JP7430803B2 - 3CLproを標的とするフィリリンとその誘導体、及び新型コロナウイルスに対する用途 - Google Patents
3CLproを標的とするフィリリンとその誘導体、及び新型コロナウイルスに対する用途 Download PDFInfo
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Description
本発明の第一の用途において、前述誘導体はKD-2-GLU又はKD-2-SO3Hであることが好ま
しい。
本発明の第二の用途において、前述誘導体はKD-2-GLU又はKD-2-SO3Hであることが好ましい。
またフィリリン/フィリゲニン組成物の含有する薬物において、前述薬剤は錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、注射剤、スプレー剤、エアゾール剤、ゲル剤、クリーム剤、パップ剤、テープ剤又は湿布剤の形で存在することが望ましい。
また、前述方法において、前述薬剤は錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、注射剤、スプレー剤、エアゾール剤、ゲル剤、クリーム剤、パップ剤、テープ剤又は湿布剤の形で存在することが望ましい。
フィリリン/フィリゲニン組成物によるin vitro抗COVID-19ウイルス試験
2 細胞:VeroE6細胞(広州呼吸器健康研究所呼吸器疾患国立主要研究所)。
3 ウイルス:力価がTCID50 =10-6/100μLであるCOVID-19ウイルスSARS-CoV-2株(広州税関技術センターBSL-3ラボ(呼吸器疾患国立主要研究所高病原性微生物研究室))。
4 実験プロセス(実験操作は全てBSL-3実験室で行われた):
(1)滅菌96ウェル培養プレートを用い、100 μLのVeroE6細胞を2×105 cells/mLの濃度で各ウェルに添加し、37°C、5% CO2で24時間培養する。
(2)100 TCID50ウイルス溶液を100 μL/ウェルで培養プレート実験群とウイルス対照群に添加し、37°C、5% CO2インキュベーターで2時間吸着を行う。
(3)2時間後、96ウェル培養プレート中の細胞培養液を廃棄し、フィリリン/フィリゲニン組成物を表1に示す一連の濃度に希釈し、各濃度の上記薬液を100 μl/ウェルで添加し、これをそれぞれ3培養プレートずつ準備する。
(4)細胞対照、ブランク対照(溶媒対照)及びウイルス対照(陰性対照)も同時に設定する。
(5)37℃、5% CO2インキュベーターで3~4日間培養する。
(6)細胞変性効果(CPE)を光学顕微鏡で観察し、細胞変性の程度を以下の6級基準に基づいて記録する:「±」は10%未満の細胞変性、「+」は約25%の細胞変性、「++」は約50%の細胞変性、「+++」は約75%の細胞変性、「++++」は75%以上の細胞変性が認められたことである。リード‐ミュンヒの(Reed-Muench)法又はグラフパッド プリズム(GraphPad Prism 5.0)を用いて、50%細胞増殖阻害濃度(IC50)を算出する。
5 実験結果:
実験の結果は表1-1に示されたように、フィリリン/フィリゲニン組成物は低濃度でCOVID-19ウイルスを効果的に阻害することができ、50%阻害濃度IC50は63.90 μg/mL(これに対し、同時に検討したフィリリン純物質の50%阻害濃度IC50は179.1μg/mLであり、フィリゲニン純物質の阻害効果はさらに劣っている)と算出され、組成物中のフィリリンとフィリゲニンの2成分の組合せは相乗効果を発揮しているため、COVID-19の治療薬として期待される。
フィリリン/フィリゲニン組成物によるin vitro抗HCoV-229E試験
実験の結果は表2-1に示されたように、フィリリン/フィリゲニン組成物は低濃度でHCoV-229Eウイルスを効果的に阻害することができ、50%阻害濃度IC50は64.53 μg/mL(これに対し、同時に検討したフィリリン純物質及びフィリゲニン純物質の阻害効果はより劣っている)と算出され、組成物中のフィリリンとフィリゲニンの2成分の組合せは相乗効果を発揮しているため、HCoV-229Eの治療薬として期待される。
COVID-19ウイルスを阻害するフィリリン及びその誘導体の分子機構に関する研究
COVID-19ウイルスの表面にあるスパイクタンパク質(Sタンパク質)及び3-キモトリプシン様システインタンパク質
(3-chymotrypsin-like cysteine protease、略称は3CLproタンパク質)はCOVID-19ウイルスのライフサイクルプロセスと非常に重要な関連がある。COVID-19のライフサイクルとは、COVID-19の表面のSタンパク質を利用してアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合し、細胞自体のエンドサイトーシス過程を経て、細胞に侵入して遺伝物質RNAを放出し、3CLproタンパク質と共に遺伝物質RNAの複製に成功し、ウイルスを産生するのである。
バーチャルスクリーニングは、主にコンピューターで創薬スクリーニングのプロセスをシミュレートする分子ドッキング技術を活用する。このスクリーニングを実施するために、創薬標的分子の構造を知る必要があり、分子シミュレーションにより化合物ライブラリーにある低分子の標的結合力を計算して、候補化合物の生理活性を予測する。
本実験は、グライド(Glide分子)ドッキング技術を用い、3CLpro標的タンパク質に対するフィリリン(KD-1)及びその誘導体の最適な結合効果をバーチャルスクリーングし、その結果に基づいて、KD-1及びその誘導体の標的タンパク質に対する結合をin vitroで検討し、分子間相互作用及び結合モードとKD-1及びその誘導体との構造活性相関を解明する。標的タンパク質に対するKD-1及びその誘導体の活性測定により、KD-1及びその誘導体がCOVID-19に対する潜在的な阻害剤としての分子機構であることが明らかになった。
二、実験方法
1 KD-1及びその誘導体と標的タンパク質の分子ドッキング
(1)システムの準備:SARS-CoV-2メインプロテナーゼ(3CLproタンパク質)の2.16A結晶構造をタンパク質の立体構造データベース(PDB ID:6LU7)から取得した。酵素の構造は、シュレーディンガー(Schrodinger)のタンパク質 準備ウィザード(Preparation Wizard)を用いて結晶水を除去し、欠損した水素/側鎖原子を追加し、またpH 7.0の酸性及び塩基性アミノ酸残基に適切な電荷とプロトン化状態を配分する前処理をしてから、OPLS-2005力場を用いて酵素構造のエネルギーを最小化し、最後にサイトマップを用いてタンパク質の活性部位を予測した。それと同時に、シュレーディンガー のLigPrepモジュールを用いて、フィリリン及びその誘導体の構造・配座を最適化した。
(2)分子ドッキング:分子ドッキングに基づくバーチャルスクリーニングはマストロ(Maestro) 11.5のグライドワークフローを利用して行われた。フィリリン及びその誘導体(図1)のドッキング計算は、グライドの「超高精度」モード(XP)を用いて実施された。
(3)ドッキングスコア:低分子と標的タンパク質の相互作用を評価するために、水素結合、疎水性、ファンデルワールス力などの相互作用を総合的に考慮する「Glide-score」のスコア関数値を用い、その絶対値が大きいほど、低分子と標的タンパク質のドッキング複合体が安定し、適合・結合効果が良いことを示している。
(4)目標分析:新型コロナウイルス感染症の臨床予防、診断及び治療へ理論基盤と重要な参考資料を提供する目的で、KD-1及びその誘導体と新型コロナウイルスの主要標的タンパク質とのドッキング結果を通じて、KD-1及びその誘導体は新型コロナウイルスの主要タンパク質と相互作用する主要アミノ酸を分析した。
2 タンパク質の発現と精製
(1)クローニング:SARS-CoV-2 3CLproタンパク質のコーディングをする完全長遺伝子(UniprotKB-P0DTD1、残基3264-3569)は、大腸菌発現系に最適化及び合成(武漢ジーンクリエイトバイオエンジニアリング株式会社)が行われた。
(2)発現:発現プラスミドを大腸菌BL21(DE3)細胞に形質変換して、37℃で、100 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培養した。細胞の増殖はOD600 nm値が0.6-0.8になる時、0.5mM IPTGを細胞培養物に加え、30℃、180 rpmでの発現を誘導した。10時間後、3,000gで遠心分離し、細胞を回収した。
(3)精製:細胞沈殿物を溶解バッファー(20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM BME)に再懸濁し、超音波破砕により溶解した後、13,000gで、30分間遠心分離した。上清をNi-NTAアフィニティーカラムにロードし、20 mMイミダゾールを含む再懸濁バッファーで洗浄後、300 mMイミダゾールを含む溶解バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.0、150 mM NaCl)でHisタグ3CLproタンパク質を溶出した。この3CLproタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製された。3CLプロタンパク質は、最終的にモノマーとダイマーの混合物として得られ、溶液中で保存された。
3 分光実験
本実験は、JASCO-V560シリーズの紫外可視分光光度計を用いて、タンパク質の構造変化を探索した。タンパク質の紫外吸収スペクトルには2つの吸収ピークがあり、210 nmの強い吸収ピークはペプチド結合におけるC=Oのn-π*遷移に起因するタンパク質のフレームワーク立体配座を反映した。280 nmに弱い吸収ピークが現れたのは、光に対する芳香族アミノ酸(Trp、Tyr及びPhe)の吸収によるπ-π*遷移の結果である。
本実験はバッファーを参照として、200-700 nmの波長範囲で、タンパク質溶液及びフィリリンとタンパク質の混合溶液の紫外可視吸収スペクトルをスキャンした。Gel Buffer(50 mM Tris-HCl pH 7.0、150 mM NaCl)を石英キューベットに2 ml加え、10-5Mの濃度で3CLproタンパク質を10 μL加え、その吸光度値を測定すると共に、10-4Mの濃度でフィリリン 及びその誘導体をそれぞれ10 μL加えて、吸光度の変化を測定した。
三、実験結果
COVID-19のライフサイクルはCOVID-19の表面にあるSタンパク質を利用してアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合し、細胞自体のエンドサイトーシス過程を経て、細胞に侵入して遺伝物質RNAを放出し、3CLproタンパク質の関与の下、遺伝物質RNAの複製に成功し、ウイルスを産生する。本実験は、3CLproタンパク質の遺伝物質RNAの複製に関与することを阻害できる化合物を探し、抗COVID-19薬を開発する。本実験は、3CLproタンパク質の結晶構造により最適標的部位を選択し、化合物KD-1及びその誘導体(KD-2-GLUとKD-2-SO3H)のバーチャルスクリーニングを行い、KD-1、KD-2-GLU及びKD-2-SO3H化合物の3CLproタンパク質に対する部位結合のスコアが得られ、この化合物が3CLproタンパク質を標的とすることを実証した。
計算分析によって、3CLproタンパク質の3次元構造に潜在的な活性部位が5つ見つかり、そのうち、部位1が薬物分子の結合しやすい部位である。KD-1を3CLproタンパク質の5つの潜在的な活性部位にドッキングさせ、5つともドッキングに成功した。ドッキングスコアは表3-1に示されている。そのうち、他3CLproタンパク質の活性部位に比べて、3CLproタンパク質の活性部位1におけるKD-1のGlideスコアは明らかに高いため、3CLproタンパク質の活性部位1を分子ドッキングの理論値と選定した。KD-2-GLUとKD-2-SO3Hは上記と同様に計算・分析された。
分子ドッキングの結果によって、RNA複製に関与するCOVID-19ウイルスのコアタンパク質3CLproタンパク質に対するKD-1、KD-2-GLU及びKD-2-SO3H化合物の結合スコア論理値は有効であり、そのうち、KD-1とKD-2-GLUの結合スコアはとても高いことが示された。分析によって、KD-1、KD-2-GLU及びKD-2-SO3H化合物と3CLproタンパク質活性部位のペプチド結合は水素結合又は疎水性結合を生じ、アミノ酸残基とπ-π共役を形成し、その理論的データは3CLproタンパク質の構造を変化させたことが実証できた。in vitroでスペクトル法を用いた実験の結果は、KD-1、KD-2-GLU及びKD-2-SO3H化合物はいずれも278 nmにある3CLproタンパク質の特徴的なピークをシフトし増大させた現象が有り、そのうち、KD-1化合物は最も顕著であることを示している。それゆえに、KD-1、KD-2-GLU及びKD-2-SO3H化合物はいずれも3CLproタンパク質を標的とする作用があり、COVID-19ウイルスの3CLproタンパク質がウイルスの複製に関与することを阻害する化合物として、COVID-19ウイルスを標的とする阻害剤となる可能性がある。
抗新型コロナウイルスのin vivo薬効薬理試験
マウス:hACE2マウス、6-7週齢、20-40g、計120匹の雄。実験動物サプライヤー:江蘇省メディシエンスバイオ医薬品株式会社、実験動物生産許可証:SCXK(蘇)2018-0008、実験動物基準適合証明書番号:No.320727201100243581、飼料サプライヤー:江蘇省メディシエンスバイオ医薬品株式会社。
薬剤:フィリリンとフィリゲニンの重量比は90 : 10であるフィリリン/フィリゲニン組成物(大連富生天然薬物開発有限会社)。
二、実験方法
(1)COVID-19マウスの疾患進行に対する薬剤の予防効果
hACE2遺伝子組換えC57BL/6のマウスは正常群、SARS-CoV-2感染群、投与量80 mg/kgと40 mg/kg群、実薬対照群(レムデシビル50 mg/kg)、各群8匹ずつに分けられた。PBSを点鼻投与した正常群を除いて、他の各群のマウスは点鼻で105PFUのSARS-CoV-2ウイルスに感染した。感染後2時間後、投与群のマウスに1日1回、5日連続でフィリリンを胃内投与した。感染後、体重の変化を毎日記録し、5日間の死亡率を算出した。
(2)COVID-19マウスの感染による過剰な炎症に対する薬効薬理試験
ACE2遺伝子組換えC57BL/6のマウスは正常群、SARS-CoV-2感染群、投与量80 mg/kgと40 mg/kg群、実薬対照群(レムデシビル50 mg/kg)に分けられた。PBSを点鼻投与した正常群を除いて、他の各群のマウスは点鼻で105PFUのSARS-CoV-2ウイルスに感染した。感染後2時間後、投与群のマウスに1日1回、5日連続でフィリリンを胃内投与した。感染後5日目、動物を解剖し、肺を摘出し、肺組織をホモジナイズしてウイルス力価を測定し、またTrizol法によって肺組織のホモジネート上清からトータルRNAを抽出し、RT-qPCRによって関連炎症性因子のmRNAの発現を検出した。
(1)新型コロナウイルスに対する薬剤の死亡予防試験の結果
死亡予防の結果は表4-1に示され、新型コロナウイルス感染マウスに対する2用量(80 mg/kgと40 mg/kg)の投与群の予防効果はそれぞれ87.5%と42.86%あり、ウイルス感染群では71.43%のマウスが死亡し、80 mg/kg投与群の予防率はレムデシビルと同程度である。
表4-2に示されたように、2用量(80 mg/kgと40 mg/kg)の投与群は感染マウスの肺ウイルス力価が有意に低下し、80 mg/kg投与群では肺ウイルス力価に対する抑制はレムデシビル群と比べて、統計学的に有意差はない。
感染マウスの炎症性指標の測定結果は表4-3に示されたように、マウスが新型コロナウイル感染後5日目、ウイルス感染群のIL-1β、IFN-γ、MCP-1及びIFN-αの発現は顕著に上昇し、薬剤介入後、2用量群(80 mg/kgと40 mg/kg)はIL-1β、IFN-γ、MCP-1及びIFN-α炎症性因子に対していずれも抑制効果がある。なお、80 mg/kg投与群は、炎症性メディエーターの過剰発現に対する抑制力はレムデシビル群より優れている。
上記実験結果は、本発明の薬剤は新型コロナウイルス感染マウスの死亡に対して有効な予防効果があり、新型コロナウイルス感染マウスに対する死亡予防率は87.5%に達し、レムデシビル群と同程度の有効性があり、新型コロナウイルス感染マウスの肺組織ウイルス力価を有効に抑制することができ、なお新型コロナウイルス感染による過剰な炎症性因子IL-1β、IFN-α、MCP-1及びIFN-γのmRNA発現も抑制し、これによって新型コロナウイルス感染症を治療する役割を果たす。
Claims (13)
- COVID-19ウイルスの3CLproタンパク質を阻害するための試薬調整におけるフィリリン及び/ 又はその誘導体であるKD-2-GLU又はKD-2-SO3 Hの使用。
- 抗COVID-19ウイルス又はCOVID-19ウイルスによる疾患を治療するための薬剤調製におけるフィリリン/ フィリゲニン組成物の使用で、フィリリン/ フィリゲニン組成物がCOVID-19ウイルスの3CLproタンパク質を阻害することを特徴とする使用。
- フィリリン/ フィリゲニン組成物におけるフィリリンとフィリゲニンの重量比は2~ 98 :2~ 98である請求項2に記載の使用。
- フィリリン/ フィリゲニン組成物が唯一の薬物有効成分とする請求項2に記載の使用。
- 前述薬剤は錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、注射剤、スプレー剤、エアゾール剤、ゲル剤、クリーム剤、パップ剤、テープ剤又は湿布剤の形で存在する、請求項2に記載の使用。
- COVID-19病毒の3CLproタンパク質の阻害のためのフィリリン/ フィリゲニン組成物。
- フィリリン/ フィリゲニン組成物におけるフィリリンとフィリゲニンの重量比は2~ 98 :
2~ 98である請求項6に記載の組成物。 - フィリリン/ フィリゲニン組成物を含む、COVID-19ウイルスの3CLproタンパク質の阻害のための薬剤。
- フィリリン/ フィリゲニン組成物におけるフィリリンとフィリゲニンの重量比は2~ 98 :2~ 98である請求項8に記載の薬剤。
- フィリリン / フィリゲニン組成物が唯一の薬物有効成分とする請求項8に記載の薬剤。
- 前述薬剤は錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、注射剤、スプレー剤、エアゾール剤、ゲル剤、クリーム剤、パップ剤、テープ剤又は湿布剤の形で存在する請求項8に記載の薬剤。
- 抗COVID-19ウイルス又はCOVID-19ウイルスによる疾患を治療するための薬剤調製におけるフィリリン/ フィリゲニン組成物の使用で、フィリリン/ フィリゲニン組成物がCOVID-19感染による炎症性因子であるmRNA発現を抑制することを特徴とする使用。
- 前記炎症性因子は、IL-1β 、IFN-α 、MCP-1及びIFN-γのいずれかである請求項12に記載の使用。
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