JP7453724B2

JP7453724B2 - ベンズブロマロンを含む傷または瘢痕の予防または治療用薬学組成物

Info

Publication number: JP7453724B2
Application number: JP2023528711A
Authority: JP
Inventors: チョルイム，ドン; ギュパク，ジョン
Original assignee: Innovo Therapeutics Inc
Current assignee: Innovo Therapeutics Inc
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2024-03-21
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: EP4252751A1; US11951089B2; CA3199349A1; CA3199349C; JP2023548942A; IL302892A; CN116490173A; WO2022114881A1; AU2021387517A1; MX2023005893A; AU2021387517B2; KR102404883B1; EP4252751A4; US20230390236A1

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、傷または瘢痕の予防または治療用の薬学組成物に関し、より詳しくは、ベンズブロマロンを含む傷または瘢痕の予防または治療用の薬学組成物に関する。
〔背景技術〕
ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）は、赤く盛り上がり、痒疹を伴う局所病変であって、攻撃的な成長性を有し、細胞外基質の過度な蓄積、特に皮膚におけるコラーゲン過剰生産を伴う線維症である。数多い治療方法がケロイドに適用されてきたが、未だに一貫した効能を示す治療方法は開発されていない。

一方、皮膚瘢痕（ｓｋｉｎｓｃａｒ）は、過度なコラーゲンの蓄積によって盛り上がった瘢痕であり、ケロイドより弱い形態で発生する。ケロイドと同様に、ニキビ、ピアシング、切り傷及び火傷部位でよく形成される。瘢痕の大きさを減らすための手術的除去及びレーザー施術などの方法が適用されており、薬物的にはステロイドと抗癌剤の注射療法があるが、標準的な治療法としては使用されていない。

小胞体に存在するコラーゲンの特異的なＨＳＰ４７（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ４７）タンパク質は、線維化と密接な連関があることが明らかになった。ＨＳＰ４７は、コラーゲン前駆体からコラーゲンを形成する段階及び運び過程に関連する。ＨＳＰ４７は、コラーゲンの特異的な基質として看做されており、肝硬化、肺線維化及び糸球体硬化症のように多様な組織の線維症で発現が増加することが報告された。ＨＳＰ４７に対するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は実験的に糸球体硬化症、肝硬化及び肺線維症に効果があることが報告された。

なお、ＨＳＰ４７は、癌細胞からも発現されることが報告されており、ＨＳＰ４７の発現量の増加は、多くの癌細胞の転移を容易にして死亡率を高めるということが報告されている。遺伝学的な方法でＨＳＰ４７の発現を抑制したときに癌の進行を抑制するということも報告された（ＰａｒｖｅｅｎＡｅｔ．ａｌ．，２０１９）。
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、ＨＳＰ４７とコラーゲンの過度な蓄積は密接な関係があり、ケロイドと皮膚瘢痕においても過度なコラーゲンの蓄積とＨＳＰ４７の高い発現があることを認識し、このような結果からＨＳＰ４７の阻害が、ケロイド、肥厚性瘢痕、傷などの治療に効果的かつ特異的な治療ターゲットになり得ることに着眼して、ＨＳＰ４７の阻害活性を基準にして、ケロイド、皮膚瘢痕、傷の治療活性物質を導き出すことを目的とする。

但し、本発明が解決しようとする技術的課題は、前述の課題に制限されず、言及していないさらに他の課題は、下記する発明の説明から当業者にとって明確に理解されるであろう。
〔課題を解決するための手段〕
上記の課題を達成するため、本発明の一面によって、ベンズブロマロンを有効成分として含む傷または瘢痕の予防または治療用の薬学組成物が提供される。

一具現例において、前記傷または瘢痕の治療は、ＨＳＰ４７（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ４７）抑制によることであり得る。

一具現例において、前記傷または瘢痕の治療がコラーゲン生合成抑制によることであり得る。

一具現例において、前記傷は、慢性創傷、急性創傷、外科手術創傷、整形外科創傷、外傷、火傷及び戦闘創傷からなる群より選択された一つ以上であり得る。

一具現例において、前記瘢痕は、ケロイド瘢痕（ｋｅｌｏｉｄｓｃａｒ）、肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒ）、萎縮性瘢痕（ａｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒ）及びストレッチマーク(ｓｔｒｅｔｃｈｍａｒｋｓ）からなる群より選択された一つ以上であり得る。

一具現例において、前記傷または瘢痕の治療は、傷または瘢痕の面積の減少であり得る。

一具現例において、前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤または担体をさらに含み得る。

なお、本発明の他面によって、ベンズブロマロンを傷または瘢痕の予防または治療の目的で使用する用途が提供される。

本発明のさらに他面によって、ベンズブロマロンを患者に治療容量で投与する段階を含む、傷または瘢痕の予防または治療方法が提供される。
〔発明の効果〕
本発明によって、ベンズブロマロンがＨＳＰ４７（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ４７）タンパク質の機能を抑制することが確認されており、コラーゲン過多生成細胞を減少させてコラーゲンの蓄積を抑制することで、傷または瘢痕の予防または治療に使用可能であることを見出した。

したがって、本発明のベンズブロマロンを有効成分として含む組成物は、傷または瘢痕の予防または治療用として、医薬及び薬学分野において有用に使用可能である。

本発明の効果は上述した効果に制限されず、本発明の詳細な説明または特許請求範囲に記載の発明の構成から推測可能な全ての効果を含むことに理解されるべきである。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ベンズブロマロンの濃度別にＨＳＰ４７タンパク質機能抑制率（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を測定した結果である。

〔図２〕（ａ）は、肝星細胞ＬＸ－２にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。

〔図３〕肝星細胞ＬＸ－２にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ，１０μＭ）を処理した結果である。

〔図４〕（ａ）は、肝星細胞Ｔ６にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。

〔図５〕肝星細胞Ｔ６にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を処理した結果である。

〔図６〕（ａ）は、肺上皮細胞Ａ５４９にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。

〔図７〕肺上皮細胞Ａ５４９において線維化抑制率［ＯＤ（５７０ｎｍ）］をベンズブロマロン濃度別に測定した結果である。

〔図８〕（ａ）は、ケロイド患者から分離したＫＥＬＦＩＢ細胞にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、及び（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。

〔図９〕ケロイド患者から分離したＫＥＬＦＩＢ細胞において線維化抑制程度をベンズブロマロン濃度別に測定した結果である。

〔図１０〕四塩化炭素（ＣＣｌ_４）によって誘導された肝線維化モデルマウスの（ａ）血漿のアラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）及び（ｂ）ビリルビン数値の分析結果である。

〔図１１〕四塩化炭素によって誘導された肝線維化モデルマウスの各群［正常、肝線維化誘導、肝線維化誘導＋ＯＣＡ（オベチコール酸）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＱＤ（１日１回）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＢＩＤ（１日２回）］の肝に対するシリウスレッド（ＳｉｒｉｕｓＲｅｄ）染色結果である。

〔図１２〕四塩化炭素によって誘導された肝線維化モデルマウスの各群［正常（ＮｏｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌ；正常群）、肝線維化誘導（ＶｅｈｉｃｌｅＣｏｎｔｒｏｌ；対照群）、肝線維化誘導＋ＯＣＡ（オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＱＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＱＤ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＢＩＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）］の肝に対する線維化面積の分析結果である。

〔図１３〕四塩化炭素によって誘導された損傷した肝組織中のコラーゲンに含まれた４－ヒドロキシプロリンの含量を分析した結果である［正常（正常群）、肝線維化誘導（対照群）、肝線維化誘導＋ＯＣＡ（オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＱＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＱＤ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＢＩＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）］。

〔図１４〕（ａ）は、火傷によって誘導されたミニブタの瘢痕部位を撮影した写真（ｎ＝３）であり、（ｂ）は、各瘢痕部位の面積をｃｍ^２単位で測定した結果である。

〔図１５〕（ａ）は、図１４の火傷によって誘導されたミニブタの瘢痕部位の組織をスライドとして製作した後、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）染色してスキャンした写真であり、（ｂ）は、瘢痕部位の組織の厚さをミリメートル（ｍｍ）単位で測定したグラフであって、真皮層の肥大化を確認した結果である。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、ベンズブロマロンを有効成分として含む傷または瘢痕の予防または治療用の薬学組成物を提供する。

ベンズブロマロン（Ｂｅｎｚｂｒｏｍａｒｏｎｅ，ＢＢＲ，ＩＮＶ－００１ａ）は、下記の化学式１の構造を有する物質であって、ＩＵＰＡＣ名は、（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシフェニル）－（２－エチル－１－ベンゾフラン－３－イル）メタノン［（３，５－ｄｉｂｒｏｍｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－（２－ｅｔｈｙｌ－１－ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ－３－ｙｌ）ｍｅｔｈａｎｏｎｅ］（分子量４２３．９１）である。

ベンズブロマロンのＨＳＰ４７（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ４７）活性抑制に対して評価した結果、ＩＣ_５０１３２．７μＭを示したことから、ベンズブロマロンがＨＳＰ４７抑制活性を示すことを確認した。組織細胞における線維化抑制に関わり、ベンズブロマロンは肝星細胞及び肺上皮細胞の線維化を抑制し、特に、皮膚線維芽細胞の線維化を抑制して皮膚の傷及び瘢痕の面積を減少させることで、傷または瘢痕の治療に活性があることが確認された。肝線維化が誘導された動物モデルにおいて線維化による疾患症状に関わり、ベンズブロマロンは、血漿の肝数値（ＡＬＴ）及びビリルビンを有意に減少させ、組織染色学的に肝組織の線維化を抑制することが確認されており、肝組織中の４－ヒドロキシプロリンの含量を減少させることで線維化によるコラーゲン沈着を減少させることが確認されることから、ベンズブロマロンがコラーゲン生合成抑制効果を奏することを確認した。

なお、本発明は、ベンズブロマロンを傷または瘢痕の予防または治療の目的として使用する用途を提供する。

また、本発明は、ベンズブロマロンを患者に治療容量で投与することを含む、傷または瘢痕の予防または治療方法を提供する。

ＨＳＰ４７は、癌細胞においても発現することが報告されており、ＨＳＰ４７の発現量の増加は、癌細胞成長に必要なコラーゲンの蓄積によって癌細胞の転移を容易にすることが知られている。Ａ５４９肺上皮細胞の癌においてベンズブロマロン処理によってＨＳＰ４７を抑制することでコラーゲンの蓄積を阻害する結果を確認した（図６及び図７）。

本発明において、前記傷は、慢性創傷、急性創傷、外科手術創傷、整形外科創傷、外傷、火傷及び戦闘創傷からなる群より選択された一つ以上であり得る。

本発明において、前記瘢痕は、傷が付いた後に形成されるケロイド瘢痕（ｋｅｌｏｉｄｓｃａｒ）、肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒ）、萎縮性瘢痕（ａｔｒｏｐｈｉｃｓｃａｒ）及びストレッチマーク（ｓｔｒｅｔｃｈｍａｒｋｓ）からなる群より選択された一つ以上であり得る。

一具現例において、前記傷または瘢痕治療とは、傷または瘢痕の面積減少であり得る。

具体的には、本発明の薬学組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができ、各々通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口剤、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に製剤化し得る。前記薬剤学的に許容可能な担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などを含む。また、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を含む。経口用の固形製剤は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などを含み、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、でん粉、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを含み、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤などを含み得る。経口用液状製剤は、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などを含み、水、リキッドパラフィンなどの希釈剤、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含み得る。非経口用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤を含み、非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル類などを含む。坐剤の基剤としては、ウイテプソール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ－ル、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。

本発明の薬学組成物に含有されるベンズブロマロンの投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わるが、関連分野における通常の技術者によって適切に選択され得る。例えば、前記ベンズブロマロンは、１日に０．０００１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、望ましくは０．０１～１，０００ｍｇ／ｋｇの容量で投与可能であり、前記投与は一日に一回または数回に分けて投与し得る。また、本発明の薬学組成物は、組成物の総重量に対して前記ベンズブロマロンを０．００１～９０％の重量百分率で含み得る。

本発明の薬学組成物は、レット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に対して多様な経路で、例えば、開口、腹腔、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）に注射によって投与され得る。

以下、本発明の実施例を挙げて詳しく説明する。しかし、下記の実施例は本発明の例示するためのものであり、本発明の範囲がこれに制限されることではない。
＜実施例＞
１．実験
（１）試験物質
下記化学式１の構造を有するベンズブロマロン（Ｂｅｎｚｂｒｏｍａｒｏｎｅ）、ＩＵＰＡＣ名（３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシフェニル）－（２－エチル－１－ベンゾフラン－３－イル）メタノン［（３，５－ｄｉｂｒｏｍｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－（２－ｅｔｈｙｌ－１－ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ－３－ｙｌ）ｍｅｔｈａｎｏｎｅ］（分子量４２３．９１，ＴＣＩ［ＪＰ］から購入）に対して、実験を行った。

（２）ＨＳＰ４７の活性評価
酸性溶液に溶かしたコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＵＫ）２０μｌにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水，ｐＨ７．４）溶液１８０μｌを添加してフィブリル（ｆｉｂｒｉｌ）を形成し、それを３４０ｎｍの波長で測定した。ＨＳＰ４７タンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＵＳ）を９．４５μｇ／ｍｌの濃度で添加してフィブリル形成を抑制する程度としてＨＳＰ４７活性を評価した。試験物質を１００μＭ～１μＭの濃度で含ませてＨＳＰ４７阻害程度を百分率で示した。
（３）シリウスレッド分析（Ｓｉｒｉｕｓｒｅｄａｓｓａｙ）
肝星細胞ＬＸ－２（ＥｌａｂｓｃｉｅｎｃｅＣＨ）、肺上皮細胞（ＬｕｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＡ５４９，ＡＴＣＣＵＳ）、肝星細胞（ＬｉｖｅｒｓｔｅｌｌａｔｅＴ６，Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＨ）または皮膚ＫＥＬＦＩＢ（ＡＴＣＣ，ＵＳ）細胞を２４－ｗｅｌｌ組織培養プレートに１８時間培養した後、ＴＧＦ－ｂｅｔａ１０ｎｇ／ｍｌを処理した後、試験化合物と共に２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ブアン液（Ｂｏｕｉｎ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）で固定した後、蒸留水を用いて二回洗浄した。固定された細胞を２時間の間にシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓｒｅｄ）で染色した後、細胞形態の変化を観察した後、０．０１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄して０．１ＮのＮａＯＨ溶液でコラーゲンと結合したシリウスレッドを抽出した後、５７０ｎｍの波長で定量した。各化合物のコラーゲン生成抑制効能を百分率で表した。
（４）四塩化炭素によって誘発された肝線維化マウスモデル試験
四塩化炭素（ＣＣｌ_４）をマウス当たり５０μＬ（１：１のｃｏｒｎｏｉｌ）を一週に３回ずつ４週間腹腔投与し、試験物質に０．５％のメチルセルロース（Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）を添加して懸濁した後、毎日５ｍｌ／ｋｇ容量で経口投与した。対照薬物としては、オベチコール酸（ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，Ｍｅｄｋｏｏ，ＵＳ）を３０ｍｇ／ｋｇ容量で投与した。試験期間中に毎週一回体重を測定した。ＣＣｌ_４を投与してから２８日後にエーテル（ｅｔｈｅｒ）で吸入麻酔して、麻酔確認後に開腹して後大静脈から注射器を用いて採血を行った後、腹大動脈及び後大静脈を切断して放血致死させた。採血した血液は、血清を分離して血液生花学的検査を行った。肝は摘出して重量を測定し、肝の右葉は１０％中性緩衝ホルマリン溶液に固定し、左葉は半分に分けて液体窒素を用いて急速冷凍した。急速冷凍した検体は、－７０℃以下に設定されている超低温冷凍庫に保管し、４－ヒドロキシプロリン（４－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）分析に用いた。

固定された組織は、切り出し、脱水、パラフィン包埋、薄切などの通常の組織処理過程を経て組織病理学的検査のための検体を製作した後、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）、ピクロシリウスレッド（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓｒｅｄ）染色を行い、光学顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５３，Ｊａｐａｎ）を用いて組織病理学的変化を観察し、線維化面積分析を行った。
（５）火傷誘発皮膚の瘢痕抑制効能評価
８時間以上節食させたユカタンミニブタを塩酸キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ミダゾラム（Ｍｉｄａｚｏｌａｍ）及びプロポフォール（ｐｒｏｐｏｆｏｌ）を用いて麻酔した。胴体などの毛を除去した後、ポビドンヨード溶液（ｐｏｖｉｄｏｎｅｉｏｄｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で実験対象の患部を消毒した。４００ｇのステンレス分銅を用いて４０秒間患部に接触させて火傷を誘導された。脊椎から２ｃｍ、火傷誘発部位は４ｃｍの間隔で火傷を誘導された。火傷部位は、動物の全体面積の３．５％を超えないようにした。火傷を誘発してから１５日後、痂皮を除去して試験薬物を１日１回傷部位に塗布した。火傷誘導４５日目に剖検を行って傷部位をホルマリン溶液で固定してＨ＆Ｅ染色を行って真皮層の厚さを測定した。

試験薬物は、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，Ｙａｋｕｒｉｐｕｒｅｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ）に懸濁して超音波洗浄機を用いて均質の懸濁液に作り、それをラノリン（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）とワセリン（Ｍｅｒｃｋ，ＵＳＡ）に６０℃湯煎で希釈して軟膏剤に製造した。製造した軟膏剤の各々の構成成分は、試験物質１％（ｗ／ｗ）、プロピレングリコール２０％（ｗ／ｗ）、ラノリン（ｌａｎｏｌｉｎ）１５％（ｗ／ｗ）、ワセリン（ｖａｓｅｌｉｎｅ）６４％（ｗ／ｗ）である。
２．結果
（１）ＨＳＰ４７タンパク質機能抑制
コラーゲンをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に入れて３７℃でフィブリル（ｆｉｂｒｉｌ）を形成したときに測定したＯＤを１００％にし、ＨＳＰ４７とコラーゲンを共に入れてフィブリルを形成するようにしたものを０％基準にした。試験物質を濃度別に入れてＨＳＰ４７タンパク質の作用を阻害した程度を百分率で表した。ＩＣ_５０数値は、Ｐｒｉｓｍｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ，ＵＳＡ）を用いて算出した。ベンズブロマロンでＨＳＰ４７タンパク質抑制程度を測定した結果、ＩＣ_５０１３２．７μＭを得た（図１）。
（２）肝星細胞ＬＸ－２の線維化抑制
肝星細胞ＬＸ－２にＴＧＦ－β１（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳ）１０ｎｇ／ｍｌを加えて線維化を誘導し、ベンズブロマロン（ＢＢＲ）処理群にはＴＧＦ－β１とベンズブロマロン（ＢＢＲ）を共に処理した。線維化抑制程度は、細胞を固定し、コラーゲン特異的な染色法であるシリウスレッド染色を行って外形的変化を観察し（図２）、０．１ＮのＮａＯＨ溶液でシリウスレッドを抽出して定量化した（図３）。シリウスレッド染色結果（図２）に示したように、ベンズブロマロン（ＢＢＲ）３０μＭを処理した肝星細胞ＬＸ－２で線維化が減少したことを確認することができ、ＴＧＦ－β１処理群に比べて線維化程度が有意に減少したことが分かる（図３）。
（３）肝星細胞Ｔ６の線維化抑制
肝星細胞Ｔ６にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、試験物質を共に処理した。線維化抑制程度は、細胞を固定し、コラーゲン特異的な染色法であるシリウスレッド染色を行って外形的変化を観察し（図４）、０．１ＮのＮａＯＨ溶液でシリウスレッドを抽出して定量化した（図５）。シリウスレッド染色結果（図４）に示したように、ベンズブロマロン（ＢＢＲ）３０μＭを処理した肝星細胞Ｔ６で線維化が減少したことを確認することができ、ＴＧＦ－β１処理群に比べて線維化程度が有意に減少したことが分かる（図５）。
（４）肺上皮細胞Ａ５４９の線維化抑制
肺上皮細胞Ａ５４９にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、試験物質を共に処理した。線維化抑制程度は、細胞を固定し、コラーゲン特異的な染色法であるシリウスレッド染色を行って外形的変化を観察し（図６）、０．１ＮのＮａＯＨ溶液でシリウスレッドを抽出して定量化した（図７）。シリウスレッド染色結果（図６）に示したように、ベンズブロマロン（ＢＢＲ）３０μＭを処理した肺上皮細胞Ａ５４９で線維化が減少したことを確認することができ、肺上皮細胞Ａ５４９における線維化抑制程度をベンズブロマロン（ＢＢＲ）の濃度別に測定した結果、４．２５μＭのＩＣ_５０を得た（図７）。
（５）皮膚線維芽細胞ＫＥＬＦＩＢの線維化抑制
ケロイド患者から分離したＫＥＬＦＩＢ細胞（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、試験物質を共に処理した。線維化抑制程度は、細胞を固定し、コラーゲン特異的な染色法であるシリウスレッド染色をして外形的変化を観察し（図８）、０．１ＮのＮａＯＨ溶液でシリウスレッドを抽出して定量化した（図９）。シリウスレッド染色結果（図８）に示したように、ベンズブロマロン（ＢＢＲ）３０μＭを処理したＫＥＬＦＩＢ細胞で線維化が減少したことを確認することができ、ＫＥＬＦＩＢ細胞における線維化抑制程度をベンズブロマロン（ＢＢＲ）の処理濃度別に測定した結果、３μＭから線維化抑制効果を示し始め、１０μＭからは有意に抑制することが示された（図９）。
（６）血漿の肝数値（ＡＬＴ）及びビリルビン（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）分析
四塩化炭素によって誘導された肝組織損傷程度と肝機能を把握するために、剖検時に採血した血漿のアラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）とビリルビン数値を血液生化学分析装置（７１８０Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析を行った。１日２回のＢＢＲ投与群で統計的に有意にＡＬＴとビリルビンが減少した（図１０）。
（７）肝線維化組織標本分析
肝組織の線維化程度を判断するために、線維化の面積分析を行った結果（図１１及び図１２）、１日２回のＢＢＲ投与群でオベチコール酸（ＯＣＡ）と類似な水準の線維化抑制程度を示した。
（８）肝組織中の４－ヒドロキシプロリン（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）分析
肝線維化が進んで肝組織中のコラーゲンが沈着する。四塩化炭素によって誘導された損傷した肝組織中のコラーゲンに含まれた４－ヒドロキシプロリンの含量を分析して線維化程度を把握した。１日２回の３０ｍｇ／ｋｇのＢＢＲ投与群で統計的に有意に４－ヒドロキシプロリンの含量が減少した（図１３）。
（９）傷または瘢痕の減少効能評価
火傷が誘導されたミニブタの瘢痕部位を火傷誘導４５日目に撮影して図１４の（ａ）に示した。図１４の（ａ）に示されたように、ＢＢＲ処理群（１％のＢＢＲ）の瘢痕サイズ及び傷の程度は、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて確実に減少したことを確認することができ、陽性対照群であるステロイド製剤トリアムシノロン処理群（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ，０．１％，ＤｏｎｇｋｗａｎｇＰｈａｒｍＣｏ．，Ｌｔｄ．）に比べて瘢痕の程度が減少したことを確認することができた。また、前記瘢痕サイズをｃｍ^２単位で面積を求めて図１４の（ｂ）に示した。ＢＢＲ処理群（ＢＢＲ１％）の瘢痕サイズ及び傷の減少効果が数値的としても明確に示されることを確認した。

また、前記瘢痕組織をスライドに製作してスキャンした結果を図１５の（ａ）に示しており、ＢＢＲ処理群（ＢＢＲ１％）の真皮層の肥大程度が他の群よりも低いことが分かる。また、真皮層の肥大化の数値測定結果を図１５の（ｂ）に示しており、その結果、ＢＢＲ処理群（ＢＢＲ１％）において真皮層の肥大化が最も底いことが分かった。

上述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を持つ者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形可能であるということを理解することができるであろう。したがって、上述した実施例は全ての面で例示的であり、限定的ではないことに理解せねばならない。例えば、単一型として説明されている各構成要素は分散して実施されることが可能であり、同様に、分散して説明されている構成要素も、結合した形態で実施され得る。

本発明の範囲は後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその均等概念から導き出される全ての変更または変形は、本特許請求の範囲に含まれることに解釈されるものである。

ベンズブロマロンの濃度別にＨＳＰ４７タンパク質機能抑制率（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を測定した結果である。（ａ）は、肝星細胞ＬＸ－２にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。肝星細胞ＬＸ－２にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ，１０μＭ）を処理した結果である。（ａ）は、肝星細胞Ｔ６にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。肝星細胞Ｔ６にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導し、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を処理した結果である。（ａ）は、肺上皮細胞Ａ５４９にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。肺上皮細胞Ａ５４９において線維化抑制率［ＯＤ（５７０ｎｍ）］をベンズブロマロン濃度別に測定した結果である。（ａ）は、ケロイド患者から分離したＫＥＬＦＩＢ細胞にＴＧＦ－β１を１０ｎｇ／ｍｌ加えて線維化を誘導した結果であり、及び（ｂ）は、ベンズブロマロン（ＢＢＲ，３０μＭ）を共に処理した細胞のシリウスレッド染色写真である。ケロイド患者から分離したＫＥＬＦＩＢ細胞において線維化抑制程度をベンズブロマロン濃度別に測定した結果である。四塩化炭素（ＣＣｌ_４）によって誘導された肝線維化モデルマウスの（ａ）血漿のアラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）及び（ｂ）ビリルビン数値の分析結果である。四塩化炭素によって誘導された肝線維化モデルマウスの各群［正常、肝線維化誘導、肝線維化誘導＋ＯＣＡ（オベチコール酸）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＱＤ（１日１回）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＢＩＤ（１日２回）］の肝に対するシリウスレッド（ＳｉｒｉｕｓＲｅｄ）染色結果である。四塩化炭素によって誘導された肝線維化モデルマウスの各群［正常（ＮｏｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌ；正常群）、肝線維化誘導（ＶｅｈｉｃｌｅＣｏｎｔｒｏｌ；対照群）、肝線維化誘導＋ＯＣＡ（オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＱＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＱＤ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＢＩＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）］の肝に対する線維化面積の分析結果である。四塩化炭素によって誘導された損傷した肝組織中のコラーゲンに含まれた４－ヒドロキシプロリンの含量を分析した結果である［正常（正常群）、肝線維化誘導（対照群）、肝線維化誘導＋ＯＣＡ（オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＱＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＱＤ）、肝線維化誘導＋ＢＢＲＢＩＤ（ＩＮＶ－００１ａ３０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ）］。（ａ）は、火傷によって誘導されたミニブタの瘢痕部位を撮影した写真（ｎ＝３）であり、（ｂ）は、各瘢痕部位の面積をｃｍ^２単位で測定した結果である。（ａ）は、図１４の火傷によって誘導されたミニブタの瘢痕部位の組織をスライドとして製作した後、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）染色してスキャンした写真であり、（ｂ）は、瘢痕部位の組織の厚さをミリメートル（ｍｍ）単位で測定したグラフであって、真皮層の肥大化を確認した結果である。

Claims

ベンズブロマロンを有効成分として含む、ケロイド瘢痕または肥厚性瘢痕の予防または治療用の薬学組成物。
前記ケロイド瘢痕または肥厚性瘢痕の治療がＨＳＰ４７（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ４７）抑制によることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
前記ケロイド瘢痕または肥厚性瘢痕の治療がコラーゲン生合成抑制によることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
薬学的に許容可能な希釈剤または担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
ベンズブロマロンを有効成分として含む、皮膚瘢痕の面積減少のための、薬学組成物。
薬学的に許容可能な希釈剤または担体をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の薬学組成物。