CN117417909A - 一种热稳定和异丙醇耐受的羰基还原酶突变体及其应用 - Google Patents
一种热稳定和异丙醇耐受的羰基还原酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种热稳定和异丙醇耐受的羰基还原酶突变体及其应用。所述羰基还原酶突变体是在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列上发生了S148L和/或Q169K突变。本发明还公开了一种羰基还原酶组合以及制备如式II所示的化合物的方法、所述的羰基还原酶组合在制备如式II所示的化合物中的应用。本发明突变体35相对于WT，热稳定性为2077.7倍，异丙醇耐受性为209.1倍。
Description
技术领域
本发明涉及药物化合物制备领域，特别是涉及一种热稳定和异丙醇耐受的羰基还原酶突变体及其应用。
背景技术
羰基还原酶(Ketoredutase，KRED)能将前手性的羰基化合物定向还原为手性羟基化合物，是合成手性药物的重要工具。在温和条件下具有高选择性和高转化率优势的羰基还原酶，长期以来一直受到医药工业领域的重视。抗血小板治疗药物替格瑞洛(Ticagrelor)是治疗急性冠脉综合征的有效药物，于2012年11月在我国上市。(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(式II)是合成替格瑞洛的重要手性中间体。在之前的研究中，发明人发现来源于Leifsonia sp.strain S749的LSADH(羰基还原酶)能高效还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(式I)合成替格瑞洛手性醇中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ee>99.9％)。但在LSADH的实际生产应用中，发明人发现其稳定性比较低，无法适应高强度工业生产。LSADH在高浓度底物、产物和异丙醇中提前失活，无法发挥其应有的性能。因此，提高酶的稳定性使其能承受和适应恶劣的工业环境具有重要意义。
酶的稳定性改造一直是改造的热点和难点。现有的改造策略包括二硫键的引入、盐桥的修饰、表面电荷工程以及酶的环化工程等。但无论是用那种策略改造，酶稳定性改造最大的问题在于提高酶结构刚性的同时，也会降低其原有的催化活性。所以，在酶改造的过程中，能有效兼顾稳定性和活性具有极大的挑战性。为了选择合适的改造候选酶，发明人将CN110894184A、CN107686447A、CN111763662A、CN109423484A、CN106701840A、CN109112166A、CN109295020A和Org.Process Res.Dev.2017,21,1595-1601等现有专利文献中报道的能制备替格瑞诺手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇得羰基还原酶进行了系统的比较。这些天然来源的羰基还原酶在工业应用中普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。而具有较高底物浓度和较高催化效率的LSADH，是一个很有潜力的酶。因此，通过理性改造提高该酶的热稳定性和异丙醇耐受性，具有重要的实际应用价值。
发明内容
为解决现有技术中羰基还原酶存在的热稳定性差和异丙醇耐受性差问题，本发明提供了一种热稳定和异丙醇耐受的羰基还原酶突变体及其应用。本发明通过理性设计对酶进行分子进化，获得热稳定性和异丙醇耐受性大幅提高的突变体，更利于大规模工业化应用。
本发明第一方面提供了一种羰基还原酶突变体，其是在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列上发生了S148L和/或Q169K突变。
在一些优选的实施方式中，所述突变体还包括I145V、A163G和L207V中的一种或多种突变。
优选地，所述突变体还包括T100P、T111R和V183N中的一种或多种突变。
在一些优选的实施方式中，所述突变体选自以下组：
(1)S148L、S148L/Q169K、I145V/S148L/A163G/L207V、I145V/S148L/A163G/Q169K/L207V、T100P/T111R/I145V/S148L/A163G/Q169K/V183N/L207V或G78R/A81E/T100P/S105P/T111R/Q125R/I145V/S148L/A163G/V183N/L207V；
(2)Q169K、S148V/Q169K、I145V/A163G/Q169K/L207V、T100P/I145V/A163G/Q169K/L207V或T100P/T111R/I145V/A163G/Q169K/V183N/L207V。
本发明第二方面提供了另外一种羰基还原酶突变体，其是在如SEQ IDNO:1的氨基酸序列上发生了选自以下组突变：
(1)I145V/A163G/V183N/L207V；
(2)T100P/I145V/A163G/L207V；
(3)S148V/Q169T。
本发明第三方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体。
本发明第四方面提供了一种重组表达载体，其包含本发明第三方面所述的分离的核酸。
本发明第五方面提供了一种基因工程菌，其包含本发明第三方面所述的分离的核酸，或本发明第四方面所述的重组表达载体。
本发明第六方面提供了一种羰基还原酶组合，其包括至少一种本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体和野生型羰基还原酶，或包括至少两种本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体。
本发明第七方面提供了一种制备如式II所示的化合物的方法，其包括用本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体或本发明第五方面所述的基因工程菌或本发明第六方面所述的羰基还原酶组合催化如式I所示的化合物。
优选地，所述突变体为在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列上发生了T100P/T111R/I145V/S148L/A163G/Q169K/V183N/L207V突变。
在一些优选的实施方式中，其中，所述方法包括以下步骤：
在缓冲液中，加入所述突变体、NAD+、异丙醇和化合物I；反应获得如式II所示的化合物。
较佳地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为7.0，反应温度为40-50℃，例如45℃。
更佳地，如式II所示的化合物的提取包括以下步骤：
(1)加入甲叔醚萃取；使蛋白失活，过滤菌体，水层用甲叔醚再次萃取；
(2)合并萃取产物，用水和/或食盐水洗有机层，干燥；
(3)过滤和旋蒸浓缩，得纯化的化合物Ⅱ。
在一些更优选的实施方式中，其中，所需的反应条件如下：
步骤(1)中，蛋白失活的温度为55-65℃；优选60℃；时间为0.5-1.5h，例如1h；过滤菌体使用硅藻土，优选硅藻土的量为8％-12％，例如10％；
步骤(2)中，用无水硫酸钠干燥，用水和5％食盐水洗有机层。
本发明第八方面提供了本发明第一方面所述的羰基还原酶突变体或本发明第五方面所述的基因工程菌或本发明第六方面所述的羰基还原酶组合在制备如式II所示的化合物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)突变体35催化效率较野生型LSADH提高了41倍；
(2)突变体35的Tm提高了23.3℃，55℃下半衰期从3min内提高到了60h；
(3)突变体35对异丙醇耐受性提高到了80％；
(4)突变体35相对于WT，热稳定性为2077.7倍，异丙醇耐受性为209.1倍。
附图说明
图1为55℃条件下的野生型羰基还原酶LSADH和其突变体的半衰期。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1羰基还原酶LSADH工程菌及其突变体库的构建
将来源于Leifsonia sp.strain S749的羰基还原酶LSADH基因经密码子优化(SEQID NO:2)后，由南京金斯瑞合成至pET28a(+)载体中。随后将含LSADH基因的质粒导入宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得羰基还原酶(LSADH)的重组基因工程菌。
基于羰基还原酶LSADH的结构分析以及HotSpot Wizard预测，我们选取了活性口袋中E53、A63、G78、A81、A98、T100、S105、T111、G123、Q125、A132、A143、S148、S154、T159、A163、Q169、Y175、K179、V180、V183、G186、V195、S200、L204、L207、A212和S224等残基建立了定点突变文库以及组合突变文库。具体操作：通过重叠PCR引入相应突变，并将构建好的质粒文库转入大肠杆菌BL21(DE3)中，随后涂布至LB固体培养基(含50μg/mL卡那霉素)上，于37℃过夜培养。第二天，挑取单菌落至含400μL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96孔板中，37℃过夜培养。接着从过夜培养的96孔板上吸取10μL种子液转至新的96孔板中(含400μL含50μg/mL卡那霉素的发酵培养基)，于37℃震荡培养至OD600值＞0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，于28℃继续培养20h来诱导表达LSADH突变体。最后将96孔板至离心机中，4000g，30min离心收集菌体，-20℃保存备用。
发酵培养基配方如下：酵母提取物(2.4％)，大豆蛋白胨(1.2％)，氯化钠(0.3％)，甘油(0.5％)，磷酸氢二钾(0.2％)，七水硫酸镁(0.05％)。
实施例2羰基还原酶LSADH突变体粗酶液制备及筛选
用200μL裂解缓冲液(含有1000U溶菌酶的0.1M磷酸缓冲液，pH7.0)重新悬浮上述保存的菌体，然后30℃裂解1h后，至离心机中4℃，4000g，离心30min，吸取澄清的上清液测定突变体活性。LSADH和突变体的粗酶液在55℃和浓度分别为40％、60％、80％的异丙醇浸泡处理后，进行稳定性测试。测试体系(总体积200μL)如下：4mM 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮底物、1mM NADH、20％DMSO(v/v)、K2HPO4-KH2PO4磷酸缓冲液(100mM，pH 7.0)和10μLLSADH或突变体酶液。LSADH和突变体的粗酶液蛋白浓度根据实际测活情况进行稀释调整。基于340nm处NADH吸光度的变化值来计算表征LSADH及其突变体的活性。
稳定性明显提高的突变体于2mL测活体系下复测，具体为：20g/L 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮底物、20％异丙醇(v/v)、0.1g/L NAD+、K2HPO4-KH2PO4磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)和100μl处理前或处理后的粗酶液。28℃反应15min后用HPLC检测转化率。
各个突变体的相对稳定性如表1。*相比于野生型LSADH，突变体的热稳定性和异丙醇耐受性提高倍数。
表1部分突变体及其相对活性
实施例3羰基还原酶LSADH及突变体35酶学性质测定
鉴于突变体35稳定性和异丙醇耐受性显著提升，我们进一步考察了突变体35较野生型LSADH的动力学参数、55℃下半衰期、Tm和的变化(表2)。从Km和kcat/Km值可以看出，与野生型LSADH相比，突变体35对2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的亲和力提高了8倍，催化效率提高了40.5倍。在热稳定性方面，突变体35在55℃的半衰期(t1/2)为60h，野生型LSADH的半衰期(t1/2)只有3min。如附图1所示，突变体35在55℃孵育24h后仍能保持80％的催化活性，且孵育144h后还残余20％催化活性。而野生型LSADH在55℃孵育15min后已经没有活性。同时我们也测定了突变体35的熔解温度，发现突变体35的Tm值从野生型LSADH的39.5℃提高到了62.8℃。这说明突变体35比野生型LSADH在更高的温度才会发生解折叠和二级结构的逐渐破坏。为了进一步验证随着温度升高LSADH结构破坏后其活性的变化，我们测定了LSADH和突变体35在不同温度如25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃下孵育15min后的残余酶活。结果显示，突变体35的T1550值从野生型LSADH的40.0℃提高到了57.2℃。因此，突变体35的活性和热稳定性比LSADH都得到了明显的提升。
表2 LSADH及突变体的动力学参数、Tm和
实施例4公斤级的(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化制备
取0.1M的磷酸盐缓冲液(12L)，加入NAD+(20g)，加入异丙醇(8L)，加入上述发酵所得突变体35(0.4kg)，剧烈搅拌分批加化合物I(2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮)(10kg)溶液，45℃，HPLC监控反应转化率＞98％时，终止反应。加入甲叔醚(40L)萃取，加热至60℃保温1h使蛋白失活。然后加入10％的硅藻土过滤菌体，水层用甲叔醚(20L)再次萃取。有机层合并后使用水洗和5％食盐水洗，并用无水硫酸钠干燥。最终通过过滤和旋蒸浓缩得化合物Ⅱ((S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇)(9.3kg)，ee值99％。
Claims (12)
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，其是在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列上发生了S148L和/或Q169K突变。
2.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，所述突变体还包括I145V、A163G和L207V中的一种或多种突变；
优选地，所述突变体还包括T100P、T111R和V183N中的一种或多种突变。
3.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，其选自以下组：
(1)S148L、S148L/Q169K、I145V/S148L/A163G/L207V、I145V/S148L/A163G/Q169K/L207V、T100P/T111R/I145V/S148L/A163G/Q169K/V183N/L207V或G78R/A81E/T100P/S105P/T111R/Q125R/I145V/S148L/A163G/V183N/L207V；
(2)Q169K、S148V/Q169K、I145V/A163G/Q169K/L207V、T100P/I145V/A163G/Q169K/L207V或T100P/T111R/I145V/A163G/Q169K/V183N/L207V。
4.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，其是在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列上发生了选自以下组突变：
(1)I145V/A163G/V183N/L207V；
(2)T100P/I145V/A163G/L207V；
(3)S148V/Q169T。
5.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体。
6.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求5所述的分离的核酸。
7.一种基因工程菌，其特征在于，其包含如权利要求5所述的分离的核酸，或如权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种羰基还原酶组合，其特征在于，其包括至少一种如权利要求1-4任一项所述的羰基还原酶突变体和野生型羰基还原酶，或包括至少两种如权利要求1-4任一项所述的羰基还原酶突变体。
9.一种制备如式II所示的化合物的方法，其特征在于，其包括用如权利要求1-4任一项所述的羰基还原酶突变体或如权利要求7所述的基因工程菌或如权利要求8所述的羰基还原酶组合催化如式I所示的化合物；
优选地，所述突变体为在如SEQ ID NO:1的氨基酸序列上发生了T100P/T111R/I145V/S148L/A163G/Q169K/V183N/L207V突变。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在缓冲液中，加入所述突变体、NAD+、异丙醇和化合物I；反应获得如式II所示的化合物；
较佳地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为7.0，反应温度为40-50℃；
更佳地，如式II所示的化合物的提取包括以下步骤：
(1)加入甲叔醚萃取；使蛋白失活，过滤菌体，水层用甲叔醚再次萃取；
(2)合并萃取产物，用水和/或食盐水洗有机层，干燥；
(3)过滤和旋蒸浓缩，得纯化的化合物Ⅱ。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所需的反应条件如下：
步骤(1)中，蛋白失活的温度为55-65℃；优选60℃；时间为0.5-1.5h；过滤菌体使用硅藻土，优选硅藻土的量为8％-12％；
步骤(2)中，用无水硫酸钠干燥，用水和5％食盐水洗有机层。
12.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体或如权利要求7所述的基因工程菌或如权利要求8所述的羰基还原酶组合在制备如式II所示的化合物中的应用。
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