JP7457899B2 - 修飾された免疫細胞及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は免疫細胞治療の分野に属する。具体的には、本発明は、遺伝子修飾された免疫
細胞により、免疫細胞の固形腫瘍内でのホーミング及び凝集を強化させ、さらに免疫細胞
例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍に対する治療効果を強化させる。
近年、腫瘍免疫療法は急速に発展し、特に養子性細胞療法（ＡＣＴ）、即ち患者の体内
からＴ細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞を分離し、インビトロ修飾により増幅培養し、その
後患者の体内に戻して腫瘍治療を行う方法を指す。２０１３年、腫瘍の免疫療法はＳｃｉ
ｅｎｃｅ雑誌により「１０大ブレークスルー」のトップに選ばれた。
ＣＡＲ－ＴとＴＣＲ－Ｔは養子性細胞療法の重要な構成部分であり、特にＣＡＲ－Ｔ療
法は血液腫瘍の治療には顕著な成果を遂げており、高い寛解率を得て、典型的なＣＡＲ構
造は、細胞外に腫瘍抗原を識別するｓｃＦｖ、ヒンジ領域と膜貫通ドメイン、細胞内共刺
激シグナルと活性化ドメインの３つの部分から構成される。第１世代のＣＡＲは細胞内共
刺激シグナルを含まず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は殺傷活性が低く生存期間が短い。そのため、第
２世代のＣＡＲは共刺激シグナル、例えばＣＤ２８や４－１ＢＢを追加し、異なる共刺激
シグナルを採用したＣＡＲ－Ｔ細胞の特性も同じではなく、ＣＤ２８はＣＡＲ－Ｔ細胞の
殺傷活性を高め、４－１ＢＢはＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性を高めると同時にＣＡＲ－Ｔ細
胞の生存時間を延長する。それ以降、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを共に発現させ
る第３世代のＣＡＲが出現したが、その抗腫瘍効果は第２世代のＣＡＲ－Ｔよりも低かっ
た。したがって、現在、臨床的に応用されているのは主に第２世代のＣＡＲ－Ｔ細胞であ
る。
ＣＡＲ－Ｔ療法は血液腫瘍の治療には成果が出ているだけでなく、商業化も順調に進ん
でおり、米国ＦＤＡは２０１７年に２種類のＣＡＲ－Ｔ医薬品の発売を正式に承認した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は血液腫瘍の治療には非常に有効であるが、固形腫瘍に対しては治療
効果が不十分であり、寛解率が低く、オフターゲットなどの毒性や副作用が発生しやすい
。ＣＡＲ－Ｔ細胞が固形腫瘍で有効に凝集できないことはＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果に影
響を与える重要な要素の１つであり、すでにＣＡＲ－Ｔ細胞を局所的に注入する方法を採
用して腫瘍細胞でのＣＡＲ－Ｔ細胞の数を増加させて、その抗腫瘍活性を高める研究があ
るが、この注入方法の使用範囲は小さい。そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍内でのホ
ーミングを誘導する新しい方法が依然として必要である。科学研究者はＣＡＲ－Ｔ細胞に
よる固形腫瘍治療について大量の研究を行い、様々な方法でＣＡＲ－Ｔ細胞を改良し、例
えば、特許ＣＮ１１０１５７６８２Ａにおける人工標的修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞、その
製造方法及び使用は、代謝的に修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞、その製造方法及び使用に関し
、ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面にアジドなどを結合した糖類、アミノ酸などの生物活性分子を標
識することにより、生物活性分子が生体内でＣＡＲ－Ｔ細胞を腫瘍部位に効果的に標的誘
導することができるようにするが、体内のこの標的化と引き寄せはＣＡＲ－Ｔ細胞上の特
異的ＣＡＲ分子が腫瘍部位で腫瘍抗原と結合し、それによってＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的活
性化を刺激し、より効率的な腫瘍殺傷能力を達成する。特許ＣＮ１１０１４４３２５Ａに
おける標的Ｔリンパ球、その製造方法及びその使用は、標的Ｔリンパ球を提供し、ＤＲ５
を標的とするキメラ抗原受容体ＣＡＲＤＲ５及び／又はｃ Ｍｅｔを標的とするキメラ抗
原受容体ＣＡＲ ｃ Ｍｅｔを含み、ＣＡＲ ＤＲ５はＤＲ５に特異的に標的とすること
ができ、ＣＡＲ ｃ Ｍｅｔはｃ Ｍｅｔに特異的に標的とすることができ、それによっ
て、患者の体内でのＴ細胞の増幅を促進し、腫瘍細胞を効率的かつ特異的に殺傷し、腫瘍
細胞の逃避の発生を効果的に抑制し、細胞の活性及び殺傷力をより良好に維持することが
できる。
ケモカイン系は免疫細胞の遊走に重要な役割を果たしている。例えば、Ｔ細胞のリンパ
節へのホーミング、骨髄における造血幹細胞の滞留などの過程にはケモカイン系の関与が
必要である。ケモカインは免疫細胞の遊走に関与するだけでなく、腫瘍細胞の増殖、転移
などの過程にも関与する。腫瘍細胞はしばしばその増殖と転移を促進するために大量のケ
モカインを分泌する。ケモカインがＴ細胞の標的性を高めるという研究は比較的少なく、
現在公開されている文献は「Enhanced tumor trafficking of GD2 chimeric antigen rec
eptor T cells by expression of the chemokine receptor CCR2b、J Immunother、2010
”,“T lymphocytes coexpressing CCR4 and a chimeric antigen receptor targeting C
D30 have improved homing and antitumor activity in a Hodgkin tumor model,Blood、
2009”,“CXCR1- or CXCR2-modified CAR-T cells co-opt IL-8 for maximal antitumor
efficacy in solid tumors,Nat Commun,2019」があり、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＣＲ４、ＣＣ
Ｒ２ｂ又はＣＸＣＲ２の共発現はＣＣＬ１７／ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２又はＣＸＣＬ８を発
現させる腫瘍細胞への浸透に有利であり、しかし、上記の研究に適用する固形腫瘍の種類
は限定され、ケモカインファミリーと固形腫瘍の関係に対する系統的な研究が不足し、ま
た、腫瘍中でケモカインが過剰発現させるかどうかは臨床データのサポートが不足してい
る。また、サイトカインの多様性及び細胞シグナル伝達経路の複雑さに鑑みて、異なる腫
瘍における異なるケモカインの作用も同じではなく、理論分析と実際の研究結果の差がし
ばしば大きい。
本発明は、固形腫瘍に対する殺傷活性が低いという修飾された免疫細胞例えばＣＡＲ－
Ｔ細胞の欠陥を解決するために、固形腫瘍での修飾された免疫細胞の凝集を強化させる、
遺伝子修飾された免疫細胞を提供する。
本発明は、以下の技術的解決手段によって達成される。
第１態様では、本発明は、キメラ抗原受容体ＣＡＲとケモカイン受容体ＣＣＲ６とを含
み、
さらに、免疫細胞はキメラ抗原受容体ＣＡＲを発現させるとともに、ケモカイン受容体
ＣＣＲ６を過剰発現させ、
免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、好ましくはＴ細胞であり
、
任意選択的に、前記ケモカイン受容体ＣＣＲ６は過剰発現されており、
任意選択的に、標的遺伝子を免疫細胞に導入して発現させることにより、キメラ抗原受
容体ＣＡＲ及びケモカイン受容体ＣＣＲ６を得て、
任意選択的に、標的遺伝子を免疫細胞に導入する方式は、レンチウイルス、レトロウイ
ルス、アデノウイルス、一般的なプラスミドベクター、エピソームベクター、ナノ送達シ
ステム、エレクトロトランスダクション、トランスポゾン、及び標的遺伝子を免疫細胞に
送ることを実現できるほかの送達システムを含み、好ましくは、前記ウィルスはレンチウ
イルス、例えばＦＵＷ、ＣＳＩＩ－ＥＦ－ＭＣＳ又はｐＣＤＨなどの本分野における一般
的なレンチウイルスである、修飾された免疫細胞を提供する。
好ましくは、前記ケモカイン系はＣＣＬ２０－ＣＣＲ６である。
本発明では、ケモカイン受容体ＣＣＲ６を過剰発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイト
カイン分泌が影響を受けない。
本発明では、ケモカイン受容体ＣＣＲ６を過剰発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞に
対する特異的殺傷能力が影響を受けない。
本発明では、ケモカイン受容体ＣＣＲ６を過剰発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＣＬ２０
を分泌する腫瘍内へ明らかに遊走する。
本発明では、前記ＣＡＲはリーダー配列、抗原を識別するｓｃＦｖ、ヒンジ領域及び膜
貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル、細胞内活性化シグナルを含む。
任意選択的に、リーダー配列はＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に由来する。
任意選択的に、ヒンジ領域及び膜貫通領域はＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｉｇ
Ｇに由来する。
好ましくは、細胞内共刺激シグナルはＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ
）、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄに由来する。
第２態様では、本発明は関連疾患を治療する医薬品における前記免疫細胞の使用を提供
し、
さらに、前記医薬品は細胞治療に関連する医薬品であり、
前記関連疾患は腫瘍、好ましくは固形腫瘍であり、
任意選択的に、前記固形腫瘍はＣＣＬ２０を過剰発現させており、
好ましくは、子宮頸部扁平上皮癌と腺癌、結腸癌、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平
上皮癌、腎明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌、胃癌
、 及び子宮内膜癌であり、
より好ましくは、肺腺癌及び肺扁平上皮癌である。
第３態様では、本発明は、ＣＡＲを発現させるベクターとＣＣＲ６を発現させるベクタ
ーとからなり、好ましくは、前記ベクターはレンチウイルスベクターである、発現系を提
供する。
第４態様では、本発明はまた、
ＣＡＲのコード遺伝子とＣＣＲ６のコード遺伝子をＥＦ－１αプロモータを用いたレン
チウイルス発現プラスミドにそれぞれ挿入し、ＣＡＲ組換えプラスミド及びＣＣＲ６組換
えプラスミドを得ることと、
前記組換えプラスミドをそれぞれパッケージングし、第１レンチウイルスベクター及び
第２レンチウイルスベクターを得ることと、
２種類のレンチウイルスベクターを免疫細胞に順次又は同時にトランスフェクションし
て、分離することとを含む、前記免疫細胞の取得方法を提供する。
ＣＡＲのコード遺伝子とＣＣＲ６のコード遺伝子とを、２Ａ配列又はＩＲＥＳ配列を介
してタンデム連結し、次に、タンデム連結した配列をレンチウイルス発現プラスミドに挿
入し、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＣＲ６とＣＣＲ６－２Ａ－ＣＡＲ又はＣＡＲ－ＩＲＥＳ－ＣＣＲ
６とＣＣＲ６－ＩＲＥＳ－ＣＡＲを得る。
前記タンデム連結プラスミドをそれぞれパッケージングし、レンチウイルスベクターを
得て、
レンチウイルスベクターを免疫細胞にトランスフェクションして、分離する。
第５態様では、本発明はまた、キメラ抗原受容体の構築及び発現を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲのコード遺伝子、ＣＣＲ６のコード遺伝子、ＣＡＲ－
２Ａ－ＣＣＲ６コード遺伝子、ＣＣＲ６－２Ａ－ＣＡＲ、ＣＡＲ－ＩＲＥＳ－ＣＣＲ及び
ＣＣＲ６－ＩＲＥＳ－ＣＡＲコード遺伝子のコード遺伝子を人工的に合成し、配列の先端
にＸｂａＩ酵素消化部位、配列の末端にＦｓｅＩ酵素消化部位を付加する。
いくつかの実施形態では、ＸｂａＩ及びＦｓｅＩを用いてレンチウイルス発現プラスミ
ド及び標的合成遺伝子を酵素消化する。
いくつかの実施形態では、Ｔ４リガーゼで酵素消化されたレンチウイルス発現プラスミ
ド及び標的合成遺伝子を用いる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の培養系には、１００ ＵＩ／ｍＬのＩＬ－２又は１
０ ｎｇ／ｍＬのＩＬ７／ＩＬ１５組み合わせが添加されているか、又はＴ細胞培養に有
利な他の因子が含まれている。
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲはリーダー配列、抗原を識別するｓｃＦｖ、ヒン
ジ領域及び膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル、細胞内活性化シグナルを含む。
任意選択的に、
前記ＣＡＲのリーダー配列のヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に由来す
る。
前記ＣＡＲの腫瘍関連抗原ＥＧＦＲを標的とするｓｃＦｖヌクレオチド配列は配列ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２に由来する。
前記ＣＡＲのヒンジ領域及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内共刺激シグナルＣＤ２８のヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内活性化シグナルＣＤ３ζのヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５に由来する。
前記ＣＡＲのリーダー配列のアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に由来する。
前記ＣＡＲのＥＧＦＲを標的とするｓｃＦｖアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７に由来する。
前記ＣＡＲのヒンジ領域及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：８に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内共刺激シグナルＣＤ２８のアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：９に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内活性化シグナルＣＤ３ζのアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１０に由来する。
任意選択的に、細胞内の共刺激シグナルはＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯ
Ｓに由来する。
好ましくは、前記ケモカイン受容体ＣＣＲ６のヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１に由来し、アミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に由来する。
他の実施形態では、前記腫瘍関連抗原はまた、ＡＦＰ、ＢＭＣＡ、ＣＥＡ、ＣＡ－１２
５、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１７１、ＣＤ１２３、
ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ７０
、ＣＤ７１、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｈｅｒ２、ＧＤ
２、ｇｐ３６、ＧＰＣ３、ＧｎＴＶ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ
、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｃＭＥＴ、Ｐ５３、Ｐｒｏｓｔｅｉｎ、
ＰＣＴＡ－１、ＭＡＧＥ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＭＡ、ＥＴＡ、ＧＦＡＰ、
ＭＳＡ、ＭＡＲＴ－１、ＮＳＥ、ＴＡＧ－７２、ＩＬ１３Ｒα２、ＮＫＲ－２、ＲＯＲ１
、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＣＬＤ１８、ＥｐｈＡ２、ａｌｐｈａ－ｆｏｌａｔｅＲ、
ＣＡＩＸ、ＭＧ７、ＬＭＰ１、ＰＤ－Ｌ１、ＭＵＣ１、メソテリン、腺管上皮ムチン、ス
フィンゴ糖脂質、腫瘍間質抗原、内皮増殖因子、カルレティキュリン、チロシナーゼ、胎
盤アルカリホスファターゼ、チログロブリン、甲状腺転写因子１、異常なｒａｓタンパク
質、ＴＰＳＡ、ＦＰＳＡ、ＥＢウィルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトＨＰＶ抗原Ｅ６及びＥ７、
テロメラーゼ、ＨＢＶ、ｇｐ１００、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、フィブロネクチンの
エクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、ＥＬＦ２Ｍ、好
中球タンパク質エラスターゼ、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）－１、ＩＧＦ－ＩＩ、及
びＩＧＦＩ受容体から選ばれる。
従来技術に比べて、本発明で得られる有益な効果は、主として以下の点を含むが、これ
らに限定されるものではない。
本発明では、ケモカインＣＣＬ２０と固形腫瘍との関係を系統的に比較し、肺癌の臨床
例及びヒト肺癌細胞系を用いて検証を行う。
本発明の修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍での凝集を明らかに
促進し、固形腫瘍に効果的に接触できないというＣＡＲ－Ｔ細胞の欠点を解決し、さらに
、固形腫瘍へのＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤を促進し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性をさらに向
上させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療技術を固形腫瘍の治療に適用することを可能とし、固形腫瘍
に対するＣＡＲ－Ｔの治療効果が悪いという従来技術の技術的欠陥を解決する。
本発明の修飾されたＣＣＲ６＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は各種の固形腫瘍に適用でき、より広い
適用性があり、二重プラスミド系によりＣＣＲ６と異なる抗原を標的とするＣＡＲとの組
み合わせが容易になり、ＣＣＲ６＋ＣＡＲ－Ｔの適用範囲が効果的に広がる。
本発明の修飾されたＣＣＲ６＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が適用され得る固形腫瘍は、悪性度や危
害性の高いさまざまな腫瘍を含み、肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌
、乳癌、前立腺癌などの主要な臓器の腫瘍を含む。
本発明の修飾されたＣＣＲ６＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍の腫瘍病変を消滅できるだけでな
く、ケモカイン系によって殺傷されたＣＣＬ２０高発現腫瘍転移病変を追跡することもで
きる。
本発明の修飾されたＣＣＲ６＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌能及び腫瘍細胞に対
する特異的殺傷能は影響を受けないが、ＣＣＬ２０分泌固形腫瘍へのホーミング及び凝集
の能力を強化させ、患者の生存時間を延ばす。
バイオインフォマティクス分析ＴＣＧＡデータベースにおける腫瘍組織及び癌周辺の正常組織でのＣＣＬ２０のｍＲＮＡ発現レベルであり、ＣＣＬ２０は複数の固形腫瘍の腫瘍組織で高発現されている。 肺癌患者の腫瘍組織及び癌周辺の正常組織のＣＣＬ２０の分泌レベルのＥＬＩＳＡ検出であり、ＣＣＬ２０はほとんどの肺癌患者の腫瘍組織で高発現されている。 ヒト肺癌細胞系のＣＣＬ２０分泌レベルのＥＬＩＳＡ検出であり、正常なヒト肺上皮細胞ＢＥＡＳ－２ＢはＣＣＬ２０をほぼ分泌しておらず、Ｈ２３、Ａ５４９及びＣＣＬ２０過剰発現細胞系Ａ５４９／ＣＣＬ２０は高レベルでＣＣＬ２０を分泌している。 ＣＣＬ２０に対応するケモカイン受容体ＣＣＲ６の肺癌患者のＴ細胞（休止状態及び活性化状態）、特にキラー細胞ＣＤ８ Ｔ細胞での発現レベルが低い。 ＣＣＲ６及びＥＧＦＲＣＡＲレンチウイルス粒子でＴ細胞を感染し、フローサイトメトリーによってその感染効率を分析し、ＣＣＲ６＋ＥＧＦＲＣＡＲに同時感染したＴ細胞の割合が２３％である。 ＣＣＲ６の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ細胞ＩＬ－２及びＩＦＮ－γなどのサイトカイン分泌に影響を与えない。 ＣＣＲ６の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロで共培養された標的腫瘍細胞への特異的殺傷効果に影響を与えない。 ＣＣＲ６を過剰発現させたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞はＣＣＬ２０を含有する腫瘍細胞培地へ明らかに遊走している。 ＣＣＲ６＋ＣＡＲを過剰発現させたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は明らかに腫瘍細胞（黄色丸）に凝集する。 同じ注入量では、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、ＣＣＲ６＋ＣＡＲ Ｔ細胞はより優れた抗腫瘍効果を有し、担癌マウスの腫瘍の大きさが明らかに小さくなる。 ＣＣＲ６＋ＣＡＲ Ｔ注入治療を受けたマウスの腫瘍では、より多くの腫瘍浸潤Ｔ細胞が検出され、ＣＣＲ６はより多くのＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞に凝集して腫瘍の内部に入ることを促進することを示す。 従来のＣＡＲ－Ｔ注入治療に比べて、ＣＣＲ６＋ＣＡＲ Ｔ注入治療は担癌マウスの生存時間を明らかに延ばす。
当業者であれば、本明細書の内容に基づいてプロセスパラメータを適切に改良すること
ができる。なお、全ての類似の置換や変化は当業者にとって明らかなことであり、本発明
に含まれるとみなす。本発明の製品及び方法は好適な実施例によって説明されており、当
業者は明らかに、本発明の内容、主旨及び範囲を逸脱することなく本明細素に記載の製品
及び方法について変化や適切な変更、組み合わせを行って、本発明の技術を実現、適用す
ることができる。本発明をさらに理解するために、以下、実施例を参照して本発明につい
て詳細に説明する。
実施例１
固形腫瘍中の高発現ケモカインのバイオインフォマティクススクーリング
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｌｔａｓ）は
米国ＮＣＩにより開始され、高スループットシーケンシング技術によって癌の分子機構へ
の理解を深めることを目的とする。ＴＣＧＡは世界で最も有名な癌データベースであり、
３３種類の癌のタイプ、１１０００個を超える臨床サンプルを含む。ＧＥＰＩＡウェブサ
イト分析ツールを通じてＴＣＧＡ中のケモカインＣＣＬ２０の各種の腫瘍中の発現レベル
をスクーリングし、図１に示すように、ＣＣＬ２０は、子宮頸部扁平上皮癌や腺癌、結腸
癌、食道癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、腎明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平
上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、子宮肉腫において過剰発現レベル
である。
肺癌患者の腫瘍組織及び癌周辺の組織を採取し、予冷したＰＢＳを用いて腫瘍組織をリ
ンスして重量を秤り、腫瘍組織を細断化し、肺癌組織：ＰＢＳ＝０．１ ｇ：１０ ｍＬ
の割合で氷にて十分に粉砕し、５０００ｇを４℃で１０ｍｉｎ遠心分離した後、上清を個
包装して使用に備え、ＥＬＩＳＡキットの取扱書に従って後続のＣＣＬ２０分泌レベルの
検出を行い、図２に示すように、ＣＣＬ２０はほとんどの患者の腫瘍組織において過剰発
現している。次に、ヒト肺癌細胞系のＣＣＬ２０分泌レベルをさらに検出した。４×１０
５の密度で腫瘍細胞を培養皿に接種し、２４ｈ後培地上清を採取し、取扱書に従ってＣＣ
Ｌ２０の分泌レベルを検出し、図３に示すように、ＣＣＬ２０は肺癌細胞系Ａ５４９、Ｈ
２３及びＣＣＬ２０過剰発現細胞系Ａ５４９／ＣＣＬ２０での分泌レベルが高い。
また、フローサイトメトリーによって、ＣＣＬ２０に対応する受容体ＣＣＲ６のＴ細胞
での発現状況を検出し、リンパ球分離液から肺癌患者末梢血ＰＢＭＣを分離、富化し、休
止Ｔ細胞及びＣＤ３／ＣＤ２８ ｂｅａｄｓ活性化させたＴ細胞を採取し、次に、ＣＤ４
、ＣＤ８及びＣＣＲ６フロー抗体を加えて４℃、遮光下で２０ｍｉｎ染色し、ＰＢＳで１
回洗浄した後、フローサイトメトリーチューブに移し、ＢＤ社のＡｒｉａフローサイトメ
ーターによって検出した。図４に示すように、ＣＣＲ６は、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８
Ｔ細胞のいずれにおいても、特にＣＤ８ Ｔ細胞において低発現である。したがって、Ｔ
細胞でＣＣＲ６を過剰発現させることによって、Ｔ細胞の固形腫瘍でのホーミング及び凝
集を強化させ、殺傷効果を向上させるか否かについて試験を行った。
実施例２
発現系の構築
発現系はＣＡＲを発現させるベクターとＣＣＲ６を発現させるベクターとから構成され
、ＣＡＲはリーダー配列、抗原を識別するｓｃＦｖ、ヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、細
胞内共刺激シグナル、細胞内活性化シグナルＣＤ３ζをこの順で含み、ベクターはレンチ
ウイルスベクターＦＵＷ（Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with
IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects,Protein&Cell,June 2019を参照）であ
る。
ＣＡＲのコード遺伝子、ＣＣＲ６のコード遺伝子を人工的に合成し、配列の先端にＸｂ
ａＩ酵素消化部位、配列の末端にＦｓｅＩ酵素消化部位を追加し、クローンプラスミドに
連結し、ＸｂａＩ及びＦｓｅＩを用いてレンチウイルス発現プラスミド及び標的遺伝子を
含むクローンプラスミドを酵素消化し、次に、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを切
断して線形化レンチウイルス発現プラスミド及び標的遺伝子断片を回収し、Ｔ４リガーゼ
を用いて、ゲルを切断して回収したレンチウイルス発現プラスミドと標的遺伝子を連結し
て、ＤＨ５α菌株に形質転換し、アンピシリン耐性ＬＢ固体平板に塗布して一晩培養し、
菌板上の単一クローンコロニーを選択して、アンピシリン耐性ＬＢ液体培地に接種して夜
１２～１４時間培養し、次に、プラスミドを少量で抽出して酵素消化の検証を行った結果
、正しく連結されたＣＡＲ組換えプラスミド及びＣＣＲ６組換えプラスミドをそれぞれ得
た。
ＣＡＲ組換えプラスミド及びＣＣＲ６組換えプラスミドについてエンドトキシンフリー
のバルク抽出を行い、ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇウィルスパッケージングプラスミド
とともに１０：９：６の割合でリン酸カルシウムによりウィルスパッケージング細胞２９
３Ｔにそれぞれトランスフェクションし、４８ｈ後、ウィルス粒子を含有する培地上清を
収集し、０．４５μｍのフィルタで培地上清をろ過して超遠心管に移し、低温超遠心分離
（２００００ｒｐｍ、２ｈ、４℃）によってウィルス粒子を濃縮させ、第１レンチウイル
スベクター及び第２レンチウイルスベクターを得て、次に、２種類のレンチウイルスベク
ターを免疫細胞に同時トランスフェクションした。
前記ＣＡＲのリーダー配列のヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に由来す
る。
前記ＣＡＲの腫瘍関連抗原ＥＧＦＲを標的とするｓｃＦｖヌクレオチド配列は配列ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２に由来する。
前記ＣＡＲのヒンジ領域及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内共刺激シグナルＣＤ２８のヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内活性化シグナルＣＤ３ζのヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５に由来する。
前記ＣＡＲのリーダー配列のアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に由来する。
前記ＣＡＲのＥＧＦＲを標的とするｓｃＦｖアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７に由来する。
前記ＣＡＲのヒンジ領域及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：８に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内共刺激シグナルＣＤ２８のアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：９に由来する。
前記ＣＡＲの細胞内活性化シグナルＣＤ３ζのアミノ酸配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１０に由来する。
前記ＣＣＲ６のヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に由来し、アミノ酸
配列は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２から選ばれる。
実施例３
健全者の末梢血Ｔ細胞の分離培養及び感染
健全者の末梢血を採取し、密度勾配遠心分離の方法で分離して単一の核細胞を得た後、
ミルテニーバイオテク社製のＴ細胞富化キットを用いてＴ細胞の富化を行い、Ｌｏｎｚａ
のＸ－ＶＩＶＯ １５培地に接種して１００ ＵＩ／ｍＬ ＩＬ－２を添加し、次に、取
扱書に従ってサーモフィッシャー社製のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを加えて
Ｔ細胞の活性化増幅を行った。
Ｔ細胞を３６ｈ活性化させた後、肺腺癌のターゲットＥＧＦＲ及びＣＣＬ２０－ＣＣＲ
６システムを例として、感染多重度が１０となる割合でＥＧＦＲのＣＡＲ及びケモカイン
受容体ＣＣＲ６を標的とするレンチウイルス粒子を加えて感染した。１週間後、フローサ
イトメーターによってＴ細胞の感染効率を検出し、図５に示すように、Ｔ細胞はＣＡＲ及
びＣＣＲ６の感染に成功し、そして、ＣＡＲ及びＣＣＲ６の両方が陽性であるＴ細胞の割
合は２３％に達する。
実施例４
ＣＣＲ６の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の因子分泌や細胞殺傷能力に影響を与えなかった
。
各群の２×１０５個のＴ細胞及び２×１０５個の腫瘍細胞を２４ｈ共同インキュベーシ
ョンし、次に、上清を遠心収集した後、サーモフィッシャー社製のＩＬ－２及びＩＦＮ－
ｇａｍａ ＥＬＩＳＡキットの取扱者に従って後の操作を行った。図６に示すように、Ｃ
ＣＲ６の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌能力に影響を与えなかった。次に
、ルシフェラーゼに基づいた細胞殺傷アッセイを採用している。まず、それぞれＧＦＰ－
ｌｕｃウィルス粒子を用いて標的腫瘍細胞を感染し、Ｈ１９７５／ｌｕｃ、Ｈ２３／ｌｕ
ｃ、Ａ５４９／ｌｕｃ、及びＡ５４９－ＣＣＬ２０／ｌｕｃを得た。その後、各群のＴ細
胞と腫瘍細胞とをターゲット細胞に対するエフェクター細胞の比率１０：１で２４ｈ共同
インキュベーションし、次に、フルオレセイン基質を加えてフルオレセイン値を測定し、
細胞の殺傷を算出した。Ｔ細胞を加えていない腫瘍細胞ウェルを参照として、参照ウェル
と比較し、低下した蛍光値の割合は殺傷効率であり、その公式は、殺傷百分率＝（参照ウ
ェルの蛍光値－標的ウェルの蛍光値）÷参照ウェル×１００％であった。図７に示すよう
に、ＣＣＲ６の過剰発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
実施例５
ＣＣＲ６の過剰発現によるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＣＣＬ２０分泌腫瘍細胞への遊走の
促進
ケモカイン系がＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍への凝集をガイドする実現可能性を確認するため
に、まず、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞系においてＣＣＲ６及びＥＧＦＲＣＡＲを過剰発現させ
、次に、各群の細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種し、図８に示すように、ＣＣ
Ｒ６を過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞はＣＣＬ２０を含有する腫瘍培地上清へ明らかに
遊走した。次に、１×１０６個のＡ５４９／ＣＣＬ２０細胞をマウスの背中の皮下に接種
し、１０日間後、ＣＣＲ６及びＣＡＲウィルスに感染したＪｕｒｋａｔ／ｌｕｃ細胞を尾
静脈注入し、次に、２４ｈ、４８ｈ及び１２０ｈに皮下腫瘍での蛍光強度を検出した。図
９に示すように、ＥＧＦＲ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞に比べて、ＥＧＦＲ ＣＡＲ＋Ｃ
ＣＲ６ Ｊｕｒｋａｔ細胞は明らかに皮下腫瘍で凝集している。
実施例６
ＣＣＲ６を過剰発現させたＣＡＲ Ｔ細胞はより効果的に腫瘍細胞を殺傷し、担癌マウ
スの生存時間を延ばした。
ケモカイン受容体を添加したＣＡＲ－Ｔ細胞の体内抗腫瘍活性をさらに確認するために
、２×１０５個のＨ２３／ｌｕｃ細胞をマウスの背中の皮下に接種し、７日間後、勾配用
量（１×１０７、３×１０６、１×１０６）のＣＡＲ Ｔ及びＣＣＲ６＋ＣＡＲ Ｔ細胞
を尾静脈注入し、次に、小動物イメージャーによってフルオレセイン強度を検出すること
で、腫瘍細胞のサイズを検出した。その結果、同じ注入量の条件下で、ＣＣＲ６＋ＣＡＲ
Ｔ治療群は、従来のＣＡＲ－Ｔ群よりも優れた治療効果を有し（図１０）、そして、Ｃ
ＣＲ６はＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍内部への浸潤を促進し（図１１）、より効果的な抗腫瘍効
果を発揮し、また、担癌マウスの生存時間を延ばした（図１２）。
以上は本発明の最適な特定の実施例を例示的に説明した。明らかに、本発明は以上の実
施例に限定されるものではなく、さまざまな変形が可能である。当業者が本発明の開示内
容から直接導出又は想到することができる全ての変形は、本発明の特許範囲内であるとみ
なすべきである。
[配列表]

<110> 中国科学院動物研究所

<120> 修飾された免疫細胞及びその使用

<170> PatentIn version

<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 1
1 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg
61 atccca

<210> 2
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 2
1 gatattctgc tgacccagag cccggtgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgcgtgagc
61 tttagctgcc gcgcgagcca gagcattggc accaacattc attggtatca gcagcgcacc
121 aacggcagcc cgcgcctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcattagcgg cattccgagc
181 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacag cgtggaaagc
241 gaagatattg cggattatta ttgccagcag aacaacaact ggccgaccac ctttggcgcg
301 ggcaccaaac tggaactgaa acgcaccgtg gcggcgccga gcgtgtttat ttttccgccg
361 agcgatgaac agctgaaaag cggcaccgcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat
421 ccgcgcgaag cgaaagtgca gtggaaagtg gataacgcgc tgcagagcgg caacagccag
481 gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag caccctgacc
541 ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcagggc
601 ctgagcagcc cggtgaccaa aagctttaac cgcggcgcgg gctccacctc tggatccggc
661 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggccaggtgc agctgaaaca gagcggcccg
721 ggcctggtgc agccgagcca gagcctgagc attacctgca ccgtgagcgg ctttagcctg
781 accaactatg gcgtgcattg ggtgcgccag agcccgggca aaggcctgga atggctgggc
841 gtgatttgga gcggcggcaa caccgattat aacaccccgt ttaccagccg cctgagcatt
901 aacaaagata acagcaaaag ccaggtgttt tttaaaatga acagcctgca gagcaacgat
961 accgcgattt attattgcgc gcgcgcgctg acctattatg attatgaatt tgcgtattgg
1021 ggccagggca ccctggtgac cgtgagcgcg gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg
1081 ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa
1141 gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg
1201 catacctttc cggcggtgct gcagagcagc ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc
1261 gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc
1321 aacaccaaag tggataaacg cgtggaaccg aaaagcgcgg cc

<210> 3
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 3
1 gcaattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt
61 atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc
121 ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg
181 gcctttatta ttttctgggt gagg

<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 4
1 agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg
61 cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc

<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 5
1 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc
61 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc
121 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat
181 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc
241 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc
301 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa

<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工配列
<400> 6
1 mlllvtslll celphpafll ip

<210> 7
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工配列
<400> 7
1 illtqspvil svspgervsf scrasqsigt nihwyqqrtn gsprllikya sesisgipsr
61 fsgsgsgtd ftlsinsves ediadyycqq nnnwpttfga gtklelkrtv aapsvfifpp
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241 gpglvqpsq slsitctvsg fsltnygvhw vrqspgkgle wlgviwsggn tdyntpftsr
301 lsinkdnsk sqvffkmnsl qsndtaiyyc araltyydye faywgqgtlv tvsaastkgp
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421 ssvvtvpss slgtqtyicn vnhkpsntkv dkrvepksaa

<210> 8
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工配列
<400> 8
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61 afiifwvr

<210> 9
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工配列
<400> 9
1 skrsrllhsd ymnmtprrpg ptrkhyqpya pprdfaayrs

<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工配列
<400> 10
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61 elqkdkmae ayseigmkge rrrgkghdgl yqglstatkd tydalhmqal ppr

<210> 11
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工配列
<400> 11
1 atgagcgggg aatcaatgaa tttcagcgat gttttcgact ccagtgaaga ttattttgtg
61 tcagtcaata cttcatatta ctcagttgat tctgagatgt tactgtgctc cttgcaggag
121 gtcaggcagt tctccaggct atttgtaccg attgcctact ccttgatctg tgtctttggc
181 ctcctgggga atattctggt ggtgatcacc tttgcttttt ataagaaggc caggtctatg
241 acagacgtct atctcttgaa catggccatt gcagacatcc tctttgttct tactctccca
301 ttctgggcag tgagtcatgc caccggtgcg tgggttttca gcaatgccac gtgcaagttg
361 ctaaaaggca tctatgccat caactttaac tgcgggatgc tgctcctgac ttgcattagc
421 atggaccggt acatcgccat tgtacaggcg actaagtcat tccggctccg atccagaaca
481 ctaccgcgca gcaaaatcat ctgccttgtt gtgtgggggc tgtcagtcat catctccagc
541 tcaacttttg tcttcaacca aaaatacaac acccaaggca gcgatgtctg tgaacccaag
601 taccagactg tctcggagcc catcaggtgg aagctgctga tgttggggct tgagctactc
661 tttggtttct ttatcccttt gatgttcatg atattttgtt acacgttcat tgtcaaaacc
721 ttggtgcaag ctcagaattc taaaaggcac aaagccatcc gtgtaatcat agctgtggtg
781 cttgtgtttc tggcttgtca gattcctcat aacatggtcc tgcttgtgac ggctgcaaat
841 ttgggtaaaa tgaaccgatc ctgccagagc gaaaagctaa ttggctatac gaaaactgtc
901 acagaagtcc tggctttcct gcactgctgc ctgaaccctg tgctctacgc ttttattggg
961 cagaagttca gaaactactt tctgaagatc ttgaaggacc tgtggtgtgt gagaaggaag
1021 tacaagtcct caggcttctc ctgtgccggg aggtactcag aaaacatttc tcggcagacc
1081 agtgagaccg cagataacga caatgcgtcg tccttcacta tgtga

<210> 12
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工配列
<400> 12
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301 tevlaflhcc lnpvlyafig qkfrnyflki lkdlwcvrrk ykssgfscag rysenisrqt
361 setadndnas sftm

Claims (20)

  1. 修飾された免疫細胞であって、キメラ抗原受容体を発現するとともに、ケモカイン受容体
    ＣＣＲ６を過剰発現し、前記キメラ抗原受容体はＥＧＦＲを識別する配列を含み、前記修
    飾は、前記キメラ抗原受容体及び前記ケモカイン受容体ＣＣＲ６をコードする遺伝子配列
    を前記免疫細胞に導入することを含み、前記修飾前の免疫細胞は、前記修飾された免疫細
    胞と比較してケモカイン受容体ＣＣＲ６を発現しないか、又は低発現する、ことを特徴と
    する修飾された免疫細胞。
  2. 前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、及び他の腫瘍キラー
    細胞である、ことを特徴とする請求項１に記載の修飾された免疫細胞。
  3. 前記Ｔ細胞はキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、Ｔ細胞受容体Ｔ細胞（ＴＣＲ－
    Ｔ）、及び腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）である、ことを特徴とする請求項２に記載の免疫細
    胞。
  4. 前記導入方式は、レンチウイルス、レトロウイルス、一般的なプラスミドベクター、エ
    ピソームベクター、ナノ送達システム、エレクトロトランスダクション、トランスポゾン
    、及び他の送達システムである、ことを特徴とする請求項１に記載の免疫細胞。
  5. 修飾されていない免疫細胞に比べて、前記免疫細胞は、少なくともａ）～ｅ）の性能の
    １つを有する、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫細胞。
    ａ）サイトカイン分泌能力は影響を受けないこと、
    ｂ）腫瘍細胞に対する特異的殺傷能力は影響を受けないこと、
    ｃ）ＣＣＬ２０分泌固形腫瘍へのホーミング及び凝集の能力を強化させること、
    ｄ）ＣＣＬ２０固形腫瘍での浸潤を強化させること、及び
    ｅ）患者の生存時間を延ばすこと
  6. 前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖ、ヒンジ領域及
    び膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン及び細胞内活性化シグナルＣＤ３ζを含む、こ
    とを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫細胞。
  7. 前記ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクロー
    ナル抗体、ヒト抗体、ナノ抗体及び合成抗体から選ばれる、ことを特徴とする請求項６に
    記載の免疫細胞。
  8. 前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖ、ＣＤ２８又は
    ＣＤ８ヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８又はＣＤ１３７ （４－１ＢＢ）共刺激
    ドメイン、及び細胞内活性化シグナルＣＤ３ζを含む、ことを特徴とする請求項６に記載
    の免疫細胞。
  9. 前記キメラ抗原受容体におけるリーダー配列のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
    で示され、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示さ
    れ、ＣＤ２８ヒンジ領域及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で
    示され、共刺激ドメインＣＤ２８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示され、細
    胞内活性化シグナルＣＤ３ζのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示される、こ
    とを特徴とする請求項８に記載の免疫細胞。
  10. 前記キメラ抗原受容体におけるリーダー配列のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：１で示され、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    ２で示され、ＣＤ２８ヒンジ領域及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：３で示され、共刺激ドメインＣＤ２８のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：４で示され、細胞内活性化シグナルＣＤ３ζのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：５で示される、請求項９に記載の免疫細胞。
  11. 腫瘍を治療する医薬品の製造における請求項１～１０のいずれか１項に記載の免疫細胞
    の使用。
  12. 前記腫瘍は固形腫瘍から選ばれ、前記固形腫瘍はＣＣＬ２０を高発現させ、前記ＣＣＬ
    ２０高発現固形腫瘍は、子宮頸部扁平上皮癌、子宮頸腺癌、結腸癌、食道癌、多形性膠芽
    腫、頭頸部扁平上皮癌、腎明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌
    、直腸癌、胃癌及び子宮内膜癌から選ばれる、ことを特徴とする請求項１１に記載の使用
    。
  13. キメラ抗原受容体を発現させる第１ベクターとＣＣＲ６を発現させる第２ベクターとか
    ら構成されるか、又はキメラ抗原受容体とＣＣＲ６を共発現させるベクターを含み、前記
    キメラ抗原受容体はＥＧＦＲを識別する配列を含む、ことを特徴とする遺伝子発現系。
  14. 前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖ、ヒンジ領域及
    び膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン及び細胞内活性化シグナルＣＤ３ζを含む、こ
    とを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子発現系。
  15. 前記ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクロー
    ナル抗体、ヒト抗体、ナノ抗体及び合成抗体から選ばれる、ことを特徴とする請求項１４
    に記載の遺伝子発現系。
  16. 前記キメラ抗原受容体は、リーダー配列、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖ、ＣＤ２８又は
    ＣＤ８ヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８又はＣＤ１３７ （４－１ＢＢ）共刺激
    ドメイン、及び細胞内活性化シグナルＣＤ３ζを含む、ことを特徴とする請求項１４に記
    載の遺伝子発現系。
  17. 前記キメラ抗原受容体におけるリーダー配列のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
    で示され、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示さ
    れ、ＣＤ２８ヒンジ領域及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で
    示され、共刺激ドメインＣＤ２８のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示され、細
    胞内活性化シグナルＣＤ３ζのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示される、こ
    とを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子発現系。
  18. 前記キメラ抗原受容体におけるリーダー配列のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：１で示され、ＥＧＦＲを識別するｓｃＦｖのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
    ２で示され、ＣＤ２８ヒンジ領域及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：３で示され、共刺激ドメインＣＤ２８のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：４で示され、細胞内活性化シグナルＣＤ３ζのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
    ：５で示される、請求項１７に記載の遺伝子発現系。
  19. 請求項１３～１８のいずれか１項に記載の遺伝子発現系を免疫細胞にトランスフェクシ
    ョンすることを含み、
    任意選択的に、細胞をインビトロで培養して増幅する、免疫細胞のインビトロ修飾方法
    。
  20. 前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、及び他の腫瘍キラー
    細胞である、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
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