JP7490184B2 - 電子顕微観察用試料の作製システム、プラズマ処理装置、及び電子顕微観察用試料の作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、電子顕微観察用試料の作製に関し、特に、親水化処理と導電化処理の少なくとも一方を施した樹脂テープ上に生体組織の切片を配置した電子顕微観察用試料の作製システム、電子顕微観察用試料の作製方法、及びこれに用いられるプラズマ処理装置とスパッタ装置とテープ搬送機構に関するものである。

従来、生体組織を走査電子顕微鏡観察する場合、樹脂包埋した生体組織をミクロトームなどで薄切りして得られた切片をプラスチックテープ上に搭載し、このプラスチックテープをシリコンウェハーなどの平坦な板の上に、１枚ずつ順次配置して試料を作製していた。

近年、連続的かつ自動的に電子顕微鏡観察用の切片を薄切りにして回収する装置が開発され、これを用いてプラスチックテープの上に切片を回収する研究室が増えてきた。

この方法では、樹脂包埋した試料をダイヤモンドナイフで順次切削し、切削した切片を水などの上に浮上させ、この浮上させた切片に同期して移動させたテープ上に切片を切削順に回収する（例えば非特許文献１参照）。

しかし、プラスチックテープは静電気の発生や、撥水性があるため、プラスチックテープ上に回収した切片にしわがよったり、切片が弾き飛ばされたりなどのトラブルが発生していた。

プラスチックテープに搭載した切片をそのまま走査電子顕微鏡で観察すると、チャージアップして観察し難い。そのため、切片の上から、カーボンなどの導電性コーティングを薄く施し、プラスチックテープに導電性を付与して走査電子顕微鏡で観察する（非特許文献１参照）。テープ自体が導電性を有する材質（例えば、金属など）で形成されているのが理想的であるものの、導電性を有する材質は一般的に表面の平坦性が不十分であることから、切片を搭載するテープとしては使えないためである。

一方、磁気テープの表面をプラズマ処理する装置（例えば特許文献１参照）や長尺フィルムにスパッタリングを施す装置（例えば特許文献２参照）が知られていた。しかしながら、これらのプラズマ処理装置やスパッタリング装置は、工業用であり、装置の構造が精密であったり、装置が大型であったりして、電子顕微鏡観察用の試料作製には適さないという問題があった。

特開平０７－２５６０８７号公報 特開２０１８－９２４７号公報

超薄連続切片自動回収機ＡＴＵＭを用いた試料作製方法、日本顕微鏡学会 P176-180,Vol.49,No.3,(2014)

本発明は上記した課題を解決するためになされたものであって、従来よりも簡単な構成と手法で、生体組織からなる切片を用いた電子顕微観察用試料の作製を実現することを目的とする。

特に、テープ表面の静電気または撥水性を低減するためのプラズマ処理と、テープに導電性を付与するためのスパッタ処理の少なくとも一方を行うことで、簡易な装置を用いた簡易な手法で生体組織からなる切片の電子顕微観察を可能とする電子顕微観察用の試料作製方法とシステムを提供する。

本発明者らは、樹脂テープの表面を予め親水化処理することにより、当該テープの上に連続的に切片を回収して容易かつ確実に平坦に固定できることを知見した。また、樹脂テープの表面を予め導電化処理することで、樹脂テープ上に搭載した切片の上からカーボンコーティングなどの導電性膜を形成しなくても、走査電子顕微鏡でチャージアップすることなく、高コントラストかつ高分解能で切片の観察等ができることを知見した。

本発明は上記した知見に基づいてなされたものである。本発明の一つの態様では、電子顕微観察用試料の作製システムは、
樹脂テープをプラズマ照射領域内で走行させてプラズマ照射して連続的に親水化するプラズマ処理装置と、前記樹脂テープをスパッタリング領域内で走行させて連続的にスパッタリングして導電化するスパッタ装置の少なくとも一方と、
前記プラズマ処理装置またはスパッタ装置で処理された前記樹脂テープの被処理面上に、連続的に切削された前記試料の切片を順次回収する回収装置と、
を備えている。

この電子顕微観察用試料の作製システムによれば、プラズマ処理装置によって樹脂製のテープ表面を親水化することで、撥水性や静電気を有するテープの上にも、はじかれたりすることなく切片を平坦に搭載することができる。また、スパッタ装置によって導電化された樹脂テープを用いるので、例えば走査電子顕微鏡観察においても、チャージアップすることなく、高コントラストかつ高解像度の画像を取得することができる。

電子顕微観察用試料の作製システムで用いられるプラズマ装置によれば、生体組織からなる切片を平坦に搭載可能にするために、プラスチック等の撥水性のテープや、静電気を生じるテープの表面を簡易な装置および方法で親水化することができる。

電子顕微観察用試料の作製システムで用いられるスパッタ装置によれば、生体組織からなる切片の電子顕微鏡観察を可能にするために、簡易な装置および方法でプラスチックなどの導電性を有しないテープの表面処理を行って導電性を付与することができる。

従来よりも簡単な構成と手法で、生体組織からなる切片を用いた電子顕微観察用試料の作製が実現される。本発明の電子顕微観察用の試料作製方法および装置は、生体組織からなる切片の、高コントラストかつ高解像度での連続電子顕微観察を可能とする。

実施形態の電子顕微観察用試料の作製システムの模式図である。 本実施形態の電子顕微鏡観察の全体工程図である。 本実施形態のプラズマ処理装置の構成図（その１：親水化処理）である。 本実施形態のプラズマ処理装置のガイド軸にテープがガイドされた状態の一例を示す模式図である。 本実施形態のプラズマ処理工程の動作説明フローチャートである。 本実施形態のスパッタ装置の構成図（その２：導電化処理）である。 本実施形態のスパッタ装置のテープがガイドされる機構(ガイド軸）の一例を示す模式図である。 本実施形態のスパッタ装置のガイド軸にテープがガイドされた状態の一例を示す模式図である。 本実施形態のスパッタ装置に備えるセンサの一例を表す模式図である。 本実施形態のスパッタリング工程の動作説明フローチャートである。 図５のスパッタ装置でのテープ巻き取りの外観図である。 本実施形態の切片作製（Ｓ４）・切片回収（Ｓ５）の詳細工程図である。 本実施形態の切断したテープのウェハーへの整列（Ｓ８）を示す図である。 本実施形態の電子顕微観察（Ｓ９）の例を示す図である。 本実施形態の電子顕微観察による画像分析（Ｓ９）の例を示す図である。 本実施形態の電子顕微観察における観察、及び画像分析（Ｓ９）の説明図である。 本実施形態の電子顕微鏡観察で得られる画像の例（Ｓ９）である。 本実施形態の電子顕微鏡観察で得られる画像の別の例である。

実施形態の電子顕微観察用試料の作製システムは、試料搭載用のテープ表面に連続的に親水化処理と、導電化処理の少なくとも一方を施し、処理後のテープ上に試料の切片を連続的に回収する。試料搭載用のテープは、たとえば樹脂テープである。本実施形態の試料作製システムにより、試料の切片を搭載した樹脂テープを、シリコンウェハー、ガラス基材等の基板上に固定して、例えば走査電子顕微鏡観察することができる。切片搭載後に導電性コーティングをしなくても、チャージアップなしに高コントラストかつ高分解能で切片を観察し、または、画像の取得をすることができる（以下、特に断らない限り電子顕微鏡観察は、観察画像の取得を含むものとして記載する）。

図１Ａは、実施形態の電子顕微観察用の試料作製システム１００の模式図である。電子顕微観察用の試料作製システム１００は、プラズマ処理装置１１０とスパッタ装置１２０の少なくとも一方と、回収装置１２０を含む。前処理が施されたテープが、プラズマ処理装置１１０、またはスパッタ装置１２０に導入される。プラズマ処理とスパッタ処理の両方を行う場合は、いずれを先に行ってもよいが、プラズマ処理が表面浄化作用を有することから、一例としてプラズマ処理の後に、導電性を付与するスパッタ処理を行う。

導入されるテープは、生体試料等の切片を搭載するために用いられるテープであり、テープの幅は、一例として１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下であり、好ましくは、数ミリ程度、あるいはそれ以下である。プラズマ処理装置１１０とスパッタ装置１２０は、このような幅の狭いテープに効率的にプラズマ処理またはスパッタリングを施すために、コンパクトで効率的なテープ送り機構を有する。

プラズマ処理装置１１０は、プラズマ処理装置１１０の全体動作と個々の部品の動作を制御する制御装置１１５を有する。スパッタ装置１２０は、スパッタ装置１２０の全体動作と個々の部品の動作を制御する制御装置１２５を有する。制御装置は、必ずしもプラズマ処理装置１１０とスパッタ装置１２０の内部に個別に配置されていなくてもよく、パーソナルコンピュータ等の外部の情報処理装置が制御装置として接続されていてもよい。

プラズマ処理またはスパッタリングが施された樹脂テープは、回収装置１３０のリールに設置され、試料の切片が連続してテープ上に搭載される。あらかじめ、樹脂テープの表面にプラズマ処理と、導電性を付与するスパッタ処理の少なくとも一方が施されているので、切片はテープ上の所定の位置に順次、正しく配置される。また、帯電が抑制される。

試料の切片が搭載された樹脂テープは、テープ配列ステージで、電子顕微観察及びライブラリ用に適した形態で基板上に配列されてもよい。装置間のテープの搬送は、オペレータが手動で行ってもよいし、ロボットアームや搬送装置によって自動搬送されてもよい。

図１Ｂは、本実施形態の電子顕微鏡用試料の作製方法及びこれを用いた電子顕微鏡観察の全体の工程を説明する図である。以下順次詳細に説明する。

工程Ｓ１は、テープの前処理を行う工程である。
（１）樹脂テープ
樹脂テープとしては、耐進展性（伸びない）、表面平坦性、耐薬品性、耐熱性を有する樹脂製のテープを使用することができる。樹脂テープは、耐薬品性を有することで、後述するウランや鉛を用いた電子染色に際しても、変形や変質を抑えられる。また、耐熱性を有することで、樹脂テープにプラズマ処理やスパッタリングを施した際にも変形や変質が抑えられる。

上記のような特性を有する樹脂テープの材質としては、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリエーテル・エーテルケトン（PEEK）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）などが使用可能である。用いる樹脂材料は、電子顕微観察の手法に応じて選択可能である。たとえば、電子顕微鏡観察と蛍光観察を同じ切片で同時に行う場合は、テープ自身が自家蛍光を持たない材料が良い。自家蛍光は樹脂材料自体から生じる自発的な蛍光であり、人為的に添加されたマーカー由来の光を観測する蛍光観察のノイズとなるからである。自家蛍光を持たないテープの一例として、ポリカーボネートを使用することができる。ＰＥＴやポリイミドは特定の波長に蛍光があり、ＰＥＥＫはほぼ全波長に色があるが、これらの材料も電子顕微鏡観察には適切に使用される。

なお、テープ自体が導電性を備えるのが理想的であるが、導電性を備える材質(例えば金属など)は平坦性や耐薬品性が十分ではないことが多い。例えばアルミニウムは、平坦性は高いが耐薬品性が低いので電子顕微鏡観察での使用は困難である。このため、本実施形態では、樹脂テープを使用することとした。

樹脂テープの幅は、例えば生体組織から切片を切り出す回収装置１３０の水ボート付ダイヤモンドナイフの構成に合わせて設計することができる。樹脂テープの幅は、通常幅が２．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下であり、７．５～８．０ｍｍ程度であれば十分である。樹脂テープの厚みについても上記同様に、水ボート付ダイヤモンドナイフの構成に合わせて設計することができ、好ましくは３０～７０μｍである。厚みが３０μｍ以上であれば、取り扱いがしやすく、７０μｍ以下であれば、一般的な水ボート付ダイヤモンドナイフを用いて切片を円滑に回収することができる。
（２）テープ前処理（Ｓ１）
まず、テープ前処理工程（Ｓ１）で、樹脂テープ表面を清浄化する。このテープの前処理工程では、エタノール等で樹脂テープ表面をふき取り、主に樹脂テープ表面に付着した大きなゴミや汚れを除去する。

テープ前処理工程で清浄化された樹脂テープは、プラズマ処理装置で用いられるリールに巻き取られ、次の工程のＳ２に移送される。
（３）プラズマ処理（Ｓ２）
図１Ｂにおいて、工程Ｓ２は、プラズマ処理工程である。プラズマ処理工程では、樹脂テープ表面にプラズマを照射して、樹脂テープ表面を親水化する。また、プラズマ処理によって樹脂テープ表面の微細な汚染物を除去することができる。

プラズマ処理工程では、まず、樹脂テープを巻取りしたリールをプラズマ処理装置１１０にセットする。その後、リールを回転させて、樹脂テープをプラズマ処理装置１１０のチャンバ内のプラズマ電極の間（プラズマ照射領域）に搬送し、プラズマ照射領域内を走行させる。これによりテープ表面にプラズマを照射する。

図２は、本実施形態のプラズマ処理に使用されるプラズマ処理装置１１０の構成一例を表す図である。図２の（ａ）は平面図を示し、図２の（ｂ）は正面図を示し、図２の（ｃ）は側面図を示す。テープの送り方向をＸ方向、装置の高さ方向をＺ方向、Ｘ方向及びＺ方向と直交する方向をＹ方向とする。

図２に示すプラズマ処理装置１１０は、プラズマ電極２として対向する陽極および陰極を備えている。プラズマ電極２は、例えば、上下に対向して配置した金属製の円板からなり、４、５、６、７、８インチなどのウェハーにプラズマを照射可能なサイズを有する。プラズマ電極２の配置は互いに対向していれば上下の関係に限定されず、プラズマ処理装置１１０の設置状態によっては、左右（たとえばＸ－Ｚ面と平行）に対向していても構わない。プラズマ電極２は、図２では、ステンレスを用いたが、それ以外に放電により金属が放出されないような他の材料でもよい。テープ３は、上述した樹脂テープであり、一対のプラズマ電極２の間で、テープ面を電極面に対して垂直にした状態で張られている。

プラズマ処理装置１１０は、テープ３を巻き取るリール５－１（第１のリール），および送り側のリール５－２（第２のリール）と、リール５－１，５－２を固定する回転軸８－１，８－２を備えている。リール５－１，５－２の、例えば、テープ３を巻き取る巻き取り軸の外周に凹凸部を設け、回転軸８－１，８－２の外周に凹凸部を設け、これらを嵌合させることでリール５－１，５－２を回転軸８－１，８－２に固定することができる。

筐体６は、プラズマ処理装置１１０の全体を収納する。筐体６は、図２に示すように、対向したプラズマ電極２、リール５－１、５－２とこれに巻いたテープ３などを収納する真空排気可能な容器（チャンバ）である。筐体６には、図示しない、減圧ポンプ等の真空排気機構が付設されており、これにより筐体６内を真空排気可能である。筐体６の上面、すなわち、スパッタ電極２の上方には、窓付のドアが設けられていて、ドアの開閉により筐体６にテープ３を出し入れすることができる。窓は透明基板等を用いて内部を視認可能に構成されている。耐熱性や耐薬品性の点から、透明基板としては、アクリル樹脂やポリカーボネートなどの樹脂基板やガラス板を使用することができる。

上述したように、プラズマ処理装置１１０では、プラズマ電極２の間（プラズマ照射領域内）において、テープ３の両表面に同時にプラズマ照射されるようにテープ３の表面を両スパッタ電極２の対向面に垂直に配置する。このため、リール５－１，５－２は、いずれも、その側面が、プラズマ電極２を構成する円板の平面と平行になるように筐体６内に収容されている。図２では、１本のテープ３を用いた例を示したが、例えば、複数のリールを互いに離間させて重なるように配置して、複数本のテープ３を配置してもよい。複数本のテープ３を配置する場合、テープ３を送り出す側のリール５－２は、そのうち１つを回転軸８－２に固定して、その他のテープは回転軸８－２の周上を自由回転するように設置することが好ましい。このような構成により、複数本のテープ３の巻き数が異なる場合でも、最も走行速度が速くなる、巻き数の多いテープを、上記回転軸８－２に固定したリール５－２に設置することで、これ以外のテープのたるみを防いで、安定的に連続プラズマ処理を行うことができる。

プラズマ処理装置１１０は、プラズマ電極２の間に、電圧を印加する電源装置（図示せず）と、プラズマ電極２間に所定の大きさの電流（プラズマ電流）が流れるように電気回路によって電流値を制御する図示しない電流調整器を備えている。電源装置が印加する電圧は、直流電圧または交流電圧のいずれであってもよく、高周波電圧であってもよいが、装置を小型化する点では直流電圧であることが好ましい。

駆動装置７は、回転軸８－１を駆動して回転させ、その回転速度を電気回路により自動制御する。これにより回転軸８－１に固定されたリール５－１が回転され、テープ３を所定速度で巻き取る。リール５－２を固定する回転軸８－２は、リール５－１により巻き取られるテープ３の張力によって回転する。駆動装置７を駆動させることで、回転軸８－１が回転され、これにより、テープ３が所定の搬送速度でリール５－２からリール５－１に巻き取られる。駆動装置７は例えば減速機付モーターである。この場合、ブレーキは実験で予め適切な条件を求めて設定することができる。モーターの回転数は、例えば、５～３０秒／回転程度の範囲で、６段階（２６．５秒／回転、１６．５秒／回転、１０．０秒／回転、６．０秒／回転、５．６秒／回転）などと、段階的に変更可能に設計される。

プラズマ処理装置１１０は、回転軸８－２に摩擦力を付与してその回転速度を制御するブレーキ機構９を備えている。ブレーキ機構９は、例えば筐体６内に固定され、回転軸８－２の周上の特定位置で接する長尺板で構成することができる。この長尺板の一端が筐体６内に固定され、その他端が回転軸８－２の周上に接することで、回転軸８－２と長尺板の間に摩擦力が生じ、これにより回転軸８－２の回転速度を制御する。長尺板の材質としては、プラズマ処理装置内で変質等を生じない材料であり、弾性のある材料、例えばＳＵＳなどのステンレス鋼を使用することができる。また、長尺板をステンレス鋼などの金属板で構成する場合、回転軸８－２の周上の、金属板が摺接される部分には樹脂製のシートを回転軸の外周方向に沿って設けてもよい。樹脂の種類に応じて、回転軸８－２に生じる摩擦力を調節し、回転速度を調節することができる。樹脂として具体的には、プラズマ処理装置内において反応性の低い材料、例えば、テフロン（登録商標）などが使用可能である。本実施形態のプラズマ処理装置では、回転軸８－１も同様のブレーキ機構を備えているが、これらは必要に応じて一方のみ備えていてもよい。

プラズマ処理装置１１０は、リール５－２から送り出されたテープをガイドするガイド軸１１を備えている。図３はガイド軸１１にテープ３がガイドされた状態の一例を示す模式図であり、プラズマ電極２の電極面と平面なＸ－Ｙ面内での平面図である。ガイド軸１１は、プラズマ電極２のリール５－１側とリール５－２側にそれぞれ設けられ、ガイド軸１１にガイドされるテープ３がプラズマ電極２の略中心を通るように配置される。ガイド軸１１は、円筒状軸１１ａと、この円筒状軸１１ａの外周面を自由回転可能に配置された内空の円筒板１１ｂと、ガイド軸両端に配設され、ガイド軸１１からのテープ３の離脱を防ぐ止め板１１ｃを有する。止め板１１ｃは、例えばガイド軸１１の内径よりも径の大きい円板で形成されている。ガイド軸１１の円筒板１１ｂにテープ３が接触することで、テープ３を、プラズマ照射領域の略中心を通過するように走行させて、テープ３の表面の親水化を均一化する。なお、テープ表面に一滴の水滴を落としたときに水滴がテープ表面に残らず、表面に広がっていけば、親水化が十分に行えたと判断してよい。

プラズマ処理装置１１０は、テープ３がプラズマ照射領域内を走行しているか否かを検出するセンサ１２を備えている。センサ１２は、例えば光を出射する光源と、光源から出射されて、テープ３に反射された光を検出する光検出器とを有する。光源は、テープ３により反射可能な波長の光を出射する。センサ１２は、光源からの光をテープ３の表面に垂直に照射するように配置される。テープ３として上記の樹脂テープを用いる本実施形態では、光源は例えば赤外線を出射する素子である。プラズマ処理装置１１０は、図１Ａを参照して説明したように、制御装置１１５を備えており、センサ１２の光検出器によりテープ３からの反射光が検出されない場合には、制御装置１１５は、テープ３がプラズマ照射領域を走行中していないと判断し、駆動装置７及び電源装置を停止する。

本実施形態のプラズマ処理装置１１０は、リール５－１，５－２、回転軸８－１，８－２、ガイド軸１１、駆動装置７及びブレーキ機構９からなるテープ搬送手段と、テープの走行状態を検出する、センサ１２を有する点に特徴の一つがあり、これらの構成により、プラズマ処理装置を小型かつ簡易に構成することができる。

図４は、図１Ｂのプラズマ処理の工程Ｓ２の動作を説明するフローチャートである。図４のフローチャートに沿って、プラズマ処理の動作を詳細に説明する。

図４において、Ｓ１０１は、テープ３をプラズマ処理装置１１０にセットする工程である。図２の筐体６の前面の窓付きのドアを開け、予め親水化処理の対象となるテープ３を巻き取ったリールを、図２のプラズマ処理装置１１０の送り側のリール５－２の場所にセットする。テープ３の一端を引き出し、このテープ３の一端を、筐体６の中央を通過させるためのガイド軸１１に接触させ、次いで、受け側のリール５ー１に入れ、リール５－１を少し回して巻き取らせる。その後、駆動装置７を駆動させて、テープ３が送り方向（Ｘ方向）に搬送されるのを確認する。

Ｓ１０２は、プラズマ処理装置のチャンバ内を真空排気する工程である。Ｓ１０１でテープ３をリール５－２とリール５－１の間にセットした後に、上面のドアを閉め、真空排気する。真空排気後の真空度は最大６～８Ｐａ程度である。

Ｓ１０３は、チャンバ内にガスを導入する工程である。Ｓ１０２で真空排気した後、必要に応じて所望のガスを導入し、所定圧力に調整する。プラズマ処理の雰囲気として、酸素あるいは空気（体積比で窒素：酸素＝３：１）を使用することができる。このうち、酸素を用いる方が、プラズマ電流値が安定するため、好ましい。圧力は実験で予め求めておき、例えば、ガスとして酸素を用いる場合、６～２０Ｐａの範囲であれば十分である。

Ｓ１０４は、プラズマ電極２間に電圧を印加し、プラズマ電極１１間を流れる電流値を調整する工程である。Ｓ１０３で所定雰囲気に調整された筐体６の内部で、プラズマ電圧を印加し、上述の大きさのプラズマ電流が流れるように調整する。

プラズマ電流値としては、２５ｍＡ程度であれば、十分な親水化が可能である。なお、上記の条件で親水化した場合、プラズマ処理後は１～２週間程度は問題なく親水化された状態が持続できる。例えば、長期保存により親水化状態が劣化した場合には再度、プラズマ照射すればよい。なお、最適なプラズマ電流値、テープ搬送速度、ガス雰囲気、ガス圧力、ガス種類などは、電子顕微鏡観察試料などの種類や大きさに応じて、実験により予め求めて設定することが好ましい。

Ｓ１０５は、テープ３をプラズマ電極１１間のプラズマ照射領域に一定速度で走行させ、テープ３表面にプラズマ照射する工程である。Ｓ１０４でプラズマ電圧およびプラズマ電流を親水化処理のための適切な値に調整された後、駆動装置７を駆動させて、回転軸８－１を所定の回転速度で回転させる。これにより、テープ３が所定速度で走行し、連続的にテープ３の両面に同時に親水化処理が施される。テープ搬送速度は、十分に親水化する観点から、例えばプラズマ電流値が２５ｍＡ程度のとき好ましくは３０秒～１分程度／２００ｍｍであり、必要に応じてこれ以上の滞在時間としてもよい。

Ｓ１０６は、テープの走行が終了した（終端が検出された）か判別する工程である。制御装置１１５は、Ｓ１０５で駆動装置７が駆動されると、センサ１２の光源から赤外光をテープ３に照射し、光検出器によりテープ３からの反射光が検出されているときは、テープ３がプラズマ照射領域内を走行中であると判別する。一方、制御装置１１５は、反射光が検出されなくなったときに、テープ３がプラズマ照射領域内を走行しておらず、リール５－１に巻かれたテープ３の親水化処理が終了したと判別する。また、センサでの判別がＹＥＳ（終端検出あり）の場合には、駆動装置７と電源装置を停止させることでテープ３の走行を停止させ、一連の処理を終了する。ＮＯ（終端検出なし）の場合には、Ｓ１０５を繰り返す。

以上によって、プラズマ処理装置１１０を用い、テープ３を、その表面がプラズマ電極２の電極面に対して垂直方向になるように、所定の搬送速度で走行させる。これにより、テープ３の両表面に、同時かつ均一にプラズマ照射して連続的に親水化処理することが可能となり、両表面が親水化された樹脂テープが作製される。
（４）スパッタリング
図１Ｂに戻って、工程Ｓ３は、スパッタリング工程であり、スパッリングにより樹脂テープ表面に導電性の重金属を付着させて導電化する。工程Ｓ３では、まず、工程Ｓ２において親水化された樹脂テープを巻き取ったリールを、スパッタ装置１２０にセットする。リールを回転させて、スパッタ装置１２０のチャンバ内のスパッタ電極の間（スパッタリング領域）に樹脂テープを搬送し、スパッタリングを行う。

図５は、本発明の実施形態のスパッタ装置１２０の一例の構成を示す図である。図５の（ａ）はスパッタ装置の平面図であり、図５の（ｂ）は正面図である。テープの送り方向がＸ方向、装置の高さ方向がＺ方向、Ｚ方向及びＺ方向と直交する方向がＹ方向である。

図５に示すスパッタ装置１２０は、スパッタ電極４１、４２を備えている。スパッタ電極４１、４２は、例えば装置の高さ方向で互いに対向して配置した円板状の電極であって、４、５、６、７、８インチなどのウェハーにスパッタ可能なサイズを有する。テープ１３は、上述した樹脂テープである。なお、スパッタ電極４１、４２の配置はこれらが対向していれば上下の関係に限定されず、スパッタ装置１２０の設置状態に応じて左右などでも構わない。

スパッタ電極４１は、スパッタリングターゲットで構成されている。スパッタリングターゲットとしては、導電性の重金属を用いることができる。導電性の重金属からなるスパッタリングターゲットとしては、Ａｕ，Ａｇ，Ｐｔ，Ｐｄなどからなるターゲットや、これらの任意の合金からなるターゲットを使用することができる。電子顕微鏡観察において良好なイメージングを行いやすい点で、スパッタリングターゲットとしては、金ターゲット、Ｐｔ－Ｐｄ合金ターゲットが好ましく、金ターゲットがより好ましい。Ｐｔ－Ｐｄ合金ターゲットのＰｔとＰｄの比率は例えば、質量比でＰｔ／Ｐｄが９０／１０程度であれ
ばよい。

スパッタ電極４２は、対向するスパッタ電極４１との間で放電するため、その材質はステンレスのほか、放電により金属が放出されないような他の材料を用いることができる。

スパッタ装置１２０は、テープ３を巻き取るリール１５－１（第３のリール）、および送り側のリール１５－２（第４のリール）と、リール１５－１，１５－２を固定する回転軸１８－１，１８－２とを備えている。リール１５－１，１５－２の、例えば、樹脂テープを巻き取る巻き取り軸の内周に凹凸部を設け、回転軸１８－１，１８－２の外周上に凹凸部を設けて、これらを嵌合させることでリール１５－１，１５－２を、回転軸１８－１，１８－２に固定することができる。なお、本実施形態では、３本のテープ１３を同時に走行させており、この場合、テープ１３を送り出す側のリール１５－２は、そのうち１つ（例えば筐体１６のドアより最も奥側）を回転軸１８－２に固定して、その他の２本は回転軸１８－２の周上を自由回転するように設置することが好ましい。このような構成により、３本のテープ１３の巻き数が異なる場合でも、最も走行速度が速くなる、巻き数の多いテープ１３を、上記回転軸１８－２に固定したリール１５－２に設置することで、これ以外の２本のテープのたるみを防いで、安定的に連続スパッタが可能である。

本実施形態では、スパッタ電極４１、４２の円板の対向する面とテープ１３の表面が平行になるようにテープ１３を配置する。そのため、リール１５－１、リール１５－２はその側面がスパッタ電極４１、４２の円板の対向する面と垂直に配置される。これによりテープ１３の一方の表面にスパッタリングにより導電性膜が付着されて導電化される。

筐体１６は、スパッタ装置１２０の全体を収納する。筐体１６は、図示のように、対向したスパッタ電極４１，４２、リール１５－１、１５－２とこれに巻いたテープ１３などを収納する。筐体１６には、減圧ポンプ等の真空排気機構１９が付設されており、これにより、筐体１６内を真空排気可能である。筐体１６の前面には、内部を視認可能な窓付のドアが設けられていて、ドアの開閉により筐体１６にテープ１３を出し入れすることができる。窓は透明基板により形成されている。透明基板としては、耐熱性や耐薬品性の点から、アクリルやポリカーボネートなどの樹脂基板やガラス板を使用することができる。

スパッタ装置１２０は、スパッタ電極４１、４２の間に、電圧を印加する電源装置（図示せず）と、スパッタ電極４１，４２間に所定の大きさの電流（スパッタ電流）が流れるように電気回路によって電流値を制御する図示しない電流調整器を備えている。電源装置が印加する電圧は、直流電圧または交流電圧のいずれであってもよく、高周波電圧であってもよいが、装置を小型化する点では直流電圧であることが好ましい。

電源装置によりスパッタ電極４１と、これに対向するスパッタ電極４２との間に電圧が印加されると、両電極４１、４２間に放電が生じ、これによりイオン化した雰囲気中のガスイオンが、スパッタ電極４１に衝突してスパッタ電極４１を構成するスパッタリングターゲットの材料が放出されてスパッタリングされる。放出されたスパッタリングターゲット材料は、スパッタ電極４１に対向して配置されたテープ１３の表面に付着してテープ１３の表面が導電化処理される。

駆動装置１７は、回転軸１８－１を駆動して回転させ、その回転速度を電気回路により自動制御する。これにより回転軸１８－１に固定されたリール１５－１が回転され、テープ１３を所定速度で巻き取る。リール１５－２を固定する回転軸１８－２は、リール１５－１により巻き取られるテープ１３の張力によって回転する。このように、駆動装置７を駆動させることで、回転軸１８－１が回転され、これにより、テープ１３が所定の搬送速度でリール１５－２からリール１５－１に巻き取られる。駆動装置１７は例えば減速機付モーターであり、この場合、ブレーキは実験で予め適切な条件を求めて設定することができる。

スパッタ装置１２０は、回転軸１８－１，１８－２に摩擦力を付与してその回転速度を制御するブレーキ機構２０を備えている。ブレーキ機構２０は、例えば筐体１６内に固定され、回転軸１８－２の周上の特定位置で接する長尺板で構成することができる。この長尺板の一端が筐体１６内に固定され、その他端が回転軸１８－２の周上に接することで、回転軸１８－２と長尺板の間に摩擦力が生じ、回転軸１８－２の回転速度を制御することができる。長尺板の材質としては、スパッタ装置１２０内で変質等を生じない材料であり、弾性のある材料、例えばＳＵＳなどのステンレス鋼を使用することができる。また、長尺板をステンレス鋼などの金属板で構成する場合、回転軸1８－２の周上の、金属板が摺接される部分に樹脂製のシートを設けることで、樹脂の種類などにより回転軸1８－２に生じる摩擦力を調節することができる。樹脂としては、例えば、テフロン（登録商標）を使用することができる。本実施形態のスパッタ装置１２０では、回転軸１８－１も同様のブレーキ機構を備えているが、これらは必要に応じて一方のみ備えていてもよい。

スパッタ装置１２０は、リール１５－２から送り出されたテープをガイドするガイド軸３１，３２を備えている。図６はガイド軸３１を模式的に示す図であり、図６（a）は平面図、図６（ｂ）は正面図である。図７は、テープ１３がガイド軸３１、３２にガイドされた状態の一例を示す模式図であり、リール１５－１、１５－２の平面方向（Ｘ－Ｚ面内）で見た図である。ガイド軸３１は、スパッタ電極４１のリール１５－１側とリール１５－２側にそれぞれ設けられ、ガイド軸３１にガイドされるテープ１３がスパッタ電極４２の平面の略中心を通るように配置される。図６に示されるように、ガイド軸３１は、円筒状軸３１ａと、この円筒状軸３１ａの周を自由回転可能に配置された内空の円筒板３１ｂと、複数のテープ１３のガイド領域を仕切る仕切り板３１ｃと、ガイド軸３１の両端に設けられ、テープ１３がガイド軸３１から脱離しないようにする円盤状の止め板３１ｄからなる。仕切り板３１ｃおよび止め板３１ｄは例えばガイド軸３１の内径よりも径の大きい円板からなる。なお、テープ１３は、導電化される表面がガイド軸３１に接触しないようにガイドされることが好ましい。

ガイド軸３２の構成は図２，３に示すガイド軸１１と同様であり、ガイド軸３１とは、仕切り板３１ｂを有しない点で異なる。ガイド軸３１,３２の内空円筒板３１ｂにテープ1３が接触することで、テープ1３を、スパッタ領域内でたるませずに走行させることができる。また、仕切り板３１ｃにより、テープ１３同士の接触を防ぐことができる。これらによれば、テープ1３表面の導電化が均一に実現し易い。

スパッタ装置１２０は、テープ１３がスパッタ領域内を走行しているか否かを検出するセンサ３３を備えている。図８は、スパッタ装置１２０に備えられるセンサ３３を表す模式図であり、図８（ａ）は、センサ３３が配置された図であり、図８（ｂ）はセンサ３３に備えられるフランジ付円板を表す。図８に示すように、センサ３３は、例えば光を出射する光源３３ａと、光源から出射された光を検出する光検出器３３ｂと、フランジ付円板３３ｃとを備えている。センサ３３は、光源からの光を、光源に対向して配設された光検出器で検出する。光源３３aは光検出器３３ｂと組み合わせて適宜選択することができ、例えば光の直進性の高いLED（Light emitting diode）などを使用することができる。

フランジ付円板３３ｃは、その円周にフランジ３３１を形成する切り欠きを有し、円周に沿ったフランジ３３１が光源３３ａと光検出器３３ｂの間を通過するように、かつ、フランジ付円板３３ｃが回転軸１８－１２と一体となって回転するように回転軸1８－２に固定されている。光源３３ａから出射された光は、隣接するフランジ３３１間の切り欠きを通って光検出器３３ｂに入射する。回転軸１８－１２が回転しているときは、フランジ３３１と切り欠き部分に光が交互に照射されるため、光検出器３３ｂは断続的に光を検出することになる。プラズマ処理装置１１０は、図１Ａを参照して説明したように、制御装置１２５を備えており、センサ３３の検出器によりテープ１３からの反射光が断続的に検出される場合には、テープ１３がスパッタ領域を走行中であると判別する。またセンサ３３の光検出器によりテープ１３からの反射光が所定期間検出されないか、連続して検出される場合には、制御装置１２５は、テープ１３がスパッタ領域を走行しておらず、リール１５－２に巻かれていたテープ１３の導電化処理が終了したと判別し、駆動装置７及び電源装置を停止する。

なお、スパッタ装置１２０は、電流(又は電圧)を調整する電流調整器を有しており、例えば、電流調整器により印加電圧は０．８ＫＶまたは１．４ＫＶＤＣで、電流は０から５０ｍＡの間で任意に調整可能である。また、筐体１６は排気機構を備えており、これにより内部の真空は８Ｐａまで真空排気可能である。さらに、筐体１６は、ニードルバルブ２３を備えており、これにより任意のガス（例えば空気、酸素等）を導入可能である。

本実施形態のスパッタ装置１２０においては、リール１５－１，１５－２、回転軸１８－１，１８－２、ガイド軸３１，３２、駆動装置１７及びブレーキ機構２０からなるテープ搬送手段と、テープの走行状態を検出するセンサ３３を有する点に特徴の一つがあり、これらの構成により、スパッタ装置を小型かつ簡易に構成することができる。

図９は、スパッタ装置１２０の動作を説明するフローチャートである。図９のフローチャートに沿って、図１Ｂのスパッタリング工程（Ｓ３）の動作を詳細に説明する。

図９において、Ｓ１１１は、テープをセットする工程である。これは、図５のスパッタ装置１２０の筐体１６の前面の窓付きのドアを開け、予め導電化処理の対象となるテープ１３を巻き取ったリールを、送り側のリール1５－２の場所にセットする。テープ1３の一端を引き出し、筐体1６の中央を通過させするためのガイド軸３１，３２に接触させ、巻き取側のリール1５ー１に入れ、リール1５ー１を少し回して巻き取らせる。その後、駆動装置1７を駆動させて、テープ1３が送り方向（Ｘ方向）に搬送されるのを確認する。

Ｓ１１２は、真空排気する工程である。Ｓ１１１で、リール1５－２、及びリール1５－１をセットした後に、前面のドアを閉め、チャンバ内を真空排気する。

Ｓ１１３は、チャンバ内にガスを導入する工程である。Ｓ１１２でチャンバ内を真空排気した後、所望のガスを導入し、所定圧力に調整する。この圧力は実験で予め求めたておく。導入ガスは、アルゴン、窒素、乾燥空気などを用いることができる。チャンバ内を真空排気して、スパッタリング圧力を３ＭＰａ（ゲージ圧、以下同じ）程度に調節する。チャンバ内の圧力は、スパッタ電流が適切に流れる程度であればよく、３ＭＰａであれば十分なスパッタリングが行える。

Ｓ１１４は、スパッタ電極４１、４２の間に電圧を印加し、スパッタ電極間に流れる電流値を調整する工程である。Ｓ１１３で、図２の筐体６の内部が所定の雰囲気に調整された状態で、スパッタ電圧（例えば０．８ＫＶ～１．４ＫＶの所定の大きさのスパッタ電圧）を印加し、所定の大きさのスパッタ電流が流れるように調整する。

スパッタ電流は、１０ｍＡ～５０ｍＡが好ましい。スパッタ電流が５０ｍＡ以下であれば、樹脂テープの過熱による、変形や変質を抑制することができる。また、樹脂テープ上のスパッタリングされた重金属の粒状性が悪くなりにくく、また、樹脂テープ上に切片を回収する場合に、切片にシワやキズがつきにくくなる。スパッタリング電流が１０ｍＡ以上であれば、樹脂テープを十分に導電化できるので、電子顕微鏡観察において良好なイメージングが行いやすい。スパッタ電流は、１０ｍＡ～４０ｍＡが好ましく、１０ｍＡ程度でも構わない。スパッタ電流は、テープの種類、スパッタ雰囲気（ガス）の種類、スパッタ圧力、スパッタリングターゲットの種類などに依存するので、あらかじめ実験で最適な電流を求めておき、設定することが好ましい。

Ｓ１１５は、テープを一定速度で走行させ、スパッタする工程である。Ｓ１１４でスパッタ電圧とスパッタ電流をテープ１３のスパッタ（導電化）処理のために適切な値に調整した後、図５に示す駆動装置１７を駆動させてテープ１３を所定速度で走行させ、連続的にテープ１３の一方の表面に導電化処理を施す。

スパッタリングにおける、テープ１３の搬送速度は、１０－２０分程度／２００ｍｍが好ましく、必要に応じて（２００ｍｍの樹脂テープに対して）これ以上の滞在時間としてもよい。樹脂テープの搬送速度が速すぎると、チャンバ内での樹脂テープの積算滞在時間が短くなるため、十分な導電性膜の形成ができないことがある。なお、テープを巻き取るリールの回転数が一定の場合には樹脂テープの巻き数が多くなればなるほど、ターゲット下を通過している時間が短くなっていく。このため、樹脂テープをスパッタリング領域に１回しか通さない場合、樹脂テープの最初と最後で導電性膜の厚さが異なることがある。樹脂テープがチャンバ内のターゲット下（スパッタリング領域）に存在する積算滞在時間を十分に長くするために、繰り返し処理を行ってもよい。これにより、樹脂テープ表面に均一にスパッタリングすることができ、十分な導電性を簡易に確保することができる。この場合には、導電化処理したテープ１３を巻き取ったリールを、再度スパッタ装置１２０のテープ送り出し側の回転軸１８－２にセットして再度スパッタリングする。複数回のスパッタリング行う場合、一方向に複数回走行させてもよいが、回転軸１８－１、及び１８－２の回転方向を逆向きに切り替えてチャンバ内を往復させてもよい。なお、テープ１３の搬送速度は、樹脂テープの材質、スパッタ電流の大きさ、スパッタリングターゲットの種類、スパッタ圧力などに依存するので、予めの実験により最適な値を求めておき、設定することが好ましい。

Ｓ１１６は、テープの走行が終了した（終端が検出された）か判別する工程である。Ｓ１１５で駆動装置７がオンになると、スパッタ（導電化処理）するべきテープ３が終了したか、していないかをセンサ３３で判別する。センサ３３での判別がＹＥＳの場合には、駆動装置７を停止させることでテープ１３の走行を停止させ、一連の処理を終了する。ＮＯの場合には、Ｓ１１５を繰り返す。

以上によって、図５のスパッタ装置１２０を用い、スパッタ電極４１、４２間をテープ１３の表面が電極面と平行になるように、テープ１３を、所定の搬送速度で走行させることで、テープ１３の一方の表面に、均一にスパッタリングして導電化処理することが可能となる。

なお、スパッタリング装置では、樹脂テープを１本で搬送するか又は２本以上並行して搬送することができる。２本以上搬送する場合、本数が多くなると外側の樹脂テープの、導電性膜の膜厚が薄くなり、また、厚さのばらつきが出易いため、スパッタリングターゲットの大きさにもよるが、３本以下が好ましい。

樹脂テープ表面に形成される導電性膜は、厚くなり過ぎると凹凸ができて樹脂テープの平坦性が損なわれる場合があるため、小さい粒子性の重金属をできる限り薄く、平坦にコートすることが好ましい。また、導電性膜を形成した樹脂テープ表面の表面抵抗は、１０の１４乗Ω／ｃｍ以下であればイメージングが可能であり、好ましくは１０の１２乗Ω／ｃｍ以下程度、より好ましくは１０の１０乗Ω／ｃｍ以下である。１０の１０乗Ω／ｃｍ以下であれば良好なイメージングが可能である。尚、導電性膜は、樹脂テープ上に固定した切片を電子顕微鏡で観察したときにチャージアップしなければよいので、これを目安にしてもよい。

図１０は、本実施形態のスパッタ装置１２０のリール１５－１、１５－２で３本のテープ１３が巻き取られた状態を示す外観写真である。図１０において、テープ１３の一方の表面にはスパッタリングにより形成された導電膜が形成されている。図１０では、導電膜は金を材質として示している。
（５）切片作製
図１Ｂに戻って、工程Ｓ４では、切片を作製する工程である。本実施形態では、樹脂に包埋させた生体組織を薄く連続的に切り出して、切片を連続的に作製する。生体組織としては、動物の組織であれば特に限定されず、一例として実験動物であるマウスやマーモセットなどの脳を用いる。

図１１に、本実施形態の切片作製（Ｓ４）と切片回収（Ｓ５）の詳細工程図を示す。

図１Ｂの切片作製の工程（Ｓ４）は、図１１のＳ４－１の切片作製（試料準備）と、これに続くＳ４－２の切片作製（樹脂包埋）により行われる。図１１のＳ４－１の試料準備では生体組織を採取する。図１１のＳ４－２の樹脂包埋においては、Ｓ４－１で取得した生体組織を樹脂包埋させ、樹脂包埋ブロック（組織ブロック５１）を作製する。組織ブロック５１から試料用の切片が切り出される。

樹脂包埋は、公知の手法で行うことができる。本実施形態では、グルタルアルデヒド（２．５ｗｔ％）とオスミニウム酸（１ｗｔ％）とで順に固定化した後、エポキシ樹脂で包埋して重合を行い、樹脂包埋ブロックを作製した。この方法のほか、例えば、ＴＥＭ（透過電子顕微鏡）、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）、更にimmuno-EM（免疫電子顕微鏡という染色したサンプルの観察方法）などで用いられる樹脂包埋の手法であってもよい。

工程Ｓ５は切片を回収する工程である。図１１のＳ５の切片回収（連続）において、Ｓ４－２で作製した樹脂包埋ブロック（組織ブロック５１）からダイヤモンドナイフ５２などの切削具で切片５４を順次、連続的に切り出し、処理済みのテープ６３の上に回収する。

切り出された切片５４は水ポート５９に収容した水の表面に順次浮上して、処理済みのテープ６３上にすくい取られて連続的に搬送される。水ポート５９の水面に浮上した切片５４は、処理済みのテープ６３を移動（図１１では紙面の左方向に移動）させることで、テープ６３の導電化処理された表面に連続して自動的に回収される。

切片５４は、通常、厚さ２５ｎｍから９０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍから６０ｎｍの範囲内の厚さで切り出される。切片５４の厚さはより好ましくは５０ｎｍである。切片５４は薄すぎると切り出しが困難になり、厚すぎると、電子顕微鏡観察時にチャージアップして観察が困難になるおそれがある。

図１Ｂに戻って、工程Ｓ６では、工程Ｓ５で個々の切片５４を搭載した樹脂テープを所定の長さに切断して、切片５４付きのストリップにする。テープストリップ上には、順次固定された１以上の切片５４が配置されている。

工程Ｓ７は、テープストリップ上に固定された切片５４を、電子染色する工程である。電子染色としては、例えば、飽和酢酸ウラン溶液などを用いたウラン染色と、レイノルド鉛溶液を用いた鉛染色とを行うことができる。

本実施形態では、導電化処理したテープ６３の表面に生体組織から切り出した切片５４を固定した後に電子染色することができる。膜厚が２５ｎｍから９０ｎｍの薄い切片に直接に電子染色が可能である。またテープ６３に搭載した複数の切片５４を同じ濃度で電子染色することができ、極めてコントラストが高く、高分解能の電子染色が可能である。これに対し、切片を切り出す前の組織ブロックの段階で電子染色する従来の方法では、厚く大きいブロックに電子染色するために、表面と内部とでは電子染色の度合が異なり、本実施形態のように均一かつ完全な電子染色はできない。

工程Ｓ８では、工程Ｓ６で切断、工程Ｓ７で電子染色した後のテープを電子顕微鏡観察用のウェハー上に整列する。テープをウェハー上に整列し、その後電子顕微鏡観察用の、導電性ペースト（銀ペースト等）を用いて固定する。

図１２は、ウェハー上に切断したテープストリップを整列した状態（Ｓ８）を説明する図である。

図１２のＳ８－１で、１以上の切片が固定されたテープストリップ６３ｓを準備する。テープストリップ６３ｓは、所望の数の切片５４を含む長さにカットしたものである。テープストリップ６３ｓの長さは、テープストリップ６３ｓが固定されるウェハーの大きさに合わせればよい。テープストリップ６３ｓには、既述した図１のＳ２，Ｓ３の工程により両表面に親水化処理がなされるか、一方の表面に導電化処理がなされるか、又は必要に応じて両方の処理が施されている。また、テープストリップ６３ｓ上の切片５４には、電子染色がなされている。

図１２のＳ８－２で、テープストリップ６３ｓを順次ウェハーに載置した状態を示す。ウェハーは、円形ウェハー６０１を用いてもよいし、矩形ウェハー６０２を用いてもよい。ウェハーの表面に導電性カーボン両面テープを貼り、この上に電子染色されたテープストリップ６３ｓを順次並べる。配置後に、切片５４の上から電子顕微鏡用の導電性の銀ペースト、カーボンペースト等で接着する。円形のウェハー６０１は、４インチの他に、５、６、７、８インチ等があるが、必要に応じて選択すればよい。

矩形のウェハー６０２を用いる場合は、円形のウェハー６０１がそのまま利用可能であるのに比べて、ウェハーを所定の形状に切り出す作業を要するが、一定の長さのテープストリップ６３ｓに切り出すことができる。カットの長さを一定に保ち、一枚のカットしたテープストリップ６３ｓに搭載される切片５４の数を一定化し、マルチビーム走査電子顕微鏡にて一回で観察可能な枚数を最大化することができる。

図１２のＳ８－３で、ライブラリを作成する。切片５４を搭載したテープストリップ６３ｓが配列されたウェハーを多数、保存し管理する。多数のウェハーを整列させたライブラリを構成することにより、樹脂包埋された生体の組織ブロック５１から連続して切り出した切片６４を整列させて保存できると共に、任意の場所の切片５４の電子顕微鏡画像を観察し分析できる。また、後日に何回でも、所望の場所の切片５４を追加で観察できる。

図１Ｂに戻って、工程Ｓ９では、上記実施形態の方法で得た電子顕微観察用の試料を用いて、切片の観察や、画像の取得・分析を行う。実施形態の方法で得た電子顕微観察用の試料を用いることで、電子顕微鏡などを用い、ウェハー上に整列して固定された切片５４を、チャージアップなしに高コントラストかつ高分解能で観察することができる。

図１３Ａは、電子顕微観察の例を示す図である。（ａ）は蛍光顕微鏡による試料Ｓ－ａの観察、（ｂ）は透過電子顕微鏡による試料Ｓ－ｂの観察、（ｃ）は走査電子顕微鏡による試料Ｓ－ｃの観察を示す。（ａ）の蛍光顕微鏡では、図１２のライブラリに収容されたウェハー上の切片５４からの蛍光を観察することができる。最大分解能は約２００ｎｍ、倍率は１０～４０倍程度が得られる。

（ｂ）の透過電子顕微鏡では、切片５４を透過した電子線の情報から切片５４の拡大画像を高分解能で生成することができる。最大分解能は約０．１ｎｍ、倍率は５０から１５０万倍程度が得られる。

（ｃ）の走査電子顕微鏡では、切片５４を走査した電子線の情報から切片５４の拡大画像を高解像で生成することができる。最大分解能は約０．５ｎｍ、倍率は１００万倍程度が得られる。

図１３Ｂは、連続的な画像取得の例を示す。これは、図１３Ａの走査電子顕微鏡で、ウェハー上に固定された複数の連続した切片５４について、順次観察データを取得して生成された連続的な画像である。

図１４は、図１Ｂの観察及び画像分析（Ｓ９）の別の例を示す。Ｓ９－ａで、連続的に取得された画像を、サーバコンピュータに蓄積する。サーバコンピュータに蓄積された画像は、ネットワークあるいはクラウドを介して共同研究者によって共有され、画像観察が可能になる。

図１４のＳ９－ｂは、サーバコンピュータに蓄積した切片の連続画像を、サーバコンピュータ内で重ね合わせて得た画像である。

図１４のＳ９－ｃは、Ｓ９－ｂで重ね合わせた画像をもとに、解析対象を色づけした画像の一例を示す。このように、解析対象の部位を明瞭となるようにすることができる。

図１４のＳ９－ｄは、三次元解析図の一例を示す。Ｓ９－ｂで解析対象の連続した多数の画像を取得し、これらのうち適切なもの選択して重ね合わせ、解析しようとする所望の「神経回路」の部位の三次元構造を明瞭化する。更に、厚さ方向の連続した多数の画像をもとに三次元構造を再現（復元）してもよい。

図１５は、本実施形態で作製された試料から得られる具体的な電子顕微画像の例である。図１５の（Ａ）で、切片のサイズ２ｍｍ×３ｍｍの領域の連続画像を１枚の画像に合成したものの中から、画像中の一部を拡大した拡大画像の１例を示す。

図１５の（Ｂ）に、比較例で取得した参考画像例を示す。比較例では、樹脂テープの導電化処理をせず、テープ上に搭載した切片の上から導電性コートした試料の走査顕微鏡画像である。走査型電子顕微鏡で観察する際のチャージアップを防ぐために、切片の上から薄く導電性（金やカーボン）コーティングを施して、この上から電子ビームを照射しつつ平面走査したものである。この方法では、切片の上に導電性コートされているために、当該導電性コートされた面からしか２次電子が放出されない。導電性コートした下の試料切片からの２次電子の放出がほとんどなく、コントラストが極めて低くなったものである。

本実施形態の電子顕微鏡観察方法では、切片の上から導電性コーティングをしなくても、導電化処理したテープ上に固定し、電子染色した切片から直接に２次電子放出を検出することができる。図１５の（Ａ）のような高コントラスかつ高分解能の画像を取得することが可能である。

次に実施例について説明する。本発明は以下の実施例に限定されない。

図１Ｂに示す工程によって、マーモセットの脳から採取した切片の透過電子顕微鏡連続画像を取得した。
（樹脂テープの親水化）
樹脂テープとしてカプトン(登録商標)テープ（ポリイミド製、厚み４０μｍ、幅約８ｍｍ）を用い、樹脂テープの両表面をエタノールでふき取り清浄化した。

図２に示すのと同様のプラズマ処理装置１１０を用い、樹脂テープをチャンバ内で走行させて、両表面を親水化した。プラズマ処理は、プラズマ処理装置のチャンバ内を真空排気した後、酸素ガス雰囲気にした。プラズマ電流値を２５ｍＡに調整し、回転軸の回転速度を調節することで、テープ搬送速度を、３０秒～１分程度／２００ｍｍの範囲の値にして行った。このようにして両面が親水化された樹脂テープを作製した。親水化された樹脂テープは、プラズマ処理装置１１０の出口に設置したリールに巻き取った。プラズマ処理装置１１０においては入口側のリールと出口側のリールをそれぞれ1つずつ配置し、プラズマ電極２の対向面に対してテープ表面が垂直となるように搬送して１本のテープをプラズマ処理した。リールの内径は４０ｍｍ、外径は７５ｍｍであって、テープの巻かれた状態では、テープの巻き径はテープの厚みの分だけ増加し、テープの搬送速度も、巻き径が大きい分速くなる。
（樹脂テープの導電化）
上記で親水化した樹脂テープ表面に、次のように導電性膜を形成した。図５に示すのと同様のスパッタ装置１２０を用い、樹脂テープをチャンバ内で走行させて、樹脂テープの一方の面に導電性膜を形成した。処理条件は装置の設定として、電流値が１０ｍＡ、テープ搬送速度が１０－２０分程度／２００ｍｍの範囲の所定の値で、樹脂テープをチャンバ内に２回走行させた。これは、いったんリールに巻き取ったテープをスパッタ装置１２０に再度セットして、2回目は1回目とはテープの反対の端からチャンバ内に走行させて行った。チャンバ内は真空排気した。スパッタリングターゲットとしては、金ターゲットを用いた。スパッタ装置においては入口側のリールと出口側のリールをそれぞれ３つずつ配置し、スパッタ電極の対向面に対してテープ表面が平行となるように３本のテープを搬送してスパッタリングした。スパッタ装置のリールの内径は４０ｍｍ、外径は７５ｍｍであって、テープの巻かれた状態では、テープの巻き径はテープの厚みの分だけ増加し、テープの搬送速度も、巻き径が大きい分速くなる。
（切片の作製）
マーモセットから採取した脳を、適当なサイズに切り出し、２．５ｗｔ％グルタルアルデヒドと１ｗｔ％オスミニウム酸とで順に固定化した後、エポキシ樹脂で包埋して７２時間以上の重合を行った。このようにして、樹脂包埋ブロックを作製した。
（切片の回収）
水ボート付ダイヤモンドナイフを用いて、上記で得た樹脂包埋ブロックから厚さ５０ｎｍの組織切片を連続的に切り出し、切り出された組織切片を、水ボートの水の浮力によって上記で形成された樹脂テープの導電化された表面上に順に採取した。

表面に組織切片の配置された樹脂テープを、走査電子顕微鏡観察用のシリコーンウェハー（直径４インチ）の大きさに合わせて所定の長さに切断し、ウラン（飽和酢酸ウラン溶液）と、その後、鉛（レイノルド鉛溶液）とで電子染色した。電子染色した樹脂テープを、シリコンウェハー上に組織切片が表面になるように順に並べ、その表面から走査電子顕微鏡観察用の導電性銀ペーストを塗布して固定した。

このように、樹脂包埋ブロックから切り出した組織切片が切り出し順に固定されたウェハーからなる観測用ウェハーを得た。この観測用ウェハー用い、マルチビーム走査電子顕微鏡によって、マルチビーム連続観察、および連続撮影を行った。図１５の（Ａ）に示す画像は、観察結果の中の一枚である。図１５の（Ａ）で使用した切片搭載前の樹脂テープの導電性コートされた面の表面抵抗を測定したところ、１０の１０乗Ω／ｃｍ以下であった。表面抵抗は、ハイレスターＵＸ（三菱ケミカルアナリティック社製）を用いて測定した。

なお、スパッタリング装置で使用したターゲットをＰｔ－Ｐｄ合金ターゲット（Ｐｔ９０ｗｔ％－Ｐｄ１０ｗｔ％）に変更した場合には、上記実施例よりはやや劣るものの、解析に十分なコントラストの画像が得られた。

また、スパッタリング装置の電流値を装置の設定でそれぞれ２０ｍＡ、４０ｍＡにして、上記同様に走査電子顕微鏡観察した。いずれも上記実施例と同様の鮮明なコントラストを得ることができた。４０ｍＡを採用した例では、一部に、樹脂テープ上に採取した組織薄片表面に微細なしわや傷が観察されたものがあった。これは、樹脂テープ表面にスパッタリングされたターゲット粒子の影響であると推測される。

上記ではマーモセットの脳を用いて走査電子顕微鏡観察を行ったが、マウスの脳を用いた場合も図１５の（Ａ）と同様に、高コントラストかつ高解像度の画像が取得された。
（比較例）
図１５の（Ｂ）を参照して述べたように、樹脂テープに導電性膜を付着させない以外は、上記実施例と同様に、マウスの脳を用いて組織切片付樹脂テープを作製し、ウェハー上に固定した。次いで、組織切片付樹脂テープを載置したウェハー表面に、組織切片上から重金属カーボンコーティングを施し、マルチビーム走査電子顕微鏡観察、撮影を行った。図１５の（Ｂ）に示されたとおり、この撮影画像では解析に十分なコントラストが得られなかった。
（その他の実施例）
図１６は、ポリカーボネート製のテープを使用して、搭載した切片の電子顕微鏡観察した結果を示す。テープの材料を除いて、テープの幅、厚さ、用いた組織切片は、図１５の（Ａ）のポリイミドのテープを用いた実施例と同じである。図１３Ｂに示したように連続的に撮影された電子顕微観察画像を一枚の画像につなぎ合わせた中の一部分の拡大図である。図１５の（Ａ）と同様に、良好なコントラストが得られている。試料切片搭載用のテープとして、ポリカーボネートだけではなく、上述したＰＥＮ、ＰＥＴ、ＰＥＥＫを用いるときも、図１５の（Ａ）、及び、図１６と同様に良好なコントラストが得られた。

この国際出願は、２０１８年１２月２８日に日本国特許庁に出願された特願２０１８－２４８０６７号を優先権の基礎とし、その全内容を含むものである。

２、４１、４２：スパッタ電極
３、１３：テープ
５－１、５－２、１５－１、１５－２：リール
６、１６：筐体
７、１７：駆動装置
１１、３１、３２：ガイド軸
１２、３３：センサ
１４：導電性膜
１８－１，１８－２：回転軸
１９：排気機構
２０：ブレーキ機構
２３：ニードルバルブ
５１：組織ブロック
５２：ダイヤモンドナイフ
５３：回収される切片
５４：連続切片
１００ 試料作製システム
１１０ プラズマ処理装置
１１５ 制御装置
１２０ スパッタ装置
１２５ 制御装置
１３０ 回収装置

Claims (12)

1. テープ上に試料の切片を配置した電子顕微観察用の試料作製システムであって、
   樹脂テープをプラズマ照射領域内で走行させてプラズマ照射して連続的に親水化するプラズマ処理装置と、
   前記プラズマ処理装置で処理された前記樹脂テープの被処理面上に、連続的に切削された前記試料の切片を順次回収する回収装置と、
   を備え、
   前記プラズマ処理装置は、互いに対向する一対のプラズマ電極を有し、前記樹脂テープは、前記樹脂テープの表面が前記一対のプラズマ電極の対向する電極面に対して垂直となるように搬送されることを特徴とする電子顕微観察用の試料作製システム。
2. 前記樹脂テープをスパッタリング領域内で走行させて連続的にスパッタリングして導電化するスパッタ装置、
   をさらに備え、前記樹脂テープの上に順次回収された前記切片は、当該切片の上から導電性コーティングなしに電子顕微鏡観察が可能であることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微観察用の試料作製システム。
3. 前記樹脂テープは、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリエーテル・エーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートから選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の電子顕微観察用の試料作製システム。
4. 前記スパッタ装置は、
   スパッタリングチャンバと、
   前記スパッタリングチャンバ内に対向して配置された一対のスパッタ電極と、
   前記樹脂テープをその長手方向に、前記スパッタリングチャンバ内の前記一対のスパッタ電極の間の前記スパッタリング領域内で搬送する第２の搬送手段と、
   前記第２の搬送手段によるテープ搬送速度を調整する第２の駆動装置と、
   を備え、
   前記第２の搬送手段は、前記樹脂テープを前記スパッタリング領域に送り出す第３のリールと、前記スパッタリング領域から前記樹脂テープを巻きとる第４のリールとを備え、
   前記第３のリールおよび前記第４のリールは前記スパッタリングチャンバ内に設置され、前記第２の駆動装置は前記第４のリールに回転力を与え、所定の回転速度で回転させることを特徴とする、請求項２に記載の電子顕微観察用の試料作製システム。
5. 前記第２の搬送手段は、前記一対のスパッタ電極の対向面に対して、前記樹脂テープの表面が水平方向となるように前記樹脂テープを搬送させることを特徴とする請求項４に記載の電子顕微観察用の試料作製システム。
6. 前記一対のスパッタ電極の陰極にスパッタリングターゲットが配置され、
   前記スパッタリングターゲットは、Ａｕ、Ａｇ，Ｐｔ，Ｐｄのうち１種又はこれらの２種以上の合金としたことを特徴とする請求項４に記載の電子顕微観察用の試料作製システム。
7. 前記樹脂テープを、前記プラズマ処理装置又は前記スパッタ装置内に走行させるテープ搬送機構、
   をさらに有し、前記テープ搬送機構は、
   前記樹脂テープを送り出す送り出しリールと、前記樹脂テープを巻き取る巻き取りリールと、
   前記巻き取りリールを固定することで前記巻き取りリールと一体となって回転する回転軸と、
   前記回転軸を回転させるモーターと、
   前記回転軸に摺接する長尺板からなり、前記回転軸が回転することで前記回転軸に摩擦力を与えて前記回転軸の回転速度を制御するブレーキ機構と
   を有することを特徴とする請求項２に記載の電子顕微観察用の試料作製システム。
8. プラズマ処理チャンバと、
   前記プラズマ処理チャンバ内に対向して配置された一対のプラズマ電極と、
   前記一対のプラズマ電極の間に電流を印加する第１の電源装置と、
   樹脂テープをその長手方向に、前記一対のプラズマ電極の間のプラズマ照射領域内に搬送する第１の搬送手段と、
   前記第１の搬送手段によるテープ搬送速度を調整する第１の駆動装置と、
   を備え、
   前記第１の搬送手段は、前記樹脂テープを前記プラズマ照射領域に送り出す第１のリールと、前記プラズマ照射領域から前記樹脂テープを搬巻き取る第２のリールとを備え、前記樹脂テープの表面が前記一対のプラズマ電極の対向面に対して垂直となるように前記樹脂テープを搬送させることを特徴とするプラズマ処理装置。
9. 前記第１のリール及び前記第２のリールは、前記一対のプラズマ電極の前記対向面と平行になるように前記プラズマ処理チャンバ内に配置され、前記樹脂テープの前記表面が前記一対のプラズマ電極の対向面に対して垂直となるように前記樹脂テープを搬送させることを特徴とする請求項８に記載のプラズマ処理装置。
10. テープ上に試料の切片を配置した電子顕微観察用の試料作製方法であって、
    樹脂テープをプラズマ照射領域内で走行させて前記樹脂テープの表面にプラズマ照射して親水化処理するステップと、
    前記親水化処理を施した前記樹脂テープの上に、連続的に切削された切片を順次回収する回収ステップと、
    を有し、前記親水化処理するステップでは、前記樹脂テープの前記表面が互いに対向する一対のプラズマ電極の対向面に対して垂直となるように前記樹脂テープを搬送することを特徴とする電子顕微観察用の試料作製方法。
11. 前記樹脂テープをスパッタリング領域内で走行させて前記樹脂テープの前記表面に導電性材料をスパッタリングして導電化処理するステップ、
    をさらに有し、
    前記親水化処理と前記導電化処理を施した前記樹脂テープの上に、前記切片を順次回収する、請求項１０に記載の電子顕微観察用の試料作製方法。
12. 前記切片が配置された前記樹脂テープを１以上の前記切片を含む長さにカットして得られるテープストリップを基板上に固定し、
    該基板上に固定された各切片への導電性コーティングなしに電子顕微鏡観察、または画像を取得することを特徴とする請求項１１に記載の電子顕微観察用の試料作製方法。

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