JP7527284B2

JP7527284B2 - 遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドとその使用

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Publication number: JP7527284B2
Application number: JP2021525140A
Authority: JP
Inventors: チェン、ハイビン; シャン、チョワンヤン; サイ、バオチン; ボコラ、マルコ; シ、シュミン; ホン、ルイメイ; スン、レイ; ボン、ヨンコイ
Original assignee: エンザイマスター（ニンポー）バイオエンジニアリングカンパニー・リミテッド
Priority date: 2018-12-15
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2024-08-02
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: JP2022510783A; CN111321129B; EP3894548A1; WO2020119740A1; US11999976B2; CN111321129A; US20210371829A1; EP3894548A4

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチド及びそれらの用途に関する。

キラルアルコールは広く使用されている化合物である。多くの天然または生物学的に活性な化合物は、キラルアルコール構造を含んでいる。工業生産では、化学的方法及び酵素的方法がキラルアルコールの主な製造方法である。酵素触媒法では、通常、カルボニル化合物を基質として使用し、該カルボニル基質をケト還元酵素(KRED)またはアルコール脱水素酵素(ADH)で非対称還元し、キラルアルコールを得る。該酵素的方法は、その高い選択性、高い変換率、穏やかな反応条件、低いコスト、及び少ない汚染のため、工業上で好まれている。反応機構に関しては、該ケト還元酵素またはアルコール脱水素酵素は、補因子NADHまたはNADPHによって提供される還元力H^-でカルボニル(またはケト)化合物のアルコール化合物への還元を触媒し、前記補因子NADHまたはNADPHは、それぞれNAD+またはNADP+に変換される。該プロセスが行われる間に、NAD+またはNADP+は、NADHまたはNADPHを再生する別の酵素反応によってNADHまたはNADPHに戻すこともできる。通常、NAD+またはNADP+をNADHまたはNADPHにそれぞれ変換する方法は3つある。1つ目は、図1の反応にアルコール化合物を加えることである。このアルコール化合物(イソプロパノール等)を、同じケト還元酵素またはアルコール脱水素酵素でカルボニル化合物(アセトン等)に変換する過程において、NAD+またはNADP+は、それぞれNADHまたはNADPHに還元される。2つ目は、図1の反応にグルコース脱水素酵素及びグルコースを加えることである。グルコース脱水素酵素がグルコースのグルコン酸への変換を触媒する過程において、NAD+またはNADP+は、それぞれNADHまたはNADPHに変換される。3つ目は、図1の反応にギ酸脱水素酵素及びギ酸を加えることである。ギ酸脱水素酵素がギ酸の二酸化炭素への変換を触媒する過程において、NAD+またはNADP+は、それぞれNADHまたはNADPHに変換される。

図1.ケト還元酵素によって触媒されるカルボニル化合物のキラルアルコールへの還元

(R)-(-)-1,3-ブタンジオールは比較的高価なキラルアルコール化合物であり、その合成が困難である。現在、国内市場に必要な高純度の(R)-(-)-1,3-ブタンジオールは輸入に依存している。現在、(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの工業生産は、主に日本のダイセル化学株式会社の方法に代表される化学的方法に基づいている。該方法は、ラネーNi触媒による3-ヒドロキシブチルアルデヒドの水素化から始まり、ラセミ体の1,3-ブタンジオールが得られ、次に、これを分解に供し、それぞれ(R)-(-)-1,3-ブタンジオール及び(S)-(-)-1,3-ブタンジオールを得る。この方法は、面倒な分解と再結晶化の工程を伴い、大量の廃水と固形廃棄物を生成し、高いコスト及び重度の汚染をもたらす。この方法での(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの理論収率は最大50％である。酵素的方法の場合、4-ヒドロキシ-2-ブタノンの(R)-(-)-1,3-ブタンジオールへの不斉変換は、適切なケト還元酵素で最大理論収率100％に達することがある。しかし、これまでに報告されたケト還元酵素またはアルコール脱水素酵素は、4-ヒドロキシ-2-ブタノンの不斉還元に用いて(R)-(-)-1,3-ブタンジオールを製造する際に、活性が低く、安定性が不十分であるため、工業生産には適用できない。

本発明は、高い立体選択性、高い触媒活性及び良好な安定性を有する遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを提供し、これは、キラルアルコール化合物、特に(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの製造に使用することができる。本発明はまた、遺伝子操作されたポリペプチドの遺伝子配列、遺伝子を含む組換え発現ベクター、遺伝子操作された株及びそれらの効率的な産生方法、ならびにキラルアルコール化合物の合成のための、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを使用する反応方法を提供する。

本発明者らは、クリセオバクテリウム属CA49(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic, 102(2014)1-8が文献で報告されている。)に由来する野生型ケト還元酵素ChKRED20が、4-ヒドロキシ-2-ブタノンに対して活性があることを実験的に検証した。補因子NADHの存在下で、ChKRED20は、4-ヒドロキシ-2-ブタノンを(R)-(-)-1,3-ブタンジオールに非対称的に還元することができる。ChKRED20のアミノ酸配列は、配列番号:2として示されている。しかし、ChKRED20の活性と安定性は、工業生産における製造方法の要件を満たしていないため、その性能を改良する必要がある(Applied Microbiology and Biotechnology、100(2016)3567-3575)。工業生産では、酵素の製造は一般に微生物の液体発酵によって実現される。発酵の過程において、標的酵素の産生に加えて、宿主微生物が同時に大量の非標的タンパク質(即ち、汚染タンパク質)を生成する。標的酵素の精製手段として、熱処理によって汚染タンパク質を除去することがしばしば望ましい。熱処理は、酵素溶液を精製するための非常に簡単で効果的かつ経済的な方法であり、汚染タンパク質は、熱処理によって不活性化され、沈殿し、酵素溶液から除去される。熱処理法で精製した酵素溶液を触媒反応に使用することで、反応過程における汚染タンパク質の望ましくない影響を回避するだけでなく、触媒反応後に得られる生成物の分離及び精製方法も、反応中の総タンパク質負荷が劇的に減少するため、大幅に簡素化される。大腸菌を宿主微生物として使用して標的酵素を製造する場合、工業生産条件下で酵素溶液を85℃で加熱することにより、汚染タンパク質を非常に効率的に沈殿させることができることが本発明者らによって検証された。しかし、85℃での酵素溶液の熱処理の前提は、標的酵素が非常に優れた熱安定性を持っているということである。標的酵素の熱安定性が優れているほど、85℃での熱処理に耐える標的酵素が多くなる。キラルアルコール化合物の工業的合成のための良好な熱安定性及び高活性を有するケトン還元酵素を得るために、本発明は、4-ヒドロキシ-2-ブタノンの(R)-(-)-1,3-ブタンジオールへの不斉還元の反応を参照として使用し、酵素指向進化技術を遺伝子操作されたChKRED20に採用した。本発明は、より広いスペクトルの基質に適した、高い安定性、高い活性、高い立体選択性を有する一連の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを開発した。指向進化技術の紹介については、Frances H Arnold氏による「指向進化:生命に新しい化学を持ち込もう」（Angewandte Chemie、2017年11月28日)を参照されたい。Frances H Arnold氏は、酵素指向進化技術への先駆的な貢献により、2018年のノーベル化学賞を受賞した。
図2.ケト還元酵素によって触媒される4-ヒドロキシ-2-ブタノンの(R)-(-)-1,3-ブタンジオールへの変換。これと同時に、同じケト還元酵素によって触媒されるイソプロパノールからアセトンへの変換により、NADHの再生が実現される。

配列番号:2の野生型ケト還元酵素と比較して、本発明によって提供される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、より優れた活性及び／または安定性を有し、非常に高い立体選択性でキラルアルコールを非対称的に合成することができる。特に、本発明によって提供される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、NADHの再生を実現するためにイソプロパノールをアセトンに同時に変換しながら、4-ヒドロキシ-2-ブタノンをより効率的に(R)-(-)-1,3-ブタンジオールに変換することができる(図2)。これらの遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、X10、X16、X18、X20、X22、X30、X35、X38、X39、X42、X46、X52、X53、X54、X60、X64、X65、X73、X78、X80、X86、X93、X94、X97、X104、X114、X125、X126、X134、X140、X141、X142、X150、X152、X153、X164、X169、X173、X184、X185、X187、X190、X201、X204、X206、X211、X216、X218、X224、X228、X235、X239、X244から選択される1つまたは複数の残基位置において配列番号:2の配列とは異なるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、以下の特徴(これらの特徴は、配列番号:2の参照配列へのアミノ酸残基の置換である。)の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を含む：L10V、S16R、S16K、S16N、I18V、L20Q、V22S、G30A、V35A、I38C、I38W、I38V、I38R、N39S、H42P、H42K、H42R、H42T、H42S、A46V、A46T、A52S、A52H、A52G、Q53T、G54N、V60S、V60M、T64I、S65A、S65T、L73M、V78R、I80N、I80K、I86V、I93V、G94R、G94LQ、G94、G94K、G94A、Q97K、Q97R、G104K、G104R、G104P、G104T、G104H、I114V、I114S、Y125F、E126S、E126T、E126A、E126V、G134K、G134H、G134T、G134R、N140V、M141I、M141N、M141T、A142S、A150Y、A150R、A150K、A150Q、A150N、L152Y、S153R、S153N、S153M、S153L、S153Q、V164I、V164L、N169H、E173D、V184T、G185C、G185A、A187G、E190D、M201A、M201E、A204D、A204N、I206A、M211S、M211N、K216R、E218S、V224S、V224T、S228A、M235V、M235I、Y239A、Y239S、Y239D、Y239T、Y239P、G244A、G244T、G244P; または、上記の相違に加えて、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、またはそれ以上のアミノ酸残基の挿入または欠失を含む。

より具体的には、いくつかの実施形態では、配列番号:2よりも改良された前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332に対応する配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332の参照配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。

2つのアミノ酸配列または2つのヌクレオチド配列間の同一性は、当技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムによって得られ、NCBI Blastp及びBlastnソフトウェアを使用するか、Clustal Wアルゴリズム(Nucleic Acid Research, 22(22)：4673-4680,1994) を使用して、デフォルトパラメーターに従って計算できる。例えば、Clustal Wアルゴリズムを使用すると、配列番号:2の配列番号:330に対するアミノ酸配列同一性は95.6％である。

別の態様では、本発明は、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの発現のための１つ以上の対照配列を有する発現ベクターの一部であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331に対応する配列を含むことができる。

当業者に知られているように、ヌクレオチドコドンの縮重のために、配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号:3、5、７、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331に限定されない。本発明の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドのポリヌクレオチド配列はまた、アミノ酸配列配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332をコードする任意の他のポリヌクレオチド配列であってもよい。

別の態様では、本開示は、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする配列、発現ベクター、及び遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを発現できる宿主細胞を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、E.coli等の細菌宿主細胞であり得る。前記宿主細胞は、本明細書に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素を発現及び単離するために使用することができ、あるいは基質を生成物に変換するための反応に直接使用することができる。

いくつかの実施形態では、全細胞、粗抽出物、単離された酵素、または精製された酵素の形態の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、単独で使用され、または樹脂への固定化等の固定された形態で使用され得る。

本開示はまた、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを使用して、式(II)のカルボニル基質を式(I)のキラルアルコール化合物に変換する方法を提供し、
ここで、式(I)のアルコール生成物は、*でマークされたキラル中心に示された立体化学的配置を有し、式(I)のアルコール生成物は、他の異性体よりも鏡像体過剰である。式中、
R¹が、任意に置換されたまたは非置換のアリールまたはヘテロアリール、または任意に置換されたまたは非置換のC₁-C₈ヒドロカルビルであるか、またはシクロアルキルまたは複素環式基であってもよく；
R²が、任意に置換されたまたは非置換のC₁-C₆ヒドロカルビル、ハロゲン(例えば、-F、-Cl、-Br、及び-I)、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、-NO₂、-NO、-SO₂R'または-SOR'、-SR'、-NR'R'、-OR'、-CO₂R'または-COR'、-C(O)NR' 、-SO₂NH₂または-SONH₂、-CN、CF₃であり、ここで、各R'が、-Hまたは(C₁-C₄)ヒドロカルビル、ハロゲン、(C₁-C₈)ヒドロカルビル、(C₂-C₁₂)アルケニル、(C₂-C₁₂)アルキニル、シクロアルキル、アリール、または複素環から独立して選択され、
前記方法は、カルボニル基質をアルコール生成物に変換する適切な反応条件下で、構造式(II)のカルボニル基質をケト還元酵素ポリペプチドと接触させることを含み、ここで、前記ケト還元酵素ポリペプチドは、本明細書に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:2～332の偶数配列識別子である参照配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有し、構造式(II)のカルボニル基質を、配列番号:2と比較してより良好な性能(より高い活性、より高い温度への耐性、より高い有機溶媒濃度への耐性を含む)で構造式(I)のアルコール生成物に変換することができる。

いくつかの実施形態では、式(I)のアルコール生成物は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の鏡像体過剰率で存在する。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のアルコール生成物は、
である。式中、R³が、任意に置換されたまたは非置換のC₁-C₄ヒドロカルビル、-H、ハロゲン(例えば、-F、-Cl、-Br、及び-I)、アリール、ヘテロアリール、-NO₂、-NO、-SO₂R'または-SOR'、-SR'、-NRR'、-OR'、-CO₂R'または-COR'、-C(O)NR'、-SO₂NH₂または-SONH₂、-CN、-CF₃であり、ここで、各R'が、-H、(C₁-C₄)ヒドロカルビル、シクロアルキル、アリールまたは複素環式から独立して選択され、R²が、上記で定義されたとおりであり、式(II)のカルボニル基質は、
である。

いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環のパラ位にある。いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環に対してオルトである。いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環に対してパラ及びメタの両方である。いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環に対してパラ及びオルトの両方である。いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環に対してメタ及びオルトの両方である。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のアルコール生成物は、
であり、ここで、R⁴が、上記のR³と同様に定義され、R³及びR²が、上記で定義されたものであり、構造式(II)のカルボニル基質は、
である。

いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、R³は、フェニル環に対してオルトである。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、鏡像体過剰の、式A2の化合物(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの製造過程において使用され得る：

これらの実施形態では、前記製造過程は、式A1の化合物を式A2の化合物に変換するための適切な反応条件及び補因子の存在下で、式A1の化合物4-ヒドロキシ-2-ブタノンを、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドと接触させたことを含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、式(I)の化合物または式A2の化合物は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する。

これらの方法で使用するための遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの特定の実施形態は、詳細な説明でさらに提供される。上記方法で使用できる遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322に対応するアミノ酸配列から選択される1つまたは複数の配列を含むことができる。

本明細書に開示される遺伝子操作されたポリペプチドを使用して式(I)の化合物または式A2の化合物を製造するための方法のいずれかは、pH、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補因子負荷、補因子のリサイクル過程、圧力及び反応時間の範囲を含む、適切な反応条件下で実施することができるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、以下を含む適切な反応条件下で、式(I)の化合物または式A2の化合物の製造を行ってもよい。(a)化合物(II)の基質またはA1：約1 g/L～500 g/L(b)遺伝子操作されたポリペプチド：約0.1 g/L～50 g/L(c)イソプロパノール：約5 g/L～500 g/L(d)補因子：0.01 g/L～1.0 g/L(e)有機溶媒（4-ヒドロキシ-2-ブタノン、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、またはプロパノールを含むが、これらに限定されない）：0％(v/v)～約99％(v/v)(f)pH：約4.0～約11.0(g)温度：約10℃～60℃。

発明の詳細な説明

1．定義
特に明記しない限り、本開示で使用される技術的及び科学的用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。

「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書において交換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化等)に関係なく、アミド結合によって共有結合された少なくとも2つのアミノ酸のポリマーを示す。該定義には、D-アミノ酸とL-アミノ酸、及びD-アミノ酸とL-アミノ酸の混合物が含まれる。

「遺伝子操作されたケト還元酵素」、「遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチド」、「改良されたケト還元酵素ポリペプチド」及び「遺伝子操作されたポリペプチド」は、本明細書において交換可能に使用される。

ケト還元酵素またはアルコール脱水素酵素は、本明細書において交換可能に使用することができる。

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において交換可能に使用される。

本明細書で使用される「補因子」は、触媒反応において酵素と連動して作用する非タンパク質化合物を指す。本明細書で使用される場合、「補因子」には、NADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)またはNADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩)及びその酸化型NAD+またはNADP+が含まれ、これらは補酵素とも呼ばれる。

「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸(例えば、遺伝子)のその部分を指す。

「自然発生」または「野生型」とは、自然界に見られる形態を指す。例えば、自然発生または野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界の供給源から単離することができ、マニュアルな手順によって意図的に改変されていない、生物に存在する配列である。

例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「組換えの」または「遺伝子操作された」または「天然に存在しない」は、材料または、他の方法では自然界に存在しない方法で改変されているか、またはそれと同一であるが、合成材料から、及び／または組換え技術を使用する操作によって製造または誘導された該材料の天然または天然形態に対応する材料を指す。

「配列同一性」及び「相同性」は、本明細書において交換可能に使用され、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列(「配列同一性」は一般的に百分率で表される)間の比較を指す。これは、比較ウィンドウ上で2つの最適に整列された配列を比較することによって測定される。ここで、該比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、該2つの配列の最適な整列のための参照配列と比較して、追加または欠失(即ち、ギャップ)を含み得る。該百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列に存在するか、または核酸塩基またはアミノ酸残基がギャップと整列して一致する位置の数をもたらす位置の数を測定し、その後、一致した位置の数を該比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて、配列同一性百分率を算出することによって計算できる。当業者が分かるように、2つの配列を整列させるため、多くの確立されたアルゴリズムが利用できる。例えば、局所ホモロジーアルゴリズム（SmithとWaterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482）、相同性整列アルゴリズム（NeedlemanとWunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443）、類似性法の検索（PearsonとLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444）、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装(GCGウィスコンシンパッケージのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)、または目視検査(一般に、分子生物学の現在のプロトコル、FM Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates、Inc.とJohn Wiley＆Sons、Inc.の合弁事業(1995年補足)(Ausubel)を参照)のよって比較するための配列の最適な整列を行うことができる。配列同一性百分率及び配列類似性百分率を測定するのに適したアルゴリズムの例は、Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410及びAltschulら, 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402にそれぞれ記載されているBLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターのウェッブサイトから公開されている。該アルゴリズムでは、最初に、クエリシーケンスにおける長さWの短いワードを特定することにより、高スコアの配列ペア(HSP)を特定する。これは、データベースシーケンスで同じ長さのワードと整列すると、正の値のしきい値スコアTと一致するか満たされる。Tは、近隣ワードスコアしきい値と呼ばれる(Altschulら、Supra)。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次に、ワードヒットは、累積整列スコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ヌクレオチド配列の場合、パラメーターM(一致する残基のペアの報酬スコア;常に>0)及びN(不一致の残基のペナルティスコア;常に<0)を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの拡張は、次の場合に停止される：累積整列スコアは、品質Xによって最大達成値から低下する；1つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積により、累積スコアが0以下になる；または、いずれかの配列の終わりに到達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T、及びXは、整列の感度と速度を決める。ヌクレオチド配列の場合では、BLASTNプログラムは、デフォルトとして、11のワード長(W)、期待値(E)10、M=5、N=-4、及びデフォルト値として両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合では、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)3、期待値(E)10、及びBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff及びHenikoff、1989、Proc Natl Acad Sci USA 89：10915を参照)。配列整列及び配列同一性百分率の例示的な測定では、GCGウィスコンシンソフトウェアパッケージ(Accelryr, Madison WI)中のBESTFITまたはGAPプログラムを用いて、提供されるデフォルトパラメーターを採用することができる。

「参照配列」は、配列比較のベースとして用いられる定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列の断片であってもよい。一般に、参照配列は、長さが少なくとも20個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基、長さが少なくとも25個の残基、長さが少なくとも50個の残基、または核酸またはポリペプチドの全長である。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それぞれ(1)2つの配列間で類似している配列(即ち、完全な配列の一部)を含み、かつ(2)2つの配列間で発散する配列をさらに含むことがあるため、2つ(またはそれ以上)のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較し、配列類似性の局所領域を同定及び比較することによって行われる。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、野生型配列に限定されることを意図せず、遺伝子操作されたまたは改変された配列を含んでもよい。例えば、「配列番号:2に基づくX94に対応する残基にリジンを有する参照配列」は、グリシンである配列番号:2の位置X94にある対応する残基がリジンに変更されている参照配列を指す。

「比較ウィンドウ」は、少なくとも約20個の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、ここで、該配列は、少なくとも20個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較されてもよく、そして、比較ウィンドウ内の配列の部分は、2つの配列の最適な整列のための(追加または欠失を含まない)参照配列と比較して20％以下の追加または欠失(即ち、ギャップ)を含んでもよい。比較ウィンドウは、20個の連続する残基より長くてもよく、任意に30個、40個、50個、100個、またはそれ以上の残基を含む。

所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈において、「対応する」、「参照する」または「対する」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの、指定された参照の残基の付番を指す。言い換えれば、所与の配列の残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置によってではなく、参照配列に関して指定される。例えば、遺伝子操作されたケト還元酵素等の所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して2つの配列間の残基の一致を最適化することにより、参照配列に整列させることができる。これらの場合、ギャップはあるものの、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の付番は、それらが整列されている参照配列に対して行われる。

「アミノ酸の差異」または「残基の差異」は、参照配列の対応する位置のアミノ酸残基に対する、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸の差異の位置は、一般に、本明細書では「Xn」と呼ばれ、ここで、nは、残基の差異が基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号:2と比較した位置X94での残基の差異」は、配列番号:2の位置94に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。従って、配列番号:2の参照ポリペプチドが94位にグリシンを有する場合、「配列番号:2と比較した位置X94での残基の差異」は、配列番号:2の位置94に対応するポリペプチドの位置でのグリシン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、その位置での特定のアミノ酸残基の差異は「XnY」として示され、ここで、「Xn」は、上記のように対応する位置を指し、「Y」は遺伝子操作されたポリペプチド(即ち、参照ポリペプチドとは異なる残基)に見られるアミノ酸の1文字の識別子である。いくつかの例(例えば、表1)では、本開示はまた、従来の表記法「AnB」によって示される特定のアミノ酸の差異を提供し、ここで、Aが、参照配列の残基の1文字の識別子であり、「n」が、参照配列の残基位置の数であり、またBが、遺伝子操作されたポリペプチドの配列における残基置換の1文字の識別子である。いくつかの例では、本開示の遺伝子操作されたポリペプチドは、参照配列に対して1つまたは複数のアミノ酸残基の差異を含んでもよい。これは、参照配列に対して残基の差異が存在する特定の位置のリストで示される。

「欠失」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの改変を指す。欠失は、遺伝子操作されたケト還元酵素の酵素活性を保持し、及び/または遺伝子操作されたケト還元酵素の改良された特性を保持しながら、参照酵素を構成する酵素のアミノ酸総数の最大10％、またはアミノ酸総数の最大20％までの1つまたは複数のアミノ酸、2つ以上のアミノ酸、5つ以上のアミノ酸、10以上のアミノ酸、15以上のアミノ酸、または20以上のアミノ酸を除去することを含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分及び／または末端部分を含んでもよい。様々な実施形態では、欠失は、隣接するセグメントを含んでもよく、または不連続であってもよい。

「挿入」は、参照ポリペプチドから1つまたは複数のアミノ酸を付加することによるポリペプチドの改変を指す。いくつかの実施形態では、改良された遺伝子操作されたケト還元酵素は、天然に存在するケト還元酵素ポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。ポリペプチドの内部に挿入することも、カルボキシル末端またはアミノ末端に挿入することもできる。本明細書で使用される場合、挿入物には、当技術分野で知られている融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであってもよく、または天然に存在するまたは遺伝子操作されたポリペプチドにおいて1つまたは複数のアミノ酸によって分離されてもよい。

本明細書で使用される「断片」は、アミノ末端及び／またはカルボキシル末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、該配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、長さが少なくとも10個のアミノ酸、少なくとも20個のアミノ酸、少なくとも50個のアミノ酸、またはそれ以上、及び完全長のケト還元酵素ポリペプチドの最大70％、80％、90％、95％、98％、及び99％であってもよい。

「単離されたポリペプチド」は、タンパク質、脂質、及びポリヌクレオチド等、それが天然に関連する他の物質から実質的に分離されているポリペプチドを指す。該用語は、それらの天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞またはin vitro合成において)から除去または精製されたポリペプチドを含む。遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、細胞内や細胞培養培地中に存在してもよく、または溶解物または単離された調製物等の様々な形態で調製されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、単離されたポリペプチドであってもよい。

「キラル中心」とは、4つの異なる基をつなぐ炭素原子を指す。

「立体選択性」とは、化学反応または酵素反応において、一方の立体異性体が他方よりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は、部分的であってもよく（一方の立体異性体の形成が他方よりも優先される）、または、1つの立体異性体のみが形成される完全な場合であってもよい。立体異性体がエナンチオマーである場合、該立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれる。2つのエナンチオマーの混合物中の1つのエナンチオマーの過剰分数は、通常、任意に「エナンチオマー過剰」(eeと略す)として報告される。当該分野においては、該分数、典型的には百分率は、一般に、以下の式に従って、そこから誘導されるエナンチオマー過剰(即ち、ee)として報告される：［メジャーエナンチオマー－マイナーエナンチオマー］／［メジャーエナンチオマー＋マイナーエナンチオマー］。

「立体異性体」、「立体異性体形態」、及び同様の表現は、本明細書では互換的に使用され、それらの空間のみにおける原子の配向の差異から生じる全ての異性体を指す。これには、複数のキラル中心を持ち、互いの鏡像ではないエナンチオマー及び化合物(即ち、ジアステレオマー)が含まれる。

「改良された酵素特性」は、野生型ケト還元酵素または別の改良された遺伝子操作されたケト還元酵素等の参照のケト還元酵素と比較して、特定の目的に対してより良好またはより望ましい酵素特性を指す。改良された酵素特性は、本開示において遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドによって示される。改良が期待される酵素特性には、酵素活性(これは基質変換の百分率として表すことができる)、熱安定性、溶媒安定性、pH活性特性、補因子要件、阻害剤に対する耐性(例えば、基質または生成物の阻害)、立体特異性、及び立体選択性が含まれるが、これらに限定されない。

「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的変化を指す。「変換百分率」または「変換率」は、所定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質の百分率を指す。従って、ケト還元酵素ポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換百分率」として表すことができる。該変換率は、一般に、サンプリングし、反応系の生成物の濃度及び基質の濃度を測定することで計算される：{生成物のモル濃度}/{基質のモル濃度+生成物のモル濃度}。

「熱に安定的」とは、ケト還元酵素ポリペプチドが、高温(例えば、72℃以上)に一定期間(例えば、2.5時間以上)曝露された後、野生型酵素と比較して、同様の活性を維持することを意味する。

「溶媒に安定的」または「耐溶媒的」は、ケト還元酵素ポリペプチドが、異なる濃度(例えば、5～99％)の様々な溶媒(メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルtert-ブチルエーテル等)へ一定期間(例：0.5～24時間)で曝露された後に、野生型酵素と比較して、同様の活性を維持することを指す。

「適切な反応条件」は、本開示のケト還元酵素ポリペプチドが基質を望まれる生成物化合物に変換することができる、生体触媒反応系におけるそれらの条件(例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、pH、緩衝液、共溶媒等)を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本開示において提供され、実施例に示される。

「ヒドロカルビル」は、直鎖または分岐脂肪族炭化水素鎖を指す。記号「C」に続く下付き文字の数は、特定の鎖に含まれる可能性のある炭素原子の数を指す。例えば、「C₁～C₈」は、1～8個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。ヒドロカルビル基は、任意に１つまたは複数の置換基で置換されてもよい。「アリール」とは、炭素数6～約20個の一価の芳香族炭化水素基を意味する。「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」は、親芳香環系の１つまたは複数の炭素原子がヘテロ原子(O、N、またはS)で置き換えられているアリール基を指す。「置換」は、特定の基を修飾するために使用される場合、特定の基の1つまたは複数の水素原子が、それぞれ独立して、同一または異なる置換基で置き換えられることを意味する。「置換されたヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール」は、１つまたは複数の水素原子が他の置換基で置き換えられているヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール基を指す。「任意な」または「任意に」とは、説明される事象または状況が発生しても、または発生しなくてもよいことを意味する。例えば、「任意に置換されたアリール」は、置換されても、または置換されなくてもよいアリール基を指す。該説明には、置換されたアリール基と非置換のアリール基の両方が含まれる。

本明細書で使用される場合、「化合物」は、本明細書に開示される化合物で示される構造式及び／または化学名に包含される任意の化合物を指す。化合物を、それらの化学構造及び/または化学名で識別してもよい。化学構造と化学名が矛盾する場合、化学構造が化合物の正体を決める。特に明記または別段に示さない限り、本明細書に記載の化学構造は、記載された化合物の全ての可能な異性体の形態を包含する。

2．遺伝子操作されたケト還元酵素
以下の表１は、本発明で開発された遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを示す。各行は、特定の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドのポリヌクレオチド配列番号及びアミノ酸配列番号、ならびに配列番号:2と比較した残基の差異を示す。例示された各遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの触媒性能(活性、熱安定性、反応系の安定性、生成物に対する立体選択性等を含むがこれらに限定されない、反応の全体的な性能)のレベルは、表2または表3に示される特定の意味とともに「＋」と示される。

表1

表2

実施例2に従って、表2に記載の反応条件中の酵素溶液を調製した。該酵素溶液を熱処理に供せず、それにおけるタンパク質の濃度(周知のブラッドフォード法で測定)は約10 g/Lである。該溶液は、表1中のアミノ酸配列に対応する等量のケト還元酵素ポリペプチドを含む。40℃及び中性のpHで表2中の反応を行った。該反応の操作については、実施例10を参照されたい。

表3

表3中の反応条件に記載されている熱処理された酵素溶液は、表2に記載されている酵素溶液の熱処理によって得られる。該熱処理の操作については、実施例3を参照されたい。40℃及び中性のpHで表3中の反応を行った。該反応の操作については、実施例10を参照されたい。

表1中のアミノ酸配列に対応するケト還元酵素ポリペプチドの熱安定性は異なるため、熱処理後、異なるケト還元酵素ポリペプチドは異なる程度の不活性化を示し、触媒性能の変化をもたらす。このような変更は、表2及び表3に示すように変換に反映される。

3．遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを産生するために使用できるポリヌクレオチド、対照配列、発現ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のケト還元酵素活性を有する遺伝子操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御する1つまたは複数の異種調節配列に連結し、前記遺伝子操作されたポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生成することができる。遺伝子操作されたケト還元酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入し、対応する遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを発現してもよい。

当業者には明らかなように、タンパク質配列の利用可能性及び様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、目的のタンパク質配列をコードする全ての可能なポリヌクレオチドの実例を提供する。同じアミノ酸が選択可能または同義のコドンによってコードされる遺伝暗号の縮重は、非常に多数のポリヌクレオチドの産生を可能にし、それらは全て、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする。従って、特定のアミノ酸配列を決定すると、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で１つまたは複数のコドンを単に修飾することで、任意の数の異なるポリヌクレオチドを産生することができる。この点について、本開示は、表１に列挙された例示的な遺伝子操作されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む、本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかについて、そして、参照により組み込まれる配列表において配列番号:4～332の偶数配列識別子として開示されているポリペプチドのいずれかについて、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって行うことができるポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な改変を具体的に企図している。これらは全て、特に開示されているかまたは公開されていると考えられる。

様々な実施形態では、好ましくは、前記コドンを選択し、組換えタンパク質が産生される宿主細胞を収容する。例えば、細菌に好まれるコドンを用いて細菌における遺伝子を発現し、酵母に好まれるコドンを用いて酵母における遺伝子を発現し、また、哺乳動物に好まれるコドンを用いて哺乳動物の細胞における遺伝子を発現する。

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:4～332の偶数配列識別子である参照配列に対して少なくとも約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。ここで、該ポリペプチドは、ケト還元酵素活性及び1つまたは複数の本明細書に記載の改良された特性（例えば、増加した活性で化合物A1を化合物A2に変換する能力及び／または配列番号:2のポリペプチドより安定であること）を有する。

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、上記の同一性百分率を有し、配列番号:2と比較して1つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本開示は、ケト還元酵素活性を有する遺伝子操作されたポリペプチドを提供する。ここで、該遺伝子操作されたポリペプチドは、配列番号:2の参照配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有し、以下の位置から選択される残基の差異を有する組み合わせを含む：X10、X16、X18、X20、X22、X30、X35、X38、X39、X42、X46、X52、X53、X54、X60、X64、X65、X73、X78、X80、X86、X93、X94、X97、X104、X114、X125、X126、X134、X140、X141、X142、X150、X152、X153、X164、X169、X173、X184、X185、X187、X190、X201、X204、X206、X211、X216、X218、X224、X228、X235、X239、X244。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号:3～331の奇数配列識別子を有する配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルでは、該ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドに対して約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記参照ポリヌクレオチドは、配列番号:3～331の奇数配列識別子を有する配列から選択される。

遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、様々な方法で遺伝子操作されたポリペプチドの発現を可能にするように操作することができる。該方法は、発現を改善するためのコドン最適化による配列のさらなる修飾、追加の対照配列を伴うまたは伴わない適切な発現要素への挿入、及び遺伝子操作されたポリペプチドの発現及び産生に適した宿主細胞への形質転換を含む。

発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましいか、または必要であり得る。
組換えDNA法を使用してポリヌクレオチド及び核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知されている。ガイダンスは以下に提供されている：Sambrookら, 2001, Molecular Cloning:実験マニュアル,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press及び分子生物学の現在のプロトコル, Ausubel. F.ら編集, GreenePub. Associates, 1998, 2010。

別の態様では、本開示はまた、それらが導入される宿主の種類に応じて、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびにプロモーター及びターミネーター、複製起点等の1つまたは複数の発現調節領域を含む組換え発現ベクターに関する。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列または該配列を含む核酸構築物を適切な発現ベクターに挿入することによって発現させることができる。発現ベクターを産生する際に、コード配列は、コード配列が発現のための適切な対照配列に連結されるように、ベクター内に配置される。

前記組換え発現ベクターは、組換えDNA法で便利に使用でき、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらせる任意のベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であってもよい。ベクターの選択は、一般に、導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターは、線状または閉じた環状プラスミドであってもよい。発現ベクターは、自律的に複製するベクターであってもよい。即ち、その複製がプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体等の染色体複製とは独立している染色体外実体として存在するベクター。該ベクターは、自己コピーを確実にするための任意のツールを含んでもよい。あるいは、該ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と複製するベクターであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを一緒に含む単一のベクターまたはプラスミド、あるいは2つ以上のベクターまたはプラスミドを使用してもよい。

本開示の実施形態に有用な多くの発現ベクターが市販されている。例示的な発現ベクターは、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプラスミドpACYC-Duet-1(Novagen)に挿入することによって調製することができる。

別の態様では、本開示は、本開示の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。該ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるケト還元酵素ポリペプチドの発現のための1つまたは複数の対照配列に連結されている。本開示の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現のための宿主細胞は、当技術分野で周知されている。それには、大腸菌、アルスロバクターKNK168、ストレプトマイセス、及びサルモネラ菌細胞等の細菌細胞、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris)等の真菌細胞、ショウジョウバエS2やスポドプテラSf9細胞等の昆虫細胞、CHO、COS、BHK、293、及びBowesメラノーマ細胞等の動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、E.coli BL21(DE3)である。上記宿主細胞は、野生型であってもよく、または宿主細胞のゲノムに運ばれる野生型ケト還元酵素遺伝子のノックアウト等のゲノム編集を介して遺伝子操作された細胞であってもよい。上記宿主細胞に適した培地及び増殖条件は、当技術分野で周知されている。

遺伝子操作されたケト還元酵素を発現するために使用されるポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている様々な方法で細胞に導入することができる。その技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、生体粒子衝撃、リポソーム媒介遺伝子導入、塩化カルシウム遺伝子導入、及びプロトプラスト融合が含まれる。ポリヌクレオチドを細胞に導入する様々な方法は、当業者には明らかである。

4．遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの製造方法
ケト還元酵素をコードするポリヌクレオチドを変異誘発及び／または定向進化に供し、遺伝子操作されたケト還元酵素を開発することができる。定向進化の技術については、「製薬業界のための生体触媒：発見、開発、及び製造」(2009、John Wiley ＆ Sons Asia (Pte) Ltd. ISBN：978-0-470-82314-9)を参照されたい。

遺伝子操作されたポリペプチドの配列が既知の場合、既知の合成方法による標準的な固相法でコードするポリヌクレオチドを調製できる。いくつかの実施形態では、最大約100塩基の断片を別々に合成し、次に(例えば、酵素的または化学的な連結法またはポリメラーゼ媒介法で)連結し、任意の所望の近接している配列を形成することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、例えば、自動合成法で典型的に実施されるように、Beaucageら, 1981, Tet Lett 22:1859-69またはMatthesら,People, 1984, EMBO J. 3:801-05に記載されている古典的なホスホルアミダイト法を用いる化学合成によって調製することができる。該ホスホルアミダイト法によれば、例えば、DNA自動合成機において、オリゴヌクレオチドは、合成され、精製され、徐冷され、連結され、そして適切なベクターにクローン化される。また、本質的に任意の核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから入手可能である。

いくつかの実施形態では、本開示はまた、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを調製または製造するための方法を提供する。ここで、該方法は、ポリペプチドの発現に適した培養条件下で、遺伝子操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現できる宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、該ポリペプチドの調製方法は、ポリペプチドを単離することをさらに含む。遺伝子操作されたポリペプチドを適切な細胞において発現し、タンパク質精製のための１つまたは複数の周知の技術のいずれかを用いて、該宿主細胞及び／または培養培地から単離(または回収)してもよい。タンパク質精製の技術には、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、ろ過、塩析、超遠心分離、及びクロマトグラフィーが含まれる。また、遺伝子操作されたポリペプチドを、in vitro転写＆翻訳(ivTT)システムを介して発現してもよい。

5．遺伝子操作されたケト還元酵素の使用方法及びそれを用いて製造された化合物
別の態様では、本明細書に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、補因子NADHまたはNADPHの存在下でカルボニル化合物をキラルアルコール化合物に変換することができる。本開示はまた、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを使用し、広範囲の化合物(I)またはその構造類似体の製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、式(I)の化合物を製造する過程において遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを使用することができる。

式(I)のアルコールは、*でマークされたキラル中心に示された立体化学的配置を有し、式(I)のアルコールは、他の異性体よりも鏡像体過剰である。式中、
R¹が、任意に置換されたまたは非置換のアリールまたはヘテロアリール、または任意に置換されたまたは非置換のC₁-C₈ヒドロカルビルであり、またはシクロアルキルまたは複素環式であってもよい。R²が、任意に置換されたまたは非置換のC₁-C₆ヒドロカルビル、ハロゲン(例えば、-F、-Cl、-Br、及び-I)、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、-NO₂、-NO、-SO₂R'または-SOR'、-SR'、-NR'R'、-OR'、-CO₂R'または-COR'、-C(O)NR'、-SO₂NH₂または-SONH₂、-CN、CF₃であり、ここで、各R'が、-Hまたは(C₁-C₄)ヒドロカルビル、ハロゲン、C₁-C₈ヒドロカルビル、C₂-C₁₂アルケニル、C₂-C₁₂アルキニル、シクロアルキル、アリールまたは複素環から独立して選択される。

本明細書の方法は、カルボニル基質をアルコール生成物に変換するのに適した反応条件下で、式(II)のカルボニル基質をケト還元酵素ポリペプチドと接触させることを含む。ここで、該ケト還元酵素ポリペプチドは、本明細書に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:2～332の偶数配列識別子に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97 ％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有し、そして、配列番号:2と比較してより良い性能(より高い活性、より高い温度への耐性、より高い有機溶媒濃度への耐性を含む)で式(II)のカルボニル基質を式(I)のアルコール生成物に変換することができる。

いくつかの実施形態では、式(I)のキラルアルコール生成物は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の鏡像体過剰率で存在する。

上記のように、本開示の方法において有用な遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、4-ヒドロキシ-2-ブタノンを(R)-(-)-1,3-ブタンジオールに変換する能力によって特徴付けられ得る。従って、本明細書に開示される方法の実施形態のいずれにおいても、該方法を実行することができる。ここで、該ケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:2よりも優れた触媒性能で4-ヒドロキシ-2-ブタノンを(R)-(-)-1,3-ブタンジオールに変換することができ、そして、配列番号:2～322の偶数配列識別子に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有する。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のアルコール生成物は、
である。式中、R³が、任意に置換されたまたは非置換のC₁-C₄ヒドロカルビル、-H、ハロゲン(例えば、-F、-Cl、-Br、及び-I)、アリール、ヘテロアリール、-NO₂、-NO、-SO₂R'または-SOR'、-SR'、-NR'R'、-OR'、-CO₂R'または-COR'、-C(O)NR'、-SO₂NH₂または-SONH₂、-CN、CF₃であり、ここで、各R'が、-Hまたは(C₁-C₄)ヒドロカルビル、シクロアルキル、アリールまたは複素環から独立して選択される。R²が、上記で定義されたとおりである。また、式(II)のカルボニル基質は、
である。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のアルコール生成物は、
である。式中、R⁴が、上記で定義されたR³である。R³及びR²が、上記で定義された通りである。また、式(II)のカルボニル基質は、
である。

いくつかの実施形態では、R³はフェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、R³はフェニル環に対してオルトである。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のキラルアルコール生成物は、メチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレート：
である。また、式(II)のカルボニル基質は、アセト酢酸メチル：

である。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のキラルアルコール生成物は、エチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレート：

である。また、式(II)のカルボニル基質は、アセト酢酸エチル：

である。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のキラルアルコール生成物は、エチル(S)-(-)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレート：

である。また、式(II)のカルボニル基質は、4-クロロアセト酢酸エチル：

である。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のキラルアルコール生成物は、(R) -1-[3，5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]エタノール：
である。また、式(II)のカルボニル基質は、3,5-ビストリフルオロメチルアセトフェノン：
である。

該方法のいくつかの実施形態では、式(I)のキラルアルコール生成物は、
である。また、式(II)のカルボニル基質は、
である。

いくつかの実施形態では、上記方法で製造された式(I)のアルコール生成物は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の鏡像体過剰率で存在する。

上記方法で使用するための遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの特定の実施形態は、詳細な説明でさらに提供される。上記方法で使用できる遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、鏡像体過剰の式A2の化合物(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの製造方法に使用できる。

これらの実施形態では、該方法は、補因子NADHの存在下、及び式A1の化合物を式A2の化合物に変換するのに適した反応条件下で、式A1の化合物4-ヒドロキシ-2-ブタノン：
を、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドと接触させたことを含む。

上記方法のいくつかの実施形態では、式A2の化合物は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の鏡像体過剰率で製造される。

本明細書に記載の方法において、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、補因子NADHの存在下で、カルボニル基質のキラルアルコール生成物への変換を触媒する。いくつかの実施形態では、該反応中の補因子NADHの再生は、同じ遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの作用で、別のアルコール化合物(イソプロパノール等)をカルボニル化合物(アセトン等)に変換することによって達成される。該過程において、NAD+は、NADHに変換される。いくつかの実施形態では、該反応中の補因子NADHの再生は、グルコース脱水素酵素によるグルコースのグルコン酸への変換を触媒することによって達成される。該過程において、NAD+は、NADHに変換される。該方法の具体例は、実施例9で記載されている。いくつかの実施形態では、該反応中の補因子NADHの再生は、ギ酸脱水素酵素によるギ酸の二酸化炭素への変換を触媒することによって達成される。該過程において、NAD+は、NADHに変換される。

当業者に知られているように、ケト還元酵素触媒反応は可逆的である。いくつかの実施形態では、補因子NAD+の存在下で、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドはまた、式(I)または式A2のキラルアルコール化合物をそれぞれ式(II)または式A1の化合物に変換することができる。

該方法のいくつかの実施形態では、前記基質は、ラセミアルコール化合物である。また、本明細書に開示される遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、他のエナンチオマーを保持しながら、一方のエナンチオマーを選択的にカルボニル化合物に変換する。これにより、ラセミアルコール化合物のキラル分割が達成される。ケト還元酵素によってアルコール化合物をカルボニル化合物に変換する過程において、例えば、同じケト還元酵素でアセトンをイソプロパノールに変換することによって、NAD+の再生が同時に達成される。該方法の具体例について、実施例15を参照されたい。

本明細書に記載され、また実施例に例示されているように、本開示では、本明細書の方法で使用できる一連の適切な反応条件が検討される。これには、補因子の再生方法、温度、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、緩衝液、pH、及び反応時間が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを用いて生物触媒的に基質化合物を生成物化合物に変換する方法を実施するための他の適切な反応条件は、日常的な実験によって容易に最適化できる。これには、個々の反応物の負荷、pH、温度、溶媒条件、及び補因子再生方法を変化させる実験的な反応条件下で、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを基質化合物と接触させることが含まれるが、これらに限定されない。また、生成物化合物は、例えば、本明細書で提供される実施例に記載の方法を用いて検出される。

上記のように、本開示の方法で使用するためのケト還元酵素活性を有する遺伝子操作されたポリペプチドは、一般に、配列番号:2～332の偶数配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

例えば、所望の生成物化合物の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件における酵素の安定性、及び基質から生成物への変換を考慮して、反応混合物への基質化合物の負荷を変えることができる。該方法のいくつかの実施形態では、前記適切な反応条件は、少なくとも0.5 g/L、少なくとも約1 g/L、少なくとも約5 g/L、少なくとも約10 g/L、少なくとも約15 g/L、少なくとも約20 g/L、少なくとも約30 g/L、少なくとも約50 g/L、少なくとも約75 g/L、少なくとも約100 g/L、少なくとも約150 g/L、少なくとも約200 g/L、少なくとも約250 g/L、少なくとも約300 g/L、少なくとも約350 g/L、少なくとも約400 g/L、またはそれ以上の基質(II)または基質A1の負荷を含む。ここで示されている基質負荷の値は、化合物(II)またはA1の分子量に基づいたものであるが、等モル量の化合物(II)またはA1の様々な水和物及び塩も該方法に使用できると考えられる。

該反応のいくつかの実施形態では、前記反応条件は、適切なpHを含んでもよい。酸または塩基、適切な緩衝液、または緩衝液と添加された酸または塩基との組み合わせを用いて望ましいpHまたは望ましいpHの範囲を維持することができる。反応前及び／または反応中に反応混合物のpHを制御することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約4～約11の溶液pHを含む。いくつかの実施形態では、前記反応条件は、約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11.0の溶液pHを含む。

本明細書の方法の実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増加、及び十分な反応時間のための酵素活性を考慮して、適切な温度を前記反応条件に使用することができる。従って、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約10℃～約60℃、約25℃～約50℃、約25℃～約40℃、または約25℃～約30℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応温度は、約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、または60℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、前記酵素反応中の温度は、該反応を通して特定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態では、前記酵素反応中の温度を、該反応の過程において、温度プロファイルにわたって調整してもよい。

遺伝子操作されたケト還元酵素を使用する方法は、一般に溶媒中で行われる。適切な溶媒には、水、水性緩衝液、有機溶媒、及び／または共溶媒系が含まれ、これらは一般に水性溶媒及び有機溶媒を含む。前記水性溶媒(水または水性共溶媒系)は、pH緩衝されてもよく、または非緩衝のものでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを使用する方法は、一般に、有機溶媒(例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸ブチル、1-オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)、トルエン等)、イオン性の液体(例えば、1-エチル4-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート等)を含む水性共溶媒系の中で行われる。前記水性共溶媒系の有機溶媒成分は、単一の液相を提供する水性成分と混和できるものであってもよく、または2つの液相を提供する水性成分と部分的に混和できるもの、または混和できないものであってもよい。例示的な水性共溶媒系は、水及び１つまたは複数の有機溶媒を含む。一般に、前記水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがケト還元酵素を完全に不活性化させないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載されているような酵素活性アッセイを利用して、候補の溶媒系において目的の定義された基質を用いて特定の遺伝子操作されたケト還元酵素の酵素活性を測定することによって容易に同定することができる。該方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件には、濃度が約1％～約95％(v/v)、約1％～約60％(v/v)、約2％～約60％(v/v)、約5％～約60％(v/v)、約10％～約60％(v/v)、約10％～約50％(v/v)、または約10％～約40％(v/v)の有機溶媒を含む水性共溶媒が包含される。該方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件には、濃度が少なくとも約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％(v/v)の有機溶媒が含まれる。

適切な反応条件には、基質化合物の対応する生成物化合物への生体触媒変換を可能にする反応パラメーターの組み合わせが含まれてもよい。従って、該方法のいくつかの実施形態では、前記反応パラメーターの組み合わせは、以下を含む：(a)基質A1の負荷量：約10 g/L～約600 g/L、(b)遺伝子操作されたポリペプチドの濃度：約1 g/L～約50 g/L、(c)pH：約4.0～11.0、及び(d)温度：約10～60℃。

いくつかの実施形態では、上記反応を実施できるケト還元酵素ポリペプチドは、配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332から選択されるアミノ酸配列を含む。

例示的な反応条件には、表2、表3、及び実施例8～14に提供される条件が含まれる。

本明細書に記載の反応を実施する際に、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを、部分的に精製または精製された形態で、熱処理された酵素溶液、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、及び／またはそのような細胞の細胞抽出物及び／または溶解物の反応混合物に添加してもよい。前記遺伝子操作されたケト還元酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞または細胞抽出物、その溶解物、及び単離された酵素は、固体(例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等)または半固体(例えば、湿った細胞の粗ペースト)を含む、多種多様な異なる形態で使用することができる。前記細胞抽出物または細胞溶解物は、凍結乾燥の前に、沈殿(例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理等)、続いて脱塩(例えば、限外濾過、透析等)によって部分的に精製することができる。酵素調製物はいずれも、グルタルアルデヒド等の既知の架橋剤を使用した架橋、または固相材料(樹脂等)への固定化によって安定化することができる。

本明細書に記載の反応のいくつかの実施形態では、前記反応は、本明細書に記載の適切な反応条件下で行われる。ここで、前記遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドは、固体支持体上に固定される。前記反応を行うための遺伝子操作されたケト還元酵素を固定化するのに有用な固体支持体には、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシ官能基を有するポリメタクリレート、ポリメタクリレート、スチレン/DVB共重合体、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレート等のビーズまたは樹脂が含まれるが、これらに限定されない。例示的な固体支持体には、キトサンビーズ、Eupergit C、及びSEPABEAD(三菱、EC-EP、EC-HFA/S、EXA252、EXE119、及びEXE120のタイプを含む)が含まれるが、これらに限定されない。

遺伝子操作されたポリペプチドが分泌されたポリペプチドの形態で発現されるいくつかの実施形態では、該分泌されたポリペプチドを含有する培養培地は、本明細書の方法に使用できる。

いくつかの実施形態では、固体反応物(例えば、酵素、塩等)は、粉末(例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等)、溶液、乳濁液、懸濁液等を含む、様々な異なる形態で反応に提供することができる。前記反応物は、当業者に知られている方法及び機器を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液を-80℃で少量ずつ凍結し、そして、事前に冷却した凍結乾燥チャンバーに入れた後、真空させることができる。

いくつかの実施形態では、反応物の添加順序は重要ではない。反応物を同時に溶媒に一緒に加えてもよく(例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系等)、あるいは、いくつかの反応物を別々に加えてもよく、また、いくつかは異なる時点で加えてもよい。例えば、ケト還元酵素及び基質を最初に溶媒に加え、次に有機溶媒を加えて混合してもよい。あるいは、基質は、水相に加える前に、有機溶媒中で予め混合することができる。

以下の代表例に本開示の異なる特徴及び実施形態を例示するが、これらは、例示的であり、限定的ではないことが意図される。

以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はそれらに限定されない。以下の実施例では、条件が指定されていない実験方法は、汎用の条件で、またはサプライヤーの提案に従って実施された。

実施例1：遺伝子クローニング及び発現ベクターの構築
Chryseobacterium sp.CA49由来の野生型ChKRED20ケト還元酵素のアミノ酸配列は、NCBIから検索できる。当技術分野の汎用技術を使用して、ベンダーによって対応する核酸を合成し、発現ベクターpACYC-Duet-1にクローン化した。42℃及び90秒間の熱衝撃の条件下で、該組換え発現プラスミドを大腸菌BL21(DE3) 形質転換受容性細胞に形質転換した。クロラムフェニコールを含有するLB寒天プレートに該形質転換体を蒔き、37℃で一晩インキュベートし、組換え形質転換体を得た。

実施例2：ケト還元酵素ポリペプチドの発現、及びケト還元酵素ポリペプチドを含有する酵素溶液の調製
本発明における酵素溶液の調製手順は以下の通りであり：250 mL三角フラスコ中で、クロラムフェニコール(ペプトン10 g/L、酵母エキス粉末5 g/L、塩化ナトリウム10 g/L、pH 7.0±0.2、25℃)を含有する50 mLのLB培地に、実施例1で得られた組換え形質転換体をインキュベートし、次いで、これを30℃の振とうインキュベーター内で、250 rpmで一晩培養した。該終夜の培養物のOD₆₀₀が2に達したとき、それを、5％(v/v)の接種物で250 mLのTB培地(トリプトン12 g/L、酵母エキス24 g/L、リン酸水素二ナトリウム9.4 g/L、リン酸水素二カリウム2.2 g/L、乳糖6 g/L、pH 7.2±0.2、30℃)を含有する1.0 Lのフラスコに継代培養した。そして、該発現培養物を、30℃、250 rpmの振とうインキュベーターに入れた。その間、ラクトースは、ケト還元酵素ポリペプチドの発現を誘導した。約20時間後、該発現培養物を収集し、遠心分離した(8000 rpm、10分間)。上澄みを廃棄し、湿った細胞を収集した。得られた湿った細胞を30 mLのリン酸緩衝液(PBS、pH7.0)で懸濁させ、氷浴中で超音波処理した後、遠心分離(4000 rpm、15分間)により上清を収集し、ケト還元酵素ポリペプチドを含有する酵素溶液を得た。

上記の振とうフラスコを用いた前記組換え発現法に従い、スケールを比例的に縮小することにより96ウェルプレートの中での小型化した発現法を実施し、培養液を遠心分離し、湿った細胞を得た。該湿った細胞は、当該分野で一般的に知られている化学的、機械的、または酵素的な方法で溶解することができ、細胞溶解物を遠心分離した後、酵素溶液を透明な上澄みとして得ることができる。

実施例3：酵素溶液の熱処理

図3.熱処理後の酵素溶液のSDA-PAGE画像

実施例2に記載の調製方法で、配列番号:2及び配列番号:330のケト還元酵素ポリペプチドの各酵素溶液25 mLを調製した。該酵素溶液を別々に50 mLの遠心分離管に入れ、85℃の水浴に入れた。該酵素溶液を攪拌で均一に加熱した。2時間後、該酵素溶液を遠心分離し(4000 rpm、30分間)、上澄みを収集し、熱処理した酵素溶液を得た。該熱処理した酵素溶液試料をSDS-PAGE電気泳動分析に供し、電気泳動の結果を図3に示した：試料１は、配列番号:2に対応する熱処理した酵素溶液であり、試料2は、配列番号:330に対応する熱処理した酵素溶液である。図3の結果に示されるように、85℃、2時間での熱処理後、該酵素溶液中の汚染タンパク質が完全に除去された。また、配列番号:2に対応するケト還元酵素も除去された。しかし、配列番号:330に対応するケト還元酵素が該酵素溶液中に残留した。

実施例4：ケト還元酵素変異体ライブラリーの構築
ここでは、Quikchangeキット(サプライヤ：Agilent)を使用した。該キットの説明書に従って、変異誘発プライマーの配列設計を行った。部位飽和変異誘発ライブラリーの構築は以下の通りである。PCR反応は、10 μlの5x緩衝液、1 μlの10 mM dNTP、1 μlのプラスミドDNAテンプレート(50 ng/μl)、それぞれ0.75μl(10 μM)の上流及び下流プライマー、0.5 μlの高忠実度酵素、及び36 μlのddH2Oで構成され、PCRプライマーは、該変異位置にNNKコドンを持っている。

PCR増幅工程：(1)98℃で前変性3分;(2)98℃で変性10秒;(3)72℃で徐冷と延長3分間；(2)～(3)の工程を25回繰り返す；(5)72℃で延長10分間；(6)4℃に冷却し、2 μlのDpnIを該PCR生成物に加え、37℃で一晩消化することによりプラスミドテンプレートを除去した。消化されたPCR生成物をE.coli BL21(DE3) 形質転換受容性細胞に形質転換し、クロラムフェニコールを含有するLB寒天プレートに蒔き、部位飽和変異誘発ライブラリーを得た。

実施例5：ケト還元酵素変異体ライブラリーの高処理スクリーニング
ケト還元酵素変異体ライブラリーの発現は、96ウェルプレートで行った。操作手順は以下の通りであった：寒天プレートから変異コロニー(実施例4に記載)を取り、96ウェルの浅いプレート(ウェルあたり150 μlのLB培地)中で、クロラムフェニコールを含有するLB培地にインキュベートし、180 rpm、湿度80％、及び30℃で一晩(18～20時間)培養した。

該浅いプレート培養のOD₆₀₀が2.0に達したとき、この培養の20μlを使用して、発現培養として96ウェルのディープウェルプレートにTB培地(ウェルあたり400 μLのTB培地と6 g/Lのラクトースを含有する)をインキュベートした。そして、それを30℃、湿度80％の振とうインキュベーター内で250 rpmで18～20時間一晩振とうした。該終夜発現が終了した後、前記発現培養物を4000 rpmで10分間遠心分離し、細胞ペレット(即ち、湿った細胞)を収集した。

次に、200 μL/ウェルの細胞溶解緩衝液(100 mMリン酸塩緩衝液、pH7.5、1 mg/mLリゾチームを含有)を前記ディープウェルプレートに加え、該プレートを密封し、プレートシェーカー上に700 rpmで1時間置き、細胞を破壊した。次に、該細胞溶解物を遠心分離し(4000 rpm、10分間)、そして、160 μL/ウェルの上清酵素溶液を新しいプレートに収集し、その後、密封し、熱処理に供し、72℃の水浴シェーカーで2.5時間振とうした(表2または表3中の「+」に対応するケト還元酵素ポリペプチドの高処理スクリーニング用)。

該熱処理の後、前記酵素溶液を4000 rpmで15分間遠心分離し、事前に反応原液(170 μL/ウェル)を負荷した96ウェルプレートに30 μLの上清を移した。次に、アルミニウムフィルムで該反応プレートを熱による密封をし、45℃、200 rpmのシェーカーに入れ、反応を開始した。15時間反応した後、50 μLの反応溶液を新しい96ディープウェルプレートに移し、1 mLの酢酸エチルを加えて、該反応を急冷した。該反応物をプレートシェーカーで30分間(800 rpm)振とうし、次に遠心分離し(4000 rpm、30分間)、上澄みをGC分析に供し、変換を測定した。

表2または表3中の「+」に対応するケト還元酵素ポリペプチドの高処理スクリーニングの反応条件について、反応原液を以下のように調製する：a)4-ヒドロキシ-2-ブタノンをイソプロパノールに溶解し、b)NAD+をPBS緩衝液に溶解し、a)及びb)を水と混合し、反応原液[最終濃度：4-ヒドロキシ-2-ブタノン:118 g/L、イソプロパノール:59％(v/v)、NAD+:0.24 g/L、PBS:0.01 M、pH7.0]を得る。

実施例6：(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの分析方法
GC分析方法：カラムはDB-WAX 15 m * 0.25 mm *0.25 μmであり、キャリアガスはN₂であり、検出器はFIDであり、注入口温度は250℃であり、スプリット比は28：1であり、検出器温度は300℃であり、注入量は1 μLであり、カラム温度は130℃であり、該温度は10℃/分で150℃に上昇し、次に20℃/分で160℃に上昇する。ここで、4-ヒドロキシ-2-ブタノンの保持時間：1.5分であり、(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの保持時間は2.3分である。

GCキラル分析法。注入前に、試料を次のように調製した：50 μLのMSTFAと30 μLの無水ピリジンを200 μLの試料に加え、1.5 mLの遠心分離管の中で十分に混合し、該反応液を30分間振とうした。カラムはCP-Chirasil Dex CB(CP7502)25 m * 0.25 mm * 0.25 μmであり、キャリアガスはN₂であり、検出器はFIDであり、注入口温度は250℃であり、スプリット比は28：1であり、検出器温度は300℃であり、注入量は1 μLであり、カラム温度は105℃であり、停止時間は9分である。ここで、(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの保持時間は6.5分であり、(S)-(-)-1,3-ブタンジオールの保持時間は5.82分である。

実施例7：発酵処理及び下流処理
標的遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの遺伝子を保有するプラスミドを含有するE.coli BL21(DE3)の単一コロニーを30 μg/mLクロラムフェニコールを含む50 mLのLB培地(5.0 g/L酵母エキス、10 g/Lトリプトン、10 g/L塩化ナトリウム)に播種した。これを30℃のシェーカーで、250 rpmで少なくとも16時間振とうした。該培養物のOD₆₀₀が3.5～5.0に達したとき、該培養物を用いて発酵槽に播種した。

0.6 Lの発酵ベース培地を含む1.0 Lの発酵槽をオートクレーブ内、121℃で30分間滅菌した。該発酵槽に上記の培養物を播種した。発酵槽の温度を37℃に維持し、攪拌パドルの速度は200～1000 rpmの範囲で、溶存酸素レベルを35％以上に維持するために、空気を0.4～0.8 L/分で該発酵容器に供給した。25～28％v/vの水酸化アンモニウムを添加し、該培地のpHをpH7.0に維持した。500 g/Lのデキストロースグルコース一水和物、12 g/Lの塩化アンモニウム、及び5 g/Lの硫酸マグネシウム七水和物を含有する供給溶液を供給することにより、細胞増殖を維持した。開始から約8時間で、培養のOD₆₀₀は35±5に達し、発酵槽の温度を下げ、30℃に維持した。そして、15 g/Lの最終濃度で一水和物-α-ラクトースを添加し、ケト還元酵素の発現を誘導された。その後、発酵処理をさらに16時間続け、発酵ブロスを収集した。Thermo Multifuge X3R遠心分離機を4℃、8000 rpmで10分間用いて細胞を収集した。収集した細胞は、次の下流処理で直接使用するか、または-20℃で凍結保存した。

湿った細胞を洗浄するために、4℃で該湿った細胞を10 mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.0に再懸濁させ、Thermo Multifuge X3R遠心分離機を用いて、4℃、8000 rpmで10分間遠心分離し、湿った細胞を再度収集した。上記の洗浄後の湿った細胞10 gを、50 mLの10 mM pH7.0リン酸カリウム緩衝液に再度懸濁させ、圧力ホモジナイザーで2回破砕して、細胞からケト還元酵素を放出させた。該細胞溶解物を85℃で2時間熱による処理をした(表2または表3中の「++++」に対応するケト還元酵素ポリペプチドの場合)。前記の熱処理した細胞溶解物を4000 rpmで30分間遠心分離し、その上清を収集し、熱処理した酵素溶液を得た。

実施例8：(R)-(-)-1,3-ブタンジオールを製造するための、遺伝子操作ケト還元酵素に触媒された反応処理
以下は、200 mLの反応容量での代表的な反応処理と後処理である。500 mLの反応フラスコに80 gの基質4-ヒドロキシ-2-ブタノン及び80 mLのイソプロパノールを加え、撹拌を開始した。次に、配列番号:330に対応する16 mLの熱処理した酵素溶液及び4 mgの補因子NAD+を負荷した。純水で反応フラスコ内の最終反応容量を200 mLにした。水浴で反応温度を40℃に維持し、撹拌速度は200 rpmであった。該反応の12時間目から、0.09～0.1 Mpaの真空を断続的に与え、反応で生成されたアセトンを除去し、その画分を収集した。真空の間にイソプロピルアルコールを反応フラスコに5回補充し、毎回の補充量は40 mLであった。反応の24時間後に、真空を停止し、該反応を終了させた。該反応試料を分析した結果、変換率は99％以上で、eeは99.5％以上であった。

該反応物を減圧下の蒸留に供した。最初にイソプロピルアルコール及び水を収集し、次に、減圧下で加熱し、生成物(R)-(-)-1,3-ブタンジオールを収集した。最後に、約64 gの純粋な(R)-(-)-1,3-ブタンジオールを得た。eeは99.5％以上であった。

実施例9：NADHをリサイクルするための、グルコース脱水素酵素を用いた反応処理
以下は、200 mLの反応容量での代表的な反応処理及び後処理である。500 mLの反応フラスコに、20 gの基質4-ヒドロキシ-2-ブタノン、40 mLの純水、20 mLの配列番号:102に対応する熱処理した酵素溶液、20 mLのグルコース脱水素酵素(GDH)を含有する酵素溶液、82 gのグルコース、及び4 mgの補因子NAD+を加え、純水で反応フラスコ内の最終反応容量を200 mLにした。水浴で反応温度を40℃に維持し、撹拌速度は200 rpmであった。該反応中、1M NaOH溶液でシステムのpHを約7.0に維持した。反応の24時間後に、変換率は68％で、eeは99.5％以上であった。

実施例10：(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの生成に関する、遺伝子操作されたケト還元酵素配列番号:330と野生型ケト還元酵素配列番号:2の触媒性能比較
実施例2に記載の方法に従って、以下の酵素溶液を調製した：a)配列番号:2の酵素溶液、及びc)配列番号:330の酵素溶液、a)またはc)の一部を85℃で2時間熱処理し、それぞれb)またはd)を調製した。

容量が250 mLの反応フラスコを4つ使用した。各反応フラスコに、10.0 gの4-ヒドロキシ-2-ブタノン及び25 mLのイソプロパノールを加え、次に、4つの異なる酵素溶液(表4に示す)を該4つの反応フラスコに加えた。各フラスコには異なる酵素が含まれていた：a)15 mL、b)15 mL、c)4 mL、d)4 mL。次に、0.2 mLのNAD+補因子の原液(12.5 g/L)を各反応フラスコに加えた。最終の反応容量が50 mLになるまで、純水で各反応フラスコを満たした。それにより、各反応フラスコにおける基質の最終濃度が200 g/Lに、イソプロパノールの最終濃度が50％v/vに、NAD+の最終濃度が0.05 g/Lになった。水浴で反応温度を40℃に維持した。撹拌速度は200 rpmであった。反応の12時間目から、0.09～0.1 Mpaの真空を断続的に与え、反応で生成されたアセトンを除去した。イソプロパノールを補充し、反応系におけるイソプロパノールの濃度を50％v/vに維持した。該反応の24時間後に、反応を停止させた。各反応フラスコから該反応混合物の試料を50 μL採取し、1 mLの酢酸エチルと混合することにより該試料を急冷した。実施例6の分析方法に従って変換率及びeeの値を測定し、計算した。得られた結果を表4に示す。
表4

実施例11：メチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレートを製造するためのケト還元酵素触媒反応
容量が30 mLの反応フラスコを4つ使用した。各反応フラスコに、1.0 gのアセト酢酸メチル及び2.0 mLのイソプロパノールを加え、次に、4つの異なる酵素溶液(表5に示す)を該4つの反応フラスコに加えた。各フラスコは酵素の1つを含む：e)0.25 mL、f)0.25 mL、g)0.1 mL、h)0.1 mL。次に、0.04 mLのNAD+補因子の原液(12.5 g/L)を各反応フラスコに加えた。最終反応容量が5.0 mLになるまで、純水で各反応のフラスコを満たした。これにより、各反応フラスコにおける基質(アセト酢酸メチル)の最終濃度が200 g/L、イソプロパノールの最終濃度が40％v/v、NAD+の最終濃度が0.1 g/Lになった。該反応フラスコを40℃のIKAマグネチックスターラーに置き、撹拌速度を400 rpmに設定し、反応を開始した。24時間反応した後、反応物を採取し、変換率及びeeを測定した。その結果を表5に示す。
表5

分析方法：
GC分析方法：カラムはCP-ChiraSil-DEX CB 25 m * 0.25 mm * 0.25 μmでした。キャリアガスはN₂であった。検出器はFIDであった。注入口温度は250℃であった。スプリット比は100：1であった。検出器温度は250℃であった。注入量は1 μLであった。カラム温度は120℃で、5分間維持した。アセト酢酸メチルの保持時間は2.7分であった。メチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は3.1分であった。

GCキラル分析法。注入前に、次のように試料を調製した。1.5 mLの遠心分離管の中で50 μLのMSTFA及び30 μLの無水ピリジンを200 μLの前記希釈試料と一緒に加えた。該混合物を十分に混合し、30分間振とうした。カラムはCP-Chirasil Dex CB(CP7502) 25 m * 0.25 mm * 0.25 μmであった。キャリアガスはN₂であった。検出器はFIDであった。注入口温度は250℃であった。スプリット比は50：1であった。検出器の温度は250℃であった。注入量は1 μLであった。カラム温度は110℃であった。停止時間は8分であった。メチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は3.7分であった。メチル(S)-(-)-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は3.9分であった。

実施例12：エチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレートを製造するためのケト還元酵素触媒反応
容量が30 mLの反応フラスコを4つ使用した。各反応フラスコに、1.0 gのアセト酢酸エチル及び2.0 mLのイソプロパノールを加え、次に、4つの異なる酵素溶液(表6に示す)を4つの反応フラスコに加えた。各フラスコは1つの酵素を含んでいた：i)0.25 mL、j)0.25 mL、k)0.1 mL、l)0.1 mL。次に、0.04 mLのNAD+補因子の原液(12.5 g/L)を各反応フラスコに加えた。最終反応容量が5.0 mLになるまで、純水で各反応フラスコを満たした。それにより、各反応フラスコにおける基質(アセト酢酸エチル)の最終濃度が200 g/L、イソプロパノールの最終濃度が40％v/v、NAD+の最終濃度が0.1 g/Lになった。該反応フラスコを40℃のIKAマグネチックスターラーに置き、撹拌速度を400 rpmに設定し、反応を開始した。24時間反応した後、反応物を採取し、変換率及びeeを測定した。その結果を表6に示す。
表6

分析方法：
GC分析方法：カラムはCP-ChiraSil-DEX CB 25 m * 0.25 mm * 0.25 μmであった。キャリアガスはN₂であった。検出器はFIDであった。注入口温度は250℃であった。スプリット比は50：1であった。検出器温度は250℃であった。注入量は1 μLであった。カラム温度は120℃で、4分間維持した。アセト酢酸エチルの保持時間は3.2分であった。エチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は3.7分であった。

GCキラル分析法：カラムはCP-Chirasil Dex CB(CP7502) 25 m * 0.25 mm *0.25 μmであった。キャリアガスはN₂であった。検出器はFIDであった。注入口温度は250℃であった。スプリット比は100：1であった。検出器温度は250℃であった。注入量は1 μLであった。カラム温度は100℃であった。停止時間は15分であった。エチル(R)-(-)-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は10.3分であった。エチル(S)-(-)-3-ヒドロキシブタノエートの保持時間は10.8分であった。

実施例13：エチル(S)-(-)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートを製造するためのケト還元酵素触媒反応
容量が30 mLの反応フラスコを4つ使用した。各反応フラスコに、0.3 gの4-クロロアセト酢酸エチル、2.0 mLのイソプロパノール及び2.6 mLのトリエタノールアミン緩衝液(0.1 M pH=8.5)を加え、次に、4つの異なる酵素溶液(表7に示す)を4つの反応フラスコに加え、各フラスコは1つの酵素を含んでいた：m)0.25 mL、n)0.25 mL、o)0.05 mL、p)0.05 mL。次に、0.04 mLのNAD+補因子の原液(12.5 g/L)を各反応フラスコに加えた。最終反応容量が5.0 mLになるまで、純水で各反応フラスコを満たした。これにより、各反応フラスコにおける基質(4-クロロアセト酢酸エチル)の最終濃度が60 g/L、イソプロパノールの最終濃度が40％v/v、NAD+の最終濃度が0.1 g/Lになった。該反応フラスコを40℃のIKAマグネチックスターラーに置き、撹拌速度を400 rpmに設定し、反応を開始した。24時間反応した後、反応物を採取し、変換率及びeeを測定した。その結果を表7に示す。
表7

分析方法：
GC分析方法：カラムはCP-ChiraSil-DEX CB 25 m * 0.25 mm *0.25 μmであった。キャリアガスはN₂であった。検出器はFIDであった。注入口温度は250℃であった。スプリット比は98：1であった。検出器温度は250℃であった。注入量は1 μLであった。カラム温度は50℃で、30℃/分で温度を180℃に上げた。4-クロロアセト酢酸エチルの保持時間は10.4分であった。(S)-(-)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルの保持時間は9.9分であった。

GCキラル分析法：カラムはCP-Chirasil Dex CB(CP7502) 25 m * 0.25 mm *0.25 μmであった。キャリアガスはN₂であった。検出器はFIDであった。注入口温度は250℃であった。スプリット比は100：1であった。検出器温度は250℃であった。注入量は1 μLであった。カラム温度は105℃であった。停止時間は15分であった。エチル(S)-(-)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は11.5分であった。エチル(R)-(-)-4-クロロ-3-ヒドロキシブチレートの保持時間は11.9分であった。

実施例14：(R)-1-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]エタノールを製造するためのケト還元酵素触媒反応
30 mLの反応フラスコを使用した。該反応フラスコに、1.0 gの3,5-ビス-トリフルオロメチルアセトフェノン、1.0 mLのイソプロパノール及び0.08 mLのNAD+補因子の原液(12.5 g/L)を加え、次に、0.5 mLの、配列番号:142の熱処理[75℃、2時間]した酵素溶液を加えた。最終反応容量5.0 mLまで純水で反応フラスコを満たした。これにより、反応フラスコにおける基質(3,5-ビストリフルオロメチルアセトフェノン)の最終濃度が200 g/L、イソプロパノールの最終濃度が20％v/v、NAD+の最終濃度が0.2 g/Lになった。該反応フラスコを40℃のIKAマグネチックスターラーに置き、撹拌速度を400 rpmに設定し、反応を開始した。24時間反応した後、変換率は>95％であった。また、生成物(R)-1-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]エタノールのeeは99.9％以上であった。

分析方法：
HPLC分析方法：カラム：ZORBAX SB-C18、移動相：60％アセトニトリル+ 40％水、カラム温度：30℃、注入量：10 μL、流速：1 ml/min、波長：218 nm、(R)-1-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]エタノールの保持時間は4.9分、3,5-ビストリフルオロメチルアセトフェノンの保持時間は6.7分であった。

GCキラル分析法：カラム：Beta DEXTM 225 (30 m * 0.25 mm *0.25 μm)、カラム温度：110℃の一定温度で20分間、カラム流量：1.0 ml/分、ガス化チャンバー：250℃、検出器：FID 330℃、スプリット比：1：30、注入量：1.0 μlであった。(S)-1-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]エタノールの保持時間は15.77分であった。(R)-1-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]エタノールの保持時間は16.33分であった。

実施例15：ラセミ体1,3-ブタンジオールの分解のためのケト還元酵素による反応処理
以下は、200 mLの容量での代表的な反応処理及び後処理である。ラセミ体1,3-ブタンジオールを基質 (等量の(R)-(-)-1,3-ブタンジオール及び(S)-(-)-1,3-ブタンジオールを含有) として使用した。500 mLの反応フラスコに、10 gのラセミ体1,3-ブタンジオール、20 gのアセトン、20 mLの配列番号:330の熱処理[85℃、2時間]した酵素溶液、及び4 mgの補因子NAD+を加えた。該反応フラスコを最終反応容量200 mLまで純水で満たした。水浴で反応温度を40℃に制御した。撹拌速度は200 rpmであった。24時間後に反応は完了し、分析のために試料を採取した。該基質において、(R)-(-)-1,3-ブタンジオールの99.5％以上が4-ヒドロキシ-2-ブタノンに変換された。また、該反応において、(S)-(-)-1,3-ブタンジオールのee値は99％以上であった。

理解されたいこととして、当業者は、本発明の上記の内容を読んだ後、本発明に様々な修正または改変を加えることができる。また、これらの同等な形態も添付された本発明の特許請求の範疇にある。

Claims

配列番号:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチド。
化学結合または物理吸着法によって固体材料の上に固定される、請求項１に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチド。
請求項１に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、または331である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターを含む、請求項５に記載の発現ベクター。
請求項５または６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
請求項７に記載の宿主細胞を培養し、その培養物から遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを得る工程を含む、遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドの製造方法。
請求項１に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドを含む細胞または培養液、またはその処理物を含む、ケト還元酵素触媒であって、前記処理物は、形質転換細胞の培養物から得られた抽出物、該抽出物からケト還元酵素を単離または精製して得られた単離生成物、または形質転換細胞を固定して得られた固定化生成物、その抽出物、または該抽出物の単離生成物を指す、ケト還元酵素触媒。
式(I)の化合物の製造方法であって、
式(I)の化合物が、＊でマークされたキラル中心に示された立体化学的配置を有し；該式(I)の化合物が、他の異性体よりも鏡像体過剰であり、該式(I)の化合物が、
であり；前記方法が、適切な反応条件下で、カルボニル基質を、請求項１または２に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドと接触させることを含み、前記カルボニル基質が、
である、
式(I)の化合物の製造方法。
式A2の化合物(R)-(-)-1,3-ブタンジオール：
の製造方法であって、該方法が、式A1の化合物を(R)-(-)-1,3-ブタンジオールに変換する適切な反応条件下で、式A1の化合物4-ヒドロキシ-２-ブタノンを、
請求項１または２に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドと接触させることを含む、製造方法。
請求項１０の式（Ｉ）の化合物または請求項１１の式Ａ２の化合物が、99％以上の鏡像体過剰率で存在する、請求項１０または１１に記載の製造方法。
NADHが、反応中に再生され、再生方法が、ケト還元酵素でイソプロパノールをアセトンに変換する過程、グルコース脱水素酵素でグルコースをグルコン酸に変換する過程、またはギ酸脱水素酵素でギ酸を二酸化炭素に変換する過程のいずれかである、請求項１０～１２のいずれか1項に記載の製造方法。
反応溶媒が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、またはジメチルホルムアミド(DMF)を含む、請求項１０～１３のいずれか1項に記載の製造方法。
反応条件が、温度10℃～60℃を含む、請求項１０～１４のいずれか1項に記載の製造方法。
反応条件が、pH4.0～pH11.0を含む、請求項１０～１５のいずれか1項に記載の製造方法。
基質が、5 g/L～400 g/Lの負荷量で存在する、請求項１０～１６のいずれか1項に記載の製造方法。
適切な反応条件下で、ラセミ体1,3-ブタンジオールを請求項１または２に記載の遺伝子操作されたケト還元酵素ポリペプチドと接触させることを含む、ラセミ体1,3-ブタンジオールの分割方法。
前記反応条件が、ラセミ体1,3-ブタンジオールの負荷量5 g/L～400 g/L、NAD+の負荷量0.01 g/L～0.2 g/L、アセトンの負荷量10％～50％v/v、及び温度10～60℃を含む、請求項１８に記載の方法。