호 형질 전달 모티프이며, 이의 보존 서열은 YxxL/V이다. CD3 ε, δ, γ 및 ε 사슬의 엔도도메인은 하나의 ITAM 서열을 갖고, CD3 ζ 사슬의 엔도도메인은 3개의 ITAM 서열을 가지므로, 완전한 STAR 복합체는 총 10개의 ITAM 서열을 가진다. STAR 수용체의 항원 인식 서열이 그것의 특이적 항원에 결합하는 경우, 세포 내 ITAM 서열은 차례로 인산화되고, 이어서 다운스트림 신호전달 경로를 활성화하여, Nf-κ β, NFAT 및 Ap-1와 같은 전사 인자를 활성화해, 결과적으로 T 세포의 활성화를 개시하고 효과기 기능을 생산한다. 본 발명자에 의한 이전의 연구는 STAR가 종래의 키메라 항원 수용체 CAR 보다 더 양호하게 T 세포를 활성화할 수 있고, 항원 자극의 부재하의 배경 활성화를 유의미하게 감소시키므로, 유의미한 이점을 가진다는 것을 보여주었다(중국 발명 특허 출원 번호 201810898720.2 참조). 그러나, STAR에 대한 추가적인 개선은 여전히 필요하다.
1.2. 돌연변이체 STAR(mut-STAR) 및 변형된 엔도도메인 및 막관통 도메인을 갖는 STAR(ub-STAR)의 설계
스타 프로토타입 설계에 인간화 된 TCR α/β 사슬(또는 TCR γ 및 δ 사슬) 불변 영역 서열(야생형 인간 TCR α 불변 영역, 서열번호: 1; 야생형 인간 TCR β 불변 영역, 서열번호: 2)을 사용하였다. 인간, 영장류 및 쥣과(murine) TCR α/β 사슬(마우스 TCRaC-WT, 서열번호: 3; 마우스 TCRbC-WT, 서열번호: 4)의 불변 영역 서열은 고도로 보존되고, 또한 핵심 아미노산 서열이 동일하기 때문에, 이들은 서로 대체될 수 있다.
T 세포로 전달된 후, STAR 분자는 불변 영역을 통해 T 세포의 내인성 TCR과의 불일치를 일으킨다. 한편, 이러한 불일치는 STAR 분자의 정확한 쌍형성(pairing) 효율을 감소시키고, 기능을 약화시킬 수 있다. 또 다른 한편으로는, 불일치는 알려지지 않은 특이성의 가능성을 증가시킬 수 있으며 보안 위험을 증가시킬 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 STAR 분자의 불변 영역을 인간 T 세포로 전달한 후 쥣과(murine)의 서열로 교체하여 STAR 분자의 기능을 향상시켰다. STAR 분자의 설계를 더욱 최적화하기 위해, 본 발명자들은 시스테인 돌연변이를 수행하여 STAR분자에 분자간 이황화 결합(disulfide bond)을 도입하였다. 그에 따라 STAR 분자의 2개의 사슬 간의 쌍형성이 향상되었고, 내인성 TCR과의 불일치가 감소되었다. 구체적으로, TCR α 사슬 불변 영역에서 48번 위치의 트레오닌(T)은 시스테인(C)(마우스 TCRaC-Cys, 서열번호: 5)으로 돌연변이 되었고, TCR β 사슬 불변 영역에서 56번 위치의 세린(S) 은 시스테인(C)(마우스 TCRbC-Cys, 서열번호: 6)으로 돌연변이되었다. 새롭게 첨가된 2개의 시스테인은 STAR의 2개의 사슬 사이의 이황화 결합을 형성할 것이고, 이것은 STAR의 2개의 사슬과 내인성 TCR 사슬 사이의 불일치를 감소시키며, STAR 분자가 더 안정된 복합체를 형성할 수 있도록 지원하여 더 나은 기능을 갖도록 한다. 또한, STAR 분자의 설계를 더욱 최적화하기 위해, 본 발명자들은 STAR 분자의 막관통 도메인에 소수성 아미노산 치환 수행하여, STAR 분자의 안정성을 증가시키고 기능이 더 오래 지속되도록 하였다. 구체적으로, TCR α 사슬 불변 영역의 막관통 도메인 내에서 111번 내지 119번 위치의 아미노산에 대해 3개의 아미노산 돌연변이를 수행하였다: 112번 위치의 세린(S)은 류신(L)으로 돌연변이 되었고, 114번 위치의 메티오닌(M)은 이소류신(I)으로 돌연변이 되었고, 115번 위치의 글리신(G)은 세린(V)으로 돌연변이 되었다. 이 영역에서 전체 아미노산 서열 LSVMGLRIL은 LLVIVLRIL로 변화되었고, 이 변형은 마우스 TCRaC-TM9로 지칭되었으며, 서열번호: 7의 불변 영역 서열을 생성하였다. 이러한 설계는 막관통 도메인의 소수성을 증가시켰고, TCR 막관통 도메인에 의해 운반되는 양전하에 의해 야기되는 불안정성을 상쇄시켰고, 세포막 상에서 STAR 분자를 더욱 안정되게 하였으며, 그로 인하여 도 1(중간)에 도시된 구조로부터 더 나은 기능을 얻었다.
TCR이 항원에 결합되고 활성화가 완료된 후, TCR 분자의 엔도도메인 및 막관통 도메인에서, 라이신에는 유비퀴틴 활성화 효소, 유비퀴틴 결합 효소 및 유비퀴틴 리가제 유비퀴티네이트에 의한 일련의 유비퀴틴 반응에 의해 유발된 유비퀴틴 변형이 가해졌으며, 그에 따라 T 세포 세포내이입(endocytosis)이 발생하였고, 리소좀에 의한 추가적인 분해를 위해 TCR 분자의 세로 내로의 세포내이입이 유도되었다. 결과적으로 T 세포막 표면의 TCR 분자의 농도가 감소되었고, 이것은 T 세포 활성화의 효과의 지속적인 감소로 이어졌다. 본 발명자들에 의해 돌연변이(mut)-STAR 분자에서 α 및 β 사슬의 막관통 도메인 또는 엔도도메인의 아미노산이 변형되었다. 즉, STAR 분자의 α 사슬 불변 영역의 엔도도메인과 β 사슬 불변 영역의 막관통 도메인 내의 라이신을 아르기닌으로 돌연변이시켜, 각각 마우스 TCR α C-Arg 돌연변이(서열번호: 8)의 불변 영역 서열 및 마우스 TCR β C-Arg 돌연변이(서열번호: 9)의 불변 영역 서열을 생성하였다. 그로 인하여 라이신 유비퀴틴화에 의해 유발된 STAR 분자의 세포내이입을 감소시켰다. 이러한 설계는 STAR 분자의 막관통 도메인 및 엔도도메인의 유비퀴틴화의 가능성을 감소시켰고, 그리 인하여 STAR 분자의 세포내이입을 감소시켰고, 도 1(우측)에 도시된 구조를 가지게 되어 STAR 분자가 세포막 상에서 더 안정되고 나은 기능을 갖도록 하였다.
2. 공동자극 수용체 엔도도메인을 포함하는 야생형 및 돌연변이 STAR 분자의 설계
mut-STAR 세포의 생체 내 증식 능력, 유효 생존 시간 및 종양의 미세 환경으로 침투하여 표적 세포를 효율적으로 사멸시키는 능력을 개선하기 위해, 본 발명자들은 새로운 구조를 설계하였다. 여기서, TCR-T의 임상 반응을 개선하고 지속적인 치유 효과를 실현하기 위해 mut-STAR 복합체를 변형하였고,필요에 따라 향상된 mut-STAR 세포를 맞춤화하였다.
2.1. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 포함하는 mut-STAR 분자(co-STAR)의 설계
TCR은 모든 T 세포의 표면상에 존재하는 특별한 마커이고, αβ TCR 및 γδ TCR로 나뉠 수 있다. 이에 상응하는 T 세포는 각각 αβ T 세포 및 γδ T 세포이다. 본 발명자들은, αβ T 세포 및 γδ T 세포의 성능을 개선하기 위해, 공동자극 신호를 이용하여 αβ-STAR 및 γδ-STAR를 각각 변형시켰다.
전체 T 세포의 90% 내지 95%를 차지하는 αβ T 세포에서, TCR은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬로 구성된다. αβ TCR은 가변 영역 및 불변 영역으로 구성되며. 여기서 가변 영역은 매우 다양하며, 항원 인식 및 결합 역할을 하는 반면, 불변 영역 도메인은 구조적 상호작용 및 신호 전달 역할을 한다. 본 발명에서는, T 세포의 독성 및 증식 지속성을 향상시키기 위해 인간화 된 공동자극 수용체의 엔도도메인 서열을 αβ-STAR 불변 영역의 C-말단에 도입하여(도 2), STAR T 세포 기능에 대한 영향을 연구한다. 본 발명의 STAR 불변 영역은 미변형된 WT-STAR 불변 영역, 추가적인 분자간 이황화 결합을 갖는 cys-STAR 불변 영역, 뮤린화된 hm-STAR 불변 영역, 및 하위섹션 1에 기재된 3개의 변형과 조합되는 mut-STAR를 포함한다. 공동자극 신호 형질도입 구조는 각각 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 및 서열번호: 15의 서열을 갖는 CD40, OX40, ICOS, CD28, 4-1BB 또는 CD27의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 공동자극 엔도도메인은 TCR α 사슬, TCR β 사슬, 또는 TCR α 및 β 사슬 둘 다(co-STAR)의 C-말단에 연결될 수 있다. 또한, 공동자극 엔도도메인은 TCR 불변 영역의 C-말단에 직접적으로 또는 링커 G4S/(G4S) n(여기서 G4S 링커 서열은 각각 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25임)을 통해, TCR 불변 영역의 C-말단 또는 TCR 분자의 엔도도메인 서열이 결실된 TCR 불변 영역의 C-말단에 연결된다(여기서, 엔도도메인-결실된 TCR α 사슬 불변 영역은 시스테인 치환 및 소수성 영역 변형 둘 다를 포함(마우스 TCRaC-del 돌연변이, 서열번호: 26)하고, 엔도도메인-결실된 TCR β 사슬 불변 영역은 시스테인 치환(마우스 TCRβC-del 돌연변이, 서열번호: 27)(co-링커-STAR, 도 3)을 포함함).
γδ T 세포의 TCR은 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬로 이루어지고, γδ T 세포는, TCR δ 사슬의 유형에 따라 3개의 하위군 즉, γ δ 1, γ δ 2 및 γ δ 3로 나뉘며, 여기서 상이한 하위군은 인간 신체에서 상이한 분포를 가진다. γ δ T 세포는 MHC-제한 방식으로 항원을 인식하며, 이는 병원체 및 종양의 감시에서 중요한 역할을 한다. 실험은, CD28 또는 4-1BB 및 유사한 공동자극 신호가 γ δ T 세포의 활성화 및 증식에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. γ δ T 세포의 성능을 개선하기 위해, 발명자들은 인간 공동자극 분자 수용체의 엔도도메인 서열을 각각 TCR γ 및 TCR δ의 C-말단에 도입하였다(도 2, 우측).
2.2. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 포함하는 CD3 분자(co-CD3-STAR)의 설계
CD3 서브유닛은 γ 사슬, δ 사슬, ε 사슬 및 ζ 사슬을 포함하고, TCR 분자와 함께 T 세포 수용체 복합체를 형성하는데, 이 복합체는 세포의 상태 및 자극에 대한 반응을 조절하기 위해 엑토도메인으로부터 엔도도메인으로 신호를 전달한다. 향상된 TCR T 세포를 설계하고 생체 내 T 세포의 종양 사멸 능력, 증식 능력 및 생존 시간을 개선하기 위해, 본 발명자들은 CD3 분자를 변형하였다. 이 변형을 위해 인간화 된 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 CD3 γ 사슬(서열번호: 28), δ 사슬(서열번호: 29), ε 사슬(서열번호: 30) 및 ζ 사슬(서열번호: 31)의 C-말단에 도입하였다(도4). 변형된 CD3 분자는 mut-STAR T 세포에서 발현되어 그 기능이 개선되었다.
2.3. 사이토카인 수용체 자극 영역(사이토카인-STAR, CK-STAR)을 포함하는 CD3 분자의 설계
사이토카인은 T 세포의 증식, 항-종양 및 분화에 있어서 중요한 역할을 한다. 상이한 사이토카인은 각각의 수용체와 조합되어 엑토도메인으로부터 엔도도메인으로 신호를 전달함으로써, 세포의 상태 및 자극에 대한 반응을 조절한다. 또한, 다운스트림 분자 STAT5(서열번호: 35)가 IL-2 수용체 엔도도메인에서 캐스케이드 반응에 의해 활성화되고, 이에 따라 T 세포 증식 관련 분자의 전사가 향상되고, CAR-T 세포의 증식 능력을 향상된다는 것을 연구를 통해 알게 되었다. 향상된 STAR-T 세포를 설계하고 생체 내 T 세포의 종양 사멸 능력, 증식 능력 및 생존 시간을 개선하기 위해, 본 발명자들은 STAR 분자는 변형하였는데, 인간 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-2 β 수용체 엔도도메인 IL2Rb, 서열번호 32; IL-7 α 수용체 엔도도메인, 서열번호 33; IL-21 수용체 엔도도메인, 서열번호 34 등)의 세포 내 신호 전달 도메인을 TCR α 사슬 또는 TCR β 사슬 또는 TRC α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에 연결하거나, 또는 STAT5 활성화 모이어티를 G4S(IL-2RbQ, 서열번호 36; IL-7RbQ, 서열번호 37)를 통해 IL-2 β 또는 IL-7R α 수용체 엔도도메인에 추가로 연결함으로써 변형하였다(도 5).
3. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 포함하는 야생형 및 돌연변이체 STAR 분자의 벡터의 작제
3.1 벡터 공급원
바이러스 벡터, 플라스미드 벡터 등을 포함하는 본 발명에서 사용되는 벡터는 상업 회사로부터 구매하거나 또는 상업 회사에 의해 합성되었고, 이들 벡터의 전장 서열은 수득 되었고, 특이적 절단 부위는 공지되어 있다.
3.2. 단편 공급원
본 발명에서 언급된 TCR은, 본 발명에서 사용되는 WT-STAR, mut-STAR, ub-STAR, co-STAR, co-링커-STAR, CK-STAR, co-CD3-STAR 등을 포함하는 임의의 기능적 TCR일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유전자 단편, 예컨대 TCR의 가변 영역, TCR의 불변 영역, 공동자극 분자 수용체의 엔도도메인, 사이토카인 수용체의 세포 내 신호 전달 영역, 태그 서열, 링커 등은 모두 상업 회사에 의해 합성되었다. 이들 유전자 단편은 PCR에 의해 연결되었다.
본 실시예에서, TCR 복합체의 최적화는 서열번호: 38(CD20을 표적으로 하는 항체로부터 유래됨, OFA)로 이루어진 ScFv 및/또는 서열번호: 39(CD19를 표적으로 하는 항체로부터 유래됨, FMC63)로 이루어진 ScFv를 포함하는 STAR를 이용하여 검증하였고, 서열번호: 40(적색 형광 단백질(RFP))으로 이루어진 RFP 단백질만을 발현하는 블랭크 공시험 모의 대조군과의 비교가 수행되었다.
3.3. 벡터 작제
본 명세서에서 사용되는 렌티바이러스 벡터는 pHAGE-EF1 α-IRES-RFP였는데, 여기서 선형 벡터는 제한 효소 Not I/Nhe I를 사용하여 수득되었고, 유전자 단편은 합성 및 PCR을 통해 수득되었고, 완전한 벡터는 상동 재조합을 통해 수득되었다.
4. 세포주의 작제:
4.1 플라스미드 pHAGE-루시퍼라제-GFP의 작제
렌티바이러스 벡터로서, pHAGE는 안정적으로 표적 세포의 게놈에 표적 유전자를 삽입할 수 있고, 이것은 안정된 세포주를 작제하기 위한 중요한 방식이다. 루시퍼라제는 촉매적 활성을 갖는 일종의 효소이었고, 이것은 표적 세포가 안정적으로 루시퍼라제를 발현하도록 기질의 화학적 자체발광을 촉매화 하고, 표적 세포의 수는 기질을 첨가한 후에 표시될 수 있고, 따라서 표적 세포에 대한 기능 세포의 효과를 반영할 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제 NotI/ClaI 절단 부위를 보유하는 pHAGE-EF1A 벡터는 2개의 효소에 의해 절단되었고, 루시퍼라제 및 GFP 서열을 NCBI에 의해 수득되었고, 단편은 루시퍼라제 유전자를 GFP 유전자와 중첩(overlap) PCR을 통해 조합하는 방식으로 상업 회사인 루이복싱케(Ruiboxingke)에 의해 합성되었고, 루시퍼라제-GFP 단편은 상동 재조합에 의해 pHAGE 벡터에 연결되었다.
4.2 루시페라아제를 담지한 표적 세포주의 작제
루시퍼라제 및 GFP를 담지한 렌티바이러스 벡터를 성공적으로 작제한 후, 렌티바이러스를 렌티-X-293T로 패키징하고, 렌티바이러스 용액을 PEG8000를 이용하여 농축시키고, 구배 희석 방법을 이용하여 바이러스 역가를 측정하고, 림프종 세포주 Raji를 감염시키고, 감염 72시간 후에, GFP 양성 세포가 존재하는지 아닌지를 형광 현미경을 이용하여 관찰하고, 유세포 분류기를 이용하여 GFP 양성 세포를 분류하고, 라이브러리 구축 및 보존을 위해 단일클론성 세포를 선택하였다. 동시에, 루시퍼라제 기질을 사용하여 표적 세포를 항온처리(incubation)하였고, 루시퍼라제의 발현 및 검출 수준을 측정하여 발현 수준을 결정하였다.
4.3 TCR α-β 녹아웃 주르카트(Jurkat) 세포주의 구축
TCR의 구조 및 서열 특징에 기초하여, α 및 β 사슬의 불변 영역에서 가이드 서열을 설계하여, TCR α-β-Jurkat 세포주를 작제하였다. TCR α 및 β 사슬의 불변 영역의 엑손 서열은 NCBI에서 수득하였고, TCR α 및 β 사슬의 불변 영역의 엑손 1 서열을 가이드 서열 설계하기 위한 웹사이트인 tools.genome-engineering.org에 제출하였고, 그 결과에 기초하여, 올리고 서열을 합성하였고, sgRNA-LentiCRISPR 렌티바이러스 벡터(Aidi Gene으로부터 구입)를 작제하였다. α 사슬의 가이드 서열을 렌티CRISPR-puro에 연결하였고, β 사슬의 가이드 서열을 렌티CRISPR-BSD에 연결하였다.
SgRNA-LentiCRISPR 렌티바이러스의 패키징: HEK-293T를 미리 10 cm 접시에 올려 놓고, 세포가 80% 내지 90% 만큼 성장했을 때, 형질감염 시스템을 HEK-293T에 첨가하였고, 세포 배양을 위해 다시 37℃ 배양기에 넣었다. 이 시점을 0시간으로 설정하여 시간을 계측하고; 형질감염을 시작하고 나서 12시간이 되었을 때, 새로운 10% FBS-DMEM를 첨가하였다. 형질감염 후 48시간째 및 72시간째에 바이러스를 수집하였다. 바이러스를 포함하고 있는 배양 배지를 원심분리 및 여과하였고, PEG8000과 혼합하였고, 4℃에서 12시간 초과 시간 동안 방치하였고, 다음으로 30분 동안 3500 rpm의 속도로 원심분리하였고, 상청액을 폐기한 후, 적절한 용적의 배지에 재현탁하고 침전시켰다. 그 결과 얻어진 생성물을 -80℃에서 동결시키거나, 그대로 사용하였다.
Jurkat T 세포의 감염 및 스크리닝, 그리고 단일클론성 세포주의 식별: Jurkat T 세포를 12-웰 또는 24-웰 플레이트에 접종하였고, 이어서 적절한 체적을 갖는 α 사슬 및 β 사슬의 sgRNA-LentiCRISPR 바이러스를 동시에 첨가하였을 뿐만 아니라, 폴리브렌을(총 체적 기준으로 1:1000의 비율로) 첨가하고, 잘 혼합하였다. 원심분리 감염을 32℃에서 1000 rpm의 속도로 90분 동안 수행하였다. 얻어진 생성물을 37℃ 인큐베이터에 배치하고 시간을 0시간으로 설정하고 카운팅하였다: 액체는 10시간 내지 12시간 후에 변화되었고; 48시간 후에, 적절한 최종농도로 퓨로마이신을 첨가하고, 추가적으로 48시간 동안 처리하였다. 그 결과 도시된 바와 같이 감염되지 않은 대조군 세포는 모두 사멸되었다. 생존 세포를 흡입하여, 원심분리하고, 완전한 배지에서 배양하여 TCR α-β-Jurkat 세포 은행(cell bank)을 수득하였다. TCR α-β-Jurkat 세포 은행으로부터 가져온 단일 세포를 유세포 분류기 “ARIA”를 이용하여 96-웰 플레이트에 분주하였고, 2주간 배양하였고, 성장한 단일클론성 세포주를 증폭 배양하기 위해 흡인하였다. 단클론성 세포주를 TCR α 사슬 및 β 사슬 항체로 각각 식별하였고, 두 사슬이 모두 결핍된 세포주를 증폭시켜 내인성 TCR 녹아웃 Jurkat-T 세포주를 수득하였다.
5. T 세포 형질도입을 위한 바이러스 패키징 시스템의 작제
5.1 렌티바이러스 시스템 및 패키징 방법(세대별로 상이함)
Lentix-293T 세포를 5×105/mL의 밀도로 10 cm 배양 접시에 접종한 후, 5% CO2 분위기에서 37℃의 인큐베이터에서 배양하였고, 세포 밀도가 약 80%에 이르렀을 때(현미경으로 관찰됨) 형질감염(transfection)을 수행하였다. 3개의 플라스미드, 예컨대 PMD2.G:PSPAX:전달 플라스미드를 1:2:3의 비율로 500 μL의 무혈청 DMEM과 혼합하였다. 54 μL의 PEI-Max 및 500 uL의 무혈청 DMEM을 균일하게 혼합하고 실온에서 5분 동안 두었다(PEI-Max 대 플라스미드의 체적-질량비는 3:1). 플라스미드 혼합물에 PEI-Max 혼합물을 서서히 첨가하였고, 부드럽게 취입하고, 균일하게 혼합한 다음, 실온에서 15분 동안 정치시켰다. 최종 혼합물을 배양 배지에 서서히 첨가하고, 고르게 혼합하였고, 다음으로 12시간 내지 16시간 배양을 위해 인큐베이터에 다시 넣고, 추가 배양을 위해 6% FBS DMEM 배지로 바꾸고, 바이러스 용액을 48시간 및 72시간에 지난 시점에서 수집하였다.
5.2 바이러스 역가 측정
Jurkat-C5 세포를 편평 바닥 96-웰 플레이트에서 1.5×105 세포/mL의 밀도로 접종하였고, 10% FBS 및 0.2 μL 1000× 폴리브렌을 함유하는 100 μL의 1640 배지를 각 웰에 첨가하였다. 1640 완전 배지를 이용하여 10배 바이러스 희석을 수행하였고, 바이러스 저장 용액으로 결정될 때, 제1 웰에서의 바이러스 용량은 100 μL이고, 농축 용액으로 결정될 때 1 μL이었다. 희석된 세포를 100 μL/웰의 밀도로 바이러스 웰에 첨가하고, 32℃에서 혼합하고, 90분 동안 1500 rpm으로 원심분리하였고, 72시간 동안 37℃에서 5% CO2와 함께 72 시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 편평 바닥 96-웰 플레이트로부터 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트로 흡인하고, 4℃에서 1800 rpm으로 5분 동안 원심분리하였고, 상청액을 폐기하였다. 200 uL의 1×PBS를 첨가한 후, 4℃에서 1800 rpm으로 5분 동안 원심분리를 수행하였고, 상청액을 폐기하였다. 200 uL의 4% 조직 고정 용액을 첨가하였고, 생성된 용액을 빛이 닿지 않도록 하였고, 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다. 유세포 분석법을 이용하여 감염 효율을 측정하였고, 하기 공식에 따라 역가를 계산하여 2% 내지 30%의 유효율을 가진 웰을 선택하였다: 역가(TU/mL) = 1.5 × 104 × 양성률/바이러스 부피(μL) × 1000. 아래 기재된 플라스미드의 바이러스를 위에 기재된 방법으로 패키징하였다: pHAGE-EF1A-IRES-RFP, WT-STAR, mut-STAR, co-WT-STAR(αβ-4-1BB-WT, αβ-CD27-WT, αβ-CD28-WT, αβ-ICOS-WT, αβ-OX40-WT, αβ-OX40-WT), co-STAR(αβ-4-1BB, αβ-CD27, αβ-CD28, αβ-ICOS, αβ-OX40, αβ-OX40), co-CD3-STAR(CD3 δ-4-1BB, CD3 δ-CD28, CD3 δ-ICOS, CD3 δ-OX40, CD3 ε-4-1BB, CD3 ε-CD28, CD3 ε-ICOS, CD3 ε-OX40, CD3 γ-OX40, CD3 γ-ICOS, CD3 γ-OX40, CD3 ζ-41BB, CD3 ζ-CD28, CD3 ζ-ICOS, CD3 ζ-OX40), co-linker-STAR(TCR β-del-OX40, TCR α-del-G4S-OX40, TCR α-del-G4S-OX40, TCR β-del-(G4S) 3-OX40, TCR β-del-(G4S) 7-OX40), C K-STAR(β-IL-2Rb STAR, β-IL-2RbQ STAR, α-IL-2RbQ STAR, α-IL-7RA STAR, α-IL-7RAQ STAR, α-IL-21R STAR) 등.
6. T 세포 배양 및 감염 방법의 확립
6.1 Jurkat T 세포주 배양
Jurkat T 세포주를 3*105/mL의 배양밀도 및 최대 3*106/mL의 배양 밀도로 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였고, 1일 내지 2일 간격으로 계대배양하였다. 세포를 계수 하고, 필요한 수 만큼의 세포를 취하고, 배양 배지를 보충하여 상기 밀도로 조절하고, 배양을 위해 CO2 분위기 인큐베이터에 넣었다.
6.2 Jurkat T 세포주 감염
세포를 계수하고, 1*106/mL 만큼의 세포를 취하여 원심분리하고, 액체를 이용하여 변화시키고, 10% FBS를 함유하는 1 mL의 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 24-웰 플레이트에 분주하고 적절한 양의 바이러스 용액을 첨가하였다. 또한 90분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고, 배양을 위해 CO2 인큐베이터에 두었다. 감염하고 12시간 후 10% FBS를 함유하는 새로운 RPMI 1640 배지를 이용하여 액체를 완전히 변화시켰고, 72시간 후에 양성률을 검출하였다.
6.3 인간 1차 T 세포 배양
1차 T 세포를 피코일 방법(Ficoil method)를 이용하여 단리하고, 단리된 세포를 10% FBS 및 100 IU/mL IL-2를 함유하는 X-VIVO 배지에서 배양하였고, 이때 초기 배양 밀도는 1*106/mL이었다. 이후 CD3- 및 레트로넥틴 r-피브로넥틴(각각 5ug/ml의 최종 농도)으로 예비-코팅된 웰 플레이트에 첨가하였다. 후기 배양물(anaphase culture)의 배양의 밀도는 5*105/mL 및 최대 3*106/mL이었고, 계대배양은 1 내지 2일 간격으로 수행하였다.
6.4 인간 1차 T 세포 감염
48시간 동안의 배양 후, 1차 T 세포를 MOI = 20인 바이러스 용액과 함께 첨가하였고, 90분 동안 1500 rpm로 원심분리 하였고, 배양을 위해 CO2 인큐베이터에 넣었다. 감염하고 24시간 후, 10% FBS 및 100 IU/mL IL-2를 함유하는 X-VIVO 배지를 보충하였고, 웰을 회전시켰고, 72시간 후, TAG 단백질 또는 항체를 이용하여 감염 효율을 검출하였다.
6.5. 감염 효율 검출 방법
감염하고 72시간 후, 세포를 고르게 취입하고 계수하여 얻은 5*105/ml의 세포를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 사용된 염색 용액은 PBS+2% FBS+2 mM EDTA이었다. 상응하는 항체를 첨가하여 30분간 인큐베이션 하였고, PBS를 첨가하여 2회 세척을 하였고, 검출은 컴퓨터 상에서 수행되었다.
7. WT-STAR 수용체 및 그것의 돌연변이체 mut-STAR T 세포에 대한 시험관 내 기능적 검정
7.1. T 세포 및 표적 세포에 대한 시험관 내 공동 배양 방법
표적 세포 Raji-루시퍼라제, RajiCD19KO-루시퍼라제, RajiCD20KO-루시퍼라제 및 1차 T 세포는 현탁 세포였고, 공동 인큐베이션을 위해, 상응하는 수의 세포를 취하였고, 표적 세포 배지와 혼합하였고, 배양을 위해 원심분리하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 1차 T 세포를 패키징되고 정제된 WT-STAR 및 mut-STAR T 바이러스로 감염시켰고, 공동 배양 1일 전에 감염 효율을 유세포 분석법을 이용하여 검출하였고, 효과기 세포 대 표적 세포의 비율은 1:1로 결정되었고 통상적으로 사용되었다. T 세포의 총 수를 감염 효율에 따라 결정하였고, 표적 세포의 일반적인 용량은 1×105/웰(96-웰 플레이트)이었다.
7.2. 표적 항원에 의한 T 세포의 자극
본 발명의 표적 항원은 일반적으로 세포 표면 단백질이며, T 세포의 기능을 검출할 목적으로 T 세포 활성화를 위해 직접 사용될 수 있다. 양성 T 세포를 1×105/웰의 농도로 통상적으로 첨가하였고, 원심분리를 하였고, 24시간 동안 활성화하였다. 다음으로, T 세포 기능을 검출하기 위해 T 세포 또는 표적 세포를 수집하였다.
7.3. T 세포 사멸 기능 검증: 루시퍼라제 검정
T 세포를 24시간 동안 표적 세포와 함께 공동배양하였고, 그 다음 세포 현탁액을 부드럽고 균일하게 취입하였고, 웰당 150μL의 세포 현탁액을 취하여, 백색 96웰 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 1500 rpm/분의 속도로 원심분리하였고, 상청액을 취하였고, 세포용해물을 첨가하여 15분 동안 실온에서 용해시켰고, 4℃에서 4000 rpm/분 속도로 15분 동안 원심분리하였다. 그 다음 상청액을 2개의 평행 웰의 각 웰별로 취하고, 루시퍼라제 기질(반딧불이 루시퍼라제 검정 시약)을 첨가하였다. 다음, 게인 값(gain value)을 100으로 설정한 다기능 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 화학발광 값을 얻었다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% -(웰당 효과기 세포-표적 세포 값/웰당 대조군 세포-표적 세포 값).
7.4. 루시퍼라제 검정에 의한 T 세포 사멸 기능 시험의 검출 결과에 따르면, 도 6 및 표 1에 나타난 바와 같이, 돌연변이체 mut-STAR T 세포가 더 강한 T 세포 종양 사멸 능력을 보여주었고, CD19 및 CD20을 표적으로 하는 mut-STAR T 세포가 Raji-루시퍼라제, RajiCD19KO-루시퍼라제 및 RajiCD20KO-루시퍼라제를 사멸시킨 후, 잔여 종양의 생존율은 각각 2.41%, 13.94% 및 24.40%이었다. 이는 WT-STAR 보다 각각 45.73%, 77.00% 및 76.16% 만큼 더 우수하였음을 의미하고, 돌연변이체 mut-STAR가 더 우수한 종양 사멸 효과를 가졌음을 나타낸다.
[표 1]
야생형-STAR 및 STAR의 공동 배양 후의 표적 세포의 생존율(%)
8. TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 모두의 C-말단 또는 TCR α 사슬과 TCR β 사슬 중의 어느 하나의 C-말단에 연결된 공동자극 엔도도메인이 STAR-T 세포의 기능에 미치는 영향
8.1. T 세포 및 표적 세포에 대한 시험관 내 공동 배양 방법
표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포는 현탁 세포였고, 공동 인큐베이션을 위해, 상응하는 수의 세포를 취하여 표적 세포 배지와 혼합하였고, 배양을 위해 원심분리하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 1차 T 세포를 패키징되고 정제된 WT-STAR 및 mut-STAR T 바이러스로 감염시켰고, 공동 배양 1일 전에, 유세포 분석법으로 감염 효율을 검출하였고, 효과기 세포 대 표적 세포의 비를 결정하였고, 공동 인큐베이션은 8:1, 4:1, 2:1, 1:2, 4:1 및 1:8의 통상적인 비율로 수행하였고, 시간에 따른 공동 인큐베이션의 차이를 통상적인 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간 및 48 시간의 시점에 검출하였다. co-STAR T 세포의 증식을 검출하기 위해, 표적 세포인 Raji-루시퍼라제를 7일 동안 1차 T 세포와 함께 인큐베이션하여, 세포 증식 수 및 IL-2 분비의 변화를 관찰하였고, 그 다음 유세포분석법을 이용하여 양성 T 세포를 분류하였고, 2일 동안 항원 자극 없이 휴지 배양을 실시하였고, 그 다음 다시 24시간 동안 표적 세포와 함께 공동 배양하여 T 세포의 사멸을 검출하였다. 이때, 표적 세포의 통상적인 용량은 1×105/웰(96-웰 플레이트)이었다.
8.2. 표적 항원으로 T 세포를 자극하는 방법
본 발명의 표적 항원은 일반적으로 세포 표면 단백질이고, T세포의 기능을 검출할 목적으로 T 세포 활성화에 직접적으로 사용될 수 있다. 특히 표적 항원에 양성 T 세포를 통상적으로 1×105/웰 농도로 첨가하였고, 원심분리를 수행하였다. 다음으로 24시간 동안 활성화 후에, 또는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간 또는 7 일 동안 활성화 후에, T 세포 기능 검출을 위해 세포 현탁액 또는 배양 상청액을 수집하였다.
8.3. T 세포 사멸 기능 검증: 루시퍼라제 검정
T 세포를 상이한 시간 동안 표적 세포와 함께 공동배양하였고, 그 다음 세포 현탁액을 부드럽고 균일하게 취입하였고, 웰당 150μL의 세포 현탁액을 취하여, 백색 96웰 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 1500 rpm/분의 속도로 원심분리 하였고, 상청액을 취하였고, 세포용해물을 첨가하여 15분 동안 실온에서 용해시켰고, 4℃에서 4000 rpm/분 속도로 15분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상청액을 2개의 평행 웰의 각 웰을 이용하여 취하였고, 루시퍼라제 기질(반딧불이 루시퍼라제 검정 시약)을 첨가하였다. 그 다음, 게인 값(gain value)을 100으로 설정한 다기능 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 화학발광 값을 얻었다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% -(웰당 효과기 세포-표적 세포 값/웰당 대조군 세포-표적 세포 값).
루시퍼라제 검정에 의한 T 세포 사멸 기능 시험의 검출 결과는, TCR α 사슬 및 β 사슬 둘다의 C-말단에 연결된 공동자극 엔도도메인을 갖는 mut-STAR가, T 세포 및 표적 세포의 상이한 E:T 비에서 유사한 종양 사멸 효과를 나타내었고, 도 7 및 표 2에 나타난 바와 같이 상이한 E:T 비에서 잔여 종양 생존율에 있어서 유의미한 차이가 없다는 것을 보여주었다. 그러나, 상이한 시점에서의 종양 사멸 검출 결과 관점에서는, TCR α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR(αβ-OX40) 및 48시간 동안 Raji-루시퍼라제와 함께 인큐베이션된 mut-STAR가, 유사한 종양 사멸 효과, 각각 약 24% 및 19%를 나타내었고, 이는 도 8 및 표 3에 나타난 바와 같이, TCR α 및 β 사슬 둘 다(αβ-41BB, αβ-CD27, αβ-CD28, αβ-ICOS)의 C-말단에 연결된 다른 공동자극 엔도도메인을 갖는 mut-STAR 보다 상당히 우수함을 나타낸다. 상기 결과에 기초하여, 공동자극 분자 OX40의 엔도도메인을 TCR α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에 연결하는 것은 mut-STAR의 사멸 효과에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 결과는 TCR α 사슬(α-OX40) 또는 TCR β 사슬(β-OX40)중의 어느 하나만의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR의 T 세포 사멸 기능이 루시퍼라제 검정을 통해 검출되었음을 보여준다. 검출결과에 따르면, 상이한 E:T 비(T 세포 대 공동 인큐베이션된 종양 세포의 비율) 또는 24시간 동안의 공동 인큐베이션 수행시, α-OX40 및 β-OX40가, 도 9 및 10 과 표 4 및 5에 나타난 바와 같이, α-β-OX40에 비해 유의미한 차이를 보이지 않았다. 상기 사멸 결과에 따르면, TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 둘 다(αβ-OX40)의 C-말단에 연결된 공동자극 분자 OX40의 엔도도메인을 갖는 mut-STAR 및 TCR α 사슬(α-OX40) 또는 TCR β 사슬(β-OX40)중 어느 하나만의 C-말단에 연결된 공동자극 분자 OX40의 엔도도메인을 갖는 mut-STAR 사이에 유의미한 차이는 보이지 않았으나, 이들의 종양 사멸 능력은 mut-STAR의 종양 사멸 능력 보다 상당히 더 우수하였다.
8.4. T 세포의 사이토카인 분비에 대한 분석: ELISA
T 세포 활성화 동안에, TNF-α, IFN-γ 및 Il-2과 같은 다수의 사이토카인이 방출되어, T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 것을 돕거나 T 세포 자체의 확장을 촉진하였다. T 세포가 표적 세포 또는 항원에 의해 자극된 후, T 세포를 수집하고 원심분리하여 상청액을 취하였다. 사용된 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 ELISA 키트는 인간 IL-2 미코팅 ELISA, 인간 TNF-α 미코팅 ELISA, 및 인간 IFN-γ 미코팅 ELISA(각각 물품 번호 88-7025, 88-7346 및 88-7316)이었다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: ddH2 O를 이용하여 10X 코팅 완충제를 1X로 희석하고, 코팅된 항체(250X)를 첨가하고, 잘 혼합하고, 96-웰 플레이트에 100 μL/웰 농도로 첨가한다. 플라스틱 랩으로 밀봉하고 4℃에서 밤새 방치 한 후, 1X PBST(0.05% 트윈 20을 첨가한 1X PBS)를 매번 260 μL/웰로 3회 세척하기 위해 사용하였고, 5X ELISA/ELISPOT 희석제를 ddH2O를 이용하여 1X로 희석시킨 다음, 200 μL/웰로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 이어서 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 세척을 위해 PBST를 1회 사용하였고, 표준 곡선(각각 2 내지 250, 4 내지 500, 4 내지 500의 범위)에 따라 희석 하였고, 샘플을 1X희석제로 20배 내지 50배 희석하였다. 표준 곡선에 따라 희석된 샘플을 웰당 100 μL 첨가하였고, 2개의 평행 웰을 취하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였고, PBST로 3회 세척하였고, 그 다음 1X희석제로 희석된 검출 항체를 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 세척을 위해 PBST를 3회 사용하였고, 그 다음 1X희석제로 희석한 HRP를 첨가하였고, 30분 동안 인큐베이션 시킨 후, 용액을 6회 세척하였고, 발색을 위해 TMB를 첨가하였고, 발색 시간은 15분 미만이었고, 2N H2SO4를 종결을 위해 첨가하였고, 450 nm에서의 광 흡수를 검출하였다.
ELISA 결과는 다음을 보여주었다: T 세포가 24시간 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션 된 후, TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 둘 다의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR(αβ-OX40)의 IL-2 분비량은 약 10000 pg/ml이었고, 이는 다른 구조를 갖는 STAR의 분비량 보다 상당히 높은 것이며, mut-STAR, αβ-41BB, αβ-CD27, αβ-CD28 및 αβ-ICOS의 분비량은 각각 약 7700 pg/ml, 6450 pg/ml, 6690 pg/ml, 6000 pg/ml, 및 6050 pg/ml였고; TNF α 및 IFN-γ 분비에 있어서, αβ-OX40은 mut-STAR와 유사한 결과를 보였고, 다른 구조는 도 11 및 표 6에 나타난 바와 같이 서로 상이한 양의 감소를 보였다. ELISA 결과에 따르면, TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 둘 다(αβ-OX40)의 C-말단에 연결된 공동자극 분자 OX40의 엔도도메인을 갖는 mut-STAR에 의한 IL-2 분비 수준이 mut-STAR에 의한 IL-2 분비 수준 보다 상당히 높았다.
8.5. T 세포 증식 변화의 검출: 유세포 분석법에 의한 계수
T 세포 활성화 동안에, 다수의 사이토카인이 방출되어 T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 것을 돕거나, T 세포 자체의 확장을 촉진하였고, T 세포 증식 동안에 발생된 가장 명백한 변화는 T 세포 수의 변화였다. T 세포를 7일 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션하였고, 그 다음 원심분리를 하였고, PBS를 이용하여 200 uL가 되도록 재현탁하였고, 양성 T 세포의 수를 유세포 분석법으로 계수하였다. T 세포 증식의 변화: 증식 배수 = 7일 후의 양성 T 세포의 수/첨가된 양성 T 세포의 초기 수.
분류 후, 다양한 구조를 가지는 mut-STAR-T 세포를 1:3 E:T 비로 Raji-루시퍼라제 세포와 공동배양하고, 0일차로 카운팅하고, 그 다음 유세포 분석을 위해 세포를 각각 1일차 및 7일차에 수집하였다. 이들 중에서, 사용된 배지는 IL-2가 없는 1640 완전 배지였고, TCR T 세포의 초기 수는 1x105 세포이었고, 각 시점에서의 샘플을 독립적으로 인큐베이션하였고, 나머지 공동-인큐베이션된 샘플은 다음날 액체로 반-변화되었고, 표적 세포를 보충하였다. 유세포 분석을 위해 사용된 세포를 미리 항-인간 CD3 항체로 염색하였고, 기계에서 분석을 수행할 때, 세포의 특정 용적을 수집하여 기록하였고, 시스템에서의 T 세포의 수 및 비는 전환율을 통해 알아냈다. 도 12 및 표 7에 나타난 바와 같이, mut-STAR 세포의 절대 수의 증식 배수 곡선으로부터, TCR α 사슬 및 TCR β 사슬(αβ-OX40) 둘 다의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR는 표적 세포 에피토프를 인식한 후 더 나은 활성 및 증식을 나타내었고, 이는 mut-STAR를 이용했을 때의 결과 보다 상당히 우수하였다. TCR α 사슬(α-OX40) 또는 TCR β 사슬(β-OX40)의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR의 증식은 도 13 및 표 8에 나타나 있고, 여기서, 7일 후 TCR α 사슬(α-OX40)의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR의 T 세포 증식은 11.75배이었고, mut-STAR, β-OX40 및 αβ-OX40와 같은 다른 구조의 T 세포 증식은 각각 2.755배, 4.128배 및 6.744배이었다. 따라서, α-OX40의 증식 효과는 다른 구조의 증식 효과 보다 상당히 우수하였다. 위에 언급된 종양 사멸 결과, ELISA 결과 및 T 세포 증식 결과를 조합하면, TCR α 사슬(α-OX40)의 C-말단에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR는 다른 구조에 비해 더욱 향상된 증식 및 종양 사멸 능력을 나타내었다.
위에 언급된 결과에 따르면, 최상의 증식 효과는, T 세포의 사멸 효과에 영향을 미치지 않으면서 공동자극 분자 OX40을 TCR-α 사슬에 연결함으로써 얻어진 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상이한 공동자극 분자의 세포 내 도메인이 TCR α 사슬과 일렬로 연결되어 있는 mut-STAR, 상이한 T 세포 및 표적 세포의 E:T비는, mut-STAR에 연결된 공동자극 분자 OX40의 세포 내 도메인의 사멸 효과가 다른 공동자극 도메인이 연결된 STAR의 사멸 효과 보다 더 우수하다는 것을 나타내었다. 1:2 및 1:4 E:T비에서, 공동자극 분자 Ox40에 연결된 엔도도메인(α-OX40)을 갖는 mut-STAR T 세포의 효과는 αβ-OX40의 효과와 유사하였고, 다른 공동자극 분자가 연결되어 있는 mut-STAR T 세포의 효과보다 더 우수하였다. 결과는 도 14 및 표 9에 나타나 있다. 상기 사멸 결과에 기초하여, TCR α 사슬(α-OX40)에 연결된 OX40 엔도도메인을 갖는 mut-STAR에 의해 얻어지는 종양 사멸 및 증식 능력은 mut-STAR의 능력보다 상당히 우수하였다.
[표 2]
상이한 E:T비에서 co-STAR와의 공동 배양 후의 표적 세포의 생존율(%)
[표 3]
상이한 시간 동안 co-STAR와의 공동 배양한 후의 표적 세포의 생존율(%)
[표 4]
상이한 E:T비에서 각각 α 사슬 및 β 사슬에 첨가된 OX40을 갖는 STAR와의 공동 배양 후의 표적 세포의 생존율(%)
[표 5]
상이한 시간동안 각각 α 사슬 및 β 사슬에 첨가된 OX40을 갖는 STAR와의 공동 배양 후의 표적 세포의 생존율(%)
[표 6]
표적 세포와 co-STAR의 공동 배양 후의 IL-2 분비
표적 세포와 co-STAR의 공동 배양 후의 IFN-α 분비
표적 세포와 co-STAR의 공동 배양 후의 IFN-γ 분비
[표 7]
표적 세포와 co-STAR의 공동 배양 후의 증식
[표 8]
그 α 또는 β 사슬에 연결된 OX40을 포함하는 STAR와 표적 세포의 공동 배양 후의 증식의 비교
[표 9]
9. STAR-T 세포의 기능에 대한, 상이한 CD3 사슬(co-CD3-STAR)에 연결된 공동자극 구조의 효과
9.1. T 세포 및 표적 세포에 대한 시험관 내 공동 배양 방법
표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포는 현탁 세포였고, 공동 인큐베이션을 위해, 상응하는 수의 세포를 취하여 표적 세포 배지와 혼합하였고, 배양을 위해 원심분리하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 1차 T 세포를 패키징되고 정제된 WT-STAR 및 mut-STAR T 바이러스로 감염시켰고, 공동 배양 1일 전에, 감염 효율은 유세포 분석에 의해 검출하였고, 효과기 세포 대 표적 세포의 비를 결정하였고, 공동-인큐베이션은 1:1 또는 2:1의 비로 통상적으로 수행하였고, 또한, 표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포를 7일 동안 공동-인큐베이션하여 세포 증식에 있어서 수의 변화를 관찰하였다. T 세포의 총 수를 감염 효율에 기초하여 계산하였고, 표적 세포의 일반적인 용량은 1×105/웰(96-웰 플레이트)이었다.
9.2. 표적 항원에 의한 T 세포의 자극
본 발명의 표적 항원은 일반적으로 세포 표면 단백질이며, T 세포 기능 검출을 목적으로 T 세포 활성화에 직접적으로 이용될 수 있다. 양성 T 세포를 1×105/웰로 통상적으로 첨가하고, 원심분리하고, 24 시간 동안 활성화하였다. 그리고, 세포 현탁액 또는 배양 상청액을 수집하여 T 세포 기능을 검출하였다.
9.3. T 세포 사멸 기능 검증: 루시퍼라제 검정
T 세포를 상이한 시간 동안 표적 세포와 함께 공동배양하였고, 그 다음 세포 현탁액을 부드럽고 균일하게 취입하였고, 웰당 150μL의 세포 현탁액을 취하여, 백색 96웰 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 1500 rpm/분의 속도로 원심분리 하였고, 상청액을 취하였고, 세포용해물을 첨가하여 15분 동안 실온에서 용해시켰고, 4℃에서 4000 rpm/분 속도로 15분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상청액을 2개의 평행 웰의 각 웰을 이용하여 취하였고, 루시퍼라제 기질(반딧불이 루시퍼라제 검정 시약)을 첨가하였다. 그 다음, 게인 값(gain value)을 100으로 설정한 다기능 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 화학발광 값을 얻었다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% -(웰당 효과기 세포-표적 세포 값/웰당 대조군 세포-표적 세포 값).
루시퍼라제 검정을 통한 T 세포 사멸 기능 시험의 검출 결과는 다음과 같았다. 즉, 공동자극 엔도도메인이 CD3 δ 또는 CD3 γ 또는 CD3 ε 또는 CD3 ζ 사슬의 C-말단에 연결되어 mut-STAR T 상에서 공동 발현되었을 때, 표적 세포에 대한 상이한 T 세포의 1:1 E:T 비에서의 결과에 따르면, 모든 co-CD3-STAR가 αβ-OX40 보다 더 우수한 표적 세포 사멸 효과를 나타내지는 않았지만, mut-STAR, CD3δ-OX40, CD3ζ-41BB, CD3ζ-CD28, CD3ζ-ICOS, CD3ζ-OX40과 비교하여 유사한 종양 사멸 효과를 나타내었고, 잔여 종양 생존율은 도 15 및 표 10에 나타난 바와 같이 1:1 E:T 비에서 유의미한 차이를 보이지 않았다. 상기 결과에 따르면, 공동자극 엔도도메인을 상이한 CD3 사슬의 C-말단에 연결한 경우, mut-STAR의 종양 사멸 효과가 크게 개선되지 않았으나, CD3 ζ 사슬의 C-말단에 연결된 공동자극 엔도도메인을 갖는 mut-STAR의 효과는 크게 줄어들지도 않았다.
9.4 T 세포 증식 변화의 검출: 유세포 분석법에 의한 계수
T 세포 활성화 동안에, 다수의 사이토카인이 방출되어 T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 것을 돕거나, T 세포 자체의 확장을 촉진하였고, T 세포 증식 동안에 발생된 가장 명백한 변화는 T 세포 수의 변화였다. T 세포를 7일 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션하였고, 그 다음 원심분리를 하였고, PBS를 이용하여 200 uL가 되도록 재현탁하였고, 양성 T 세포의 수를 유세포 분석법으로 계수하였다. T 세포 증식의 변화: 증식 배수 = 7일 후의 양성 T 세포의 수/첨가된 양성 T 세포의 초기 수.
분류 후, 다양한 구조를 가지는 mut-STAR-T 세포를 1:3 E:T 비로 Raji-루시퍼라제 세포와 공동배양하고, 0일차로 카운팅하고, 그 다음 유세포 분석을 위해 세포를 각각 1일차 및 7일차에 수집하였다. 이들 중에서, 사용된 배지는 IL-2가 없는 1640 완전 배지였고, TCR T 세포의 초기 수는 1x105 세포이었고, 각 시점에서의 샘플을 독립적으로 인큐베이션하였고, 나머지 공동-인큐베이션된 샘플은 다음날 액체로 반-변화되었고, 표적 세포를 보충하였다. 유세포 분석을 위해 사용된 세포를 미리 항-인간 CD3 항체로 염색하였고, 기계에서 분석을 수행할 때, 세포의 특정 용적을 수집하여 기록하였고, 시스템에서의 T 세포의 수 및 비는 전환율을 통해 알아냈다. 도 16 및 표 11에 나타난 바와 같이, mut-STAR 세포의 절대 수의 증식 배수 곡선으로부터, 다음을 알 수 있었다. 즉, 모든 co-CD3-STAR가 αβ-OX40-mut-STAR에 비해 더 양호한 표적 세포 사멸 효과를 나타내지는 않았으나, CD3 ε-CD28, CD3 δ-OX40, CD3 ζ-CD28, CD3 ζ-ICOS, CD3 ζ-OX40 등은 유사한 증식 효과를 나타내었다. 루시퍼라제 검정에 의한 사멸 검출 결과 및 T 세포 증식 결과를 조합하면, CD3 δ 또는 CD3 γ 또는 CD3 ε 또는 CD3 ζ 사슬의 C-말단에 연결되며 mut-STAR T 상에서 공동 발현되는 공동자극 엔도도메인을 갖는 구조는 αβ-OX40-mut-STAR T 세포에 비해 더 나은 종양 사멸 및 세포 증식의 효과를 나타내지는 않음을 알 수 있었다.
[표 10]
다른 CD3 엔도도메인에 연결된 공동자극 도메인을 가진 STAR와 공동 배양 후의 표적 세포의 생존율
[표 11]
7일 동안 다른 CD3 엔도도메인에 연결된 공동자극 도메인을 가진 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 증식
10. STAR-T 세포의 기능에 대한, 엔도도메인-결실된 α 또는 β 불변 영역에 연결된 링커 G 4 S를 포함하는 공동자극 엔도도메인의 효과
10.1. T 세포 및 표적 세포에 대한 시험관 내 공동 배양 방법
표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포는 현탁 세포였고, 공동 인큐베이션을 위해, 상응하는 수의 세포를 취하여 표적 세포 배지와 혼합하였고, 배양을 위해 원심분리하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 1차 T 세포를 패키징되고 정제된 WT-STAR 및 mut-STAR T 바이러스로 감염시켰고, 공동 배양 1일 전에, 감염 효율을 유세포 분석에 의해 검출하였고, 효과기 세포 대 표적 세포의 비를 결정하였고, 공동-인큐베이션은 1:1 또는 2:1의 비로 통상적으로 수행하였고, 또한, 표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포를 7일 동안 공동-인큐베이션하여 세포 증식의 수에 있어서의 변화를 관찰하였다. T 세포의 총 수를 감염 효율에 기초하여 계산하였고, 표적 세포의 일반적인 용량은 1×105/웰(96-웰 플레이트)이었다.
10.2. 표적 항원에 의한 T 세포의 자극
본 발명의 표적 항원은 일반적으로 세포 표면 단백질이었으며, 이것은 T세포의 기능을 검출하기 위한 목적으로 T 세포를 활성화시키기 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 특히 표적 항원에 양성 T세포를 1×105/웰로 통상적으로 첨가하고, 원심분리하고, 24시간 동안 활성화하여, T 세포 기능을 검출하기 위한 목적으로 이용할 세포 현탁액 또는 배양 상청액을 수집하였다.
10.3. T 세포 사멸 기능 검증: 루시퍼라제 검정
T 세포를 상이한 시간 동안 표적 세포와 함께 공동배양하였고, 그 다음 세포 현탁액을 부드럽고 균일하게 취입하였고, 웰당 150μL의 세포 현탁액을 취하여, 백색 96웰 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 1500 rpm/분의 속도로 원심분리 하였고, 상청액을 취하였고, 세포용해물을 첨가하여 15분 동안 실온에서 용해시켰고, 4℃에서 4000 rpm/분 속도로 15분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상청액을 2개의 평행 웰의 각 웰을 이용하여 취하였고, 루시퍼라제 기질(반딧불이 루시퍼라제 검정 시약)을 첨가하였다. 그 다음, 게인 값(gain value)을 100으로 설정한 다기능 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 화학발광 값을 얻었다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% -(웰당 효과기 세포-표적 세포 값/웰당 대조군 세포-표적 세포 값).
루시퍼라제 검정에 의한 T 세포 사멸 기능 시험의 검출 결과는 상이한 길이의 G4S 링커를 가진 공동자극 엔도도메인이 엔도메인-결실된 α 또는 β 불변 영역에 연결되었음을 나타내었다. T 세포 대 표적 세포의 1:1 E:T 비에서의 결과에 따르면, 링커가 α 불변 영역 엔도도메인, α-del-OX40, α-OX40, α-del-G4S-OX40, α-del-(G4S)3-OX40 및 α-β-OX40에 연결되었을 때, 유사한 사멸 효과가 나타났고, 그 효과는 α-del-(G4S)7-OX40 및 α-del-(G4S)10-OX40의 효과보다 우수하였고 링커가 길수록, T 세포 사멸 효과는 더 약하였다. 링커가 β 불변 영역 엔도도메인, β-del-OX40, β-OX40, β-del-(G4S)3-OX40 및 αβ-OX40에 연결되었을 때, 유사한 효과가 나타났고, 링커가 길수록, T 세포 사멸 효과가 약해졌다. 불변 영역 엔도도메인의 제거 후, OX40(α-del-OX40 또는 β-del-OX40)에 연결한 경우, 제거가 없었던 경우와 비교하여, 그 효과는 거의 차이가 없었다. 그러나, 링커의 첨가 후(링커의 수는 3 이하였음), α-del-(G4S)1-3-OX40 또는 β-del-(G4S)1-3-OX40의 효과는 α-del-OX40 또는 β-del-OX40의 효과보다 더 우수하였다. 링커가 α 불변 영역 엔도도메인에 연결된 경우의 효과와 β 불변 영역 엔도도메인에 연결된 경우의 효과의 비교에서는, 링커가 α 불변 영역 엔도도메인에 연결된 경우의 효과가 β 불변 영역 엔도도메인에 연결된 경우의 효과 보다 더 우수하다고 나타났다. 그러나, 도 17 및 도 18, 및 표 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 2:1 E:T 비율에서 잔여 종양 생존율에는 유의미한 차이가 없었다. 상기 결과에 따르면, 엔도도메인-결실된 α 또는 β 불변 영역에 연결된 G4S 링커를 포함하는 공동자극 엔도메인을 갖는 mut-STAR는, mut-STAR의 종양 사멸 효과에 영향을 미치지 않았고, α 불변 영역 엔도도메인에 연결한 경우, β 불변 영역 엔도도메인에 연결한 경우 보다 우수한 효과가 나타났고, 링커 길이가 길 수록 종양 사멸 효과는 약하였다.
10.4. T 세포의 사이토카인 분비에 대한 분석: ELISA
T 세포 활성화 동안에, TNF-α, IFN-γ 및 Il-2과 같은 다수의 사이토카인이 방출되어, T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 것을 돕거나 T 세포 자체의 확장을 촉진하였다. T 세포가 표적 세포 또는 항원에 의해 자극된 후, T 세포를 수집하고 원심분리하여 상청액을 취하였다. 사용된 TNF-α, IFN-γ, 및 IL-2 ELISA 키트는 인간 IL-2 미코팅 ELISA, 인간 TNF-α 미코팅 ELISA, 및 인간 IFN-γ 미코팅 ELISA(각각 물품번호 88-7025, 88-7346 및 88-7316)였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: ddH2O를 이용하여 10X 코팅 완충제를 1X로 희석하고, 코팅된 항체(250X)를 첨가하고, 잘 혼합하고, 96-웰 플레이트에 100μL/웰로 첨가하였다. 플라스틱 랩으로 밀봉하고 4℃에서 밤새 방치 한 후, 1X PBST(세척 완충액(Wash Buffer)으로 지칭하기도 함, 0.05% 트윈 20을 첨가한 1X PBS)를 세척을 위해 매번 260 μL/웰로 3회 사용하였고, ddH2O를 사용하여 5X ELISA/ELISPOT 희석제를 1X로 희석하였고, 200 μL/웰로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 이어서 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 세척을 위해 PBST를 1회 사용하였고, 표준 곡선(각각 2 내지 250, 4 내지 500, 4 내지 500의 범위)에 따라 희석 하였고, 샘플을 1X희석제로 20배 내지 50배 희석하였다. 표준 곡선에 따른 샘플을 웰당 100 μL 첨가하였고, 2개의 평행 웰을 취하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였고, PBST로 3회 세척하였고, 그 다음 1X희석제로 희석된 검출 항체를 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 세척을 위해 PBST를 3회 사용하였고, 그 다음 1X희석제로 희석한 HRP를 첨가하였고, 30분 동안 인큐베이션 한 후, 용액을 6회 세척하였고, 발색을 위해 TMB를 첨가하였고, 발색 시간은 15분 미만이었고, 2N H2SO4를 종결을 위해 첨가하였고, 450 nm에서의 광 흡수를 검출하였다.
ELISA의 결과에 따르면, T 세포가 24시간 동안 표적 세포와 공동배양 된 후, α-del-(G4S)7-OX40 OX40의 구조를 가진 mut-STAR의 IL-2 및 IFN-γ의 분비물이 mut-STAR의 분비물 보다 상당하게 더 낮은 반면, 다른 구조들, 예컨대 β-del-OX40, α-del-OX40, α-del-G4S-OX40 및 α-del-(G4S)3-OX40의 IL-2 분비는 각각 mut-STAR의 IL-2 분비와 비슷하였고; 오직 β-del-OX40만이 mut-STAR의 분비와 유사한 IFN-γ 분비를 보였고, 다른 구조들의 IFN-γ 분비는 도 19 및 20, 및 표 14 및 15에 나타난 바와 같이 상이하게 감소하였다. ELISA 결과에 따르면, α 또는 β 불변 영역의 엔도도메인이 결실 된 구조에서, α 사슬의 엔도도메인 결실은 IFN-γ 분비에 영향을 미쳤지만, IL-2 분비에 영향을 미치지 않았고, 반면 β 사슬의 엔도도메인 결실은 IL-2 또는 IFN-γ의 분비에 영향을 미치지 않았다; 또한, α 사슬의 엔도도도메인이 결실된 후, 링커를 사용하여 OX40 엔도도메인에 연결시켰고, 이 때, 7 미만의 길이를 갖는 링커의 경우, IL-2 분비에 영향을 미치지 않았으나, IFN-γ 분비에 영향을 미쳐 감소시켰다.
10.5. T 분화 변화의 검출: 유세포 분석에 의한 계수
T 세포 활성화 동안, 다수의 사이토카인 및 다른 케모카인이 방출되었고, 신호가 사이토카인 또는 케모카인 수용체를 통해 핵으로 형질도입 되어, T 세포의 분화를 조절하였다. T 세포는 원시 T 세포(미감작)에서 중심 기억 T 세포(Tcm)로, 다음으로 효과기 기억 T 세포(Tem)로, 마지막으로 효과기 T 세포(Teff)로 분화한다. 그러나, 생체 내 T 세포의 증식 및 지속성은 중심 기억 T 세포(Tcm)로 분화되고 그리고 효과기 기억 T 세포(Tem)로 분화되는 T 세포의 수에 영향을 받는다. 기억 T 세포는 줄기 세포 T 세포, 중심 기억 T 세포 및 효과기 기억 T 세포로 분류될 수 있다. 중심 기억 T 세포의 분화 비율은 생체 내에서의 T 세포의 지속적 사멸 효과에 영향을 미친다. 효과기 T 세포에 대한 원시 T 세포의 비는 생체 내 T 세포의 종양-사멸 효과 및 지속성에 영향을 미친다. T 세포 표면에서의 CD45RA 및 CCR7의 발현을 유세포 분석을 통해 검출하였고, 이에 따라 T 세포의 분화를 알 수 있었다. T 세포를 7일 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션하고, 원심분리하고, 30분 동안 항-인간-CD45RA-Percp-cy5.5 및 항-인간-CCR7-APC 유동 항체로 염색하고, 다시 원심분리하고, PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정하였고, T 세포의 분화를 유세포 분석을 통해 검출하였다.
유세포 분석의 결과에 따르면, G4S 링커-함유 공동자극 엔도도메인이 α 또는 β 불변 영역의 엔도메인이 결실되어 있는 구조에 연결되는 경우, 수득된 α-del-(G4S)3-OX40이 중심 기억 T 세포로의 상당히 분화했음을 나타내고, 한편 α(α-del-OX40) 또는 β(β-del-OX40) 불변 영역의 엔도메인에 직접적으로 연결된 OX40을 가진 구조는 또한 도 21 및 표 16에 나타난 바와 같이 중앙 기억 T 세포의 분화를 촉진한다는 것을 보여준다. 동시에, 다양한 변형 구조를 갖는 mut-STAR T 세포의 효과기 T 세포의 수가 mut-STAR의 효과기 T 세포의 수 보다 상당히 낮았지만, 각각의 미감작 T 세포의 비율은 각각 도 22 및 표 17에 나타난 바와 같이, mut-STAR의 것(28.3%) 보다 상당히 높았다. 종양 사멸 결과, ELISA 결과 및 유세포 분석을 통한 세포 분화 검출 결과를 조합하면, (G4S)3 링커를 통해 OX40 엔도도메인에 연결되고, α 또는 β 불변 영역의 엔도도메인이 결실된 mut-STAR는, 종양 사멸 효과 및 IL-2 분비에 영향을 미치지 않으면서 T 세포의 기억 세포 집단의 분화를 상당히 개선할 수 있다.
[표 12]
상이한 링커를 통해 Ox40에 연결된 α 사슬을 갖는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 표적 세포 사멸의 효과
[표 13]
상이한 링커를 통해 Ox40에 연결된 β 사슬을 갖는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 표적 세포 사멸의 효과
[표 14]
상이한 링커를 통해 Ox40에 연결된 α 사슬을 갖는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 IL-2 분비
[표 15]
상이한 링커를 통해 Ox40에 연결된 α 사슬을 갖는 STAR와 표적 세포의 공동 배양 후의 IFN-α 분비
[표 16]
상이한 링커를 통해 Ox40에 연결된 α 사슬을 갖는 STAR의 중심 기억 T 세포 분화에 대한 효과
[표 17]
상이한 링커를 통해 Ox40에 연결된 α 사슬을 갖는 STAR의 T 세포 분화에 대한 효과
11. 돌연변이 STAR-T 세포의 기능에 대한, 막관통 도메인 또는 엔도도메인에서 TCR 세포내이입 관련 라이신의 아르기닌으로의 변형의 효과
11.1. T 세포 및 표적 세포에 대한 시험관 내 공동 배양 방법
표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포는 현탁 세포였고, 공동 인큐베이션을 위해, 상응하는 수의 세포를 취하여 표적 세포 배지와 혼합하였고, 배양을 위해 원심분리하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 1차 T 세포를 패키징되고 정제된 WT-STAR 및 mut-STAR T 바이러스로 감염시켰고, 공동 배양 1일 전에, 감염 효율은 유세포 분석에 의해 검출하였고, 효과기 세포 대 표적 세포의 비를 결정하였고, 공동-인큐베이션은 1:1 또는 2:1의 비로 통상적으로 수행하였고, 또한, 표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포를 7일 동안 공동-인큐베이션하여 세포 증식에 있어서 수의 변화를 관찰하였다. T 세포의 총 수를 감염 효율에 기초하여 계산하였고, 표적 세포의 일반적인 용량은 1×105/웰(96-웰 플레이트)이었다.
11.2. 표적 항원에 의한 T 세포의 자극
본 발명의 표적은 일반적으로 세포 표면 단백질이고, 이것은 T세포의 기능을 검출하기 위한 목적으로 T 세포를 활성화시키기 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 특히 표적 항원에 양성 T세포를 1×105/웰로 통상적으로 첨가하고, 원심분리하고, 24시간 동안 활성화하여, T 세포 기능을 검출하기 위해 사용할 세포 현탁액 또는 배양 상청액을 수집하였다.
11.3. T 세포 사멸 기능 검증: 루시퍼라제 검정
T 세포를 상이한 시간 동안 표적 세포와 함께 공동배양하였고, 그 다음 세포 현탁액을 부드럽고 균일하게 취입하였고, 웰당 150μL의 세포 현탁액을 취하여, 백색 96웰 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 1500 rpm/분의 속도로 원심분리 하였고, 상청액을 취하였고, 세포용해물을 첨가하여 15분 동안 실온에서 용해시켰고, 4℃에서 4000 rpm/분 속도로 15분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상청액을 2개의 평행 웰의 각 웰을 이용하여 취하였고, 루시퍼라제 기질(반딧불이 루시퍼라제 검정 시약)을 첨가하였다. 그 다음, 게인 값(gain value)을 100으로 설정한 다기능 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 화학발광 값을 얻었다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% -(웰당 효과기 세포-표적 세포 값/웰당 대조군 세포-표적 세포 값).
루시퍼라제 검정을 이용한 T 세포 사멸 기능 시험의 검출 결과에 따르면, T 세포 대 표적 세포의 E:T비가 2:1 또는 1:1일 때, 막관통 도메인 또는 엔도도메인에서 TCR 세포내이입과 관련된 라이신이 아르기닌으로 변형되어 있는 mut-STAR,즉 ub-STAR의 종양 세포 사멸 효과는 도 23 및 표 18에 나타난 바와 같이, mut-STAR T 세포의 종양 세포 사멸 효과 보다 상당히 낮았다.
11.4. T 세포의 사이토카인 분비에 대한 분석: ELISA
T 세포 활성화 동안에, TNF-α, IFN-γ 및 IL-2과 같은 다수의 사이토카인이 방출되어, T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 것을 돕거나 T 세포 자체의 확장을 촉진하였다. T 세포가 표적 세포 또는 항원에 의해 자극된 후, T 세포를 수집하고 원심분리하여 상청액을 취하였다. 사용된 IFN-γ, 및 IL-2 ELISA 키트는 인간 IL-2 미코팅 ELISA 및 인간 IFN-γ 미코팅 ELISA(각각 물품 번호 88-7025, 88-7346 및 88-7316)이었다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: ddH2O를 사용하여 10X 코팅 완충제(coating buffer)를 1X로 희석하고, 코팅된 항체(250X)를 첨가하고, 잘 혼합하고, 96-웰 플레이트에 100 μL/웰 농도로 첨가한다. 플라스틱 랩으로 밀봉하고 4℃에서 밤새 방치 한 후, 1X PBST(세척 완충액(Wash Buffer)으로 지칭하기도 함, 0.05% 트윈 20을 첨가한 1X PBS)를 세척을 위해 매번 260 μL/웰로 3회 사용하였고, ddH2O를 사용하여 5X ELISA/ELISPOT 희석제를 1X로 희석하였고, 200 μL/웰로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 이어서 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 세척을 위해 PBST를 1회 사용하였고, 표준 곡선(각각 2 내지 250, 4 내지 500, 4 내지 500의 범위)에 따라 희석 하였고, 샘플을 1X희석제로 20배 내지 50배 희석하였다. 표준 곡선에 따라 희석된 샘플을 웰당 100 μL 첨가하였고, 2개의 평행 웰을 취하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였고, PBST로 3회 세척하였고, 그 다음 1X희석제로 희석된 검출 항체를 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 세척을 위해 PBST를 3회 사용하였고, 그 다음 1X희석제로 희석한 HRP를 첨가하였고, 30분 동안 인큐베이션 시킨 후, 용액을 6회 세척하였고, 발색을 위해 TMB를 첨가하였고, 발색 시간은 15분 미만이었고, 2N H2SO4를 종결을 위해 첨가하였고, 450 nm에서의 광 흡수를 검출하였다.
ELISA 결과에 따르면, 24시간 동안 T 세포 대 표적 세포의 E:T비를 2:1 또는 1:1로 하여, 표적 세포와 함께 공통 인큐베이션 한 ub-STAR에 의한 IL-2 및 IFN-γ 분비의 수준은 도 24, 25 및 표 19 및 20에 나타난 바와 같이 mut-STAR T 세포의 분비 수준 보다 상당히 낮았다. 여기서 ub-START는, TCR 세포내이입-관련 라이신이 막통과 도메인 또는 엔도도메인에서 아르기닌으로 변형된 mut-STAR이다.
11.5. T 세포 분화 변화의 검출: 유세포 분석에 의한 계수
T 세포 활성화 동안, 다수의 사이토카인 및 다른 케모카인이 방출되었고, 신호는 사이토카인 또는 케모카인 수용체를 통해 핵으로 형질도입 되어, T 세포의 분화를 조절하였다. 생체 내 T 세포의 증식 및 지속성은 중심 기억 T 세포로 분화된 T 세포의 수에 영향을 받았다. 기억 T 세포는 줄기 세포 T 세포, 중심 기억 T 세포 및 효과기 기억 T 세포로 분류될 수 있다. T 세포 표면에서의 CD45RA 및 CCR7의 발현을 유세포 분석을 통해 검출하였고, 이에 따라 T 세포의 분화를 알 수 있었다. T 세포를 7일 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션하고, 원심분리하고, 30분 동안 항-인간-CD45RA-Percp-cy5.5 및 항-인간-CCR7-APC 유동 항체로 염색하고, 다시 원심분리하고, PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정하였고, T 세포의 분화를 유세포 분석을 통해 검출하였다.
유세포분석의 결과에 따르면, 중심 기억 T 세포의 분화에 대해서도, 미감작 T 세포 대 효과기 T 세포의 비에 대해서도, mut-STAR과 ub-STAR는 유의미한 차이를 보이지 않았다. 여기서, ub-STAR는 막통과 도메인 또는 엔도도메인에서 TCR 세포내이입-관련 라이신이 아르기닌으로 변형된 mut-STAR이다. 이 결과는, 막통과 도메인 또는 엔도도메인에서 TCR 세포내이입-관련 라이신의 아르기닌으로의 변형이, 도 26 및 27 및 표 21 및 22에 나타난 바와 같이, mut-STAR T 세포의 분화에 유의미한 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다. 종양 사멸 결과, ELISA 결과 및 세포 분화에 대한 유세포 분석 시험 결과를 조합하면, ub-STAR, 예컨대 막관통 도메인 또는 엔도도메인에서 TCR 세포내이입-관련 라이신이 아르기닌으로 변형된 mut-STAR는 mut-STAR 변형을 촉진하는 효과를 갖지 않음을 알 수 있다.
[표 18]
막관통 도메인 변형을 갖는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 사멸 효과
[표 19]
막관통 도메인 변형을 갖는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 IL-2 분비
[표 20]
막관통 도메인 변형을 갖는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 IFN-γ 분비
[표 21]
중심 기억 STAR-T 세포의 분화에 대한 막관통 도메인 변형의 효과
[표 22]
STAR-T 세포의 분화에 대한 막관통 도메인 변형의 효과
12. STAR-T 세포의 기능에 대한, α 또는 β 불변 영역 엔도도메인에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 자극 영역을 가진 돌연변이체 STAR의 효과
12.1. T 세포 및 표적 세포에 대한 시험관 내 공동 배양 방법
표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포는 현탁 세포였고, 공동 인큐베이션을 위해, 상응하는 수의 세포를 취하여 표적 세포 배지와 혼합하였고, 배양을 위해 원심분리하였다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: 1차 T 세포를 패키징되고 정제된 WT-STAR 및 mut-STAR T 바이러스로 감염시켰고, 공동 배양 1일 전에, 감염 효율은 유세포 분석에 의해 검출하였고, 효과기 세포 대 표적 세포의 비를 결정하였고, 공동-인큐베이션은 1:1 또는 2:1의 비로 통상적으로 수행하였고, 또한, 표적 세포 Raji-루시퍼라제 및 1차 T 세포를 7일 동안 공동-인큐베이션하여 세포 증식에 있어서 수의 변화를 관찰하였다. T 세포의 총 수를 감염 효율에 기초하여 계산하였고, 표적 세포의 일반적인 용량은 1×105/웰(96-웰 플레이트)이었다.
12.2. 표적 항원에 의한 T 세포의 자극
본 발명의 표적은 일반적으로 세포 표면 단백질이고, 이것은 T세포의 기능을 검출하기 위한 목적으로 T 세포를 활성화시키기 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 특히 표적 항원에 양성 T세포를 1×105/웰로 통상적으로 첨가하고, 원심분리하고, 24시간 동안 활성화하여, T 세포 기능을 검출하기 위해 사용할 세포 현탁액 또는 배양 상청액을 수집하였다.
12.3. T 세포 사멸 기능 검증: 루시퍼라제 검정
T 세포를 상이한 시간 동안 표적 세포와 함께 공동배양하였고, 그 다음 세포 현탁액을 부드럽고 균일하게 취입하였고, 웰당 150μL의 세포 현탁액을 취하여, 백색 96웰 플레이트에 첨가하고, 5분 동안 1500 rpm/분의 속도로 원심분리 하였고, 상청액을 취하였고, 세포용해물을 첨가하여 15분 동안 실온에서 용해시켰고, 4℃에서 4000 rpm/분 속도로 15분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상청액을 2개의 평행 웰의 각 웰을 이용하여 취하였고, 루시퍼라제 기질(반딧불이 루시퍼라제 검정 시약)을 첨가하였다. 그 다음, 게인 값(gain value)을 100으로 설정한 다기능 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 화학발광 값을 얻었다. 세포 사멸 계산: 사멸 효율 = 100% -(웰당 효과기 세포-표적 세포 값/웰당 대조군 세포-표적 세포 값).
루시퍼라제 검정에 의한 T 세포 사멸 기능 시험의 검출 결과에 따르면, 상이한 사이토카인 수용체 자극 영역이, T 세포 대 표적 세포의 E:T 비를 2:1로 하여, 돌연변이체 STAR의 α 또는 β 영역 엔도도메인에 연결되었을 때, β-IL-2Rb, α-IL-2Rb,α-IL-7RA 및 α-IL21R은 모두 mut-STAR와 유사한 사멸 효과를 나타내었고, 한편 β-IL2RbQ, α-IL2RbQ 및 α-IL7RAQ는 도 28 및 표 23에 나타난 바와 같이 mut-STAR 보다 상당히 낮은 종양 사멸 효과를 보였다. 또한, 상이한 사이토카인 수용체 자극 영역에 연결된 돌연변이체 STAR의 사멸 효과를 검출하였고, 도 29 및 표 24에 나타난 바와 같이 2:1 및 1:1 E:T 비의 α-del-(G4S) 3-OX40-STAR의 사멸 효과와 비교하였다. α-IL7RA의 사멸 효과는 α-del-(G4S)3-OX40-STAR의 사멸 효과보다 약간 낮았고, 다른 사이토카인 수용체 구조체에 연결된 STAR의 사멸 효과는 α-del-(G4S)3-OX40-STAR의 사멸 효과 보다 상당히 낮았다.
12.4. T 세포의 사이토카인 분비에 대한 분석: ELISA
T 세포 활성화 동안에, TNF-α, IFN-γ 및 Il-2과 같은 다수의 사이토카인이 방출되어, T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 것을 돕거나 T 세포 자체의 확장을 촉진하였다. T 세포가 표적 세포 또는 항원에 의해 자극된 후, T 세포를 수집하고 원심분리하여 상청액을 취하였다. 사용된 IFN-γ, 및 IL-2 ELISA 키트는 인간 IL-2 미코팅 ELISA 및 인간 IFN-γ 미코팅 ELISA(각각 물품 번호 88-7025, 88-7346 및 88-7316)이었다. 구체적인 단계는 다음과 같았다: ddH2O를 사용하여 10X 코팅 완충제(coating buffer)를 1X로 희석하고, 코팅된 항체(250X)를 첨가하고, 잘 혼합하고, 96-웰 플레이트에 100 μL/웰 농도로 첨가한다. 플라스틱 랩으로 밀봉하고 4℃에서 밤새 방치 한 후, 1X PBST(세척 완충액(Wash Buffer)으로 지칭하기도 함, 0.05% 트윈 20을 첨가한 1X PBS)를 세척을 위해 매번 260 μL/웰로 3회 사용하였고, ddH2O를 사용하여 5X ELISA/ELISPOT 희석제를 1X로 희석하였고, 200 μL/웰로 96웰 플레이트에 첨가하였고, 이어서 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 세척을 위해 PBST를 1회 사용하였고, 표준 곡선(각각 2 내지 250, 4 내지 500, 4 내지 500의 범위)에 따라 희석 하였고, 샘플을 1X희석제로 20배 내지 50배 희석하였다. 표준 곡선에 따라 희석된 샘플을 웰당 100 μL 첨가하였고, 2개의 평행 웰을 취하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였고, PBST로 3회 세척하였고, 그 다음 1X희석제로 희석된 검출 항체를 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 세척을 위해 PBST를 3회 사용하였고, 그 다음 1X희석제로 희석한 HRP를 첨가하였고, 30분 동안 인큐베이션 시킨 후, 용액을 6회 세척하였고, 발색을 위해 TMB를 첨가하였고, 발색 시간은 15분 미만이었고, 2N H2SO4를 종결을 위해 첨가하였고, 450 nm에서의 광 흡수를 검출하였다.
ELISA 결과에 따르면, T 세포가 24시간 동안 표적 세포와 함께 1: 1 또는 1: 2 E: T 비로 인큐베이션 되었을 때, β-IL-2Rb의 IL-2 분비는 mut-STAR의 IL-2 분비 보다 상당히 높았고, α-IL-2RbQ, β-IL-2RbQ 및 α-IL-7RAQ의 IL-2 분비는 유사한 수준을 보였고, α-IL-2RbQ의 IL-2 분비는 도 30 및 표 25에 나타난 바와 같이 mut-STAR의 IL-2분비 보다 상당히 낮았다. β-IL-2Rb의 IFN-γ 분비는 mut-STAR의 IFN-γ 분비 보다 상당히 높았고, 다른 구조들의 IFN-γ 분비는 도 31 및 표 26에 나타난 바와 같이, mut-STAR의 IFN-γ 분비 보다 상당히 낮았다.
12.5. T 분화 변화의 검출: 유세포 분석에 의한 계수
T 세포 활성화 동안, 다수의 사이토카인 및 다른 케모카인이 방출되었고, 신호는 사이토카인 또는 케모카인 수용체를 통해 핵으로 형질도입 되어, T 세포의 분화를 조절하였다. 생체 내 T 세포의 증식 및 지속성은 중심 기억 T 세포로 분화된 T 세포의 수에 영향을 받았다. 기억 T 세포는 줄기 세포 T 세포, 중심 기억 T 세포 및 효과기 기억 T 세포로 분류될 수 있다. T 세포 표면에서의 CD45RA 및 CCR7의 발현을 유세포 분석을 통해 검출하였고, 이에 따라 T 세포의 분화를 알 수 있었다. T 세포를 7일 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션하고, 원심분리하고, 30분 동안 항-인간-CD45RA-Percp-cy5.5 및 항-인간-CCR7-APC 유동 항체로 염색하고, 다시 원심분리하고, PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정하였고, T 세포의 분화를 유세포 분석을 통해 검출하였다.
중심 기억 T 세포의 분화 및 미감작 T 세포 대 효과기 T 세포의 비율의 관점에서, α 또는 β 불변 영역 엔도도메인에 연결된 상이한 사이토카인 수용체 자극 영역을 갖는 돌연변이체 STAR는 다양한 차이를 나타내었는데, α-IL-2Rb, β-IL-2Rb, α-IL-2RbQ 및 β-IL-2RbQ는 mut-STAR와 비교하여 유의미한 차이를 보이지 않았고, α-IL-7RA, α-IL-7RAQ 및 α-IL-21R은 도 32 및 33, 및 표 27 및 28에 나타난 바와 같이 mut-STAR과 비교하여 유의미한 차이가 보이지 않았다. 상기 결과에 따르면, 상이한 사이토카인 수용체 자극 영역이 돌연변이체 STAR의 α 또는 β 불변 영역 엔도도메인에 연결되었을 때, mut-STAR T 세포의 분화에 상당한 영향을 끼쳤다.
[표 23]
그 α사슬이 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인에 연결되어 있는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 사멸 효과
[표 24]
그 α사슬이 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인에 연결되어 있는 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 사멸 효과
[표 25]
그 α사슬이 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인에 연결된 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 IL-2 분비
[표 26]
그 α사슬이 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인에 연결된 STAR와 표적 세포를 공동 배양한 후의 IFN-γ 분비
[표 27]
그 α사슬이 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인에 연결된 STAR의, 중심 기억 T 세포 분화에 대한 효과
[표 28]
그 α사슬이 상이한 사이토카인 수용체 자극 도메인에 연결된 STAR의, T 세포의 분화에 대한 효과
13. 다양한 STAR-유사 T 세포의 생체 내 증식 및 항-종양 능력의 평가
1) 실험 동물 모델
본 실험에서, NSG 면역결핍 마우스를 모델로서 사용하였다. 마우스 유전자형은 T 세포, B 세포 및 NK 세포가 결여된 NOD-Prkdcem26Il2rgem26/Nju이었고, 이의 대식세포 및 수지상 세포 또한 결핍되었다. NSG 마우스는 현재 가장 완전히 면역결핍된 마우스 균주였고, 이는 이식된 종양 및 T 세포를 거부하지 않기 때문에, T 세포 요법의 전임상 연구에서 널리 사용된다. 본 실험에서, 6주령 내지 8주령의 암컷 NSG 마우스를 사용하였고, 각각의 배치에서 마우스의 중량 차이를 2g 내로 제어하였다. 마우스를 특정 병원체를 갖지 않는(SPF) 장벽 내측의 독립적으로 환기된 케이지에 두었고, 병원체 오염을 예방하기 위해, 약산성 pH의 식수 및 정상식이 제공되었다.
2) 종양 모델의 작제
혈액 종양 모델을 구성함에 있어서, 인간 버킷 림프종 세포주 Raji 세포를 이종이식을 위해 사용하였다. Raji 세포는 렌티바이러스 벡터에 의해 루시퍼라제 유전자를 발현하는 세포 균주였고, Raji 종양의 발생 및 변화를 마우스 생체 내에서 플루오레세인 화학발광 및 영상화를 통해 추적 관찰하였다. 이 모델에서, 상이한 용량(일반적으로 약 1 내지 3 x106 세포)의 Raji-루시퍼라제 세포를 매트릭스 겔과 혼합하였고, 복강내 주사로 6주령 내지 8주령의 암컷 NSG 마우스에 접종하였다. 3일 후, 마우스의 복강내로 플루오레세인 칼륨 염 용액을 주사하였고, 생체 내 종양 세포의 형광 신호를 생체 내 영상화에 의해 검출하였다. Raji 세포는 마우스에서 빠르게 성장하였고, 복강에서 고형 종양을 생성하였으며, 마우스의 체중 감소와 같은 증상을 유발하였고; 마우스에 대해 요법적 치료를 하지 않았고, 마우스는 Raji 종양의 부담으로 인하여 약 40일 내에 사망하였다.
3) 동물실험 운영
모든 동물 작업은 동물 프로토콜에 따른 승인 후에 수행하였다.
4) 종양 성장을 모니터링하기 위한 수단
본 실험에서, 집락화를 위해 동물에 루시퍼라제 유전자를 가진 종양 세포를 동물에게 주사함으로써, 기본적으로 생체 내 형광 영상을 사용하였다. 효소의 존재 하에 특정 파장을 갖는 광을 방출하는 기질로서의 플루오레세인 칼륨 염 용액을 마우스 복강내에 주사하였고, 생체 내 종양 세포의 형광 신호를 생체내 영상화를 통해 검출하였다. 형광 신호의 정량적 분석을 수행하고, 종양 성장을 정량적으로 반영하기 위해 히트맵을 그렸다.
5) 동물에서 T 세포 활성 및 증폭을 검출하기 위한 방법
생체내 T 세포의 생존 및 확장은 최종 항-종양 효과와 직접적으로 관련된다. 동물에서 T 세포의 활성 및 증식을 검출하기 위해, 혈액 샘플을 정기적으로 마우스로부터 수집하고, 말초 혈액에서 STAR-T 세포의 비율, 세포 상태 및 세포 그룹화를 분석하였다. 구체적인 작업은 다음과 같다: 3일 내지 4일 마다, 마우스를 아이소플루란으로 마취하였고, 약 100 uL의 혈액을 마우스 안와로부터 수집하였다. 혈액 샘플은 항응고, 혈장 수집 및 적혈구 절단을 거친 다음, 나머지 세포에 대해 유동염색을 실시하여, CD4 대 Cd8의 비 및 CCR7, CD45RA, PD-1, LAG-3 및 TIM-3과 같은 분자들을 검출하였고, 검출된 것들은 T 세포 서브세트 분석 및 세포 상태 분석을 위해 사용되었다. 동시에, 마우스의 말초 혈액의 STAR-T 세포의 절대 수를 유세포 분석 또는 디지털 PCR에 의해 얻었다. 또한, 실험의 말기에, 마우스를 해부하여 마우스의 다른 면역 기관에 있는 T 세포의 비율을 검출할 수 있다.
6) 동물에서 T 세포 안전성을 평가하기 위한 방법
STAR-T 세포의 세포독성 및 안전성을 평가하기 위해, STAR-T 세포가 실험 동물에 대해 부작용을 유발시켰는지를 조사하였다. 마우스의 거동 상태를 관찰하고, 마우스의 병리를 분석하고, 마우스의 중요한 기관로부터 취한 절편을 분석함으로써, 재주입된 T 세포가 유의미한 독성을 가졌는지를 평가할 수 있었다. 동시에, 마우스의 비-종양 조직에서 T 세포의 침윤을 분석함으로써, T 세포가 마우스의 비-종양 조직에 대한 표적외 사멸 효과를 나타내는지 여부를 결정할 수 있다. 또한, 마우스 혈액에서 IL-2, IFN-γ, TNF α 또는 IL-6과 같은 사이토카인의 수준을 검출함으로써, T 세포가 계통적인 사이토카인 폭풍을 일으킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있다.
7) T 세포 종양 침윤 능력을 평가하기 위한 방법
T 세포가 종양에 침윤하는 능력은 고형 종양을 극복하기 위한 핵심이다. T 세포의 침윤 능력을 검출하기 위해, 먼저 종양 조직을 분리한 다음, 소화 및 분쇄를 거쳐 단일 세포를 수득하고, 얻어진 세포에 유동 염색을 실시하여, 종양 조직에서 T 세포의 비율을 검출하였다. 동시에, 종양 현탁액으로부터 밀도 구배 원심분리(예컨대 퍼콜(Percoll) 구배, 피콜(Ficoll) 구배 등)를 통하여 종양 세포, 종양 기질 세포 및 면역 세포를 추가로 분리할 수 있다. 이를 통해, 정제된 종양-침윤 T 세포를 얻고, 이들의 케모카인 수용체 발현, T 세포 고갈 등과 같은 특징들을 서열분석 및 다른 방법에 의해 상세히 분석할 수 있다.
8) 결과
위에 기술한 시험관 내 기능의 평가 결과에 따라, 5×105 Raji-루시퍼라제 종양 세포를 꼬리 정맥을 통해 6 주령 내지 8 주령의 NCG 암컷 마우스에 접종하여 마우스 종양 모델을 구성하였고(도 34), αβ OX40-STAR 또는 mut-STAR T 세포를 발현하는 생체 내 기능을 추가로 평가하였다. 6일차에, 종양을 갖는 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다: A: PBS 주사 그룹(동일한 부피의 PBS가 주사됨); B: mut-STAR T 세포 주사 그룹; C: αβ OX40-STAR T 세포 주사 그룹; D: BBz-CAR-T 세포 주사 그룹. B/C/D 그룹의 마우스에, 꼬리 정맥 주사를 통해, 5x10 5 TCR T 세포를 주사하였고, 그룹 A의 마우스에 동일한 용적의 200 μL PBS를 주사하였다. 다음 몇 주 내에, 종양 세포 성장, 생체 내 TCR T 세포 증식 및 마우스 생존을 모니터링하였다. 도 34 및 도 35에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여, 실시예에서 작제된 αβ OX40-STAR T 및 mut-STAR T 세포는 종양을 보유한 마우스의 생존 시간을 상당히 연장시킬 수 있고, 종양이 사라지고 난 후 상이한 시점에 종양 세포를 마우스에 재주한 후에도, αβ OX40-STAR T 및 mut-STAR T는 종양 세포를 적절하게 제거할 수 있고, αβ OX40-STAR T의 효과는 mut-STAR T의 효과보다 우수하고, αβ OX40-STAR T 그룹에 속하는 마우스의 생존 시간은 STAR-T 그룹 및 CAR-T 그룹에 속하는 마우스의 생존 시간 보다 길었다. 또한, 도 36에 나타난 바와 같이, STAR-T 그룹과 비교하여, αβ OX40-STAR T 세포의 생체 내 증식 효과는 STAR-T 세포의 생체 내 증식 효과 보다 더 우수하였고, 종양 재주입의 경우에, αβ OX40-STAR T 세포에서 약간의 증식이 발생하였으나, STAR-T 세포에서는 증식이 발생하지 않았다. 상기 동물 실험의 결과에 기초하여, αβ OX40-STAR 구조의 시험관 내 및 생체 내 효과가 mut-STAR의 효과 보다 더 우수하다는 것을 발견할 수 있었다.
위에 기술한 시험관 내 기능의 평가 결과에 따라, 2×106 Raji-루시퍼라제 종양 세포를 복강내 주입을 통해 6 주령 내지 8 주령의 NCG 암컷 마우스에 접종하여 마우스 종양 모델을 구성하였고(도 37), 상이한 효과를 발현하는 mut-STAR T 세포의 생체 내 기능을 추가로 평가하였다. 8일차에, 종양을 보유한 마우스를 7개의 그룹으로 나누었다: A: PBS 주사 그룹(동일한 부피의 PBS가 주사됨); B: 이중-car; C: 이중-STAR-T 세포 주사 그룹; D: αβOX40-STAR T 세포 주사 그룹; E: α-del- OX40-STAR-T 세포 주사 그룹; F: α-del-(G4S)3-OX40-STAR-T 세포 주사 그룹; 및 G: α-IL7R-STAR-T 세포 주사 그룹. B/C/D/E/F/G 그룹의 마우스에, 꼬리 정맥을 통해, 5x106 TCR T 세포를 주사하였고, A그룹의 마우스에 동일한 용적의 200 μL PBS를 주사하였다. 다음 몇 주 내에, 종양 세포 성장, 생체 내 STAR-T 세포 증식 및 마우스 생존을 모니터링하였다. 도 37에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여, 본 실시예에서 작제된 α-del-(G4S)3-OX40-STAR-T 세포는 종양 보유 마우스의 종양 세포를 상당히 사멸시킬 수 있었고, 그 효과는 다른 그룹에 비해 우수하였다. 위에 기재한 동물 실험의 결과에 기초하여, α-del-(G4S)3-OX40-STAR 구조의 시험관 내 및 생체 내 효과가 mut-STAR의 효과 보다 더 우수하다는 것을 발견할 수 있었다.
실시예 2: 개선된 TCR
1. 불변 영역 돌연변이를 갖는 돌연변이체 및 T 세포 수용체의 설계
외인성 TCR 분자는 T 세포로 전달된 후, T 세포의 내인성 TCR과 불일치하여, 불일치를 형성할 수 있다. 이로 인하여, 한편으로는 TCR 분자의 정확한 페어링 효율을 감소시키고 TCR T 세포의 기능을 약화시킬 수 있고; 다른 한편으로는, 잠재적 표적외 독성을 초래하고 치료의 위험을 증가시킬 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명에 따르면, 야생형 αβ TCR 서열(wtTCR, 도 38에서 좌측)의 불변 영역에서 돌연변이 변형을 일으켜, 각각 cysTCR, hmTCR 및 mut-ohmTCR를 설계하였다(도 38).
1.1. 불변 영역 내에 분자간 이황화 결합이 도입된 cysTCR의 설계
본 발명자들은 TCR α 사슬 불변 영역 내 48번 위치의 트레오닌(Thr)을 시스테인(Cys)으로 변형시켰고, TCR β 사슬 불변 영역 내 56번 위치의 세린(Ser)을 시스테인(Cys)으로 변형시켰다. 새롭게 첨가된 2개의 시스테인은 외인성 TCR의 2개의 사슬(cysTCR, 도 38에서 좌측의 2개) 사이에 이황화 결합을 형성하여, TCR 분자가 더욱 안정된 복합체를 형성하여 더욱 우수한 기능을 얻는 것을 도울 수 있다.
1.2. 뮤린 hmTCR의 설계
TCR α 사슬 및 TCR β 사슬의 불변 영역의 서열은 상이한 종(예컨대 인간과 마우스)에서 고도로 보존된다. 연구에 따르면, 뮤린 TCR 불변 영역은 인간화 된 TCR 불변 영역과 쉽게 불일치를 형성하지 않고, 뮤린 불변 영역은 인간 CD3 분자에 대해 더 높은 친화도를 가져 인간 T 세포에서 더 안정된 복합체를 형성할 수 있고, TCR T 세포의 기능을 크게 개선시킬 수 있다. 따라서, 인간화 된 TCR의 불변 영역 서열을 뮤린 TCR의 불변 영역 서열로 치환하여 뮤린 불변 영역, 예컨대, hmTCR(도 38에서 우측의 2개)을 가진 TCR분자를 구성한다.
1.3. 막관통 소수성 아미노산 치환 및 추가적인 분자간 디설파이드 결합을 갖는 뮤린 mut-ohmTCR의 설계
TCR 분자의 설계를 더욱 최적화하기 위해, hmTCR을 위해 설계된 뮤린 불변 영역을 인간 T 세포에서 TCR 분자의 발현에 적응하도록 코돈 인간화하였다. 동시에, 뮤린 TCR α 사슬 불변 영역 내 48번 위치의 트레오닌(Thr)은 시스테인(Cys)으로 변형되었고, TCR β 사슬 불변 영역 내 56번 위치의 세린(Ser)은 시스테인(Cys)으로 변형되어, 추가적인 분자간 이황화 결합을 형성하였고, 이것은 TCR 분자가 보다 안정된 복합체를 형성하는 것을 도왔다. 또한, 본 연구에서는, TCR α 사슬 막관통 영역에서 111번 내지 119번 위치의 아미노산 영역이 LSVMGLRIL로부터 LLVIVLRIL로 변화되었다. 예컨대, 112번 위치에서 세린(Ser)은 류신(Leu)으로 변형되었고, 114번 위치에서 메티오닌(Met)은 이소류신(Ile)으로 변형되었고, 115번 위치에서 글리신(Gly)은 발린(Val)으로 변형되었다. 이로 인하여 막관통 영역의 소수성이 증가되고, TCR 막관통 영역에 의해 운반된 양전하에 의해 야기되는 불안정성이 상쇄되고, 세포막 상에서 TCR 분자가 더욱 안정된다. 그로 인하여 더 나은 기능을 얻게 된다. 따라서, 이러한 3가지 아이디어(도 38의 우측)을 조합하여 mut-ohmTCR 구조를 설계하였고, TCR T 세포의 기능을 개선하였다.
2. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 갖는 TCR-CD3 분자의 설계
TCR T 세포의 생체 내 증식능력, 유효 생존시간 및 종양 미세환경으로 침투하여 표적 세포를 효율적으로 사멸시키는 능력을 향상시키기 위하여, 본 연발명자들은 TCR-CD3 복합체를 변형하여 새로운 구조를 설계하였다. TCR-T의 임상 반응을 개선하여 지속적인 치료 효과를 달성하기 위해 필요에 따라 맞춤형 강화 TCR-CD3 세포를 활성화였다.
2.1. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 포함하는 TCR 분자(장갑-TCR)의 설계
TCR은 모든 T 세포 표면에 존재하는 특수한 마커였으며, 이는 αβTCR 및 γδ TCR로 나뉜다. 이들은 상응하는 T 세포: αβ T 세포 및 γδ T 세포를 가진다. 본 발명자들은 αβ T 세포 및 γ δ T 세포의 성능을 개선하기 위해 공동자극 신호를 이용하여 αβ TCR 및 γδ TCR를 각각 변형하였다.
전체 T 세포의 90% 내지 95%를 차지하는 αβ T 세포에서, TCR은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬로 구성된다. αβ TCR은 가변 영역 및 불변 영역으로 구성되며, 가변 영역은 항원 인식 및 결합과 같은 다양한 역할을 수행하며, 불변 영역 도메인은 구조적 상호작용 및 신호 전달 역할을 한다. 본 발명에서는, T 세포의 독성 및 증식 지속성을 향상시키기 위해, 인간화 된 공동자극 분자 수용체의 엔도도메인 서열을 αβ-STAR 불변 영역의 C-말단에 도입함으로써(도 39에서 좌측), STAR T 세포의 기능에 대한 영향을 연구하였다. 본 발명의 αβ TCR 불변 영역은 미변형된 wtTCR 불변영역과, 추가적인 분자간 이황화 결합을 갖는 cysTCR 불변 영역, 뮤린 hmTCR 불변 영역 및 하위섹션 1에 기재된 3개의 변형의 조합을 갖는 mut-STAR로 구성된다. 공동자극 신호 전달 구조는 CD40/OX40/ICOS/CD28/4-1BB/CD27의 세포 내 신호 전달 도메인으로 구성된다. 공동자극 엔도도메인은 TCR α 사슬, TCR β 사슬, 또는 TCR α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에 연결될 수 있다. 또한, 공동자극 분자 도메인은 TCR 불변 영역의 C-말단에 직접 또는 G4S/(G4S)n을 통해 연결되거나, TCR 분자의 엔도도메인 서열을 결실시킨 후 TCR 불변 영역의 C-말단에 연결될 수 있다.
γδ T 세포에서, TCR은 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬로 구성되고, γδ T 세포는 TCR δ 사술의 종류에 따라 3 개의 하위군, 예컨대, γδ1, γδ2 및 γ δ 3로 나뉘며, 여기서 상이한 하위군은 인간 신체에서 상이한 분포 보인다. γ δ T 세포는 MHC-제한 방식으로 비-펩티드 항원을 인식하며, 이는 병원체 및 종양의 감시에서 중요한 역할을 한다. 실험에서는 CD28/4-1BB 및 유사한 공동자극 신호가 γ δ T 세포의 활성화 및 증식에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. γ δ T 세포의 성능을 개선하기 위해, 발명자들은 인간 공동자극 분자 수용체의 엔도도메인 서열을 TCR γ 및 TCR δ의 각각의 C-말단에 도입하였다(도 39, 우측).
2.2. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 포함하는 CD3 분자(장갑-CD3)의 설계
CD3 서브유닛은 γ 사슬, δ 사슬, 및 ε 사슬 및 ζ 사슬을 포함하였고, TCR 분자와 함께 T 세포 수용체 복합체를 형성하였으며, 이 복합체는 세포의 상태 및 자극에 대한 반응을 조절하기 위해 엑토도메인으로부터 엔도도메인으로 신호를 전달한다. 향상된 TCR T 세포를 설계하고 생체 내 T 세포의 종양 사멸 능력, 증식 능력 및 생존 시간을 개선하기 위해, 본 발명자들은 CD3 분자를 변형하였다. 이 변형을 위해 인간화 된 공동자극 분자 수용체 엔도도메인을 CD3 γ 사슬, δ 사슬, ε 사슬 및 ζ 사슬(도 40)의 C-말단에 도입하였다. 변형된 CD3 분자는 TCR T 세포에서 발현되어 그 기능을 개선하였다.
3. 공동자극 분자 수용체 엔도도메인 및 그 돌연변이체를 포함하는 TCR의 플라스미드 작제
3.1 플라스미드 공급원
렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 단백질 발현 벡터, 식세포, 렌티바이러스 패키징 플라스미드, 레트로바이러스 패키징 플라스미드 등을 포함하는, 본 발명에서 사용되는 벡터는, 상업 회사로부터 구입하였거나 또는 상업 회사에 의해 합성되었고, 이들 벡터의 전장 서열은 수득되었고, 특이적 절단 부위는 공지되어 있다.
3.2. 단편 공급원
본 발명에서 언급된 TCR은 본 발명에서 사용된 바와 같은 TCR-E 141, TCR-E 315, TCR-E 316을 포함하는 임의의 기능적 TCR일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유전자 단편은 TCR-E141/TCR-E315/TCR-E316의 가변 영역, wtTCR 불변 영역, cysTCR 불변 영역, hmTCR 불변 영역, mut-ohmTCR 불변 영역, 공동자극 수용체 엔도메인, 태그 서열 및 링커 등을 포함하고, 이들 모두는 상업적 회사에 의해 합성되었다. PCR을 통해 하나 이상의 표적 단편을 합성 프라이머에 연결하여, 상응하는 기능적 서열을 얻었다.
3.3 플라스미드 공급원
본 명세서에서 사용되는 렌티바이러스 벡터는 pHAGE-EF1 α-IRES-RFP였는데, 여기서 선형 벡터는 제한 효소 Not I/Nhe I를 사용하여 수득되었고, 유전자 단편은 합성 및 PCR를 통해 수득되었고, 완전한 벡터는 상동 재조합을 통해 수득되었다.
4. 인간 1차 TCR T 세포 및 표적 세포주의 작제
4.1 렌티바이러스 패키징
일정 비율의 무균적으로 추출된 표적 유전자 플라스미드 및 패키징 플라스미드 psPAX2 및 pMD2.G를 PEI(폴리에틸렌이민)와 혼합하였고, Lenti-X 293T 세포를 형질감염시키고, 48시간 및 72시간 시점에서 세포 배양 상청액을 수집하였고, 수집된 상청액을 여과한 후 PEG8000(폴리에틸렌 글리콜, PEG) 과 혼합하였고, 4℃에서 밤새 정치시켰고, 3500 rpm으로 30분 동안 원심분리하였고, 상청액을 버린 후, 적은 양의 배지에 재현탁시켜 농축된 렌티바이러스를 얻었다.
4.2 인간 1차 T 세포의 단리, 배양 및 렌티바이러스 감염
림프구 분리를 위해 사용되는 용액인 피콜(Ficoll)을 사용하여, 지원자의 말초 혈액으로부터 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 단리하였고, EasySep 인간 T 세포 단리 키트(줄기 세포 기술)의 제품 사용 지침에 따라 음성 선택법으로, PBMC로부터 T 세포를 얻었고, 이것을 IL-2(100U/mL)를 함유하는 1640 완전 배지를 사용하여 1x106 세포/mL로 재현탁하였고, 항-CD3/CD28 항체로 코팅된 배양 접시에서 활성화하였다. 활성화 48시간 후, 32℃에서 2시간 동안 1500 rpm으로 원심분리함으로써, 렌티바이러스 시스템을 이용하여 TCR 또는/및 CD3으로 로딩된 바이러스 입자로 T 세포를 감염시키고, 감염된 T 세포를 꺼내어 37℃ 세포 배양 인큐베이터에서 10시간 동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 첨가하여 감염을 종결시켰다. 이 세포를 37℃ 세포 배양 인큐베이터에서 연속적으로 배양하였다. 감염 3일 후, TCR-양성 세포를 유세포분석에 의해 분류하였다.
4.3 세포주의 작제
로그 성장 단계의 Raji 세포를 렌티바이러스 시스템을 사용하여, LMP2-RFP, HLA-A*1101-BSD 및 루시퍼라제-GFP 각각으로 로딩된 바이러스 입자를 이용하여 감염시켰다. 약물 스크리닝 및 유동 분류를 통해, LMP2, HLA-A*1101 분자 및 루시퍼라제를 안정적으로 동시에 발현하는 Raji 세포를 수득하였고, 수득된 세포는 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 세포로 명명하였다.
5. 상이한 불변 영역을 갖는 TCR T 세포의 기능에 대한 공동자극 신호의 효과
공동자극 신호가 생체 내 증식을 향상시키며 TCR T 세포의 종양 살상 효과를 향상시킬 수 있는지 조사하기 위해, OX40, CD40 및 ICOS 엔도도메인을 TCR α 사슬 및 β 사슬의 C-말단에 추가하였다(각각 4개의 상이한 불변 도메인을 갖는 wtE141, cysE141, hmE141, mut-ohmE141). 따라서 플라스미드 wtE141-αβ-OX40, cysE141-αβ-OX40, hmE141-αβ-OX40, mut-ohmE141-αβ-CD40, cysE141-αβ-CD40, hmE141-αβ-CD40, mut-ohmE141-αβ-CD40, wtE141- αβ-ICOS, cysE141-αβ-ICOS, hmE141-αβ-ICOS, mut-ohmE141-αβ-ICOS 및 mut-ohmE141-αβ-ICOS를 구성하였다. 또한, 플라스미드는 또한 상이한 불변 영역을 갖는 TCR-E315 및 TCR-E316의 α 사슬 및 β 사슬의 C-말단에 OX40, CD40 또는 ICOS를 첨가함으로써 작제되었다. 바이러스를 제2 세대 패키징 플라스미드로 패키징하였고, 이것은 이후, 1차 T 세포를 감염시키고 양성 세포를 분류하는데 사용되었다. 분류된 TCR T 세포를, 섹션 5의 방식에 따라 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 세포와 함께 공동배양을 시작하여, 0일로 카운팅하였고, 유세포 분석을 위해 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일째에 각각 배양된 세포를 수집하였다. 이들 중에서, 사용된 배지는 IL-2가 없는 1640 완전 배지였고, TCR T 세포의 초기 수는 1x105 세포이었고, 각 시점에서의 샘플을 독립적으로 인큐베이션하였고, 나머지 공동-인큐베이션된 샘플은 다음날 액체로 반-변화되었고, 표적 세포를 보충하였다. 유세포 분석을 위해 세포를 미리 항-인간 CD3 항체로 염색하였고, 기계에서 분석을 수행시에, 세포의 특정 부피를 수집하여 기록하였고, 시스템에서의 T 세포의 수 및 비는 전환율을 통해 알아냈다(Fig.41A). E141 TCR T 세포의 절대 수의 증식 곡선(도 41A의 좌측)에서 볼 수 있듯이, TCR 불변 영역의 C-말단에 OX40 수용체가 추가되어 있는 TCR T 세포는 표적 세포 에피토프를 인식한 후 더 나은 활성 및 증식을 보였다. 또한, 시스템에서(도 41A, 우측), T 세포와 잔여 표적 세포의 분율을 분석한 결과, OX40가 첨가된 TCR T 세포가, mut-ohmE141 TCR T 세포에 대하여, 더 강한 종양 제거 능력을 나타낸다는 것과, 공동자극 신호가 T 세포의 기능을 상당히 향상시킨다는 것을 발견하였다. 또한, CD40 또는 ICOS가 첨가된 TCR-E141에 대해 장기간 시험관 내 공동 배양을 실시한 결과, 키메라 공동자극 신호가 세포 증식을 상당히 개선하고 T 세포의 종양 사멸 능력을 향상시킬 수 있다는 것이 드러났다. TCR을 TCR-E315(도 41B) 및 TCR-E316로 대체한 경우에도, 유사한 결과를 얻었다. 상기 실험 결과에 따르면, TCR의 C-말단에서 OX40, CD40 및 ICOS과 같은 공동자극 도메인 중 엔도도메인을 융합하는 경우 TCR T 세포의 증식 능력 및 종양 세포 사멸 능력을 상당히 향상시킬 수 있음을 드러났다. 그 중에서도, 공동자극 도메인의 엔도도메인을 mut-ohm TCR의 불변 영역에 첨가했을 때, 상응하는 TCR T 세포의 증식 능력 및 사멸 능력이 가장 크게 개선되였다.
6. TCR T 세포 기능에 대한 상이한 공동자극 신호의 효과
상이한 공동자극 신호에 의해 변형된 TCR T 세포의 성능을 비교하기 위해, 4-1BB, CD28, ICOS, OX40, OX40, CD27 및 CD40 분자의 엔도도메인을 각각 mut-ohm 141 TCR 불변 영역의 C-말단에 첨가하고, 이어서, 작제된 mut-ohm E141-αβ-4-1BB, mut-ohm E141-αβ-CD28, mut-ohm E141-αβ-ICOS, mut-ohm E141-αβ-OX40, mut-ohm E141-αβ-CD27, mut-ohm E141-αβ-CD27, mut-ohm E141-αβ-CD40 TCR T 세포를, 섹션 5의 공동-배양 방식에 따라, Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 세포와 함께 공동배양하고, 시스템 내 T 세포의 수 및 비율을 유세포분석에 의해 분석하였다. T 세포의 절대 수의 증식 곡선 및 E:T 비율(도 42A)의 결과로부터, TCR 불변 영역의 C-말단에 CD40, OX40, ICOS 또는 CD28이 첨가된 TCR T 세포는, 공동자극 신호 변형 없이, mut-ohm E141-αβ-wt와 비하여, 우수한 활성 및 증식 능력 그리고 크게 개선 된 사멸 능력을 가진다는 것을 알 수 있었다. 이들 중에서, CD40 및 Ox40이 첨가된 TCR T 세포의 경우에, 활성, 증식 및 종양 제거 능력이 더욱 크게 개선되었다. 또한, 마찬가지로, α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에서 본 실시예에 기재된 공동자극 분자에 연결된 TCR-E315 및 TCR-E316 플라스미드를 작제하였고, TCR T 세포의 표적 세포 사멸 능력에 대한, 상이한 공동자극 분자의 영향을 분석하였다. 그 결과는 다음과 같다. 즉, TCR-E141과 유사한 결과를 TCR-E315(도 42B) 및 TCR-E316에 의해 얻을 수 있었다. 이것은 상응하는 TCR T 세포의 증식 능력 및 표적 세포 사멸 능력이, 기능적 TCR 불변 영역 중의 임의의 불변 영역의 C-말단에서 공동자극 신호를 선택적으로 키메라화하는 경우, 크게 증가될 수 있음을 나타낸다. 이에 기초하여, TCR T 세포는 TCR C-말단에서 공동자극 신호 또는 다른 기능적 도메인을 키메라화함으로써 TCR T 세포의 성능을 개선하기 위한 요건에 따라 맞춤화될 수 있다.
7. 장갑-TCR T 세포의 기능에 대한 TCR 분자의(G4S)n 링커 및 엔도도메인 서열의 효과
(G4S)n 링커는 단백질 조작에서, 융합 분자에 더 나은 유연성으로 제공함으로써 기능을 개선하기 위해 널리 이용되었다. 공동자극 수용체 엔도도메인을 통합시키는 TCR 분자의 기능을 더욱 개선하기 위해, 융합 단백질 장갑-TCR 분자의 기능에 대한(G4S)n 링커의 영향를 연구하였다. Mut-ohm E141-αβ-G4S-OX40 플라스미드 및 mut-ohm E141-αβ-(G4S)3-OX40 플라스미드는, 공동자극 수용체 도메인과 mut-ohm E141 TCR 분자의 C-말단 사이에 1개 또는 3개의 G4S 링커를 도입함으로써 작제되었고, 또한, mut-ohm E141-αβ-delC-G4S-OX40 플라스미드 및 mut-ohm E141-αβ-delC-(G4S) 3-OX40 플라스미드는 mut-ohm TCR αβ 불변 영역의 C-말단에서 엔도도메인을 결실시키고, 이후 1개 또는 3개의 G4S 링커를 통해 공동자극 수용체 도메인에 연결함으로써 설계되었다. 마찬가지로, 링커를 mut-ohm E141-αβ-CD40,mut-ohm E141-αβ-ICOS 뿐만 아니라 OX40, CD40 및 ICOS 변형을 갖는 TCR-E315 및 TCR-E316에 도입하여, 상응하는 플라스미드를 작제하였다. 제2 세대 패키징 플라스미드로 Lenti-X 293T의 형질감염 수행 후, 바이러스를 수득하였고, 이를 사용하여 1차 T 세포를 감염시키고, 양성 세포를 분류하였다. 분류된 TCR T 세포를, 섹션 5의 방식에 따라 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 세포와 함께 공동배양을 시작하여, 0일로 카운팅하였고, 유세포 분석을 위해 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일째에 각각 배양된 세포를 수집하였다. TCR 불변 영역의 C-말단과 OX40 엔도도메인 사이에 1개 또는 3개의 G4S 링커를 도입함으로써 TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력을 증가시킬 수 있고, TCR 불변 영역의 C-말단에서 세포 내 아미노산을 결실시킴으로서, 링커가 첨가되지 않은 mut-ohm E141-αβ-wt에 비하여, TCR T 세포의 기능을 더욱 개선시킬 수 있다는 것을, T 세포 절대 수의 증식 곡선 및 E:T 비율로부터 알 수 있다(도 43A). OX40을 CD40 또는 ICOS로 추가로 대체하였을 때, 대조군 그룹인 mut-ohm E141-αβ-CD40 및 mut-ohm E141-αβ-ICOS와 비교하여, 위에 기재된 변형 이후에, TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력이 크게 향상되었다. 한편, TCR-E315(도 43B) 및 TCR-E316으로부터도 유사한 결과를 얻었다.
8. TCR T 세포의 기능에 대한, 상이한 TCR 사슬에 공동자극 구조를 연결했을 때의 효과
상이한 TCR 사슬에 대한 공동자극 도메인을 연결했을 때의 T 세포 기능에 대한 영향를 조사하기 위해, 4-1BB 및 OX40의 엔도도메인을 TCR α 사슬의 C-말단에 첨가하거나, 또는 TCR β 사슬 또는 TCR α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에 첨가하여, 다음과 같이 플라스미드를 작제하였다: mut-ohm E141-α-4-1BB, mut-ohm E141-β-4-1BB, mut-ohm E141-α-4-1BB, mut-ohm E141-α-OX40, mut-ohm E141-β-OX40 및 mut-ohm E141-αβ-OX40. 마찬가지로, TCR-E315 및 TCR-E316의 상이한 사슬에 첨가된 OX40 또는 4-1BB 엔도도메인을 갖는 플라스미드를 또한 작제하였다. 바이러스를 제2 세대 패키징 플라스미드로 패키징하였고, 이것은 이후, 1차 T 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. TCR-양성 T 세포를, 섹션 5의 방식에 따라 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 세포와 함께 공동배양을 시작하여, 0일로 카운팅하였고, 유세포 분석을 위해 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일째에 각각 배양된 세포를 수집하였다. T 세포의 절대 수의 증식 곡선 및 E:T 비의 결과(도 44, 도 45; A는 E141, B는 E315)로부터 알 수 있는 바와 같이, 공동자극 신호가 첨가되지 않은 mut-ohm E141-wt와 비교하여, TCR α 또는 β 사슬 불변 영역 중 하나의 C-말단에만 4-1BB 도메인이 도입된 TCR T 세포는, TCR α 및 β 사슬 둘 다의 C-말단에 4-1BB 도메인이 도입된 TCR T 세포 보다 더 양호한 활성화 및 증식을 보여주었고, TCR α 사슬에만 도입된 세포가 TCR β 사슬에만 도입된 세포에 비해 약간 더 양호한 효과를 보여주었다. 대조적으로, 오직 TCR α 사슬 불변 영역의 C-말단에만 OX40 도메인을 도입한 설계는 TCR β 사슬에만 도입한 설계나 두 사슬 모두에 도입한 설계 보다 상당히 우수한 효과를 나타내었다(도 45). 한편, TCR-E315 및 TCR-E316으로부터도 유사한 결과를 얻었다. 상기 실험 결과에 따르면, TCR α 사슬의 C-말단에 공동자극 엔도도메인을 도입하는 것이, 표적 세포의 항원성 에피토프의 인식 후 TCR T 세포의 활성화 및 증식을 가장 잘 촉진한다는 것을 알 수 있었다. 이것은, TCR β 사슬에만 또는 TCR α 및 β 사슬 모두에 동시에 공동자극 도메인을 키메라화하는 경우와 비교하여, 사멸 기능이 더 개선된다는 것을 보여준다.
9. TCR T 세포의 기능에 대한, TCR α 사슬의 C-말단에 G 4 S 링커를 포함하는 공동자극 엔도도메인을 연결하는 효과
하위 섹션 6, 7 및 8의 결과를 조합함으로써, 공동자극 수용체 엔도도메인을 통합하는 장갑-TCR T 세포의 기능을 더욱 향상시키기 위해,공동자극 수용체 엔도도메인을 TCR α 사슬의 C-말단에 직접 연결하거나 또는 세포 내 아미노산을 제거한 후의 TCR α 사슬의 C-말단에 연결할 때, 장갑-TCR T 세포의 기능에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 플라스미드: wtE141-α-OX40, wtE141-α-G4S-OX40, wtE141-α-delC-G4S-OX40, wtE141-αβ-delC-G4S-OX40, hmE141-α-OX40, hmE141-α-G4S-OX40, hmE141-α-delC-G4S-OX40, hmE141-αβ-delC-G4S-OX40, cysE141-α-OX40, cysE141-α-G4S-OX40, cysE141-α-delC-G4S-OX40, cysE141-αβ-delC- OX40 G4S-OX40, mut-ohmE141-α-OX40, mut-ohmE141-α-G4S-OX40, mut-ohmE141-α-delC-G4S-OX40 및 mut-ohmE141-αβ-delC-G4S-OX40를 작제하였다. 플라스미드: CD40 및 ICOS가 첨가된 TCR-E141, 및 TCR-E315, 및 OX40, CD40, 및 ICOS가 첨가된 TCR-E316을 작제하였다. 바이러스를 제2 세대 패키징 플라스미드로 패키징하였고, 이것은 이후, 1차 T 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. TCR-양성 T 세포를, 섹션 5의 방식에 따라 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 세포와 함께 공동배양을 시작하여, 0일로 카운팅하였고, 유세포 분석을 위해 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일째에 각각 배양된 세포를 수집하였다. 위 결과(도 46)는 다음을 보여준다: TCR α 사슬의 C-말단과 공동자극 분자 사이에 하나의 G4S를 도입하면 TCR T 의 증식 및 사멸 능력이 증가하고; 또한, TCR 불변 영역의 C-말단에서 세포 내 아미노산 결실이 발생하는 경우, 링커가 추가 되어 있지 않은 대조군과 비교하여, TCR T 세포 기능을 더욱 향상시킬 수 있다. TCR α와 β 사슬 둘 다에 동시에 키메라 분자가 추가되어 있는 그룹과 비교하여, α 사슬에만 동일한 변형을 가한 경우, 동시에 양쪽 사슬에 변형을 가한 경우 보다도 상당히 나은 효과를 나타내었다. 또한, 대조군과 비교하여 OX40이 CD40 또는 ICOS로 추가로 대체되고 난 후, α 사슬에서 세포 내 아미노산을 제거하고 G4S를 통해 CD40 또는 ICOS에 연결했을 때, TCR T 세포의 증식 및 사멸 능력이 또한 상당히 향상되었다. 한편, TCR-E315 및 TCR-E316으로부터도 유사한 결과를 얻었다.
10. 장갑-TCR T 세포의 생체 내 증식 및 항-종양 능력의 평가
생체 내 공동자극 도메인을 포함하는 TCR T 세포의 증식 및 항-종양 효과를 입증하기 위해, 4×105 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제 종양 세포를 5주령 내지 6주령의 NOD/Scid IL-2R γ null(NCG) 암컷 마우스에 꼬리 정맥 주입으로 접종하여 마우스 종양 모델을 작제하였다(도 47 참조). 제6일째에, 마우스를 하기와 같이 5개의 그룹으로 나누었다: A: PBS 주사 그룹(같은 부피의 PBS가 주사됨); B: mut-ohmE141 TCR T 세포 주사 그룹; C: mut-ohmE141-αβ-OX TCR T 세포 주사 그룹, D: mut-ohmE141-α-OX40 TCR T 세포 주사 그룹, 및 E: mut-ohmE141-αβ-delC-G4S-OX40 TCR T 세포 주사 그룹, 여기서 그룹 B/C/D/E의 마우스는 꼬리 정맥에 4×105 TCR T 세포를 주사하고, 반면 그룹 A의 마우스에는 같은 부피인 200 μL PBS를 주사하였다. 다음 몇 주 내에, 마우스 내 종양 세포 성장, 마우스 내 인간 TCR T 세포 증식 및 마우스 생존을 모니터링하였다. 도 48에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서 작제된 공동분자를 포함하는 TCR T 세포는 대조군에 비하여 마우스 내 증식의 측면에서, 더 양호한 결과를 나타내었다. 또한, 도 47 및 도 49에 도시된 바와 같이, 대조군에 비하여, 본 실시예에서 작제된 themut-ohmE141-α-OX40 TCR T 세포는 종양 보유 마우스의 생존 시간을 상당히 연장시켰고, 따라서 마우스의 생존율을 개선하였다.
11. 장갑-CD3 분자를 발현하는 TCR T 세포의 기능 평가
(1) 시험관 내 기능의 평가
δ 사슬, ε 사슬, γ 사슬 및 ζ 사슬을 포함하는 상이한 CD3 서브유닛의 C-말단에 인간 공동자극 수용체 엔도도메인을 도입했을 경우의, TCR T 세포의 기능에 대한 효과를 비교하기 위해, 본 발명에 따라, CD3 분자를 하기 플라스미드를 작제하도록 변형하였다: CD3δ-4-1BB, CD3δ-CD28, CD3δ-ICOS, CD3δ-OX40, CD3ε-4-1BB, CD3ε-CD28, CD3ε-ICOS, CD3ε-OX40, CD3γ-4-1BB, CD3γ-CD28, CD3γ-ICOS, CD3γ-OX40, CD3ζ-4-1BB, CD3ζ-CD28, CD3ζ-ICOS, 및 CD3ζ-OX40, 여기서 CD3은(G4S)3 링커를 통해 공동자극 수용체 도메인에 연결되었다. 변형된 장갑-CD3 분자 및 cysE141 TCR 분자를 T 세포에서 동시에 발현하였다. 그 다음 유세포 분류에 의해 수득 된 이중 양성 세포를 섹션 5에 따라 Raji-HLA-A*1101-LMP2-루시퍼라제와 함께 공동-배양하고, TCR T 세포의 기능을 평가하였다. 생체 내 T 세포 증식 곡선 및 도 50에 도시된 E:T 비 및 도 51에 도시된 7일째의 E:T 비의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, CD3δ-OX40 분자 또는 CD3γ-ICOS 분자를 발현하는 cysE141 TCR T 세포는 증식 및 사멸 능력 측면에서 장갑-CD3 분자를 가지지 않는 다른 장갑-CD3 TCR T 세포 또는 대조군인 cysE141 TCR T세포 보다 상당히 우수하였다. 동시에, 7일째에 수집된 공동배양 상청액 내의 사이토카인 IFNγ 수준(도 52)으로부터 알 수 있듯이, 장갑-CD3 분자를 가지지 않는 cysE141에 비하여, CD3 δ-OX40 또는 CD3 γ-ICOS의 발현이 cysE141 TCR T 세포의 활성화를 촉진하였다. 한편, TCR-E315 및 TCR-E316으로부터도 유사한 결과를 얻었다.
(2) 생체 내 기능의 평가
상기 실험관 내 기능 평가에 따라, 4×105 Raji-HLA-A*1101-LMP2-luciferase 종양 세포를 5-6주령의 NCG 암컷 마우스의 꼬리 정맥에 접종하여 마우스 종양 모델을 구축하였고(도 53), CD3δ-OX40 분자 또는 CD3γ-ICOS 분자를 발현하는 cysE141 TCR T 세포의 생체 내 기능을 추가로 평가하였다. 6일차에, 종양을 보유한 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다: A: PBS 주사 그룹(동일한 부피의 PBS를 주사함); B: cysE141 TCR T 세포 주사 그룹; C: CD3δ-OX40 cysE141 TCR T 세포 주사 그룹; 및 D: CD3γ-ICOS cysE141 TCR T 세포 주사 그룹, 여기서 B/C/D/E 그룹의 마우스에는 꼬리 정맥을 통해 4x105 TCR T 세포를 주사하였고, A그룹의 마우스에는 동일한 부피의 200 μL PBS를 주사하였다. 다음 몇 주 내에, 종양 세포 성장, 생체 내 TCR T 세포 증식 및 마우스 생존을 모니터링하였다. 도 53 및 도 55에 도시된 바와 같이, 대조군에 비하여, 본 실시예에서 작제된 CD3δ-OX40 cysE141 TCR T 세포는 종양 보유 마우스의 생존 시간을 상당히 연장시켰다. 또한, 도 54에 도시한 바와 같이, 대조군에 비하여, CD3δ-OX40 분자를 발현하는 cysE141 TCR T 세포는 마우스 내에서 더 양호한 증식을 보였다.
12. TCR T 세포 기능에 대한 공동자극 신호의 영향
공동자극 분자가 γδ TCR T 세포의 기능에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 인간 공동자극 분자의 엔도도메인 서열을 TCR γ 사슬의 C-말단, TCR δ 사슬의 C-말단, 그리고 TCR γ 사슬 및 TCR δ 사슬 둘다의 C-말단에 각각 도입하였다. 공동자극 수용체 엔도도메인을 통합하는 γδ TCR T 세포의 기능을 추가로 개선하기 위해, 세포 내 아미노산을 제거하거나 제거하지 않은 채로, TCR γ 사슬 및 δ 사슬의 C-말단에, 직접 또는 G4S 링커를 통해 공동자극 수용체 도메인을 연결하여 하기와 같이 플라스미드를 작제하였다: TCR-G115-γ-OX40，TCR-G115-δ-OX40，TCR-G115-γδ-OX40，TCR-G115-γδ-G4S-OX40，TCR-G115-γδ-delC-G4S-OX40. 바이러스를 제2 세대 패키징 플라스미드로 패키징하였고, 이것은 이후, 1차 T 세포를 감염시키고 양성 세포를 분류하는데 사용되었다. 분류한 γδ TCR T 세포를 효과기 세포로 사용하고, 인간 Daudi 세포(버킷 림프종)를 표적 세포로 사용하였다. IL2 배지 없이, 1640 완전 배지를 사용하여 5:1 E:T 비로 24시간 동안 공동배양을 수행하였다. 작업은 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 방법(Promega)의 지침에 따라 수행하였다. 세포 사멸율은 다음과 같이 계산하였다: 세포 사멸율(%) = [(A 실험 세포 -A 효과기 세포 자발 방출 웰 - A 표적 세포 자발 웰) /(A 표적 세포 자발 최대 방출 웰-A 표적 세포 자발 웰)] × 100%. 또한, 24시간 동안의 공동 배양 후 상청액을 수집하였고, ELISA 키트(Invitrogen)의 지침에 따라 작업을 수행하였고, 상청액 중의 IFN-γ 수준을 검출하였다. 결과(도 56 및 도 57)로 부터 알 수 있듯이, 대조군에 비하여, TCR의 C-말단에 공동자극 분자의 엔도도메인을 갖는 γδ T 세포가 더 강한 종양 제거능을 가졌고, TCR γ 및 δ 사슬 둘 다의 C-말단에 OX40을 도입한 설계는 TCR γ 사슬 및 δ 사슬 중 하나의 C-말단에만 OX40을 도입하는 설계 보다 상당히 더 우수한 능력을 나타냈다. 이러한 도입이 없었던 대조군에 비하여, TCR 불변 영역의 C-말단 사이에 G4S를 도입하고, 세포 내 아미노산을 결실시키고, 공동자극 분자를 도입한 설계는 γδ TCR T 세포의 사멸 능력을 증가시켰다.
실시예 3 불변 영역의 N-말단 변형의 STAR에 대한 영향
1. STAR 수용체 불변 영역 도메인의 설계
본 실시예에서, hSTAR는 인간 TCR 불변 영역을 포함하는 STAR를 지칭하였고, hmct STAR는 실시예 1에 기재된 바와 같이 시스테인 치환 및 막관통 도메인 변형을 갖는 불변 영역을 포함하는 STAR를 지칭하였고, 뮤린 TCR α 사슬 불변 영역은 hmct STAR TCR α(서열번호: 41)이었고, 뮤린 TCR β 사슬 불변 영역은 hmct STAR TCRb(서열번호: 6)이었고. 그 특정 구조는 도 58에 도시되어 있다.
STAR 분자의 설계를 더욱 최적화하기 위해, α 사슬 불변 영역에서의 불변 영역 뮤린화, 시스테인 부위 돌연변이 및 소수성 아미노산 돌연변이에 기초하여, STAR 분자의 불변 영역의 N-말단을 특별히 재배열하여 더 나은 결과를 얻었다. 재배열은, 일부 서열은 결실하고, 일부 서열에 대해서는 인간화 돌연변이를 수행하는 것을 의미한다. 인간화 돌연변이에서 중요한 것은, 임상 적용시 STAR-T 세포가 수용체에 의해 거부될 가능성을 최대한 피하기 위해, STAR 분자의 기능을 보장하면서 STAR 분자내의 비인간 서열을 가능한 한 감소시키는 것이다.
TCR α 사슬 불변 영역의 N-말단에서 18개의 아미노산 재배열의 스케줄(뮤린 서열은 DIQNPEPAVYQLKDPRSQ임)을 아미노산 특성에 기초하여 분석하였는데, 그 결과, 뮤린 및 인간화 서열에서 E6D, K13R, R16K 및 Q18S가 상동성 아미노산 치환에 속하는 반면, P15S 치환은 비극성 아미노산 대 극성 아미노산 치환에 속한다는 것을 발견하였다. 따라서, 이 부위 근처의 단백질이 본질적으로 보존적이지 않고, 그 기능에 영향을 미치지 않으면서 변형될 수 있다는 것을 발견할 수 있었다. 요약하자면, 1번 내지 14번 위치의 아미노산 서열은 유지되고 인간화되었고, 15번 내지 18번 위치의 아미노산은 결실되었다.
TCR β 사슬 불변 영역의 N-말단에서 25개의 아미노산 재배열의 스케줄(뮤린 서열은 DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQK임)을 아미노산 특성에 기초하여 분석하였는데, 그 결과, 뮤린 및 인간화 서열에서 R3K 및 L12V만이 상동성 아미노산 치환이었고, T6F, K9E, S11A, K17E, A21S, N22H 및 K23T는 이종성 아미노산 치환이었다. 따라서, 이들 부위 근처의 단백질이 본질적으로 보존적이지 않고, 그 기능에는 영향을 미치지 않으면서 변형될 수 있다는 것을 발견할 수 있었다. 요약하자면, 1번 내지 16번 위치의 아미노산 서열은 유지되고 인간화되었고, 17번 및 21번 내지 25번 위치의 아미노산은 결실되었다.
N-말단 배열 후, 수득된 TCR α 사슬 불변 영역은 Nrec STAR TCRa(서열번호: 42)이었고, 수득된 TCR β 사슬 불변 영역은 Nrec STAR TCRb(서열번호: 43)이었고, 특정 구조는 도 58에 도시되었다.
2. STAR 공동자극 인자의 설계
1) STAR의 상이한 최적화 방법의 조합
상이한 STAR 기능에 대한 공동자극 인자의 효과를 입증하기 위해, 본래의 최적화되지 않은 STAR 구조(인간 TCR α/β STAR, hSTAR), C-영역이 뮤린화, 시스틴 변형 및 막관통 변형을 갖는 hSTAR에 기초한 hmct STAR, 및 N-말단 변형을 갖는 hmct STAR에 기초한 Nrec STAR가 선택되었다.
2) 공동자극 인자를 포함하는 STAR 구조의 설계
STAR-T 세포의 독성 및 T 세포 증식 지속성을 향상시키기 위해, 본 발명에 따르면, 인간화 된 공동자극 수용체의 엔도도메인 서열을 STAR 불변 영역의 C-말단에 도입하여(도 59) STAR -T 세포 기능에 대한 효과를 연구하였다. 위에 언급한 3개의 구조, 즉 본래의 최적화 되지 않은 STAR 구조(인간 TCR α/β STAR, hSTAR), hSTAR에 기반하여 변형된 hmct STAR 및 N-말단 변형을 갖는 hmct STAR에 기반한 Nrec STAR를 본 발명의 STAR 불변 영역 구조로서 선택하였다. 공동자극 신호 전달 구조는 CD40, OX40, ICOS, CD28, 4-1BB 및 CD27의 세포 내 신호 전달 도메인으로 구성된다. 본 발명에서, 변형은 TCR α 사슬, β 사슬, 및 α 및 β 사슬에서 일어난다. 본 발명에서, 공동자극 분자 변형은 도 60에 도시된 바와 같이 TCR α 및 β 사슬에서 발생하였다.
3. GPC39-표적화 GC33-STAR-T 기능
1) CD19-표적화 항체 서열의 결정
공개된 scFv 서열 FMC63을 GPC3-표적화 항체 중쇄 가변 영역(항-GPC3 GC33 VH, 서열번호: 53) 및 항체 경쇄 가변 영역((항-GPC3 GC33-VL, 서열번호: 52) 으로서 선택하였다.
2) 공동자극 인자를 포함하는 CD19-표적화 STAR 및 벡터의 작제
STAR는 2개의 폴리펩티드 사슬를 포함하였다: 제1 폴리펩티드 사슬은 각각 hSTAR/hmct STAR/Nrec STAR의 TCR bC 사슬과 항-GPC3 FMC63-VL을 융합함으로써 형성되고, 제2 폴리펩티드 사슬은 각각 hSTAR/hmct STAR/Nrec STAR의 TCR aC 사슬과 항-GPC3 GC33 VH를 융합함으로써 형성된다. GM-CSF 신호 펩티드는 양쪽 사슬 모두에서 이용되었다. HSTAR/hmct STAR/Nrec STAR 중에서 2개의 사슬의 서열은 Furin-SGSG-p2A 프로테아제 절단 부위의 폴리펩티드 단편에 의해 연결되었고, 전사된 후, 함께 단백질로 번역되었고, 퓨린 및 p2A에 상응하는 프로테아제에 의해 절단되었고, 최종적으로 2개의 독립적인 단백질 사슬을 생산하였다. 전체 유전자는 제한 엔도뉴클레아제 부위 NheI 및 NotI를 통해 렌티바이러스 발현 벡터 pHAGE 내로 삽입되었다. 벡터는 암피신 내성 유전자, EF 1 α 프로모터 및 IRES-RFP 형광 리포터 유전자에 의해 운반되었다. 하기 플라스미드는 유전자 단편의 클로닝, 조립, 형질전환, 서열분석 및 플라스미드 추출에 의해 수득되었다: GC33-hSTAR, GC33-hmct STAR 및 GC33-Nrec STAR.
공동자극 인자를 포함하는 STAR 벡터의 작제: 3개의 GPC3-표적화 STAR 벡터에 기초하여: 공동자극 인자 CD40, OX40, ICOS, CD28, 41BB 및 CD27을 포함하는 GC33-hSTAR, GC33-hmct STAR 및 GC33-Nrec STAR를 그 위에 작제하고, 상기 서열을 유전자 합성에 의해 얻었다. 공동자극 인자를 PCR을 통해 GC33-hSTAR, GC33-hmct STAR 및 GC33-Nrec STAR 벡터에 첨가하였고, TCR α 및 β 사슬에는 동일한 공동자극 인자를 상동성 재조합에 의해 첨가하였다. GC33-hSTAR- CD40, GC33-hSTAR-OX40, GC33-hSTAR-ICOS, GC33-hSTAR-CD28, GC33-hSTAR-41BB, GC33-hSTAR-CD27, GC33-hmct STAR-CD40, GC33-hmct STAR- OX40, GC33-hmct STAR-ICOS, GC33-hmct STAR-CD28, GC33-hmct STAR-41BB, GC33-hmct STAR-CD27, GC33-Nrec STAR-CD40, GC33-Nrec STAR-OX40, GC33-Nrec STAR-ICOS, GC33-Nrec STAR-CD28, GC33-Nrec STAR-41BB and GC33-Nrec STAR-CD27를 마지막으로 작제하였다.
3) CD19-표적화 STAR 및 공동자극 인자를 포함하는 STAR-T의 사멸능 검출
미감작 T 세포(NC group) 및 하기를 발현하는 T 세포를 24시간 동안 HUH-7-luc 세포와 함께 24-웰 플레이트에서 공동 배양하였다: GC33-hSTAR, GC33-hmct STAR, GC33-Nrec STAR GC33-hSTAR-CD40, GC33-hSTAR-OX40, GC33-hSTAR-ICOS, GC33-hSTAR-CD28, GC33-hSTAR-41BB, GC33-hSTAR-CD27, GC33-hmct STAR-CD40, GC33-hmct STAR- OX40, GC33-hmct STAR-ICOS, GC33-hmct STAR-CD28, GC33-hmct STAR-41BB, GC33-hmct STAR-CD27, GC33-Nrec STAR-CD40, GC33-Nrec STAR-OX40, GC33-Nrec STAR-ICOS, GC33-Nrec STAR-CD28, GC33-Nrec STAR-41BB 및 GC33-Nrec STAR-CD27. T 세포의 양성 수는 각각 RFP 양성률에 따라 각각 4E5로 조정되었고, RAJI-luc 세포의 수는 4E5였고, 총 1 mL의 공동 배양 시스템이었다. 24시간 동안 공동 배양한 후, 세포를 실온에서 1500 rpm로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 부드럽게 폐기한 후, 용해를 위해 실온에서 400 μL의 단백질 용해물을 첨가하여 10분간 진탕하고, EP 튜브로 옮기고, 4℃에서 10분간 12000 rpm로 원심분리하고, 웰당 20 μL만큼씩 각 샘플에 대해 2개의 다중 웰에 취하고, 백색 96-웰 플레이트에 첨가하고, 50 μL 루시퍼라제 기질을 첨가하고, 다기능성 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 형광 값을 검출하였고, 각 그룹에 대해 표적 세포의 사멸을 계산하였다. 결과는 hSTAR의 사멸 효율이 hmct STAR와 Nrec STAR의 사멸 효율 보다 상당히 낮았으며, 그 중에서도 Nrec STAR의 사멸 효율이 가장 높았다. 공동자극 인자를 포함하는 동일한 STAR의 결과에 따르면, OX40 및 ICOS가 STAR의 사멸 효과를 상당히 증가시킬 수 있는 반면, 다른 공동자극 인자는 STAR의 사멸 능력에 대해 유의미한 효과를 나타내지 않았다. 41BB는 STRA의 사멸 기능을 감소시켰으나, 그 차이는 유의미하지 않았다(도 61).
도 4. 공동자극 인자를 포함하는 GPC3-표적화 STAR 및 STAR-T의 핵 RelB 수준의 검출
다음과 같은 바이러스를 얻었다: GC33-hSTAR, GC33-hmct STAR, GC33-Nrec STAR, GC33-hSTAR-CD40, GC33-hSTAR-OX40, GC33-hSTAR-ICOS, GC33-hSTAR-CD28, GC33-hSTAR-41BB, GC33-hSTAR-CD27, GC33-hmct STAR-CD40, GC33-hmct STAR- OX40, GC33-hmct STAR-ICOS, GC33-hmct STAR-CD28, GC33-hmct STAR-41BB, GC33-hmct STAR-CD27, FMC63-Nrec STAR-CD40, FMC63-Nrec STAR-OX40, FMC63-Nrec STAR-ICOS, FMC63-Nrec STAR-CD28, FMC63-Nrec STAR-41BB 및 FMC63-Nrec STAR-CD27를 MOI=1의 역가로 Jurkat 세포로 감염시켰고, 감염 4일 후, T 세포주를 12-웰 플레이트에서 HUH-7-luc 세포주와 공동 배양하였다. 이 때, STAR-T 세포는 4E6이었고, 표적 세포는 2E5 이었고(표적 세포는 미리 하루 전에 12-웰 플레이트에 접종했음), 6시간 동안 공동 배양 후 핵 단백질의 추출을 위해 세포를 수집하였고, 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 이용하여 핵 RelB 수준을 검출하였다. 그 결과는 핵 RelB 수준이 공동자극 인자가 없는 GC33-hSTAR, GC33-hmct STAR 및 GC33-Nrec STAR 그룹에서 매우 낮았다는 것을 보여주었다. 이것은 미감작 STAR-T 그룹과 일치하는 결과였다. 공동자극 인자를 첨가한 후, CD28을 제외한 다른 공동자극 인자는 핵 RelB 수준을 상당히 증가시켰고, 그 중에서도 41BB는 도 62에 나타난 바와 같이 핵 RelB 수준을 가장 크게 개선시켰다.
4. CD19-표적화 FMC63-STAR-T 기능
1) CD19-표적화 항체 서열의 결정
공개된 scFv 서열 FMC63을 CD19-표적화 항체 중쇄 가변 영역(항-CD19 FMC63-VH, 서열번호: 50) 및 항체 경쇄 가변 영역(항-CD19 FMC63-VL, 서열번호: 51) 으로서 선택하였다.
2) 공동자극 인자를 포함하는 CD19-표적화 STAR 및 벡터의 작제
STAR는 2개의 폴리펩티드 사슬를 포함하였다: 제1 폴리펩티드 사슬은 각각 hSTAR/hmct STAR/Nrec STAR의 TCR bC 사슬과 항-CD19 FMC63-VL을 융합함으로써 형성되고, 제2 폴리펩티드 사슬은 각각 hSTAR/hmct STAR/Nrec STAR의 TCR aC 사슬과 항-CD19 FMC63 VH를 융합함으로써 형성된다. GM-CSFR 신호 펩티드는 양쪽 사슬 모두에서 이용되었다. HSTAR/hmct STAR/Nrec STAR 중에서 2개의 사슬의 서열은 Furin-SGSG-p2A 프로테아제 절단 부위의 폴리펩티드 단편에 의해 연결되고, 전사되고, 함께 단백질로 번역되고, 퓨린 및 p2A에 상응하는 프로테아제에 의해 절단되고, 최종적으로 2개의 독립적인 단백질 사슬을 생산한다. 전체 유전자는 제한 엔도뉴클레아제 부위 NheI 및 NotI를 통해 렌티바이러스 발현 벡터 pHAGE 내로 삽입되었다. 벡터는 암피신 내성 유전자, EF 1 α 프로모터 및 IRES-RFP 형광 리포터 유전자에 의해 운반되었다. 하기 플라스미드는 유전자 단편의 클로닝, 조립, 형질전환, 서열분석 및 플라스미드 추출에 의해 수득되었다: FMC63-hSTAR, FMC63-hmct STAR, FMC63-Nrec STAR.
공동자극 인자를 포함하는 STAR 벡터의 작제: 3개의 CD19-표적화 STAR 벡터인 FMC63-hSTAR, FMC63-hmct STAR 및 FMC63-Nrec STAR를 기반으로 하여, 공동자극 인자인 CD40, OX40, ICOS, CD28, 41BB 및 CD27을 그 위에 작제하고, 상기 서열은 유전자 합성에 의해 얻었다. 공동자극 인자를 PCR을 통해 FMC64-hSTAR, FMC63-hmct STAR 및 FMC63-Nrec STAR 벡터에 첨가하였고, TCR α 및 β 사슬에는 동일한 공동자극 인자를 상동성 재조합에 의해 동시에 첨가하였다. FMC63-hSTAR-CD40, FMC63-hSTAR-OX40, FMC63-hSTAR-ICOS, FMC63-hSTAR-CD28, FMC63-hSTAR-41BB, FMC63-hSTAR-CD27, FMC63-hmct STAR-CD40, FMC63-hmct STAR- OX40, FMC63-hmct STAR-ICOS, FMC63-hmct STAR-CD28, FMC63-hmct STAR-41BB, FMC63-hmct STAR-CD27, FMC63-Nrec STAR-CD40, FMC63-Nrec STAR-OX40, FMC63-Nrec STAR-ICOS, FMC63-Nrec STAR-CD28, FMC63-Nrec STAR-41BB 및 FMC63-Nrec STAR-CD27이 마침내 작제되었다.
3) CD19-표적화 STAR 및 공동자극 인자를 포함하는 STAR-T의 사멸능 검출
미감작 T 세포(NC group), FMC63-hSTAR, FMC63-hmct STAR, FMC63-Nrec STAR, FMC63-hSTAR-CD40, FMC63-hSTAR-OX40, FMC63-hSTAR-ICOS, FMC63-hSTAR-CD28, FMC63-hSTAR-41BB, FMC63-hSTAR-CD27, FMC63-hmct STAR-CD40, FMC63-hmct STAR- OX40, FMC63-hmct STAR-ICOS, FMC63-hmct STAR-CD28, FMC63-hmct STAR-41BB, FMC63-hmct STAR-CD27, FMC63-Nrec STAR-CD40, FMC63-Nrec STAR-OX40, FMC63-Nrec STAR-ICOS, FMC63-Nrec STAR-CD28, FMC63-Nrec STAR-41BB 및 FMC63-Nrec STAR-CD27을 24시간 동안 RAJI-luc 세포와 함께 24-웰 플레이트에서 공동 배양하였다. T 세포의 양성 세포 수는 각각 RFP 양성률에 따라 각각 4E5로 조정되었고, RAJI-luc 세포의 수는 4E5이었고, 총 1 mL의 공동 배양 시스템이었다. 24시간 동안의 공동 배양 후, 공동 배양된 세포를 고르게 혼합하고, 150 μL현탁액을 흡인하고, 70 μL 루시퍼라제 기질을 첨가하고, 어둠 속에서 저속으로 10분 동안 진탕시킨 후, 다기능성 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 형광값을 검출하고, 각 그룹의 표적 세포 사멸 효과를 계산하였다. 결과는 hSTAR의 사멸 효율이 hmct STAR와 Nrec STAR의 사멸 효율 보다 상당히 낮았으며, 그 중에서도 Nrec STAR의 사멸 효율이 가장 높았다. 공동자극 인자를 포함하는 동일한 STAR의 결과에 따르면, OX40 및 ICOS가 STAR의 사멸 효과를 상당히 증가시킬 수 있는 반면, 다른 공동자극 인자는 STAR의 사멸 능력에 대해 유의미한 효과를 나타내지 않았다. 41BB는 사멸 기능을 감소시켰으나, 그 차이는 유의미하지 않았다(도 61).
4) 공동자극 인자를 포함하는 CD19-표적화 STAR 및 STAR-T의 핵 RelB 수준의 검출
다음과 같은 바이러스를 얻었다: FMC63-hSTAR, FMC63-hmct STAR, FMC63-Nrec STAR, FMC63-hSTAR-CD40, FMC63-hSTAR-OX40, FMC63-hSTAR-ICOS, FMC63-hSTAR-CD28, FMC63-hSTAR-41BB, FMC63-hSTAR-CD27, FMC63-hmct STAR-CD40, FMC63-hmct STAR- OX40, FMC63-hmct STAR-ICOS, FMC63-hmct STAR-CD28, FMC63-hmct STAR-41BB, FMC63-hmct STAR-CD27, FMC63-Nrec STAR-CD40, FMC63-Nrec STAR-OX40, FMC63-Nrec STAR-ICOS, FMC63-Nrec STAR-CD28, FMC63-Nrec STAR-41BB 및 FMC63-Nrec STAR-CD27 를 MOI=1의 역가로 Jurkat 세포로 감염시켰고, 감염 4일 후, T 세포주와 CD19 단백질을 12-웰 플레이트(2 μg/mL, 500 μL을 12-웰 플레이트에 코팅하였고, 4℃ 냉장고에서 밤새 정치함)에서 공동배양 하였다. 이 때, STAR-T 세포는 4E6이었고, 표적 세포는 2E5 이었고(표적 세포는 미리 하루 전에 12-웰 플레이트에 접종했음), 6시간 동안 배양 후 핵 단백질의 추출을 위해 세포를 수집하였고, 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 이용하여 핵 RelB 수준을 검출하였다. 그 결과는 핵 RelB 수준이 공동자극 인자가 없는 FMC63-hSTAR, FMC63-hmct STAR 및 FMC63-Nrec STAR 그룹에서 매우 낮다는 것을 보여주었다. 이것은 미감작 STAR-T 그룹과 일치하는 결과였다. 공동자극 인자를 첨가한 후, CD28을 제외한 다른 공동자극 인자는 핵 RelB 수준을 상당히 증가시켰고, 그 중에서도 41BB는 도 62에 나타난 바와 같이 핵 RelB 수준을 가장 크게 개선시켰다.
5. CD19-표적화 334-STAR-T 기능
1) CD19-표적화 항체 서열의 결정
본 발명자들에 의해 개발된 334 항체 서열을 CD19-표적화 항체 중쇄 가변 영역(항-CD19 334-VH, 서열번호: 54) 및 항체 경쇄 가변 영역(항-CD19 334-VL, 서열번호: 55)으로서 선택하였다.
2) 공동자극 인자를 포함하는 CD19-표적화 STAR 및 벡터의 작제
STAR는 2개의 폴리펩티드 사슬를 포함하였다: 제1 폴리펩티드 사슬은 각각 hSTAR/hmct STAR/Nrec STAR의 TCR bC 사슬과 항-CD19 334-VL을 융합함으로써 형성되고, 제2 폴리펩티드 사슬은 각각 hSTAR/hmct STAR/Nrec STAR의 TCR aC 사슬과 항-CD19 GC33 VH를 융합함으로써 형성되었다. GM-CSFR 신호 펩티드는 양쪽 사슬 모두에서 이용되었다. hmct STAR/Nrec STAR의 2개의 사슬 서열은 Furin-SGSG-p2A 프로테아제 절단 부위의 폴리펩티드 단편에 의해 연결되었고, 전사된 후, 함께 단백질로 번역되었고, 퓨린 및 p2A에 상응하는 프로테아제에 의해 절단되고, 최종적으로 2개의 독립적인 단백질 사슬을 생산하였다. 전체 유전자는 제한 엔도뉴클레아제 부위 NheI 및 NotI를 통해 렌티바이러스 발현 벡터 pHAGE 내로 삽입되었다. 벡터는 암피신 내성 유전자, EF 1α 프로모터 및 IRES-RFP 형광 리포터 유전자에 의해 운반되었다. 하기 플라스미드는 유전자 단편의 클로닝, 조립, 형질전환, 서열분석 및 플라스미드 추출에 의해 수득되었다: 334 hmct STAR, 334 Nrec STAR.
공동자극인자를 포함하는 STAR 벡터 작제: CD19를 표적으로 하는 STAR 벡터인 334-hmct STAR 및 334-Nrec STAR를 기반으로 하여, 공동자극인자 OX40을 작제하였고, 유전자 합성을 통해 상기 서열을 얻었다. 공동자극 인자를 PCR을 통해334-hmct STAR and 334-Nrec STAR 벡터에 첨가하였고, TCR α 및 β 사슬에 동일한 공동자극 인자를 상동성 재조합에 의해 동시에 첨가하였다. 최종적으로, 334-hmct STAR-OX40 및 334-Nrec STAR-OX40이 제작되었다.
3) CD19-표적화 STAR 및 공동자극 인자를 포함하는 STAR-T의 사멸능 검출
미감염된 T 세포(NC 그룹), 334-hmct STAR, 334-Nrec STAR, 334-hmct STAR-OX40 및 334-Nrec STAR-OX40을 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 RAJI-luc 세포와 공동배양하였다. T 세포의 양성 세포 수는 각각 RFP 양성률에 따라 각각 4E5로 조정되었고, RAJI-luc 세포의 수는 4E5이었고, 총 1 mL의 공동 배양 시스템이었다. 24시간 동안의 공동 배양 후, 공동 배양된 세포를 고르게 혼합하고, 150 μL현탁액을 흡인하고, 70 μL 루시퍼라제 기질을 첨가하고, 어둠 속에서 저속으로 10분 동안 진탕시킨 후, 다기능성 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 형광값을 검출하고, 각 그룹의 표적 세포 사멸 효과를 계산하였다. 그 결과, hmct STAR의 사멸 효율은 Nrec STAR의 사멸 효율 보다 상당히 낮았으며, Nrec STAR의 사멸 효율이 가장 높았다. 또한, OX40은 STAR의 사멸 효과 및 핵 RelB 수준를 상당히 증가 시킬 수 있다. 도 63 참조.
6. CD19 및 CD 20-이중 표적화 STAR-T 기능
1) CD19 및 CD20을 표적으로 하는 항체 서열 결정
CD19-표적화 항체 중쇄 가변 영역(항-CD19 FMC63-VH, 서열번호 50) 및 항체 경쇄 가변 영역(항-CD19 FMC63-VL, 서열번호 51); CD20-표적화 항체 중쇄 가변 영역(항-CD20 2C6-VH, 서열번호 62) 및 항체 경쇄 가변 영역(항-CD20 2C6-VL, 서열번호 63).
2) 공동자극 인자를 포함하는 CD19 및 CD20을 표적으로 하는 STAR 및 벡터의 구축
STAR는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되었다: 제1 폴리펩티드 사슬은 각각 항-CD20 2C6 VL-(G4S)3-VH를 hmct STAR/Nrec STAR의 TCR bC 사슬에 융합함으로써 형성되고, 제2 폴리펩티드 사슬은 각각nti-CD19 FMC63 VL-(G4S)3-VH를 hmct STAR/Nrec STAR의 TCR aC 사슬과 융합함으로써 형성된다. GM-CSFR 신호 펩티드는 양쪽 사슬 모두에서 이용되었다. hmct STAR/Nrec STAR의 2개의 사슬 서열은 Furin-SGSG-p2A 프로테아제 절단 부위의 폴리펩티드 단편에 의해 연결되었고, 전사된 후, 함께 단백질로 번역되었고, 퓨린 및 p2A에 상응하는 프로테아제에 의해 절단되고, 최종적으로 2개의 독립적인 단백질 사슬을 생산하였다. 전체 유전자는 제한 엔도뉴클레아제 부위 NheI 및 NotI를 통해 렌티바이러스 발현 벡터 pHAGE 내로 삽입되었다. 벡터는 암피신 내성 유전자, EF 1 α 프로모터 및 IRES-RFP 형광 리포터 유전자에 의해 운반되었다. 하기 플라스미드는 유전자 단편의 클로닝, 조립, 형질전환, 서열분석 및 플라스미드 추출에 의해 수득되었다: FMC63-2C6-hmct STAR 및 FMC63-2C6-Nrec STAR.
공동자극인자를 포함하는 STAR 벡터 작제: CD19 및 C20을 표적으로 하는 STAR 벡터인 FMC63-2C6-hmct STAR 및 FMC63-2C6-Nrec STAR를 기반으로 하여, 공동자극인자 OX40을 작제하였고, 유전자 합성을 통해 상기 서열을 얻었다. 공동자극 인자를 PCR을 통해 FMC63-2C6-hmct STAR 및 FMC63-2C6-Nrec STAR 벡터에 첨가하였고, TCR α 및 β 사슬에 동일한 공동자극 인자를 상동성 재조합에 의해 동시에 첨가하였다. 최종적으로, FMC63-2C6-hmct STAR-OX40 및 FMC63-2C6-Nrec STAR-OX40이 작제되었다.
3) CD19 및 CD20을 표적으로 하는 STAR 및 공동자극 인자를 포함하는 STAR-T의 사멸능 검출
미감작된 T 세포(NC 그룹), FMC63-2C6-hmct STAR, FMC63-2C6-Nrec STAR, FMC63-2C6-hmct STAR-OX40 및 FMC63-2C6-Nrec STAR-OX40을 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 RAJI-luc 세포와 공동배양하였다. T 세포의 양성 수는 각각 RFP 양성률에 따라 각각 4E5로 조정되었고, RAJI-luc 세포의 수는 4E5였고, 총 1 mL의 공동 배양 시스템이었다. 24시간 동안의 공동 배양 후, 공동 배양된 세포를 고르게 혼합하고, 150 μL현탁액을 흡인하고, 70 μL 루시퍼라제 기질을 첨가하고, 어둠 속에서 저속으로 10분 동안 진탕시킨 후, 다기능성 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 형광값을 검출하고, 각 그룹의 표적 세포 사멸 효과를 계산하였다. 그 결과, hmct STAR의 사멸 효율은 Nrec STAR의 사멸 효율 보다 상당히 낮았으며, Nrec STAR의 사멸 효율이 가장 높았다. 또한, OX40은 STAR의 사멸 효과 및 핵 RelB 수준을 상당히 증가 시킬 수 있다(도 64 참조).
[서열목록 프리텍스트]
서열번호: 1 야생형 인간 TCR α 불변 영역의 아미노산 서열
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDF KSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLS VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
서열번호: 2 야생형 인간 TCR β 불변 영역의 아미노산 서열
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVST DPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAK PVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVK RKDF*
서열번호: 3 야생형 마우스 TCR α 불변 영역의 아미노산 서열
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
서열번호: 4 야생형 마우스 TCR β 불변 영역의 아미노산 서열
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
서열번호: 5 시스테인 치환을 갖는 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역(마우스 TCRaC-Cys)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLR LWSS
서열번호: 6 시스테인 치환을 갖는 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역(마우스 TCRβC-Cys)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
서열번호: 7 소수성 아미노산 치환을 갖는 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역(마우스 TCRaC-TM9)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRL WSS
서열번호: 8 막관통 도메인에 시스테인 치환을 갖는 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역(마우스 TCRaC-Arg 돌연변이)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLRVAGFNLLMTLRLWSS
서열번호: 9 엔도도메인에 시스테인 치환을 갖는 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역(마우스 TCRβC-Arg 돌연변이)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGRATLYAVLVSTLVVMAMVRRRNS
서열번호: 10 CD40 엔도도메인의 아미노산 서열
KKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISV
서열번호: 11 OX40 엔도도메인의 아미노산 서열
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
서열번호: 12 ICOS 엔도도메인의 아미노산 서열
KKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
서열번호: 13 CD28 엔도도메인의 아미노산 서열
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
서열번호: 14 4-1BB 엔도도메인의 아미노산 서열
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
서열번호: 15 CD27 엔도도메인의 아미노산 서열
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
서열번호: 16 G4S 링커의 아미노산 서열
GGGGS
서열번호: 17 (G4S)2 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGS
서열번호: 18 (G4S)3 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 19 (G4S)4 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 20 (G4S)5 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 21 (G4S)6 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 22 (G4S)7 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 23 (G4S)8 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 24 (G4S)9 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 25 (G4S)10 링커의 아미노산 서열
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
서열번호: 26 시스테인 치환 및 소수성 변형을 갖는 엔도도메인-결실 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역(마우스 TCRαC-del 돌연변이)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
서열번호: 27 시스테인 치환을 갖는 엔도도메인-결실 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역(마우스 TCRβC-del 돌연변이)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
서열번호: 28 인간 CD3γ의 아미노산 서열
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN
서열번호: 29 인간 CD3δ의 아미노산 서열
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK
서열번호: 30 인간 CD3ε의 아미노산 서열
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
서열번호: 31 인간 CD3ζ의 아미노산 서열
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호: 32 인간 IL-2β 수용체 엔도도메인의 아미노산 서열
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
서열번호: 33 인간 IL-7α 수용체 엔도도메인의 아미노산 서열
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
서열번호: 34 인간 IL-21 수용체 엔도도메인의 아미노산 서열
SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS
서열번호: 35 인간 STAT5 활성화 모이어티의 아미노산 서열
YRHQ
서열번호: 36 인간 IL-2β 수용체 엔도도메인 및 인간 STAT5 활성화 모이어티의 아미노산 서열
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGGGGSYRHQ
서열번호: 37 인간 IL-7α 수용체 엔도도메인 및 인간 STAT5 활성화 모이어티의 아미노산 서열
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQGGGGSYRHQ
서열번호: 38 ScFv의 항-CD20의 아미노산 서열
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
서열번호: 39 항-CD19 FMC63 ScFv의 아미노산 서열
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
서열번호: 40 적색 형광 단백질의 아미노산 서열
MASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGA*
서열번호: 41 마우스 TCRaC-Cys-TM9(hmct STAR TCRaC)
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
서열번호: 42 마우스 TCRaC-Cys-TM9-N.Rec(Nrec STAR TCRaC)
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
서열번호: 43 N-말단 변형 및 시스테인 치환을 갖는 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역(마우스 TCRbC-Cys-N.Rec, Nrec STAR TCRbC)
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
> 서열번호: 44 TCR-E141 α 가변 영역의 아미노산 서열
MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQWFHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVLNNNDMRFGAGTRLTVKP
> 서열번호: 45 CR-E141 β 가변 영역의 아미노산 서열
MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQGRWYEQYFGPGTRLTVT
> 서열번호: 46 TCR-E315 α 가변 영역의 아미노산 서열
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAGKTSYDKVIFGPGTSLSVIP
> 서열번호: 47 TCR-E315 β 가변 영역의 아미노산 서열
MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSVFPTSVEQYFGPGTRLTVT
> 서열번호: 48 TCR-E316 α 가변 영역의 아미노산 서열
MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDQSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDEQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMVSGAGGGADGLTFGKGTHLIIQP
> 서열번호: 49 TCR-E316 β 가변 영역의 아미노산 서열
MSNQVLCCVVLCLLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSIGVGLSNTEAFFGQGTRLTVV
서열번호 50 항-CD19 FMC63 VH
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
서열번호 51 항-CD19 FMC63 VL
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
서열번호 52 항-GPC3 GC33 VL
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
서열번호 53 항-GPC3 GC33 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
서열번호 54 항-CD19 334 VH
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKALGFIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAFHPGSGGSAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTFEDSAVYHCTRQLGPDWGQGTLVTVS
서열번호 55 항-CD19 334 VL
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCWQGTQFPWTFGGGTKLEIK
서열번호: 56 막관통 도메인에서 N-말단 변형, 시스테인 치환 및 소수성 변형을 갖는 엔도도메인-결실 마우스 T 세포 수용체 α 사슬 불변 영역
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
서열번호: 57 N-말단 변형 및 시스테인 치환을 갖는 엔도도메인-결실 마우스 T 세포 수용체 β 사슬 불변 영역
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
서열번호: 58 야생형 인간 TCR γ 사슬 불변 영역의 아미노산 서열:
DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
서열번호: 59 야생형 마우스 TCR γ 사슬 불변 영역의 아미노산 서열:
XKRLDADISPKPTIFLPSVAETNLHKTGTYLCLLEKFFPDVIRVYWKEKDGNTILDSQEGDTLKTNDTYMKFSWLTVPERAMGKEHRCIVKHENNKGGADQEIFFPSIKKVAVSTKPTTCWQDKNDVLQLQFTITSAYYTYLLLLLKSVIYLAIISFSLLRRTSVCGNEKKS
서열번호: 60 야생형 인간 TCR δ 사슬 불변 영역의 아미노산 서열:
XSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL*
서열번호: 61 야생형 마우스 TCR δ 사슬 불변 영역의 아미노산 서열
XSQPPAKPSVFIMKNGTNVACLVKDFYPKEVTISLRSSKKIVEFDPAIVISPSGKYSAVKLGQYGDSNSVTCSVQHNSETVHSTDFEPYANSFNNEKLPEPENDTQISEPCYGPRVTVHTEKVNMMSLTVLGLRLLFAKTIAINFLLTVKLFF*
서열번호: 62 항 CD20 2C6 VH
AVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYTMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCTKDNQYGSGSTYGLGVWGQGTLVTVSS
서열번호: 63 항 CD20 2C6 VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSG TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK
Sequence listing <110> China Immunotech (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. Tsinghua University <120> Improved T cell receptor-costimulatory molecule chimera <130> P2021TC1560 <150> 202010377726.2 <151> 2020-05-07 <150> 202010449454.2 <151> 2020-05-25 <150> 202011549176.4 <151> 2020-12-24 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys 1 5 10 15 Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr 20 25 30 Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 35 40 45 Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala 50 55 60 Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser 65 70 75 80 Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp 85 90 95 Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe 100 105 110 Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 115 120 125 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 2 <211> 176 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 65 70 75 80 Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln 85 90 95 Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala 130 135 140 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe 165 170 175 <210> 3 <211> 137 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp Ser Thr Leu 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Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu 130 135 140 Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu 165 170 175 Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala 180 185 190 Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr 195 200 205 Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly 210 215 220 Ala 225 <210> 41 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 41 Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln 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Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met 20 25 30 Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His 35 40 45 Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu 50 55 60 Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His 85 90 95 Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Gln Gly Arg Trp Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr 130 <210> 46 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 46 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 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Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 48 Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe 20 25 30 Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser 35 40 45 Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu 50 55 60 Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr 65 70 75 80 Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn 85 90 95 Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys 100 105 110 Ala Met Val Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly 115 120 125 Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln Pro 130 135 <210> 49 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 49 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 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Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 53 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 54 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Phe His Pro Gly Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Thr Arg Gln Leu Gly Pro Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 55 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu 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Glu Gly Asn Thr Met Lys 50 55 60 Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys 85 90 95 Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val 100 105 110 Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr 115 120 125 Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu 145 150 155 160 Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser 165 170 <210> 59 <211> 172 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 59 Xaa Lys Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu 1 5 10 15 Pro Ser Val Ala Glu Thr Asn Leu His Lys Thr Gly Thr Tyr Leu Cys 20 25 30 Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Arg Val Tyr Trp Lys Glu 35 40 45 Lys Asp Gly Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gln Glu Gly Asp Thr Leu Lys 50 55 60 Thr Asn 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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (65)

  1. 변형된 T 세포 수용체(TCR)로서,
    TCR은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 포함하고; 적어도 하나의 공동자극 분자 엔도도메인은 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 중 적어도 하나의 C-말단에 연결되고;
    TCR α 사슬은 제1 표적 결합 영역 및 제1 불변 영역을 포함하고, TCR β 사슬은 제2 표적 결합 영역 및 제2 불변 영역을 포함하며;
    표적 결합 영역은 항원 결합 영역이고,
    공동자극 분자 엔도도메인은 OX40인, 변형된 TCR.
  2. 제1항에 있어서,
    항원-결합 영역은
    i) 항체;
    ii)수용체; 또는
    iii) 리간드로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  3. 제1항에 있어서,
    TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 중 적어도 하나의 천연 엔도도메인이 결실된, 변형된 TCR.
  4. 제3항에 있어서,
    공동자극 분자 엔도도메인은 천연 엔도도메인이 결실된 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 중 적어도 하나의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결되는, 변형된 TCR.
  5. 제4항에 있어서,
    링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내는, 변형된 TCR.
  6. 제5항에 있어서,
    n은 3인, 변형된 TCR.
  7. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 공동자극 분자의 엔도도메인이 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 중 오직 하나의 C-말단에 연결되는, 변형된 TCR.
  8. 제7항에 있어서,
    적어도 하나의 기능적 도메인이 TCR α 사슬의 C-말단에 연결되는, 변형된 TCR.
  9. 제8항에 있어서,
    TCR α 사슬의 천연 엔도도메인이 결실되어 있는, 변형된 TCR.
  10. 제9항에 있어서,
    공동자극 분자 엔도도메인은 천연 엔도도메인이 결실되어 있는 TCR α 사슬의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된 것인, 변형된 TCR.
  11. 제10항에 있어서,
    링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내는, 변형된 TCR.
  12. 제11항에 있어서,
    n은 3인, 변형된 TCR.
  13. 제7항에 있어서,
    적어도 하나의 공동자극 분자 엔도도메인이 TCR β 사슬의 C-말단에 연결되는, 변형된 TCR.
  14. 제13항에 있어서,
    TCR β 사슬의 천연 엔도도메인이 결실되어 있는, 변형된 TCR.
  15. 제14항에 있어서,
    공동자극 분자 엔도도메인은, 천연 엔도도메인이 결실되어 있는 TCR β 사슬의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된, 변형된 TCR.
  16. 제15항에 있어서,
    링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내는, 변형된 TCR.
  17. 제16항에 있어서,
    n은 3인, 변형된 TCR.
  18. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 공동자극 분자 엔도도메인이 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 각각의 C-말단에 연결되는, 변형된 TCR.
  19. 제18항에 있어서,
    TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 둘 다의 천연 엔도도메인이 결실되어 있는, 변형된 TCR.
  20. 제19항에 있어서,
    공동자극 분자 엔도도메인은, 천연 엔도도메인이 결실되어 있는 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 각각의 C-말단에 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된, 변형된 TCR.
  21. 제20항에 있어서,
    링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내는, 변형된 TCR.
  22. 제21항에 있어서,
    n은 3인, 변형된 TCR.
  23. 제1항에 있어서,
    1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 숫자의 공동자극 분자 엔도도메인이 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬 중에서 선택되는 적어도 하나의 C-말단에 연결되는, 변형된 TCR.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 불변 영역은 천연 인간 TCR α 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR α 사슬 불변 영역인, 변형된 TCR.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 불변 영역은 변형된 TCR α 사슬 불변 영역인, 변형된 TCR.
  26. 제25항에 있어서,
    변형된 TCR α 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 48번 위치의 아미노산 트레오닌(T)이 시스테인(C)으로 돌연변이 된 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  27. 제25항에 있어서,
    변형된 TCR α 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 112번 위치의 아미노산 세린(S)이 류신(L)으로 돌연변이되고, 114번 위치의 아미노산 메티오닌(M)이 이소류신(I)으로 돌연변이 되고, 115번 위치의 아미노산 글리신(G)이 발린(V)으로 돌연변이 된 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  28. 제25항에 있어서,
    변형된 TCR α 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 6번 위치의 아미노산 E는 D로 치환되고, 13번 위치의 K는 R로 치환되며, 15번 내지 18번 위치의 아미노산은 결실되어 있는 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  29. 제25항에 있어서,
    변형된 TCR α 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 48번 위치의 아미노산 트레오닌(T)은 시스테인(C)으로 돌연변이되고, 112번 위치의 아미노산 세린(S)은 류신(L)으로 돌연변이 되고, 114번 위치의 아미노산 메티오닌(M)은 이소류신(I)으로 돌연변이되고, 115번 위치의 아미노산 글리신(G)은 발린(V)으로 돌연변이 된 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  30. 제25항에 있어서,
    변형된 TCR α 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR α 사슬 불변 영역과 비교하여, 6번 위치의 아미노산 E는 D로 치환되고, 13번 위치의 K는 R로 치환되고, 15번 내지 18번 위치의 아미노산은 결실되고, 48번 위치의 아미노산 트레오닌(T)은 시스테인(C)으로 돌연변이되고, 112번 위치의 아미노산 세린(S)은 류신(L)으로 돌연변이 되고, 114번 위치의 아미노산 메티오닌(M)은 이소류신(I)으로 돌연변이 되고, 115번 위치의 아미노산 글리신(G)은 발린(V)으로 돌연변이 된 마우스 TCR α 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 불변 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 8, 26, 41, 42 및 56 중의 하나로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 TCR.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 불변 영역은 천연 인간 TCR β 사슬 불변 영역 또는 천연 마우스 TCR β 사슬 불변 영역인, 변형된 TCR.
  33. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 불변 영역은 변형된 TCR β 사슬 불변 영역인, 변형된 TCR.
  34. 제33항에 있어서,
    변형된 TCR β 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여, 56번 위치의 아미노산 세린(S)이 시스테인(C)으로 돌연변이 된 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  35. 제33항에 있어서,
    변형된 TCR β 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여, 3번 위치의 아미노산 R은 K로 치환되고, 6번 위치의 아미노산 T는 F로 치환되고, 9번 위치의 K는 E로 치환되고, 11번 위치의 S는 A로 치환되고, 12번 위치의 L은 V로 치환되고, 17번 및 21번 내지 25번 위치의 아미노산은 결실된 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  36. 제33항에 있어서,
    변형된 TCR β 사슬 불변 영역은, 야생형 마우스 TCR β 사슬 불변 영역과 비교하여, 56번 위치의 아미노산 세린(S)은 시스테인(C)으로 돌연변이되고, 3번 위치의 아미노산 R은 K로 치환되고, 6번 위치의 아미노산 T는 F로 치환되고, 9번 위치의 K는 E로 치환되고, 11번 위치의 S는 A로 치환되고, 12번 위치의 L은 V로 치환되고, 17번 및 21번 내지 25번 위치의 아미노산은 결실된 마우스 TCR β 사슬 불변 영역으로부터 유래되는, 변형된 TCR.
  37. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 불변 영역은 서열번호: 2, 4, 6, 9, 27, 43 및 57 중의 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 TCR.
  38. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 독립적으로 또는 서로 조합하여 표적 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 TCR.
  39. 제38항에 있어서,
    표적 항원은 암관련 항원이고, 암 관련 항원은 포스파티딜이노시톨 프로테오글리칸 3(GPC3), CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123, CD138, ERbB2(HER2/neu), 암 배아 항원(CEA), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디시알로강글리오시드 GD2, 관 상피 뮤신, gp36, TAG-72, 당지질(glycosphingolipids), β-인간 융모성 성선 자극 호르몬, α 태아 글로불린(AFP), 외인성 렉틴 반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실에스테라아제, mut hsp70- 2. M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스테인, PSMA, 생존 및 텔로머라제, 전립선암 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린 B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메소텔린, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 제시 종양-특이적 펩티드 에피토프, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 매트릭스 항원, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 A(EDA) 및 엑스트라 도메인 B(EDB), 테나신-C의 A1 도메인(TnC A1), 섬유아세포 관련 단백질(fap), CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, Foxp3, B7-1(CD80), B7-2(CD86), GM-CSF, 사이토킨 수용체, 내피인자, 주조직 적합 복합체(MHC) 분자, BCMA, TNFRSF17, SLAMF7, GPRC5D, FKBP11, KAMP3, ITGA8 및 FCRL5로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 변형된 TCR.
  40. 제38항에 있어서,
    제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는
    제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 변형된 TCR.
  41. 제38항에 있어서,
    i) 제1 표적 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하거나; 또는, 제1 표적 결합 영역은 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 제1 표적 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하거나; 또는, 제1 표적 결합 영역은 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하며,
    이로 인해 변형된 TCR은 CD19에 특이적으로 결합하는, 변형된 TCR.
  42. 제38항에 있어서,
    제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체를 포함하거나; 또는
    제2 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체를 포함하거나; 또는
    제1 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 항체 또는 단일 도메인 항체를 포함하고 제2 항원 결합 영역은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일사슬 항체 또는 단일 도메인 항체를 포함하는, 변형된 TCR.
  43. 제42항에 있어서,
    i) 제1 표적 결합 영역 또는 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하거나, 또는 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하거나; 또는
    ii) 제1 표적 결합 영역 또는 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하거나; 또는 제1 표적 결합 영역 및 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하거나; 또는
    iii) 제1 표적 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고, 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호: 55에 나타낸 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 단일사슬 항체를 포함하거나; 또는
    iv) 제1 표적 결합 영역은 서열번호: 54에 나타낸 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55에 나타낸 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고, 제2 표적 결합 영역은 서열번호: 50에 나타낸 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 51에 나타낸 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 사슬 항체를 포함하고;
    이로 인해 변형된 TCR은 CD19에 특이적으로 결합하는, 변형된 TCR.
  44. 제42항에 있어서,
    단일 사슬 항체는 링커에 의해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 변형된 TCR.
  45. 제44항에 있어서,
    링커는 (G4S)n이고, 여기서 n은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내는, 변형된 TCR.
  46. 제45항에 있어서,
    n은 1 또는 3인, 변형된 TCR.
  47. 제42항에 있어서,
    제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 동일한 표적 항원에 결합하는, 변형된 TCR.
  48. 제47항에 있어서,
    제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 동일한 표적 항원의 상이한 영역에 결합하는, 변형된 TCR.
  49. 제42항에 있어서,
    제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 상이한 표적 항원에 결합하는, 변형된 TCR.
  50. 제1항의 변형된 TCR을 포함하는 단리된 생체 외 치료적 면역 세포.
  51. 제50항에 있어서,
    T 세포 또는 Nk세포인 치료적 면역 세포.
  52. 제50항의 치료적 면역 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
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