JP4939263B2 - 高感度質量分析装置および分析方法 - Google Patents
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Description
(1)生体組織や細胞からのタンパク質の抽出。
(2)抽出物(液)からのタンパク質の分離。
(3)分離されたタンパク質またはその分解物としての(ポリ)ペプチド等の分析。
(4)得られた分析結果の同定。
本発明の質量分析装置は、図13に示すように、試料切片を調製するための試料切片調製部1と、この試料切片調製部で調製された試料切片に対して飛行時間型質量分析を行うための質量分析部2と、を少なくとも有して構成される。以下、装置各部について説明する。
試料切片調製部には、少なくとも、試料保持機構3、切刃4及び切刃位置制御機構5が設けられている。
試料保持機構3は、切刃による試料切断時に試料6を確実に保持しておくための機構を有し、試料切片などの調製において用いられている試料保持機構を利用して構成することができる。例えば、ミクロトームやSAICASで用いられている試料ホルダーなどを切刃保持機構として利用することができる。
切刃4としては、試料保持機構に保持された試料を切断し、切断により生じた試料切片を切刃の所定面に載置可能である構造を有するものが用いられる。また、本発明においては、切刃面に載せた試料切片に対して質量分析のためのビーム照射が行われるので、切刃としては、かかるビーム照射処理に適合したものが選択される。かかる目的用途に適した切刃であれば、いかなるものでも良いが、市販されているミクロトーム、SAICASの切刃が好ましい。ミクロトームとは、試料を顕微鏡で見るために薄く切る前処理装置であり、滑走式、回転式などがある。ミクロトームは、主に病理検査のときに使われ、一般的には、細胞をミクロトームで2ミクロンや3ミクロンの厚さに切り、薬剤で染色をして顕微鏡で観察するために用いられる。最近では素材の研究等にも多く使われるようになり、切断した物の表面は1ミクロン以下の精度で平坦になっているため、研究用途などではその表面を観察したりもされている。例えば写真の感光フィルムの断面を観察したり、ゴム素材の密度を観察したりするときに使用される。SAICASとは、鋭利な切刃を用いて、素材の表面から内部にかけて切込み、切刃に生ずる抵抗力を検出するシステムである。市販のSAICAS装置では、測定される膜厚が0.1〜1000μmであるが、原理的には1Åから切断することが可能である。このときの試料切断の空間分解能は、切刃の位置制御能力により決定する。なお、適切な膜厚については後述する。
本発明の試料はいかなる材質、形態を有するものでも良いが、好ましくは、生体組織、細胞である。
(1)下限の設定理由
生体組織や細胞に存在するタンパク質(大きさが10nm未満)を切断しない範囲であること。
(2)上限の設定理由
試料厚さ数十nm程度の有機試料であれば、容易にイオンビームが前記金属薄膜表面に達し、後述のイオン増感効果を発揮すること。また、試料形態が生体組織や細胞である場合、その内容物の多くが水であり、真空測定時には水分は蒸発する。前記範囲の上限の設定理由には、上記(2)の理由に付け加えて、真空時における水分蒸発後の切片の膜厚が凍結時のおよそ数重量%乃至30重量%程度になること、が挙げられる。すなわち、切断する際に100nm以下の厚さであれば、イオンビーム照射時には試料厚さを数十nm以下にすることができる。なお、水分蒸発によって切刃上に付着したタンパク質等の物体を質量分析する際には、多くの分子がイオン増感効果により効率良くイオン化され、質量分析を可能にするものと考えられる。
本発明の質量分析装置は、液滴付与機構を有していても良い。かかる装置の一例の模式的な断面図を図14に示す。図14中、液滴付与チャンバー13は、液滴付与機構14を有している。液滴付与機構14は、本発明の質量分析装置内において、試料切断によって切刃面に付着した試料切片に対し、位置精度を保持したまま溶液15を付与するための機構である。液滴付与機構は、試料切片調製部あるいは質量分析部と同じ室内にあってもよいが、好ましくは別途チャンバーを設け、常温常圧の状態で使用できる方がよい。さらに好ましくは、本チャンバーは湿度コントロールが可能であることが好ましい。また、本チャンバーは溶液処理後には、真空状態にもできるものであることが好ましい。液滴付与機構の形態としては、インクジェット装置が好ましく、ピエゾ方式、バブルジェット方式のどちらの装置を用いてもよい。前記溶液15としてペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどの消化酵素を含む溶液を用いれば、試料切片中に存在するタンパク質を分解し、高感度な領域で質量分析を行うことができる。酵素溶液付与の際、切片に付与した液滴が互いに接触しないよう、付与量と距離を調節することが好ましい。
飛行時間型質量分析を行う質量分析部2に用いられる質量分析装置は、切刃面に載置された試料切片の質量分析が可能である構成を有する装置であればよい。例えば、少なくも以下の各構成要素を用いて質量分析部を構成することができる。
(1)試料切片を保持するホルダーを有する、分析チャンバー2。
(2)試料切片にビームを照射するためのビーム発生源、ビームを所定位置に照射するための光学系などを有するビーム照射手段8。
(3)分析チャンバー内の雰囲気を測定条件(真空)に整えるための雰囲気調整手段9。
(4)二次イオンなどの検出計10。
金蒸着切刃で切断した生体組織切片のポリペプチドをTOF−SIMS分析する。生体組織6(ヒト癌組織:Tissue Microarray Human Tumor Tissue(Lymphoma))をSi基板3上に付着させ、ロードロックチャンバー1内に保持させる(図2(a))。基板が保持されたロードロックチャンバー内の温度を−80℃に設定し、生体組織を凍結させる。このときの試料厚さは約100nmである。上面に金薄膜7が形成された切刃4を操作して、図3のように生体組織を斜めから切断する。このとき切刃の上面には、クロム薄膜5nmを介して、金薄膜10nmを積層させている。切断することによって切刃上面に付着した生体組織の切片11(図4(a))を分析チャンバー2内のTOF−SIMS検出計10の真下に水平になるように移動させる(図2(b))。分析チャンバー2内は室温下、超高真空であり、切刃上面に付着した生体組織は、内容物が切刃上面に付着したまま、水分が昇華される(図4(b))。このときの試料厚さは約20nmである。試料表面に対しパルスイオンビーム(一次イオンビーム)12を照射し、発生した二次イオンを検出する二次元的なスキャンにより、図4(b)の切片内容物を質量分析し、イメージングする。分析によって得られる細胞膜由来のPO3イメージ(図5(a))およびポリペプチド特有のイメージ(図5(b))のイメージング結果によって、生体組織内の特定の細胞内にポリペプチドが存在することがわかる。
金蒸着のない切刃を持つSAICAS装置で切断した生体組織切片のポリペプチドをTOF−SIMS分析する。
金蒸着切刃で多重に切断した複数の生体組織切片に含まれるポリペプチドをTOF−SIMS分析することにより、生体組織の3次元的分析を行う。
本実施例においては、以下の点を除き、実施例1と同様にして金蒸着切刃で切断した生体組織切片のポリペプチドをTOF−SIMS分析する。本実施例では、図14(a)と14(b)に示すように、生体組織切片が付着した切刃を溶液付与チャンバーに移動させ、インクジェットで酵素溶液を付与する。具体的には、切断することによって切刃上面に付着した生体組織の切片11(図4(a))を、溶液付与チャンバー13に移動させ、インクジェット14の真下に水平になるよう移動させる(図14(b))。常温常圧下、リン酸緩衝溶液(pH7.4)にトリプシン(CHEMICON社製)を含む酵素溶液を、切片11上にインクジェットにて付与する。1時間後、インクジェットから溶液が出ないよう処置し、溶液付与チャンバーを真空にする。真空に達すると、切刃上面に付着した生体組織は、内容物が切刃上面に付着したまま、水分が昇華される(図4(b))。このときの試料厚さは約20nmである。切刃上面に付着した生体組織の切片11を分析チャンバー2に移動させ、TOF−SIMS検出計10の真下に水平になるように移動させる(図14(c))。
2 質量分析部(分析チャンバー)
3 試料保持機構(Si基板)
4、4a、4b 切刃
5 切刃位置制御機構
6 生体組織
7、7a、7b 金属薄膜
8 ビーム照射手段
9 雰囲気調整手段
10 検出計
11、11a、11b 切片
12 ビーム
13 液滴付与チャンバー
14 液滴付与機構
15 溶液
Claims (10)
- 分析用の試料切片を調製するための試料切片調製部と、該試料切片調製部で調製された試料切片の飛行時間型質量分析を行う質量分析部と、を有する質量分析装置であって、
前記試料切片調製部は、試料を保持するための試料保持機構と、切刃面の少なくとも一部に金属薄膜を有する切刃と、前記切刃の位置を制御して、試料の切断と切断により生じた試料切片の切刃面への載置とを行うための切刃位置制御機構と、を有し、
前記質量分析部は、前記切刃を保持する切刃保持機構と、該切刃の前記試料切片が載置された面にパルスレーザーあるいはパルスイオンビームを照射するためのビーム照射機構と、を備えている
ことを特徴する質量分析装置。 - 前記試料の切断時に、前記切刃面が上面となるように前記切刃が位置制御される請求項1に記載の質量分析装置。
- 前記金属薄膜が金薄膜である請求項1に記載の質量分析装置。
- 前記パルスレーザーあるいは前記パルスイオンビームは、ピコ秒からナノ秒のパルス幅を有する請求項1に記載の質量分析装置。
- 前記試料保持機構を配置した領域と前記ビーム照射が行われる領域は、それぞれ独立して温度及び湿度の制御が可能となっている請求項1に記載の質量分析装置。
- 前記試料がポリペプチドを含む請求項1に記載の質量分析装置。
- 前記質量分析が飛行時間型二次イオン質量分析である請求項1に記載の質量分析装置。
- 前記切刃面に付着した試料切片に、液滴を付与するための液滴付与機構を更に備えている請求項1に記載の質量分析装置。
- 試料切片にパルスレーザーあるいはパルスイオンビーム照射することにより、該試料切片内の分子をイオン化して飛行時間型質量分析を行う質量分析方法において、
切刃面の少なくとも一部に金属薄膜を有する切刃により試料を切断し、該切刃面に付着した試料切片に、パルスレーザーあるいはパルスイオンビーム照射することを特徴とする質量分析方法。 - 前記切刃面に付着した試料切片に、消化酵素溶液を付与する工程を含む請求項9に記載の質量分析方法。
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