JP7437824B2 - 検査対象が小細胞肺がん又は胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法、並びに、これらの判定方法に用いるためのプローブ及びプローブセット - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、
(3-3)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、
(3-4)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する第三の工程と、
を含む、
2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法。
前記<2>に記載の判定方法。
前記混合物をアニーリング処理する工程を含む、
前記<1>~<4>のいずれか1項に記載の判定方法。
前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、
前記<1>~<5>のいずれか1項に記載の判定方法。
前記<1>~<6>のいずれか1項に記載の判定方法。
前記<1>~<7>のいずれか1項に記載の判定方法。
前記度数分布を第一の度数分布とし、
前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記(3-1)及び(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
前記<1>~<8>のいずれか1項に記載の判定方法。
前記第一の度数分布を基に、前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求めることを更に含む、
前記<9>に記載の判定方法。
前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記(3-1)及び(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
前記<10>に記載の判定方法。
(3-1A)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求めること、
(3-2A)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得ること、
(3-3A)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定すること、
(3-4A)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定すること、
を含むプロセスにより2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成された判定装置。
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。
本開示において「~」を用いて示された数値範囲には、「~」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。各成分に該当する物質が複数種存在する場合、各成分の含有率は、特に断らない限り、当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
また、本開示に記載された具体的かつ詳細な内容の一部又は全てを利用せずとも本発明を実施可能であることは、当業者には明らかである。また、本発明の側面をあいまいにすることを避けるべく、公知の点については詳細な説明又は図示を省略する場合もある。
また、図面における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに制限されない。また、実質的に同一の機能を有する部材には全図面を通して同じ符号を付与し、重複する説明は省略する場合がある。
本開示に係る2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法は、(1)2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る第一の工程と、(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、(3-3)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、(3-4)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する第三の工程と、を含む。
図1に、本開示に係るナノポア分析技術に用いる分析装置の一例の概略断面図を示す。図1に示されるように、この分析装置は、例えば、ナノポア1Nと、脂質二重膜2と、第一の溶液3と、第二の溶液4と、測定試料に含まれる特定オリゴヌクレオチド5A及び5Bと、プローブ6と、電圧印加手段7と、を有する。また、第一の溶液3及び第二の溶液4には、電解質が含まれている。第一の溶液及び第二の溶液は、容器内に収容されている。なお、ナノポア分析技術に用いる分析装置としては、特開2015-77559、特開2014-10062等で開示されている分析装置が挙げられる。
図2に示すように、電流経時変化データでは、ナノポアINの貫通孔1Pを通る電流が阻害されていない時間TOと、ナノポアINの貫通孔1Pを通る電流が阻害されている時間TCが観測される。本開示におけるナノポア計測技術では、このナノポアINの貫通孔1Pを通る電流が阻害されている時間TC(以下「インターバル時間」とも称す)を、上述の電流経時変化データから読み取り、このデータに対して中心極限定理に基づく処理を行うことによって、測定試料における特定オリゴヌクレオチドの有無を判定している。
図3(C-1)は、5種の特定オリゴヌクレオチド5A~5Eに相補的な配列を有するプローブ6に対し、全5種の特定オリゴヌクレオチド5A~5Eがハイブリダイゼーションし複合体HYB5を形成した場合のナノポア1Nと複合体HYB5との相互作用の一例である。図3(C-1)に示すように、電圧の印加により、ナノポア1Nの貫通孔1P内に侵入したHYB5は、第二の溶液4の方向へ移動するとともに特定オリゴヌクレオチド5A~5Eとの複合を段階的に解消していくと考えられる。
本開示に係る判定方法は、第一の工程を含む。
第一の工程では、2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る。
上記検査対象に由来するサンプルとしては、例えば、生体由来の検体等が挙げられる。生体由来の検体としては、特に制限されず、尿、血液、唾液等が挙げられる。血液検体としては、例えば、赤血球、全血、血清、血漿等が挙げられる。
検査対象から得られたサンプルは、液体であってもよく、固体であってもよい。例えば、検査対象から得られたサンプルの未希釈液をそのまま使用してもよいし、該サンプルを媒体に、懸濁、分散又は溶解した希釈液を使用してもよい。検査対象から得られたサンプルが固体の場合、例えば、検体を溶液媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液を液体検体として使用することが好ましい。溶液媒体としては、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が挙げられる。このようにして得られた液体検体を、第一の溶液として、又は第一の溶液に添加して上記の判定方法において用いることができる。
プローブの種類が1種である場合、プローブは、2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれに相補的な配列を、それぞれ異なる領域に有する。
プローブが、前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的な配列を全て一分子中に含むプローブであると、2種以上の特定オリゴヌクレオチドとプローブとが形成する種々の複合体のインターバル時間を調節し易くなる傾向にある。
プローブが、それぞれ前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドの少なくとも1種に相補的な配列を含む複数のプローブ群であると、各プローブの設計及び/又は修飾により、2種以上の特定オリゴヌクレオチドとプローブとが形成する種々の複合体のインターバル時間を調節し易くなる傾向にある。
プローブの3’末端にポリデオキシシトシン構造を有すると、プローブの3’末端側が、電圧を印加した際にナノポアの貫通孔内に、複合体がより侵入し易い傾向にある。
ヘアピン構造は嵩高いため、プローブ1の5’末端がナノポアの貫通孔内に侵入し難い傾向にある。つまり、プローブの5’末端にヘアピン構造を有すると、プローブの5’末端側からのナノポアの貫通孔内への侵入を抑制し、3’末端側の一方向のみからナノポアの貫通孔内へ侵入させ易くすることができる。その結果、各複合体のナノポア分析におけるインターバル時間のばらつきが抑制される傾向にある。
本開示に係る判定方法は、第一の工程と、後述する第二の工程との間に、前記混合物をアニーリング処理する工程を含んでいてもよい。
アニーリングの時間としては、1分以上20分以下であることが好ましく、1分以上15分以下であることがより好ましく、1分以上10分以下であることが更に好ましい。
本開示に係る判定方法は、第二の工程を含む。
第二の工程では、ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る。なお、第一の溶液は、第一の工程にて得たプローブと測定試料とを混合した混合物を含む。
第一の溶液及び第二の溶液は、ナノポアの貫通孔内を通過する電流を観測することができれば、特に限定されず、適宜好適な電解液を適用してよい。電解液に含まれる電解質の種類としては、KCl、NaCl等が挙げられる。なお、電解液を用いた場合、電解質の濃度は、十分な電流強度を得る観点から、例えば、1000mM以上10M以下であってもよい。
本開示に係る判定方法は、第三の工程を含む。
第三の工程では、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、
(3-3)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、
(3-4)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する。
標本平均とは、上述で無作為に選択したn個の標本に関する算術平均値を意味する。
標本平均の信頼区間が90%以上であると、測定試料における2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を、より精度よく判定することができると考えられる。
本開示によれば、配列番号8「GTCGAACGTTTTCGTTCGACCCTCATCTCGCCCGCAAAGACCCACCCTACCTGCACTGTAAGCACTTTTCCCACAAACCATTATGTGCTGCTACCCACTTATCAGGTTGTATTATAACCAACGGAACCACTAGTGACTTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC」の塩基配列を有するDNAであるプローブ(以下、「プローブ1」と称する)が提供される。
本開示に係るプローブセットは、配列番号9「ACTACCTGCACTGTAAGACTATAAGCACTTTA」の塩基配列を有するDNAであるプローブ(以下、「プローブ2-1」と称す)と、配列番号10「CTACCTGCCACTTTG」の塩基配列を有するDNAであるプローブ(以下、「プローブ2-2」と称す)と、を含む。プローブセットは、その他のプローブを更に含んで構成されていてもよい。
本開示に係る2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定装置は、CPUと、メモリと、を備え、
(3-1A)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求めること、
(3-2A)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得ること、
(3-3A)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定すること、
(3-4A)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定すること、
を含むプロセスにより2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成されている。
電流強度経時変化測定機器120で得られた電流強度経時変化データは、イントラネット110を介して判定装置100に送信される。前記電流強度経時変化データに対してCPU101により、図4にS11~S13として例示するような中心極限定理に基づく処理を行い、標本平均の度数分布を得る。もちろん、図4における中心極限定理に基づく処理における母集団及び標本集団のサイズ、インターバル時間の抽出個数、ステップS12における繰り返し数などは単なる例示であって、本開示に基づいて適宜設定すればよい。例えば、上記第三の工程の説明を参照できる。
(3-1A)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求める工程、
(3-2A)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得る工程、
(3-3A)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定する工程、
(3-4A)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する工程。
本開示に係る検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法は、(1)小細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む。
本開示に係る検査対象が胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法は、(1)胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む。
以下の材料を用いた。
下記に示す塩基の配列を有する各miRNAを、高速液体クロマトグラフィーグレード(DNA FASMAC Co., Ltd.)でそれぞれ合成し、65μg/mLの溶液にして使用した。
配列番号1:UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG
・miR-15a
配列番号2:UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG
・miR-224
配列番号3:CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU
・miR-106a
配列番号4:AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
・miR-193
配列番号5:UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA
・miR-20a
配列番号6:UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG
・miR-17-5p
配列番号7:CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGU
1.0M KCl、10mM MOPS、pH7.0の緩衝溶液を使用した。
プローブ1は、核酸塩基等の設計が可能なCaltech(California Institute of Technology)のNUPACKを用いて、塩基配列を設計した。プローブの塩基配列は、胆管がんにおいて差示的に発現することがわかっている5種の特定オリゴヌクレオチドmiR-193、miR-106a、miR-15a、miR-374及びmiR-224に対し、この順で3’末端側から完全に相補的な配列となるように設計した。次に、この設計した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィーグレード(DNA FASMAC Co., Ltd.)でそれぞれ合成した。得られたオリゴヌクレオチドの5’末端にヘアピン構造を、3’末端にデオキシシトシンが20個連結したポリデオキシシトシンを導入し、これをプローブ1とした。プローブ1は、5’末端側から配列番号8「GTCGAACGTTTTCGTTCGACCCTCATCTCGCCCGCAAAGACCCACCCTACCTGCACTGTAAGCACTTTTCCCACAAACCATTATGTGCTGCTACCCACTTATCAGGTTGTATTATAACCAACGGAACCACTAGTGACTTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC」の塩基配列を有する。プローブ1は、緩衝溶液中、484.8μg/mLに調製したもの(以下、「プローブ1溶液」と称す)を使用した。
プローブ2-1は、核酸塩基等の設計が可能なCaltech(California Institute of Technology)社製のNUPACKを用いて、塩基配列を設計した。
プローブ2-1は、小細胞肺がんにおいて差示的に発現することがわかっている特定オリゴヌクレオチドmiR-20aに対し完全に相補的な塩基配列を、3’末端側に有する。また、プローブ2-1は、小細胞肺がんにおいてmiR-20aと同様に差示的に発現することがわかっている特定オリゴヌクレオチドmiR-17-5pに対し完全に相補的な塩基配列を、5’末端側に有する。プローブ2-1は、5’末端側から配列番号9「ACTACCTGCACTGTAAGACTATAAGCACTTTA」の塩基配列を有する。次に、この設計した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィーグレード(DNA FASMAC Co., Ltd.)で合成し、プローブ2-1を得た。プローブ2-1は、緩衝溶液中、1888μg/mLに調製したもの(以下、「プローブ2-1溶液」と称す)を使用した。
プローブ2-2は、核酸塩基等の設計が可能なCaltech(California Institute of Technology)社製のNUPACKを用いて、塩基配列を設計した。
プローブ2-2は、miR-20aに対し完全に相補的な塩基配列を、3’末端側に有する。また、プローブ2-2は、miR-17-5pに対し完全に相補的な塩基配列を、5’末端側に有する。プローブ2-2は、5’末端側から配列番号10「CTACCTGCCACTTTG」の塩基配列を有する。次に、この設計した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィーグレード(DNA FASMAC Co., Ltd.)で合成し、プローブ2-2を得た。プローブ2-2は、緩衝溶液中、447.9μg/mLに調製したもの(以下、「プローブ2-2溶液」と称す)を使用した。
ナノポアを有する脂質二重膜を、脂質としてジフタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC、Avanti Polar Lipids, Inc.)を用いて、1つのウェル上に設け、脂質二重膜によりウェル内の溶液を第一の溶液及び第二の溶液に隔てた。次に、脂質二重膜で隔てられる第一の溶液及び第二の溶液(それぞれ4.7μL)それぞれに、1M KClおよび10mM MOPS(pH7.0)を加えた。なお、ナノポアは、スタフィロコッカス・アウレウスから単離された単量体ポリペプチドである野生型αHL(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO and USA、List Biological Laboratories、Campbell、CA、USA)を使用した。
[実施例1]
(プローブ2-1及びプローブ2-2のみを混合した、特定オリゴヌクレオチドを含まない混合物の調製)
1μLのプローブ2-1溶液と、1μLのプローブ2-2溶液と、を混合し、混合物を調製した。その後、混合物を95℃で5分間加熱し、次いで室温(25℃)にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体HYB0とした。
測定試料である1μLのmiR-20a溶液と、1μLのプローブ2-1溶液と、1μLのプローブ2-2溶液と、を混合し、混合物を調製した。その後、混合物を95℃で5分間加熱し、次いで室温(25℃)にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体HYB1-20aとした。他方の特定オリゴヌクレオチドmiR-17-5pについても、HYB1-20aと同様にして、対応する混合物:HYB1-17-5pを調製し、アニーリング処理を行った。
測定試料であるそれぞれ1μLのmiR-20a溶液及びmiR-17-5p溶液と、1μLのプローブ2-1溶液と、1μLのプローブ2-2溶液と、を混合し、混合物を調製した。その後、混合物を95℃で5分間加熱し、次いで室温(25℃)にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体HYB2DUOとした。
複合体HYB1-20a溶液を、第一の溶液中に4.7μL加えた。次に、第一の溶液から第二の溶液の方向へ+150mVの一定電圧を印加し、電流経時変化データを、Digidata 1440Aアナログ-デジタル変換器(Molecular Devices)を備えたClampex 9.0(Molecular Devices)を用いて、取得した。なお、Axopatch 200B Amplifier(Molecular Devices、San Jose、CA、USA)を用いて印加している電流を記録した。混合物HYB-193と同様にして、他の混合物:HYB0、HYB1-17-5p及びHYB2DUOについてもそれぞれ電流経時変化データを取得した。
第二の工程により得られた複合体HYB1-20aに関する電流経時変化データを基に、度数分布を得た。図4に詳細なフローチャートを示す。まず、電流経時変化データS10から、300個のインターバル時間を取得し、これを母集団とした(S11)。次に、前記300個のインターバル時間から、無作為に10000個のインターバル時間を選択し、これを標本集団とした(S12A)。その後、この標本集団について算術平均を求め、これを標本平均とした(S12B)。図4に示すように、この標本集団を作成し標本平均を求める工程(S12)を65536回繰り返し、度数分布を得た。得られた65536個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した(S13、及び図5(B-2)参照)。複合体HYB1-20aと同様にして作成したHYB0のヒストグラムを図5(B-1)に、HYB1-17-5pのヒストグラムを図5(B-3)に、HYB2DUOのヒストグラムを図5(B-4)に、それぞれ示す。なお、本開示において母集団とは、統計処理を行う前の測定データの意味で用いている。
(第一及び第二の工程)
実施例1と同様にして電流経時変化データを取得した。
上記第二の工程により得られた複合体HYB1-20aに関する電流経時変化データから、300個のインターバル時間を取得し、これを母集団とした。次に、この母集団に対する算術平均を求めた。得られた算術平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作製した(図5(A-2)を参照)。複合体HYB1-20aと同様にして作成したHYB0のヒストグラムを図5(A-1)に、HYB1-17-5pのヒストグラムを図5(A-3)に、HYB2DUOのヒストグラムを図5(A-4)に、それぞれ示す。
[実施例2]
(第一の工程)
(5種の特定オリゴヌクレオチドそれぞれとプローブ1との1:1の混合物の調製)
測定試料である1μLのmiR-193溶液と、1μLのプローブ1溶液とを混合し、混合物を調製した。その後、混合物を95℃で5分間加熱し、次いで室温(25℃)にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体HYB1-193とした。他の特定オリゴヌクレオチドであるmiR-106a、miR-15a、miR-374、miR-224についても、miR-193と同様にして、それぞれ対応する混合物:HYB1-106a、HYB1-15a、HYB1-374及びHYB1-224を調製し、HYB1-193の場合と同様にアニーリング処理を行った。
測定試料であるそれぞれ1μLのmiR-193溶液、miR-15a溶液及びmiR-224溶液と、1μLのプローブ1溶液とを混合し、混合物を調製した。その後、混合物を95℃で5分間加熱し、次いで室温(25℃)にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体HYB3とした。
測定試料であるそれぞれ1μLの5種の特定オリゴヌクレオチドの溶液(miR-193溶液、miR-106a溶液、miR-15a溶液、miR-374溶液及びmiR-224溶液)と、1μLのプローブ1溶液と混合し、混合物を調製した。その後、混合物を95℃で5分間加熱し、次いで室温(25℃)にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体HYB5とした。
複合体HYB1-193溶液を、第一の溶液中に4.7μL加えた。次に、第一の溶液から第二の溶液の方向へ+150mVの一定電圧を印加し、電流経時変化データを、Digidata 1440Aアナログ-デジタル変換器(Molecular Devices)を備えたClampex 9.0(Molecular Devices)を用いて、取得した。なお、Axopatch 200B Amplifier(Molecular Devices、San Jose、CA、USA)を用いて印加している電流を記録した。混合物HYB-193と同様にして、他の混合物:HYB1-106a、HYB1-15a、HYB1-374、HYB1-224、HYB3及びHYB5についてもそれぞれ電流経時変化データを取得した。
第二の工程により得られた複合体HYB1-193に関する電流経時変化データを基に、実施例1と同様にして得た65536個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した(図6参照)。また、複合体HYB-193と同様にして、他の複合体:HYB1-106a、HYB1-15a、HYB1-374、HYB1-224、HYB3及びHYB5についてもそれぞれヒストグラムを作成した(図6参照)。なお、各複合体のヒストグラムにおいて、縦軸である頻度(度数)は、各正規分布の中央値にてノーマライズした値を示している。
[実施例3]
(健常者に由来するサンプル:第一及び第二の工程)
実施例1において、測定試料を、健常者の血漿から抽出したmiRNAを含む溶液5μLとした。その他は、実施例1と同様にして電流経時変化データを取得した。また、血漿は、健常者の血液から遠心分離することで得た。血漿からmiRNAを含む溶液の抽出には、NucleoSpin miRNA Plasma(製品番号740981.10、マッハライ・ナーゲル社製)を用いた。
実施例1と同様にして得られた65536個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した(図7(A)参照)。
実施例1において、測定試料を、胆管がんに罹患していることが予め判明している者の血漿から抽出したmiRNAを含む溶液とした。その他は、実施例1と同様にして電流経時変化データを取得した。また、血漿は、健常者の血液から遠心分離することで得た。血漿からmiRNAを含む溶液の抽出には、NucleoSpin miRNA Plasma(製品番号740981.10、マッハライ・ナーゲル社製)を用いた。
実施例1と同様にして得られた65536個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した(図7(B)参照)。
これらの結果から、本開示に係る2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法によれば、比較例1では不可能に近かった2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を、簡便に、且つ、精度よく判定することができることがわかった。
1P ナノポアの貫通孔
2 脂質二重膜
3 第一の溶液
4 第二の溶液
5A、5B、5C、5D、5E 特定オリゴヌクレオチド
6 プローブ
7 電圧印加手段
100 判定装置
101 CPU
102 ROM
103 RAM
104 不揮発性メモリ
105 バス
106 入出力インターフェース(I/O)
110 イントラネット
120 電流強度経時変化測定機器
130 表示装置
Claims (4)
- (1)小細胞肺がんにおいて差示的に発現する2種以上の特定オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について、中心極限定理に基づき、母集団である複数個のインターバル時間から無作為に複数個のインターバル時間を選択し標本集団とする工程Aと、前記標本集団の標本平均を求める工程Bと、前記工程A及び工程Bを繰り返す工程Cと、を含む処理を行い第一の度数分布を得て、
(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含み、
前記プローブは、前記インターバル時間が前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドの種類によって異なるように設計されており、
前記検査対象に由来するサンプル、健常者に由来するサンプル、及び小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルは、臨床サンプルから核酸を抽出した溶液であり、
下記(i)、(ii)、(iii)及び(iv)の少なくとも1つの判定基準に基づき、検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法:
(i)第一の度数分布の予め定められた信頼区間と、第二の度数分布の予め定められた信頼区間と、が重複していない場合に、検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有すると判定する。
(ii)第一の度数分布の中央値と第三の度数分布の中央値とが合致している場合に、検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有すると判定する。
(iii)第一の度数分布の予め定められた信頼区間に、第二の度数分布の中央値が含まれている場合、検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有さないと判定する。
(iv)第一の度数分布の予め定められた信頼区間と、第三の度数分布の予め定められた信頼区間と、が重複している場合に、検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有すると判定する。 - (1)胆管がんにおいて差示的に発現する2種以上の特定オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について、中心極限定理に基づき、母集団である複数個のインターバル時間から無作為に複数個のインターバル時間を選択し標本集団とする工程Aと、前記標本集団の標本平均を求める工程Bと、前記工程A及び工程Bを繰り返す工程Cと、を含む処理を行い第一の度数分布を得て、
(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含み、
前記プローブは、前記インターバル時間が前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドの種類によって異なるように設計されており、
前記検査対象に由来するサンプル、健常者に由来するサンプル、及び胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルは、臨床サンプルから核酸を抽出した溶液であり、
下記(i)、(ii)、(iii)及び(iv)の少なくとも1つの判定基準に基づき、検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法:
(i)第一の度数分布の予め定められた信頼区間と、第二の度数分布の予め定められた信頼区間と、が重複していない場合に、検査対象が胆管がんに罹患している又はそのリスクを有すると判定する。
(ii)第一の度数分布の中央値と第三の度数分布の中央値とが合致している場合に、検査対象が胆管がんに罹患している又はそのリスクを有すると判定する。
(iii)第一の度数分布の予め定められた信頼区間に、第二の度数分布の中央値が含まれている場合、検査対象が胆管がんに罹患しているリスクを有さないと判定する。
(iv)第一の度数分布の予め定められた信頼区間と、第三の度数分布の予め定められた信頼区間と、が重複している場合に、検査対象が胆管がんに罹患している又はそのリスクを有すると判定する。 - 請求項2に記載の方法に用いるための、配列番号8の塩基配列を有するプローブ。
- 請求項1に記載の方法に用いるための、配列番号9の塩基配列を有するプローブと、配列番号10の塩基配列を有するプローブと、を含む、プローブセット。
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analytical chemistry,2017年,Volume 89, Issue 4,pp. 2312-2317 |
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