CN116018143A

CN116018143A - 用于治疗由sars-cov-2病毒引起的病毒感染的包含地尔硫卓的组合物

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Publication number: CN116018143A
Application number: CN202180032644.7A
Authority: CN
Inventors: M·罗莎-卡拉特拉瓦; O·特利尔; M·A·皮佐诺; A·特拉外西; B·帕德; T·于连
Original assignee: Xijia Treatment Co; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Normale Superieure de Lyon
Current assignee: Xijia Treatment Co; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Normale Superieure de Lyon
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2023-04-25
Also published as: US20230210866A1; WO2021181044A1; CA3170621A1; FR3108033A1; FR3108033B1; JP2023517639A; IL296342A; EP4117669A1

Abstract

本发明涉及一种在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物，其在用于预防和/或治疗称为COVID‑19病的由SARS‑CoV‑2病毒引起的病毒感染中的治疗用途。

Description

用于治疗由SARS-COV-2病毒引起的病毒感染的包含地尔硫卓的组合物

技术领域

本发明涉及已知治疗性化合物单独或与其他活性成分组合用于治疗严重急性呼吸系统综合征冠状病毒SARS-CoV-2引起的病毒感染(也称为冠状病毒2019病(COVID-19))的新的治疗用途。

背景技术

人类急性呼吸道感染(IRA)是引起全世界诊疗、住院和死亡的主要原因之一，特别是幼儿死亡的主要原因，导致每年有近200万人死亡。在引起急性呼吸道感染的病原体中，病毒占有重要地位。更特别地，大多数儿童肺炎病例中存在病毒，并且病毒是成人细菌性肺炎的诱发因素。

冠状病毒是包膜病毒，具有呈螺旋对称的衣壳。冠状病毒具有单条正链ARN基因组，能够感染鸟类和哺乳动物的细胞。

冠状病毒感染可以引起呼吸道疾病，其与类似普通感冒的症状(特别是由hCoV和OC43病毒引起的感冒)、细支气管炎(由NL63病毒引起)或者甚至更严重的疾病，如由SARS-CoV(严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus))引起的严重急性呼吸系统综合征(在2003年引起流行)、以及由MERS-CoV引起的中东呼吸系统综合征(在2012年引起流行)相关。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2或SARS-CoV-2是2019-2020年冠状病毒流行起源的冠状病毒，产生了名为冠状病毒病2019(COVID-19)的肺炎形式。2020年1月30日，世界卫生组织(WHO)宣布此次流行为“国际关注的突发公共卫生事件”。截至2020年3月9日，全球已确诊111,321例病例，包括在109个国家的3892例死亡。

与SARS-CoV病毒相关的SARS-CoV-2病毒属于严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒种，属于β冠状病毒属(Betacoronavirus)和冠状病毒科(Coronaviridae)(Gorbalenya等人，2020)。病毒粒子的形态是冠状病毒的典型形态，特别是具有光环(halo)刺突蛋白(“spike”)，因此它们被命名为“冠状病毒”。

SARS-CoV-2基因组由29,903个核苷酸的单链ARN组成，于2020年1月5日由上海复旦大学(中国)的一个团队首次测序。SARS-CoV-2基因组与SARS-CoV的基因组相似度为79.5％，与蝙蝠冠状病毒相似度为96％，这表明SARS-CoV-2病毒的起源是动物传染的，并且存在于蝙蝠中(Zhou等人，2020)。

SARS-CoV-2感染的症状与季节性流感非常相似：包括发烧、疲倦、干咳、气短、呼吸困难、肺炎和肾功能衰竭，严重病例中可导致患者死亡(Hui等人，2020年)。

根据各国向世卫组织提供的确诊感染和死亡数据计算致死率，可以估计死亡率约为2％(2020年2月的数据)。然而，由于难以在现场估计确诊病例的数量和直接归因于SARS-CoV-2的死亡数，这一死亡率仍然不确定。事实上，应该指出的是，根据世卫组织的数据，大多数死亡患者的免疫系统因其他健康问题(如高血压、糖尿病或心血管疾病)而减弱。

SARS-CoV-2的潜伏期估计在2至14天之间，但在某些情况下潜伏期可能更长，达24天。

目前没有特定的抗病毒治疗或疫苗可以用于预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒感染。

目前感染这种病毒的患者接受的主要治疗基本上是为了缓解发烧、咳嗽和呼吸困难的症状，以促进他们的自然恢复。

以对其他类型病毒的治疗活性而闻名的抗病毒化合物，目前正在二期和三期临床试验中进行测试。这些抗病毒化合物特别涉及细胞或病毒蛋白酶抑制剂化合物和核苷类似物。这些不同的治疗化合物具体地包括瑞德西韦(Remdesivir)、加利地韦(Galidesivir)、洛匹那韦(Lopinavir)、甲磺酸卡莫司他(Camostat mésilate)和氯喹。

瑞德西韦

瑞德西韦是一种广谱抗病毒化合物，作为核苷类似物，特别是作为腺苷类似物起作用。这种化合物以冻干物形式提供，静脉内施用。瑞德西韦被代谢为其活性核苷酸类似物的形式(GS-441524)：其存在会误导病毒聚合酶，导致病毒ARN合成减少。

瑞德西韦由吉利德科学公司(Gilead Science)研发，用于治疗埃博拉病毒感染和马尔堡病毒感染。在临床前模型中，瑞德西韦还具有针对其他单链ARN病毒的抗病毒活性，如尼帕(Nipah)、亨德拉(Hendra)和拉沙热(Lassa)病毒、呼吸道合胞病毒(VRS)以及SARS和MERS冠状病毒(Lo等人，2017)。

到目前为止，在临床上，已针对健康志愿者和感染埃博拉病毒的患者对瑞德西韦进行了研究。为一些感染SARS-CoV-2的患者开出的治疗并未提供有关治疗SARS-CoV-2感染的安全性和/或有效性的信息。此外，鉴于有限的临床经验，这种化合物的毒性特征和由此而来的安全特征目前尚未得到表征。瑞德西韦尚未获得上市许可。

在此背景下，吉利德向中国提供了瑞德西韦，以便在包含感染SARS-CoV-2的患者(有或无症状)在内的多项临床测试中对瑞德西韦进行评估。2020年2月26日，吉利德宣布测试这种化合物的两项3期临床试验的效能。

加利昔韦

加利昔韦(BCX4430)是一种核苷类似物，特别是腺苷的类似物，由BioCrystPharmaceuticals研发。

这种抗病毒化合物最初研发用于对抗丙型肝炎病毒，随后用于对抗丝状病毒，如埃博拉病毒和马尔堡病毒。当暴露于病毒后长达48小时施用加利昔韦，可以保护啮齿动物和猴子免受埃博拉病毒病和马尔堡病毒病。为了填补西非抗击埃博拉病毒病流行的可用治疗方法的不足，已经加速用于人的研发。

这种化合物针对ARN病毒的所有其他科，如布尼亚病毒、沙粒病毒、副粘病毒、冠状病毒和黄病毒具有广谱抗病毒活性。

莫努匹韦(Molnupiravir)

莫努匹韦(也缩写为EIDD-2801和MK-4482)是一种抗病毒化合物，其优点是适合口服施用。

这种化合物是一种前药，其在摄入后代谢为N4-羟基胞苷，N4-羟基胞苷是核苷衍生物，通过在病毒ARN依赖性ARN聚合酶的ARN复制中引入错误来抑制ARN病毒。

这种化合物已测试了其抗流感活性。莫努匹韦还对冠状病毒具有一定的活性，如分别导致所谓的SRAS、MERS和COVID-19病的SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。(Painter等人，2021)；(Sheahan等人，2020)。

洛匹那韦

洛匹那韦是一种病毒蛋白酶抑制剂，用作抗人类免疫缺陷病毒(VIH)的抗病毒药物。洛匹那韦与利托那韦(Ritonavir)组合，由Laboratories Abbott实际上以克力芝(Kaletra)的名称进行销售。

洛匹那韦通过抑制新病毒粒子产生功能性蛋白质和酶来发挥作用，从而阻止病毒的传播。

在人类中，洛匹那韦在生物体中被细胞色素P450系统迅速分解。这就是洛匹那韦与利托那韦组合施用的原因。第二种药物也是一种蛋白酶抑制剂，其功能是抑制细胞色素P450的单加氧酶，从而减缓这些酶对洛匹那韦的分解。这使得可以显著减少所需剂量，从而减少患者需要吸收的片剂数量。

2004年发表的一项研究表明，洛匹那韦/利托那韦组合对SARS患者具有“显著的临床益处”(Chu等人，2004年)。

关于SARS-CoV-2的治疗，在首批41名确诊的COVID-19病患者接受治疗的医院，已开始使用这种抗VIH药物的组合进行随机对照试验。

甲磺酸卡莫司他

甲磺酸卡莫司他(FOY-305)是一种低分子量的合成蛋白酶抑制剂。甲磺酸卡莫司他能够抑制胰蛋白酶、prostasine、matriptase和血浆激肽释放酶。这种化合物用于治疗胰腺的慢性炎症。此外，这种化合物减弱呼吸道的上皮钠通道的功能并改善黏膜纤毛的清除。

甲磺酸卡莫司他片剂在日本获得批准，以

商标进行销售。甲磺酸卡莫司他片剂用于缓解慢性胰腺炎的急性症状和术后反流性食管炎。

专利EP2 435 064提出靶向丝氨酸蛋白酶HAT和TMPRSS2用于治疗病毒感染，特别是流感病毒感染。

最近，已经表明甲磺酸卡莫司他抑制SARS-CoV-2的跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)，这是一种病毒增殖所必需的酶(Hoffmann等人，2020年)。

氯喹

氯喹最初以其抗疟疾活性而闻名，根据体外获得的数据，氯喹对SARS-CoV具有抗病毒作用(Vincent等人，2005年)。

最近发表的研究描述了磷酸氯喹在治疗SARS-CoV-2病毒中的明显功效。(Wang等人，2020；Gao等人，2020)。

因此，现在中国专家的共识建议在治疗患者时加入磷酸氯喹，对于被诊断为轻、中、重度疾病且无氯喹禁忌症的患者，使用500mg，每天2次，共10天。

然而，临床数据仍然有限。

正在积极寻找新的抗病毒化合物来治疗和预防这种新出现的病毒SARS-CoV-2。

近年鉴定的新型抗病毒化合物具体地包括地尔硫卓，其是作用于病毒的宿主细胞而不是直接作用于病毒的活性化合物，从而使地尔硫卓具有广谱作用并能够治疗各种病毒感染。

国际专利申请WO 87/07508描述使用地尔硫卓治疗与巨细胞病毒或疱疹相关的病毒感染。

国际专利申请WO 2011/066657描述了使用地尔硫卓治疗或预防病毒感染，如口腔疱疹、生殖器疱疹和带状疱疹。

国际专利申请WO 2016/146836描述了使用地尔硫卓治疗流感病毒感染。

(Fujioka等人.,2018)的文章教导说，已知其作为Ca2+离子转运抑制剂作用的地尔硫卓，也具有抑制甲型流感病毒引起的细胞感染的作用。

国际专利申请WO 2019/224489详细公开了地尔硫卓的某些生物学作用，地尔硫卓诱导编码III型干扰素的基因在呼吸道上皮细胞和肠上皮细胞中表达。因此，地尔硫卓被推荐用于各种治疗应用，特别是用于治疗呼吸道和肠道上皮细胞中的病毒性和细菌性呼吸道感染。

像地尔硫卓一样，小檗碱是一种已知具有抗病毒活性的活性化合物。

小檗碱是由某些植物，特别是小檗属植物产生的异喹啉生物碱，其在亚洲药典中大量使用。

在体外和小鼠模型中进行的研究表明，小檗碱作用于多种细胞途径，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎和代谢特性，改善高血糖和II型糖尿病以及高脂血症。(Mohan等人，2017)

特别是小檗碱对于抗肺动脉高压(HTAP)具有积极作用，肺动脉高压是一种肺微血管重塑的弥漫性疾病，伴有肺动脉平滑肌细胞的恶性增殖，导致肺动脉压持续升高，导致右心室肥大(HVD)。

小檗碱还具有出色的抗炎特性，减少关节肿胀、组织浸润和炎症细胞对其的破坏。小檗碱调节巨噬细胞的极化，降低巨噬细胞的吞噬功能，降低M1细胞因子的含量，提高M2细胞因子(IL-10和转化生长因子-β1或TGF-β1)的水平。

小檗碱具有广谱抗细菌活性，特别是针对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SARM)的感染。当小檗碱在体外与甲氧基hydnocarpin(méthoxyhydnocarpin)组合应用时，小檗碱抑制金黄色葡萄球菌的生长。

小檗碱对多种病毒具有抗病毒活性，特别是：

-对于疱疹病毒HSV(Song等人2014)，

-对于流感病毒(Wu等人2011)，

-对于巨细胞病毒(HCMV)：低(微摩尔)浓度的小檗碱通过干扰病毒立即早期蛋白-2(IE2)的反式激活活性来抑制各种HCMV毒株的复制，包括临床分离株和对已批准的ADN聚合酶抑制剂耐药的毒株(Luganini等人，2019)，

-对于丙型肝炎病毒(VHC)：小檗碱可以抑制VHC进入细胞(Ting-Chun Hung等人，2019)，

-对于寨卡病毒(ZIKV)：已经证明小檗碱和大黄素特别有效地对抗几种病毒的进入和复制，特别是触发针对ZIKV的强大的杀病毒作用(Batista等人2019)。

对于冠状病毒：

-小檗碱可以对SARS-CoV具有抗病毒作用(WO 2013/185126)，尽管没有提供实验数据；以及

-小檗碱对MERS-CoV具有抗病毒作用(WO 2018/073549)。

在本发明的上下文中，已经在病毒感染的细胞试验和在气-液界面处体外培养的人呼吸道上皮模型上选择并评价了多种化合物。当这些化合物中的一些单独或组合使用时，以完全出人意料的方式表现出对SARS-CoV-2冠状病毒的抗病毒作用。

所选择的化合物之前被描述用于其他治疗应用。出人意料的是，现在已经证明这些化合物单独或组合使用时对SARS-CoV-2具有抗病毒活性，能够治疗和/或预防这种冠状病毒的感染。

特别地，基于至少两种抗病毒化合物组合的组合治疗对于治疗和/或预防冠状病毒SARS-CoV-2的感染特别有效。

发明内容

本发明涉及选自地尔硫卓、小檗碱及其组合的化合物在治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染(所谓的COVID-19病)中的治疗用途。

特别地，本发明涉及地尔硫卓在预防和/或治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染(称为COVID-19病)中的治疗用途。

此外，本发明涉及一种药物组合物用于在治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染(所谓的COVID-19病)中的治疗用途，所述药物组合物在合适的药物载体中包含至少一种选自地尔硫卓和小檗碱的化合物。

本发明还涉及在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物，用于在预防和/或治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的治疗用途。

本发明还涉及如上所述的用途的组合物，其包含至少一种选自以下的其他活性成分：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物。

在核苷类似物中，优选的化合物是瑞德西韦、加利昔韦、莫努匹韦及其组合。

在病毒蛋白酶抑制剂中，优选的化合物是洛匹那韦，更优选洛匹那韦与利托那韦的组合。

在跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂中，优选的化合物是甲磺酸卡莫司他。

本发明还涉及一种组合产品，其包含至少一种选自地尔硫卓和小檗碱的化合物以及至少一种选自以下的其他活性成分：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物，

用于在预防和/或治疗由病毒SARS-CoV-2引起的病毒感染中同时、分开或相继使用。

本发明还涉及一种组合产品，其包含地尔硫卓和至少一种选自以下的其他活性成分：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物，

-用于在预防和/或治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中同时、分开或相继使用。

最后，本发明还涉及一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓与瑞德西韦的组合；或地尔硫卓与莫努匹韦的组合。

附图说明

图1显示了小檗碱和瑞德西韦单药治疗对培养的受SARS-CoV-2病毒感染的VeroE6细胞的抗病毒作用。

图1A：实验的时序图。

图1B：在单药治疗中小檗碱和瑞德西韦分子的效果相对剂量的曲线，以及在感染后48和72小时(hpi)的相关IC50的测定。瑞德西韦和小檗碱在48hpi时具有抗病毒作用，IC50分别测定为0.98μM和17.47μM。这种抗病毒作用在72hpi时甚至更加明显，对于瑞德西韦和小檗碱，IC50分别小于0.72μM和5.60μM。

图2显示地尔硫卓/瑞德西韦和小檗碱/瑞德西韦组合对培养的受SARS-CoV-2病毒感染的Vero E6细胞的抗病毒作用。

图2A：实验的时序图。

图2B：地尔硫卓/瑞德西韦和小檗碱/瑞德西韦组合的效果相对剂量的曲线，以及在感染后48和/72小时(hpi)的相关IC50的测定。在固定浓度的地尔硫卓(11.5μM)存在下与瑞德西韦组合处理，可以在48hpi时获得IC50为0.32μM的抗病毒功效。以相同的方式，在固定浓度的瑞德西韦(2.5μM)的存在下与地尔硫卓组合进行处理，可以在48hpi时获得IC50为0.55μM的抗病毒功效。此外，在固定浓度的小檗碱(12.5μM)存在下与瑞德西韦组合处理，可以在48hpi时获得IC50为0.65μM的抗病毒功效。在感染的更晚期阶段(72hpi)，在固定浓度的地尔硫卓(11.5μM)存在下与瑞德西韦组合进行处理，可以获得IC50为0.35μM的抗病毒功效。

图3以视觉方式显示了图1B和图2B中所示的某些结果。

图3A：实验的时序图。

图3B：通过光子显微镜观察瑞德西韦和地尔硫卓在单药治疗和组合中对培养的受SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞层的抗病毒作用。在与之前(图2)相同的实验条件下，与未经处理的对照以及单药治疗处理相比，瑞德西韦(0.625μM)和地尔硫卓(11.5μM)的组合非常明显地降低了感染的细胞病变效应(圆形细胞从细胞层上脱落)。

图4：实施例3的实验的时序图。

图5.实施例4的实验的时序图。接种A549-ACE2细胞，然后用SARS-CoV-2病毒毒株感染，接着在感染后1小时用地尔硫卓或瑞德西韦处理。

图6.(A)A549-ACE2以10^-1的MOI浓度被感染；(B)A549-ACE2细胞以10^-2的MOI浓度被感染。

细胞未处理(黑色曲线)、或用5μM的瑞德西韦(灰色方块)或45μM的地尔硫卓(灰色三角形)进行处理。结果表示为在上清液中测量到的病毒滴度与在未处理细胞的孔中测量到的病毒滴度相比的百分比，其是病毒感染后时间的函数。

图7.(A).测量地尔硫卓对受SARS-CoV-2病毒毒株感染的A549-ACE2细胞的IC50。病毒滴度表示为在上清液中测量到的病毒滴度与在未处理细胞的孔中测量到的病毒滴度相比的百分，其是使用的地尔硫卓浓度的函数。(B)在处理72小时后，测量地尔硫卓对A549-ACE2细胞的CC50。细胞的活力表示为测量的未处理的细胞活力的百分比。结果显示为使用的地尔硫卓浓度的函数。

具体实施方式

本发明涉及地尔硫卓在预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染(称为COVID-19病)中的治疗用途。

本发明还涉及药物组合物用于治疗SARS-CoV-2病毒(COVID-19)引起的病毒感染的治疗用途，所述药物组合物在合适的药物载体中包含至少一种选自地尔硫卓和小檗碱的化合物。

本发明还涉及在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物，用于其在预防和/或治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的治疗用途。

“SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染”是指人或动物生物体的细胞已被SARS-CoV-2冠状病毒(也称为COVID-19)感染。

在本发明的含义内，表述“SARS-CoV-2病毒”在一方面是指在首次鉴定出并由上海的复旦大学团队于2020年初测序的冠状病毒(Zhou等人，2020)；在另一方面，包括在稍后出现的与该首次鉴定的病毒毒株相关的所有变体，特别是以下SARS-CoV-2变体毒株：

i发明人使用的“类原始”毒株，如实施例所述；

ii B.1谱系的毒株hCoV-19/France/ARA-104350/2020(GISAID ID：EPI_ISL_683350)(这种毒株在其刺突蛋白中至少具有D614G突变；与下面引用的变体相比，该毒株现在视为在欧洲流行的野生毒株)；

iii一种被称为“英国变体”的B.1.1.7谱系的病毒毒株hCoV-19/France/ARA-SC2118/2020(ID GISAID：EPI_ISL_900512)；

iv B.1.3.5.1谱系的南非毒株(501Y.V2.HV001)和

v B.1.1.28谱系的巴西毒株。

病毒感染通常由保健专业人员在观察受感染患者症状的基础上作出诊断。为了确认诊断，可能需要进行补充的生物学检查：对血液和/或咳痰和/或支气管肺泡液的分析。

特别是，可以通过分子生物学和/或基于呼吸道样本的病毒滴定进行检测，或通过测定血液中循环的SARS-CoV-2的特异性抗体来确定感染。

在受感染个体中检测这种特异性病毒是通过常规诊断方法进行的，特别是通过分子生物学(PCR)可以确认个体确实涉及这种SARS-CoV-2病毒，这些方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。

术语“治疗”指在人或动物生物体中对抗冠状病毒SARS-CoV-2感染的事实。通过施用至少一种根据本发明的组合物，生物体中的病毒感染水平(感染滴度)将降低，优选地，相较于在没有治疗的情况下预期的恢复时间，病毒将在更短的时间内从生物体中完全地消失。

术语“治疗”也指缓解与病毒感染相关的症状(呼吸系统综合征、肾衰竭、发烧等)的事实。

根据本发明的某些组合物还旨在用于预防SARS-CoV-2感染。

因此，本发明涉及：

-一种在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物，用于其在治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的治疗用途。

-一种在合适的药物载体中包含小檗碱的药物组合物，用于其在治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的治疗用途；

-一种在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物，用于其在预防由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的用途。

在本发明的意义上，术语“预防”表示阻止或至少降低在人或动物生物体中出现SARS-CoV-2感染的可能性的事实。通过施用至少一种根据本发明的组合物，所述生物体的人或动物细胞变得不太容易被感染，因此更可能不被所述冠状病毒感染，或在被所述冠状病毒感染期间出现不太严重的症状。

根据本发明的组合物可以是旨在施用于人的药物类型，或是旨在施用于非人动物的兽药类型。对于动物，预计用于预防和/或治疗冠状病毒SARS-CoV-2感染的兽药组合物旨在施用至被这种冠状病毒感染的动物。

根据本发明，术语“合适的药物载体”是指药物载体或赋形剂，其是自身对这里考虑的感染没有作用的化合物。这些载体或赋形剂是药学上可接受的，这指它们可以被施用于个体或动物而不产生显著的有害作用。

表述“至少一种选自地尔硫卓和小檗碱的化合物”是指药物组合物包含地尔硫卓、或小檗碱或两者的组合。

根据第一方面，根据本发明的用于其用途的药物组合物至少包含有效量的地尔硫卓。这种药物组合物旨在用于治疗和/或预防SARS-CoV-2病毒感染的用途。

根据第二方面，根据本发明的用于其用途的药物组合物至少包含有效量的小檗碱。

根据第三方面，根据本发明的用于其用途的药物组合物至少包含有效量的地尔硫卓和有效量的小檗碱。

在本发明的含义内，术语“有效量”是指足以在生物体内抑制冠状病毒的增殖和/或复制、和/或发生病毒感染的活性化合物的量。这种抑制可以定量，例如，如本申请实施例中所示，通过测量病毒滴度进行定量。

因此，根据本发明的一个具体方面，如上所述的用于其用途的药物组合物包含地尔硫卓和小檗碱的组合。

在本发明的含义内，术语“组合”指包含至少两种不同的活性化合物的组合物，两种化合物都具有抗病毒作用。

这种组合包含按重量计相同量的每种抗病毒化合物，即按重量计50％地尔硫卓和50％小檗碱的组合，或包含不等剂量的每种化合物，如90％地尔硫卓和10％小檗碱、80％地尔硫卓和20％小檗碱、70％地尔硫卓和30％小檗碱、60％地尔硫卓和40％小檗碱、40％地尔硫卓和60％小檗碱、30％地尔硫卓和70％小檗碱、20％地尔硫卓和80％小檗碱、或甚至10％地尔硫卓和90％小檗碱，百分比表示为化合物的重量相对于组合的总重量。

地尔硫卓

地尔硫卓是苯并噻氮卓类(benzothiazépines)家族成员的分子，CAS编号为42399-41-7。

在本发明的含义内，“地尔硫卓”指其对映异构体L-顺式或D-顺式之一形式的分子、或者两者的外消旋混合物、或者甚至是地尔硫卓盐(如盐酸地尔硫卓)，其扩展的化学式如下式(I)所示：

式I

地尔硫卓已经被知道30多年了，并在欧洲和美国得到了药品监管部门的批准。它可以以盐酸地尔硫卓的形式施用。

和

是地尔硫卓最常见的商品名称。

有许多制剂可用，特别是延长释放的制剂。地尔硫卓有可用的不同盖仑形式，如用于局部施用的乳膏剂形式、用于口服施用的片剂或胶囊剂形式、用于制备注射用溶液的粉剂形式、或用于吸入的药物制剂形式(WO 02/094238、US 4,605,552)。

用于人的常规剂量方案为180mg/天至360mg/天，以胶囊或片剂施用，作为钙通道阻断剂用于其治疗用途。

这种化合物的第一个确定的生理特性是阻断钙通道，因此阻断细胞内钙流。地尔硫卓特别是减缓了钙跨膜进入心肌肌纤维和血管平滑肌纤维。这使得可能降低到达收缩蛋白的细胞内钙浓度。

在人中，地尔硫卓的施用指征在于其具有血管舒张作用，用于降低心脏工作的目的。因此，地尔硫卓用于处理心脏和循环系统病症，如心绞痛、高动脉压、心肌缺血和心动过速。

从肾脏和外周的角度来看，地尔硫卓还通过逆转血管紧张素II的效应而起作用。在局部应用中，指示地尔硫卓可以用于慢性肛裂的病例。

专利EP 1 117 408描述了地尔硫卓作为钙通道阻断化合物用于治疗与视网膜感光细胞变性相关的病理的用途。

如前所述，已经在多个专利申请中描述了使用地尔硫卓治疗病毒感染。此外，目前正在进行一项化学试验(FLUNEXT PHRC#15-0442ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03212716)，目的是获得这种新型治疗性抗病毒适应症的上市许可。

小檗碱

小檗碱是一种存在于大量植物中，特别是在小檗(Berbéri)种中的天然生物碱。其CAS编号为633-66-9。

在本发明的含义内，“小檗碱”指的是其所有形式的分子。其展开的化学结构如下示意所示：

式II

这种分子因其抗真菌、抗细菌和抗炎特性而广泛用于亚洲药典。

在细胞中，小檗碱特别位于线粒体中，在其中小檗碱抑制呼吸复合物I，从而减少ATP的产生和随后对AMPK(一磷酸腺苷活化的蛋白激酶)的活化。这种普遍存在的酶在细胞能量稳态中发挥作用。AMPK活化的主要作用是(i)刺激肝脏脂肪酸的氧化和生酮作用，(ii)抑制胆固醇的合成、脂肪生成和甘油三酯的合成，(iii)刺激骨骼肌中脂肪酸的氧化和肌肉对葡萄糖的吸收以及(iv)调节胰腺β细胞的胰岛素分泌。

小檗碱的生物利用度很低，但这并不代表困难，因为小檗碱的全身作用被认为是在很大程度上通过肠道微生物群以及其代谢物的修饰，或在同一微生物群对小檗碱的代谢之后。

小檗碱的半衰期也很短，4小时的模式。这意味着每日剂量理想地应分为3次摄入。对于成人，每日剂量通常为500mg至1500mg。

与另一种活性成分组合

根据本发明的用于其用途的组合物旨在包含至少一种选自地尔硫卓和小檗碱的化合物，其还可以包含除合适的药物载体之外的其他活性化合物。

更具体地，地尔硫卓和小檗碱或其混合物可单独或与至少一种其他活性成分组合用于治疗。

这可以涉及用于改善地尔硫卓和/或小檗碱的抗病毒活性的化合物，或者相反地，地尔硫卓和小檗碱可以作为这些其他活性化合物的增效剂。

因此，本发明涉及地尔硫卓或小檗碱或其组合，其用于增强用于治疗和/或预防SARS-CoV-2引起的病毒感染的其他治疗化合物，特别在本申请中所引用的那些的抗病毒作用。

这些额外的活性化合物可以选自申请WO 2015/157223中引用的药物类别的试剂，即选自抗细菌剂、抗寄生虫剂、神经传递抑制剂、雌激素受体抑制剂、ADN合成和复制抑制剂、蛋白质成熟抑制剂、激酶途径抑制剂、细胞骨架抑制剂、脂质代谢抑制剂、抗炎剂、离子通道阻断剂、细胞凋亡抑制剂和组织蛋白酶抑制剂。

因此，根据本发明的一个具体实施方案，如上所述的用于其用途的药物组合物包含至少一种其他活性成分，特别是抗病毒剂。

在本发明的含义内，术语“抗病毒剂”或“抗病毒化合物”应指作用在病毒载量上(也被称为感染滴度)的活性成分，其通过直接或间接抑制受感染的生物体内病毒，特别地，在本案中是冠状病毒SARS-CoV-2的复制和/或传播。

根据本发明的一个具体方面，用于预防和/或治疗冠状病毒SARS-CoV-2引起的感染的用途的药物组合物，除了地尔硫卓和/或小檗碱之外，还包含至少一种其他抗病毒剂。

旨在以表现出抗病毒作用所需的剂量使用这种其他抗病毒剂，这种剂量被指定为“有效的”，这种剂量可由本领域技术人员容易地确定。

这种组合包含以重量计相同量的每种抗病毒化合物，即以重量计50％的地尔硫卓和/或小檗碱以及50％的另一种抗病毒剂的组合，或不同剂量的每种化合物，如90％的地尔硫卓和/或小檗碱以及10％的其他抗病毒剂、80％-20％、70％-30％、60％-40％、40％-60％、30％-70％、20％-80％，甚至10％地尔硫卓和/或小檗碱以及90％的另一种抗病毒剂，百分比表示为化合物的重量相对于组合的总重量。

“抗病毒活性”或“抗病毒作用”应指：

-对病毒的直接作用，特别是抑制病毒的复制周期或病毒在宿主细胞中的感染和繁殖能力的作用，或

-所述病毒通过调节目标细胞的某些基因的表达而对目标细胞的间接作用。“目标细胞”应指被冠状病毒感染的细胞、和/或由于与被感染细胞临近而可能在之后被感染的细胞。

根据抗病毒剂的作用方式，分为不同类别。这些类别具体地包括：

-干扰或停止ADN或ARN合成的核苷酸类似物或核糖核苷类似物；

-参与ADN或ARN合成的酶(解旋酶、复制酶)的抑制剂；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-在病毒复制周期中抑制病毒成熟步骤的化合物；

-干扰与细胞膜结合或干扰病毒进入宿主细胞的化合物(融合或进入抑制剂)，如跨膜丝氨酸蛋白酶，特别是2型的那些；

-通过阻断病毒在细胞内分解，防止病毒在进入宿主细胞后进行自体表达的试剂；

-使病毒进入其他细胞增殖受限的试剂。

在本领域技术人员公知的这些抗病毒剂中，特别用于对抗ARN病毒的那些是：核苷类似物、病毒蛋白酶抑制剂、解旋酶抑制剂和病毒进入目标细胞的抑制剂，如跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂。

在本发明的含义内，“核苷类似物”是指用于防止病毒在受感染细胞中复制的化合物，如阿昔洛韦(aciclovir)。这些化合物的结构与在复制过程中掺入病毒ADN链中的核苷非常相似，但是这些化合物充当链终止剂并阻止病毒ADN聚合酶的作用。

这种化合物将选自鸟苷的核苷类似物(例如，利巴韦林)、腺苷的核苷类似物(例如，瑞德西韦或加利昔韦)、胞苷的核苷类似物(莫努匹韦)或胸苷的核苷类似物，或其脱氧形式。

在本发明的含义内，“病毒蛋白酶抑制剂”是指通过抑制至少一种病毒蛋白酶的作用而发挥作用的抗病毒化合物，所述病毒蛋白酶是能够切割和组装病毒蛋白质(获得新的感染性病毒粒子必不可少的方法)的蛋白质。然后，获得的病毒粒子不能感染新细胞。这种治疗策略特别用于治疗VIH(人类免疫缺陷病毒)引起的病毒感染。

在本发明的含义内，“跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂”是指通过抑制病毒进入细胞而发挥作用，特别是通过作用在跨膜丝氨酸蛋白酶2(缩写为TMPRSS2)而起作用的抗病毒化合物。

根据本发明的一个具体实施方案，如上所述的用于其用途的组合物包含至少一种其他活性成分，其选自：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物。

根据本发明的第一实施方案，该组合包含地尔硫卓和至少一种核苷类似物。

根据本发明的第二实施方案，该组合包含地尔硫卓和至少一种病毒蛋白酶抑制剂。

根据本发明的第三实施方案，该组合包含地尔硫卓和至少一种跨膜丝氨酸蛋白抑制剂，特别是2型的跨膜丝氨酸蛋白抑制剂。

根据本发明的第四实施方案，该组合包含地尔硫卓和氯喹。

根据本发明的第五实施方案，该组合包含地尔硫卓和选自以下的两种化合物的混合物：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；和

-氯喹。

根据本发明的第六实施方案，该组合包含小檗碱和至少一种核苷类似物。

根据本发明的第七实施方案，该组合包含小檗碱和至少一种病毒蛋白酶抑制剂。

根据本发明的第八实施方案，该组合包含小檗碱和至少一种跨膜丝氨酸蛋白抑制剂，特别是2型的跨膜丝氨酸蛋白抑制剂。

根据本发明的第九实施方案，该组合包含小檗碱和氯喹。

根据本发明的第十实施方案，该组合包含小檗碱和选自以下的至少两种化合物的混合物：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；和

-氯喹。

至少一种核苷类似物可特别选自：瑞德西韦、加利地韦、莫努匹韦及其组合。

至少一种病毒蛋白酶抑制剂可以特别是洛匹那韦，优选洛匹那韦与利托那韦组合。

至少一种跨膜丝氨酸蛋白抑制剂，特别是2型的跨膜丝氨酸蛋白抑制剂，可以特别是甲磺酸卡莫司他。

根据其他实施方案，根据本发明的用于其用途的药物组合物包含或由以下组成：

-地尔硫卓和瑞德西韦；

-地尔硫卓和加利昔韦；

-地尔硫卓和莫努匹韦；

-地尔硫卓和洛匹那韦，优选组合利托那韦；

-地尔硫卓和甲磺酸卡莫司他；

-地尔硫卓和氯喹，或者甚至

-地尔硫卓和所有可能的瑞德西韦、加利昔韦、莫努匹韦、洛匹那韦、甲磺酸卡莫司他和氯喹的组合。

-小檗碱和瑞德西韦；

-小檗碱和加利昔韦；

-小檗碱和莫努匹韦；

-小檗碱和洛匹那韦，优选组合利托那韦；

-小檗碱和甲磺酸卡莫司他；

-小檗碱和氯喹，或者甚至

-小檗碱和所有可能的瑞德西韦、加利昔韦、莫努匹韦、洛匹那韦、甲磺酸卡莫司他和氯喹的组合。

-地尔硫卓和小檗碱以及瑞德西韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及加利昔韦的组合；

-地尔硫卓和莫努匹韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及洛匹那韦的组合，优选组合利托那韦；

-地尔硫卓和小檗碱以及甲磺酸卡莫司他的组合；

-地尔硫卓和小檗碱和氯喹的组合，或者甚至

-地尔硫卓和小檗碱以及所有可能的瑞德西韦、加利昔韦、莫努匹韦、洛匹那韦、甲磺酸卡莫司他和氯喹的组合的组合。

如实施例所示，这些组合具有协同抗病毒效应。

例如，表2中所示的结果强调这个事实：即在感染后48小时，瑞德西韦的效果在地尔硫卓的存在下更大(+68％)，以及在小檗碱的存在下更大(+33％)。

表3中显示的结果强调，在鼻上皮模型中，在感染后48小时，瑞德西韦的作用通过存在地尔硫卓(病毒产量减少+1.3log)或小檗碱(病毒产量减少+0.89log)增强。

根据本发明的另一个实施方案，如上所述的用于其治疗用途的组合物另外包含至少一种抗生素。

这样的抗生素将特别用于防止与正在感染的病毒的细菌二重感染。

抗生素选自本领域技术人员公知的抗生素，特别是在病毒感染期间用于避免细菌二重感染的抗生素，特别是大环内酯家族的抗生素。

根据本发明的药物组合物适用于鼻、口服、舌下、吸入、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、经眼或直肠施用。

根据一个优选的实施方案，如上所述的用于其用途的组合物特征在于其是适用于鼻施用，特别是鼻内施用，特别是通过吸入施用的盖仑形式。

鼻内途径是一种施用途径，其特征在于药物组合物通过多种方法，如滴剂、喷雾剂或吸入器直接引入患者的鼻腔。建议使用特定的装置，如鼻内粘膜喷雾装置。

鼻内途径提供了快速、无痛和无创地施用药物的可能性，其功效通常与静脉内途径相当。鼻内途径特别适用于儿科或老年人，或医疗紧急情况。

根据一个实施方案，如上所述的用于其用途的药物组合物通过鼻内途径施用。

根据另一个优选的实施方案，如上所述的用于其用途的药物组合物通过吸入施用。

吸入指通过呼吸道吸收。具体地，这是一种用于吸收用于治疗目的的化合物以及吸收气体形式、微滴或悬浮剂中的粉末形式的某些物质的方法。

通过吸入(即通过鼻和/或口途径)施用药物组合物或兽药组合物是本领域技术人员公知的。

有两种类型的吸入施用：

-当组合物为粉末形式时，通过吹入法施用，和

-当组合物为气雾剂(悬浮剂)形式或加压的溶液形式(例如，水溶液)时，通过雾化施用。然后，推荐使用雾化器或喷雾器来施用药物组合物或兽药组合物。

因此，此处考虑的盖仑形式选自：粉末、液滴的水性悬浮剂或加压溶液。

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物，

其用于同时、分开或相继用于预防和/或治疗由SARS-CoV-2病毒(COVID-19)引起的病毒感染的用途。

这种组合产品将特别由以下组成：

-地尔硫卓和瑞德西韦；

-地尔硫卓和加利昔韦；

-地尔硫卓和莫努匹韦；

-地尔硫卓和洛匹那韦；

-地尔硫卓和甲磺酸卡莫司他；

-地尔硫卓和氯喹，或者甚至

根据其他实施方案，这种组合产品将特别由以下组成：

-小檗碱和瑞德西韦；

-小檗碱和加利昔韦；

-小檗碱和莫努匹韦；

-小檗碱和洛匹那韦；

-小檗碱和甲磺酸卡莫司他；

-小檗碱和氯喹，或者甚至

-小檗碱和所有可能的瑞德西韦、加利昔韦、莫努匹韦、洛匹那韦和氯喹的组合。

根据其他实施方案，该组合产品将特别由以下组成：

-地尔硫卓和小檗碱以及瑞德西韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及加利昔韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及莫努匹韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及洛匹那韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及甲磺酸卡莫司他的组合；

-地尔硫卓和小檗碱和氯喹的组合，或者甚至

根据本发明的一个实施方案，如上所述的这些组合产品之一同时、分开或相继用于预防SARS-CoV-2病毒(COVID-19)引起的病毒感染。

根据本发明的一个实施方案，如上所述的这些组合产品之一同时、分开或相继用于治疗由SARS-CoV-2病毒(COVID-19)引起的病毒感染。

这种组合产品可以包含其他活性化合物，特别是至少一种抗生素。

本发明还涉及用于治疗感染了SARS-CoV-2病毒的患者(患有所谓的COVID-19病)的方法，包括向所述患者施用在合适的药物载体中包含至少一种选自地尔硫卓和小檗碱的化合物的药物组合物。

本发明还涉及一种在能够被所述病毒感染的个体中用于预防出现由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染(所谓的COVID-19病)的方法，包括向所述个体施用在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物。

本发明还涉及用于治疗感染了SARS-CoV-2病毒的患者(患有所谓的COVID-19病)的方法，包括向所述患者施用在合适的药物载体中包含地尔硫卓的药物组合物。

特别地，这种方法还可以包括向所述患者施用另一种活性化合物，特别是选自以下的化合物：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物。

本发明还涉及一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓和/或小檗碱与瑞德西韦的组合。

本发明还涉及一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓与瑞德西韦的组合。

本发明还涉及一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓与莫努匹韦的组合。

更准确地说，所述药物组合物在合适的药物载体中包含地尔硫卓、小檗碱和瑞德西韦的组合。

本发明还涉及在合适的药物载体中包含以下组合的药物组合物：

-地尔硫卓和小檗碱以及加利昔韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及洛匹那韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及莫努匹韦的组合；

-地尔硫卓和小檗碱以及甲磺酸卡莫司他的组合；

-地尔硫卓和小檗碱和氯喹的组合，甚至

这些组合可以根据每种化合物的所有可能比率进行配制。特别地，这些组合包含以重量计相同量的每种抗病毒化合物(每种33％)，或不同剂量的每种化合物，百分比表示为化合物的重量相对于组合的总重量。

所有这些组合的治疗用途也是本发明的目的。

实施例

实施例1至3显示，对于治疗SARS-CoV-2引起的感染，一方面，使用地尔硫卓或小檗碱进行单药治疗的治疗有效性，以及在另一方面将这些分子与瑞德西韦组合的优势。

此处未提供的其他数据是使用芹菜素获得的，芹菜素是另一种对某些病毒毒株，特别是针对MERS-CoV具有抗病毒作用的化合物(WO 2018/073549)。然而，这种分子对冠状病毒SARS-CoV-2没有显著的抗病毒作用。

在用地尔硫卓、小檗碱或瑞德西韦进行单药治疗、或这些分子中两种的组合(地尔硫卓+瑞德西韦或小檗碱+瑞德西韦)处理的Vero E6细胞感染上清液还有顶极洗涤液、以及重构人上皮细胞裂解物(HAE MucilAir，Epithelix)的样本中通过RT-qPCR和/或通过TCID50/ml进行病毒载量定量。

已经确定了与分子的每种浓度相对应的病毒产量，并显示为相对于在相同条件下但未处理的感染细胞或HAE的病毒产量。测定每种治疗条件的中位抑制浓度(IC50)。

实施例1.材料和方法

使用的病毒

使用的病毒分离自感染SARS-CoV-2的患者的样本。

本研究中使用的SARS-CoV-2毒株分离自一名47岁的患者，招募自一个评估患有COVID-19的患者的法国临床队列(NCT04262921)。本研究按照赫尔辛基宣言进行，并获得了当地伦理委员会的批准。使用Illumina MiSeq对病毒毒株进行测序，并参考BetaCoV/France/IDF0571/2020保存在GISAID EpiCoVTM数据库中(识别号为EPI_ISL_411218)。作为参考，请参阅(Pizzorno等人，2020年)。

通过接种Vero E6细胞(ATCC CRL-1586)进行病毒的分离，随后出现细胞病变效应。在病毒诱导的第一个效应出现后，收集感染上清液并使用QIAmp Viral RNA(QIAGEN)试剂盒提取病毒ARN。然后，提取的ARN然后通过Illumina MiSeq(Zymo-Seq RiboFree)进行测序，覆盖率为500×，并使用hisat2比对程序和共有序列进行组装。

然后将该序列以BetaCoV/France/IDF0571/2020的名称提交到GISAID EpiCoV平台上(登录ID EPI_ISL_411218)。

这种病毒毒株在系统发育上非常接近于2020年1月/2月在流行病开始时流行的SARS-CoV-2毒株。因此，这种毒株代表了目前在世界上观察到的被称为“COVID-19”的传染病起源的SARS-CoV-2毒株。

Vero E6细胞感染操作方案

Vero E6(ATCC CRL-1586)细胞培养在4.5g/l葡萄糖的DMEM培养基中，补充有L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素以及10％的灭活胎牛血清中，在37℃，5％ CO2下培养。

为了产生感染，将细胞用不含血清的培养基冲洗两次，并用含有病毒稀释液的最小体积覆盖以获得足够的感染复数(MOI)，这种稀释液由感染滴度确定(参见关于确定感染滴度的部分)。在存在最小体积的情况下孵育一小时后，将培养基替换为4.5g/l葡萄糖的DMEM培养基，补充有L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素以及2％的灭活胎牛血清，然后将细胞再次孵育在37℃、5％ CO2下。

上皮感染操作方案

为了产生感染，我们还使用了重构的人上皮模型(HAE MucilAir，Epithelix)(其获自通过鼻活检获得的原代人细胞)，在Costar Transwell插入物中(Corning,NY,USA)使用特定培养基在气-液界面培养。对于感染实验，使用培养基OptiMEM(Gibco，ThermoFisher Scientific)轻轻清洗顶极两次，然后用150μl的在培养基OptiMEM中的病毒稀释液进行感染，感染复数(MOI)为0.1。在37℃、5％ CO2下孵育1小时后，撤掉病毒悬浮液。

Vero E6细胞中感染滴度的测定

使用有限稀释技术在96孔板上对这些Vero E6细胞进行感染滴度的测定。将50μl体积的系列稀释液以一式四份放置在孔中。然后，将细胞在37℃、5％ CO2下孵育，然后在感染3天后监测细胞病变效应的存在。使用Reed和Muench的技术计算在50％组织培养物中的感染剂量(DICT50/ml)，即在50％的接种细胞中形成感染所需的病毒滴度。

通过定量PCR对病毒基因组进行定量

所使用的探针和引物描述见香港大学公共卫生学院(表1)。

使用StepOnePlus实时PCR系统试剂盒(Applied Biosystems)进行定量“一步”PCR，使用试剂EXPRESS One-Step Superscript qRT-PCR(Invitrogen)，反应体积为20μl，含有10μl的超混合Express qPCR(2×)、每种引物1μl(10μM)、3.1μl水、0.4μl Rox染料(25μM)和2μl病毒ARN。

使用以下程序：在50℃下15分钟，然后进行40个循环(在95℃15秒；在60℃1分钟)。

表1.

FAM和TAMRA指定为荧光标记物。

实施例2.在Vero E6细胞模型中，比较地尔硫卓、小檗碱和瑞德西韦、以及地尔硫卓+瑞德西韦和小檗碱+瑞德西韦组合对SARS-CoV-2病毒的IC50。

感染了SARS-CoV-2(MOI 0.1)的Vero E6细胞在感染后一小时通过增加浓度的以下物质进行处理：

-地尔硫卓(2.8μM至45μM)，

-小檗碱(1.6μM至25μM)，和

-瑞德西韦(0.6μM至10μM)，

单独使用(图1)和组合使用(图2)。

对于所测试的每种组合治疗，其中一种分子的剂量是固定的，与浓度增加的另一种分子(分别与单药治疗中使用的浓度范围相同)组合，反之亦然。在感染细胞的培养上清液中测量的病毒感染滴度(在感染后48和72小时取样)，反映了在各种处理条件下测量的病毒复制水平。

下表2总结了在Vero E6细胞被SARS-CoV-2感染不同时间、使用不同的单药治疗进行处理和/或组合处理获得的IC50数据。

表2.

该表说明了与使用这些分子的单药治疗相比，组合处理具有降低某些分子的IC50方面的收益。

因此，瑞德西韦与固定浓度的地尔硫卓(11.5μM)组合可在48hpi时将其IC50降低约68％(0.32μM相对0.98μM)，在72hpi时将其IC50降低52％(0.35μM相对0.72μM)。

平行地，地尔硫卓与固定浓度的瑞德西韦组合，使可能获得0.55μM的IC50，而在48hpi时其IC50大于45μM。

此外，瑞德西韦与固定浓度的小檗碱(12.5μM)组合可以在48hpi时获得其IC50约33％的降低(0.65μM相对0.98μM)。

实施例3.通过重构人呼吸道上皮感染模型，比较地尔硫卓、小檗碱和瑞德西韦、以及地尔硫卓+瑞德西韦、小檗碱+瑞德西韦组合针对SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性。

使用SARS-CoV-2感染重构的鼻源性人呼吸道上皮细胞并在气液界面培养(

HAE，Epithelix)(MOI 0.1)。每天用以下分子以单一或组合处理对基础培养基处理一次：

-地尔硫卓(45μM或90μM)、

-瑞德西韦(20μM或40μM)和

-小檗碱(4μM)

感染后48或72小时。

图4显示了这些实验的时序图。

在不同的时间，收获上皮细胞和并进行裂解。提取总ARN，通过RT-PCR来对病毒基因组定量，使用对细胞基因产物(GAPDH)的定量对数据进行归一化。

这些数据可以通过相对测量病毒复制来评价通过单药治疗进行处理和组合处理的活性病毒作用，表示为对照(未处理)中病毒复制的百分比、或相对病毒产量的-log10。

表3

表3显示使用地尔硫卓、小檗碱和瑞德西韦通过单药治疗进行处理，以及使用地尔硫卓+瑞德西韦和小檗碱+瑞德西韦进行组合处理，对SARS-CoV-2病毒在鼻源性的人呼吸道上皮模型(

HAE，Epithelix)中复制的效果。

表3总结了在鼻或支气管来源的重构人呼吸道上皮感染模型中，地尔硫卓、小檗碱、瑞德西韦以及地尔硫卓/瑞德西韦和小檗碱/瑞德西韦组合针对SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性的数据。

在单一处理中，瑞德西韦对鼻源性的上皮细胞在48hpi具有显著功效(病毒复制降低超过7.75log10)。

瑞德西韦与地尔硫卓或与小檗碱的组合(在与单药治疗相同的浓度条件下)显著增加了抗病毒作用(分别与地尔硫卓和小檗碱的组合使病毒复制减少了8.6log10和8.29log10)。

使用地尔硫卓或小檗碱的单药治疗处理在48hpi时也具有显著的抗病毒功效(使用地尔硫卓和小檗碱使病毒复制分别降低了0.35log10和0.86log10)。

在我们的实验条件下，瑞德西韦在鼻源上皮中在72hpi时的功效虽然仍然非常高，但相对小于在48hpi的功效(在20μM时减少2.42log10和2.05log10，在40μM时减少2.30log10和2.24log 10)。

在72hpi时，瑞德西韦/地尔硫卓组合对鼻源性上皮细胞有功效，但与瑞德西韦的单一处理没有显著差异。这可以解释为在这些实验条件下地尔硫卓的抗病毒功效受到限制(在鼻上皮细胞中降低了0.16/0.15log10)。

实施例4.在A549-ACE2细胞模型中，比较地尔硫卓和瑞德西韦对SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性

细胞系A549的细胞是来源于腺癌的人肺泡基底上皮细胞。这种细胞系用作肺癌研究的模型，也被用作针对呼吸道的传染性病毒的目标细胞。这些细胞随后被修饰以表达ACE2受体，SARS-CoV-2病毒通过该受体穿透进宿主细胞中。这种细胞系A549-ACE2获自Creative Biogene(USA)。

与Vero细胞相反，这些细胞A549-ACE2具有完整且可操作的干扰素信号传到通路。因此，它们更适合研究作用在这些信号传导通路上的地尔硫卓的作用。

实验操作方案如下：

-接种A549-ACE2细胞，

-使用SARS-CoV-2的类原始毒株感染A549-ACE2细胞(MOI为10^-1和10^-2)24小时后，

-感染后(pi)1小时，用45μM地尔硫卓处理细胞。

-在感染后24小时、48小时、72小时和96小时对上清液进行取样，通过RT-PCR对病毒进行定量。

使用的孵育介质如下：

·接种培养基：DMEM 1g/L葡萄糖(Glc)、200mM L-谷氨酰胺(L-Glu)、104单位青霉素/链霉素(P/S)、10％胎牛血清(FCS)

·感染培养基：DMEM 1g/L Glc、200mM L-Glu、104U P/S、0％ FCS

·处理培养基：DMEM 1g/L Glc、200mM L-Glu、104U P/S、2％ FCS

图5显示了实验操作方案：在1hpi进行单一处理，然后在24、48、72和96hpi对上清液进行取样。

图6显示对以两种不同的感染复数率感染的细胞(A：MOI＝10^-1；B：MOI＝10^-2)使用地尔硫卓(45μM)或瑞德西韦(5μM)进行处理所获得的结果。

随着时间的推移，瑞德西韦和地尔硫卓这两种化合物可以通过单一处理获得相同水平的对病毒滴度的抑制(通过RT-PCR测量)，这与感染复数率无关。

实施例5.在细胞系A549ACE2中，测定地尔硫卓对SARS-CoV-2的IC50和CC50

实验操作方案如下：

-接种A549-ACE2细胞，

-使用SARS-CoV-2的类原始毒株感染A549-ACE2细胞(MOI为10^-1)24小时后，

-感染后(pi)1小时，用不同浓度的地尔硫卓处理细胞。

-在感染后72小时对上清液进行取样，通过RT-PCR对病毒进行定量。

IC50是中位抑制浓度，即对测试的SARS-CoV-2毒株的病毒复制获得50％抑制所需的地尔硫卓的量。

得到的结果如图7A所示：地尔硫卓的IC50为19.7μM，这表明在体外具有良好的抑制功效。

平行地，也在相同的实验条件下验证地尔硫卓对A549-ACE2细胞的细胞毒性。为此目的，通过监测在各种浓度的地尔硫卓存在时A549-ACE2细胞的活力，用以测量CC50(50％细胞毒性浓度)，其对应于将细胞活力减半所需的地尔硫卓的剂量。在处理开始后72小时通过进行MTS确定活力(viabilité)。

MTS测试是一种比色法：该方法基于活细胞将化合物MTS四唑还原以产生有色甲臜产物，从而能够对活细胞(有色)和死细胞进行计数。

获得的结果如图7B所示：当地尔硫卓浓度等于374μM(该剂量远高于之前测量的IC50)，细胞的活力降低了一半。

参考文献

专利

EP 2 435 064

WO 87/07508

WO 2011/066657

WO 2016/146836

WO 2019/224489

WO 2013/185126

WO 2018/073549

WO 02/094238

US 4,605,552

EP 1 117 408

WO 2015/157223

文献

Alexander E.Gorbalenya，Susan C.Baker，Ralph S.Baric，Raoul J.de Groot，Christian Drosten，Anastasia A.Gulyaeva，Bart L.Haagmans，Chris Lauber，Andrey MLeontovich，Benjamin W.Neuman，Dmitry Penzar，Stanley Perlman，Leo L.M.Poon，Dmitry Samborskiy，Igor A.Sidorov，Isabel Sola et John Ziebuhr，《Severe acuterespiratory syndrome-relatedcoronavirus-The species and its viruses，astatement of the Coronavirus Study Group》，bioRxiv，2020

Zhou P，Yang XL，Wang XG，Hu B，Zhang L，Zhang W，Si HR，Zhu Y，Li B，HuangCL，ChenHD，Chen J，Luo Y，Guo H，Jiang RD，Liu MQ，Chen Y，Shen XR，Wang X，Zheng XS，Zhao K，Chen QJ，Deng F，Liu LL，Yan B，Zhan FX，Wang YY，Xiao GF，Shi ZL.A pneumoniaoutbreak associated with a new coronavirus of probable batorigin.Nature.2020Feb 3.doi：10.1038/s41586-020-2012-7

Hui DS，I Azhar E，Madani TA，Ntoumi F，Kock R，Dar O，lppolito G，MchughTD，Memish ZA，Drosten C，Zumla A，Petersen E.

Int J Infect Dis.2020Feb；91：264-266.doi：10.1016/j.ijid.2020.01.009.Epub 2020Jan 14.PubMed PMID：31953166

Lo MK，Jordan R，Arvey A，Sudhamsu J，Shrivastava-Ranjan P，Hotard AL，Flint M，McMullan LK，Siegel D，Clarke MO，Mackman RL，Hui HC，Perron M，Ray AS，Cihlar T，Nichol ST，Spiropoulou CF.GS-5734and its parent nucleoside analoginhibit Filo-，Pneumo-，and Paramyxoviruses.Sci Rep.2017Mar 6；7：43395.doi：10.1038/srep43395.PubMed PMID：28262699；PubMed Central PMCID：PMC5338263

Painter WP，Holman W，Bush JA，Almazedi F，Malik H，Eraut NCJE，Morin MJ，Szewczyk LJ，Painter GR.Human Safety，Tolerability，and Pharmacokinetics ofMolnupiravir，a Novel Broad-Spectrum Oral Antiviral Agent with ActivityAgainst SARS-CoV-2.Antimicrob Agents Chemother.2021Mar 1：AAC.02428-20.

Sheahan TP，Sims AC，Zhou S，Graham RL，Pruijssers AJ，Agostini ML，LeistSR，

A，Dinnon KH 3rd，Stevens LJ，Chappell JD，Lu X，Hughes TM，George AS，HillCS，Montgomery SA，Brown AJ，Bluemling GR，Natchus MG，Saindane M，Kolykhalov AA，Painter G，Harcourt J，Tamin A，Thornburg NJ，Swanstrom R，Denison MR，Baric RS.Anorally bioavailable broad-spectrum antiviral inhibits SARS-CoV-2in humanairway epithelial cell cultures and multiple coronaviruses in mice.Sci TranslMed.2020Apr 29；12(541)：eabb5883.

Chu CM，Cheng VC，Hung IF，Wong MM，Chan KH，Chan KS，Kao RY，Poon LL，WongCL，Guan Y，Peiris JS，Yuen KY；HKU/UCH SARS Study Group.Role of lopinavir/ritonavir in the treatment of SARS：initial virological and clinicalfindings.Thorax.2004Mar；59(3)：252-6.PubMed PMID：14985565；PubMed CentralPMCID：PMC1746980

Hoffmsnn M，Kleine-Weber H，Schroeder S，Krüger N，Herrler T，Erichsen S，Schiergens TS，Herrler G，Wu NH，Nitsche A，Müller MA，Drosten C，

S.SARS-CoV-2Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a ClinicallyProven Protease Inhibitor.Cell.2020Mar4.pii：S0092-8674(20)30229-4.doi：10.1016/j.cell.2020.02.052.[Epub ahead of print]PubMed PMID：32142651

Vincent MJ，Bergeron E，Benjannet S，Erickson BR，Rollin PE，Ksiazek TG，Seidah NG，Nichol ST.Chloroquine is a potent inhibitor of SARS coronavirusinfection and spread.Virol J.2005Aug 22；2：69.PubMed PMID：16115318；PubMedCentral PMCID：PMC1232869

Wang，M.，Cao，R.，Zhang，L.et al.Remdesivir and chloroquine effectivelyinhibit the recently emerged novel coronavirus(2019-nCoV)in vitro.Cell Res30，269-271(2020)

Gao J，Tian Z，Yang X.Breakthrough：Chloroquine phosphate has shownapparent efficacy in treatment of COVID-19 associated pneumonia in clinicalstudies.Biosci Trends.2020Feb 19.doi：10.5582/bst.2020.01047.[Epub ahead ofprint]PubMed PMID：32074550

Fujioka Y，Nishide S，Ose T，Suzuki T，Kato I，Fukuhara H，Fujioka M，Horiuchi K，Satoh AO，Nepal P，Kashiwagi S，Wang J，Horiguchi M，Sato Y，Paudel S，Nanbo A，Miyazaki T，Hasegawa H，Maenaka K，Ohba Y.A Sialylated Voltage-DependentCa2+Channel Binds Hemagglutinin and Mediates Influenza A Virus Entry intoMammalian Cells.Cell Host Microbe.2018 Jun 13；23(6)：809-818.

Mohan MC，Abhimsnnue AP，B PK.Identification and Characterization ofBerberine in Tinospora cordifolia by Liquid Chromatography Quadrupole Time ofFlight Mass Spectrometry(LC MS/MS Q-tof)and Evaluation of its antiInflammatory Potential.Pharmacognosy Journal.2017；9(3)：350-355

Song S，Qiu M，Chu Y，Chen D，Wang X，Su A，Wu Z.Berberine down-regulatescellular JNK and NF-KB activation and this may result in an inhibition of HSVreplication.Antimicrob Agents Chemother.2014Jun 9

Wu Y，Li JQ，Kim YJ，Wu J，Wang Q，Hao Y.In vivo and in vitro antiviraleffects of berberine on influenza virus.Chin J Integr Med.2011Jun；17(6)：444-52

Anna Luganini，Beatrice Mercorelli，Lorenzo Messa et Giorgio Palù，《Theisoquinoline alkaloid berberine inhibits human cytomegalovirus replication byinterfering with the viral Immediate Early-2(IE2)protein transactivatingactivity.》，Antiviral Research，vol.164，avril 2019，p.52-60

Ting-Chun Hung，Alagie Jassey，Ching-Hsusn Liu et Chien-Ju Lin，《Berberine inhibits hepatitis C virus entry by targeting the viral E2glycoprotein》，Phytomedicine，vol.53，février2019，p.62-69

Mariana Batista，Ana Braga，Guilherme Campos et Marcos Souza，《NaturalProducts lsolated from Oriental Medicinal Herbs Inactivate Zika Virus》，Viruses，vol.11，no 1，11 janvier 2019，p.49.

Andrés Pizzorno，Blandine Padey，Thomas Julien，Sophie Trouillet-Assant，Aurélien Traversier，Elisabeth Errazuriz-Cerda，Julien Fouret，Julia Dubois，Alexandre Gaymard，

-Xavier Lescure，Victoria Dulière，Pauline Brun，SamuelConstant，Julien Poissy，Bruno Lina，Yazdan Yazdanpanah，Olivier Terrier andManuel Rosa-Calatrava.“Characterization and treatment of SARS-CoV-2 in nasaland bronchial human airway epithelia.″2020Cell Reports Medecine Volume 1，Issue 4，21 July 2020，100059

序列表

<110> 里昂第一大学

国家健康科学研究所

国家科学研究中心

里昂高等师范学院

西嘉治疗公司

<120> 用于治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染的包含地尔硫卓的组合物

<130> B379238PCT D40411

<150> FR2002351

<151> 2020-03-10

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 1

tggggyttta crggtaacct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 2

aacrcgctta acaaagcact c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sonde

<400> 3

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Claims

1.地尔硫卓在用于预防和/或治疗称为COVID-19病的由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的治疗用途。

2.一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓，用于预防和/或治疗称为COVID-19病的由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中的治疗用途。

3.根据权利要求2所述的用途的组合物，其包含至少一种选自以下的其他活性成分：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物。

4.根据权利要求3所述的用途的组合物，其包含选自瑞德西韦、加利昔韦、莫努匹韦及其组合的核苷类似物。

5.根据权利要求4所述的用途的组合物，其包含地尔硫卓和瑞德西韦的组合。

6.根据权利要求4所述的用途的组合物，其包含地尔硫卓和加利昔韦的组合。

7.根据权利要求4所述的用途的组合物，其包含地尔硫卓和莫努匹韦的组合。

8.根据权利要求3所述的用途的组合物，其包含病毒蛋白酶抑制剂，特别是洛匹那韦，优选洛匹那韦与利托那韦的组合。

9.根据权利要求3的用途的组合物，其包含跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂，特别是甲磺酸卡莫司他。

10.根据权利要求1至9中任一项的用途的组合物，还包含至少一种抗生素。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途的组合物，其特征在于所述组合物为适于鼻内施用，特别是吸入施用的盖仑形式。

12.一种组合产品，其包含地尔硫卓和至少一种选自以下的其他活性成分：

-核苷类似物；

-病毒蛋白酶抑制剂；

-跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂；

-氯喹，和

-上述化合物的任何混合物，

用于在预防和/或治疗由SARS-CoV-2病毒引起的病毒感染中同时、分开或相继使用。

13.一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓和瑞德西韦的组合。

14.一种药物组合物，其在合适的药物载体中包含地尔硫卓和莫努匹韦的组合。