CN115551515B - 靶向3CLpro的连翘苷及其衍生物和抗新冠应用 - Google Patents

Abstract

靶向抑制COVID‑19病毒的3CLpro蛋白的连翘苷及其衍生物、连翘苷和连翘脂素的组合物在制备用于抗冠状病毒或用于治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用。其中，冠状病毒是COVID‑19病毒，冠状病毒所致疾病为COVID‑19。

Description

靶向3CLpro的连翘苷及其衍生物和抗新冠应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更确切的说，本发明涉及靶向抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的连翘苷和/或其衍生物以及连翘苷和连翘脂素组合物在制备抗冠状病毒(尤其是COVID-19病毒)的药物中的应用等。

技术背景

COVID-19，即2019冠状病毒病(又称新型冠状病毒肺炎)，COVID-19的致病源是COVID-19病毒(又称新型冠状病毒)，其属于冠状病毒，与2003年爆发的SARS有较高同源性。目前还没有治疗COVID-19的特效药。事实上，针对已经爆发过的SARS，至今仍旧没有特效药。

本发明人致力于中药提取物的研究，偶然并惊人地发现了，连翘苷和较少的连翘脂素组成药用组合物，在抗病毒方面具有增效、尤其是协同增效的药用效果。例如，中国专利申请CN105362283A公开了一种连翘苷/连翘脂素组合物及其在缓解或/和治疗病毒性疾病中的应用，其中，病毒性疾病为流感病毒、副流感病毒、柯萨奇病毒CoxA16、呼吸道合胞病毒RSV、单纯带状疱疹病毒HSV-I、单纯带状疱疹病毒HSV-II、单纯带状疱疹病毒CVB3、腺病毒ADV或肠道病毒EV71所致病毒性疾病。

然而，具有抗病毒作用的药物非常多，作用机制也多样化，无法预知现有抗病毒药物中的哪些对新出现的COVID-19病毒具有抑制作用。特别是，由于冠状病毒与上述连翘苷/连翘脂素组合物所针对的病毒有较大差异，而目前对COVID-19病毒及对其的治疗机制的研究还没有定论，所以本领域技术人员更无法预知连翘苷/连翘脂素组合物对冠状病毒(尤其是COVID-19病毒)具有抑制效果。

另外，连翘苷、连翘脂素或它们的衍生物对于COVID-19病毒的水解酶(3-chymotrypsin-like cysteine protease，简称为3CL pro蛋白)的影响也没有报道。

然而，本发明人令人意外地发现，连翘苷/连翘脂素组合物对COVID-19病毒具有良好的抑制作用，结合其安全性高，其对其他适应症的临床审批正在接近于完成进行，因此具备成为治疗COVID-19的药物的前景并可以快速投入临床使用；进一步地，本发明人发现，连翘苷、连翘脂素或它们的衍生物对COVID-19病毒的3CL pro蛋白具有靶向抑制作用，可以作为该蛋白的抑制剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供新的靶向抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的试剂，并提供用于抗冠状病毒(尤其是COVID-19病毒)或用于治疗冠状病毒所致疾病(尤其是COVID-19)的药物。

具体而言，在第一方面，本发明提供了连翘苷和/或其衍生物在制备用于抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的试剂中的应用。抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的试剂包含连翘苷和/或其衍生物。

本发明第一方面的应用可以是连翘苷或其衍生物的单独应用，也可以是连翘苷和其衍生物的联合应用，例如使用连翘苷/连翘脂素组合物的应用。在本发明第一方面的应用中，抑制可以是体内抑制，也可以是体外抑制。

优选在本发明第一方面的应用中，所述衍生物是KD-2-GLU或KD-2-SO₃H。

相应地，在第二方面，本发明还提供了抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的方法，其包括使COVID-19病毒的3CLpro蛋白与连翘苷和/或其衍生物接触的步骤。该方法可以是体内方法，也可以是体外方法。

优选在本发明第二方面的方法中，所述衍生物是KD-2-GLU或KD-2-SO₃H。

在第三方面，本发明提供了连翘苷/连翘脂素组合物在制备用于抗冠状病毒的药物中的应用，另外，本发明也提供了连翘苷/连翘脂素组合物在制备用于治疗冠状病毒所致疾病的药物中的应用。抗冠状病毒可以是在体外抗冠状病毒，例如在体外抑制冠状病毒的增值，但是，优选是在体内抗冠状病毒，后者就是治疗冠状病毒所致疾病。

在本文中，如无相反指示，“连翘苷/连翘脂素”、“连翘苷和连翘脂素”和“连翘苷和连翘脂素组合物”可以互换使用，指的是由连翘苷与连翘脂素组成的组合物，即连翘苷/连翘脂素作为一个整体计量。优选在本发明中，连翘苷与连翘脂素的重量比为2～98∶2～98，优选为80～98∶2～20，更优选为90～98∶2～10，如90∶10或98∶2。

优选在本发明第三方面的应用中，冠状病毒是COVID-19病毒，或，冠状病毒所致疾病为COVID-19。优选连翘苷/连翘脂素组合物抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白，即在本发明第三方面的应用中，连翘苷/连翘脂素组合物通过抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白来抗COVID-19病毒或治疗COVID-19病毒所致疾病。

连翘苷/连翘脂素组合物可以与其他抗冠状病毒(如，COVID-19病毒)或治疗冠状病毒所致疾病(如，COVID-19)的药物联合使用，也可以单独使用。本发明人研究发现，连翘苷/连翘脂素组合物的抗COVID-19病毒的机制包括抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白。

优选本发明第三方面的应用是连翘苷/连翘脂素组合物作为唯一药物活性成分的应用，即，所述药物中的唯一活性成分是连翘苷/连翘脂素组合物。也就是说，本发明第三方面优选提供了连翘苷/连翘脂素组合物作为唯一药物活性成分在制备用于抗冠状病毒(如，COVID-19病毒)的药物中的应用，或连翘苷/连翘脂素组合物作为唯一药物活性成分在制备用于治疗治疗冠状病毒所致疾病(如，COVID-19)的药物中的应用。

药物可以包括药学上可接受的载体而配制成药物制剂。这对于本领域技术人员来说是熟知的。优选在本发明第三方面的应用中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。

相应地，本发明还提供了连翘苷/连翘脂素组合物的第二药用及使用其的治疗方法。在第四方面，本发明提供了连翘苷/连翘脂素组合物，其用于抗冠状病毒(如，COVID-19病毒)。本发明也提供了连翘苷/连翘脂素组合物，其用于治疗冠状病毒所致疾病(如，COVID-19)；或者，本发明还提供了连翘苷/连翘脂素组合物，其用于抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白。

进一步地，本发明提供了包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物，其用于抗冠状病毒(如，COVID-19病毒)。本发明也提供了包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物，其用于治疗冠状病毒所致疾病(如，COVID-19)；或者，本发明还提供了包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物，其用于抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白。

优选地，包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物中，连翘苷/连翘脂素是所述药物中的唯一药物活性成分。

也优选地，包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。

在第五方面，本发明提供了用于抗冠状病毒(如，COVID-19病毒)的方法，其包括向有需要的患者给药有效量的连翘苷/连翘脂素组合物，相应地，本发明也提供了用于治疗冠状病毒所致疾病(如，COVID-19)的药物的方法，其包括向有需要的患者给药有效量的连翘苷/连翘脂素组合物。优选其中，连翘苷/连翘脂素组合物抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白来抗COVID-19病毒或治疗COVID-19病毒所致疾病。

进一步地，本发明提供了用于抗COVID-19病毒的方法，其包括向有需要的患者给药有效量的包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物，相应地，本发明也提供了用于治疗冠状病毒所致疾病(如，COVID-19)的药物的方法，其包括向有需要的患者给药有效量的包含连翘苷/连翘脂素组合物的药物。

在本文中，给药的剂量(有效量)和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况和感染的严重程度等)确定。由于患者具体情况会发生变化，因此给药的剂量也会发生变化，选取合适的量是在临床医师的能力范围内的。给药形式根据药物组合物的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选口服的给药形式。

优选地，在所述方法中，连翘苷/连翘脂素组合物是所述药物中的唯一药物活性成分。

也优选地，在所述方法中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。

本发明的有益效果在于，提供了抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的试剂和方法；连翘苷/连翘脂素组合物在低浓度时即可有效抑制COVID-19病毒等冠状病毒，其中连翘苷和连翘脂素两种成分的组合起到了协同增效的作用，有前景成为治疗COVID-19等冠状病毒的药物，并可以快速投入临床使用。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了连翘苷及其衍生物的结构。

图2是KD-1与COVID-19的3CLpro靶蛋白结合模拟图。

图3是KD-2-GLU与COVID-19靶蛋白结合模拟图。

图4是KD-2-SO₃H与COVID-19的3CLpro靶蛋白结合模拟图。

图5显示了3CL pro蛋白的克隆、表达及纯化的结果。

图6是3CLpro蛋白与KD-1的紫外分析图。

图7是3CLpro蛋白与KD2-GLU的紫外分析图。

图8是3CLpro蛋白与KD2-SO₃H的紫外分析图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步示例性地说明本发明。如未特别指明，实施例中所用的方法均记载于本领域的技术文献和药品监管机构的规范文件中，仪器、原料和试剂均为公开市场所购买的。

实施例1连翘苷/连翘脂素组合物体外抗COVID-19病毒的研究

1试验药物：连翘苷/连翘脂素组合物，其中连翘苷与连翘脂素的重量比为90∶10(大连富生天然药物开发有限公司)。

2细胞：VeroE6细胞(广州呼吸健康研究院呼吸疾病国家重点实验室)。

3病毒：COVID-19病毒SARS-CoV-2株(广州海关技术中心BSL-3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高治病病原微生物研究室))，滴度为TCID50＝10^-6/100μL。

4实验过程(实验操作均在BSL-3实验室内完成)：

(1)无菌96孔培养板，每孔加入100μL浓度为2×10⁵cells/mL VeroE6细胞，37℃5％CO₂培养24小时；

(2)培养板实验组和病毒对照组加入100 TCID50病毒液100μL/孔，37℃5％CO₂培养箱吸附2h；

(3)2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；连翘苷/连翘脂素组合物稀释成如表1-1所示的一系列浓度，每个浓度3个复孔，100μl/孔加入上述药液；

(4)同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)和病毒对照(阴性对照)；

(5)细胞37℃，5％CO₂孵箱孵育3-4天；

(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”无病变出现；“±”为细胞病变少于10％；“+”为细胞病变约25％；“++”为细胞病变约50％；“+++”为约75％的细胞出现病变：“++++”为75％以上病变。采用Reed-Muench法或GraphPad Prism5.0计算半数有效浓度(IC50)。

5实验结果：

实验结果如表1-1所示，连翘苷/连翘脂素组合物在低浓度下即能有效抑制COVID-19病毒，经计算，半数抑制浓度IC₅₀为63.90μg/mL(而同时研究的连翘苷纯品的半数抑制浓度IC₅₀为179.1μg/mL，而连翘脂素纯品的抑制效果更差)，组合物中连翘苷和连翘脂素两种成分的组合起到了协同增效的作用，因此有望用于治疗COVID-19。

表1-1

实施例2连翘苷/连翘脂素组合物体外抗HCoV-229E的研究

冠状病毒HCoV-229E致病性较低，通常仅导致类似于普通感冒的呼吸道症状。本实施例基本参照实施例1所示的过程进行，所不同的在于所用的冠状病毒是HCoV-229E(广州海关技术中心BSL-3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高治病病原微生物研究室)，滴度为TCID50＝10^-5.5/100μL，使用病毒的滴度为100TCID50；连翘苷/连翘脂素组合物稀释成如表2-1所示的一系列浓度。实验操作均在BSL-3实验室内完成。

实验结果如表2-1所示，连翘苷/连翘脂素组合物在低浓度下即能有效抑制HCoV-229E，经计算，半数抑制浓度IC₅₀为64.53μg/mL(而同时研究的连翘苷纯品和连翘脂素纯品的抑制效果更差)，组合物中连翘苷和连翘脂素两种成分的组合起到了协同增效的作用，因此有望用于治疗HCoV-229E所引起的疾病。

表2-1

实施例3连翘苷及其衍生物COVID-19病毒的分子机制的研究

一、实验背景

COVID-19病毒表面上Spike蛋白(S蛋白)及COVID-19病毒的水解酶(3-chymotrypsin-like cysteine protease，简称为3CL pro蛋白)在生命周期过程中是非常重要的环节，COVID-19生命周期是利用COVID-19表面的S蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，经过细胞本身的内吞过程，侵入细胞内释放遗传物质RNA，在3CL pro蛋白的参与下遗传物质RNA成功复制产生病毒。

虚拟筛选主要应用分子对接技术，是将药物筛选的过程在计算机上模拟，实施这种筛选需要获知药物作用靶标的分子结构，通过分子模拟手段计算化合物库中的小分子与靶标结合的能力，预测候选化合物的生理活性。

本实验利用Glide分子对接技术，进行虚拟筛选连翘苷(KD-1)及其衍生物对3CLpro靶蛋白最佳结合效果，基于筛选结果研究在体外KD-1及其衍生物对靶蛋白的结合，阐明分子间相互作用及结合模式和KD-1及其衍生物的构效关系；通过KD-1及其衍生物对靶蛋白活性测定，揭示KD-1及其衍生物作为COVID-19潜在的抑制剂分子机制。

二、实验方法

1KD-1及其衍生物与靶蛋白的分子对接

(1)系统准备：从蛋白质数据库(PDB ID：6LU7)获取了SARS-CoV-2主蛋白酶(3CLpro蛋白)的晶体结构。通过用Schrodinger中的protein Preparation Wizard对酶的结构进行了预处理，消除结晶水和添加缺失的氢/侧链原子，并为pH 7.0的酸性和碱性氨基酸残基分配适当的电荷和质子化状态，再使用OPLS-2005力场对酶的结构进行能量最小化，最后用Sitemap对蛋白的活性位点进行预测。同时用Schrodinger的LigPrep模块进行连翘苷及其衍生物的结构构象的优化。

(2)分子对接：基于分子对接的虚拟筛选是使用Maestro 11.5的Glide工作流程进行的。通过使用Glide的“超精确度”模式(XP)进行对连翘苷及其衍生物(图1)的对接计算。

(3)对接分数：以“Glide-score”得分函数值评价小分子与靶蛋白的相互作用，该函数综合考虑了氢键、疏水、范德华力等相互作用，其绝对值越大表明小分子与靶蛋白的对接复合物越稳定、匹配结合作用越好。

(4)分析靶点：通过KD-1及其衍生物与新型冠状病毒关键靶蛋白的对接结果，分析KD-1及其衍生物与新型冠状病毒关键靶蛋白作用的关键氨基酸，以便为临床预防、诊断、治疗新型冠状病毒感染提供理论依据及重要参考。

2蛋白的表达与纯化

(1)克隆：编码SARS-CoV-2 3CL pro蛋白的全长基因(UniprotKB-P0DTD1，残基3264-3569)已针对大肠杆菌表达系统进行了优化和合成(武汉金开瑞生物工程有限公司)。

(2)表达：将表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，然后在37℃的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养。当细胞生长到OD600nm值在0.6-0.8时，将0.5mM IPTG加入细胞培养物中以诱导在30℃，180rpm下表达。10小时后，通过3,000g离心收集细胞。

(3)纯化：将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，2mM BME)中，通过超声破碎裂解，然后以13,000g离心30分钟。将上清液加载到Ni-NTA亲和柱上，然后用20mM咪唑的重悬缓冲液中洗涤，再用300mM咪唑的裂解缓冲液(50mM Tris-HClpH 7.0，150mM NaCl)洗脱His标记的3CL pro蛋白。通过离子交换色谱法进一步纯化3CLpro蛋白。最终得到了以单体和二聚体的混合物形式的3CL pro蛋白，并保存于溶液中。

3光谱学实验

本实验利用JASCO-V560系列紫外可见分光光度计探究蛋白质的结构变化。蛋白的紫外吸收光谱具有两个吸收峰，210nm处的强吸收峰反映了蛋白质的框架构象，这是由于肽键中C＝O的n-π*跃迁引起的。280nm处的弱吸收峰出现是由于芳香族氨基酸(Trp，Tyr和Phe)对光的吸收引起π-π*跃迁的结果。

本实验以缓冲溶液作为参比，在200-700nm的波长范围内，扫描蛋白溶液、连翘苷蛋白混合溶液的紫外可见吸收光谱。向石英比色皿中加入2ml Gel Buffer(50mM Tris-HClpH 7.0，150mM NaCl)，加入10μL 3CL pro蛋白浓度为10^-5M，并测定其吸光度值，同时各加10μL连翘苷及其衍生物浓度为10^-4M，测定其吸光度变化。

三、实验结果

COVID-19生命周期是利用COVID-19表面的S蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，经过细胞本身的内吞过程，侵入细胞内释放遗传物质RNA，在3CL pro蛋白的参与下，遗传物质RNA成功复制产生病毒。本实验寻找能阻止3CL pro蛋白的参与遗传物质RNA复制的化合物，进而开发抗COVID-19的药物。本实验通过3CL pro蛋白的晶体结构，选择最佳靶标位点对KD-1及其衍生物(KD-2-GLU和KD-2-SO₃H)化合物进行虚拟筛选，可得到KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物3CL pro蛋白位点结合分值，从而证明该化合物靶向性。

通过计算分析，在3CLpro蛋白三维结构中找到5个潜在活性位点，其中位点1是药物分子易于结合的位点。将KD-1对接到3CLpro蛋白的5个潜在活性位点，5个活性位点全部对接成功，对接分数见表3-1所示。其中KD-1在3CLpro蛋白的活性位点1处的Glide Score分值明显高于3CLpro蛋白其他活性位点，并选择了3CLpro蛋白活性位点1作为分子对接的理论值。KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物计算分析同上。

表3-1 KD-1与3CLpro蛋白5个潜在活性位点对接分数

选择了KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H与3CLpro蛋白活性最佳活性位点，通过“GlideScore”评估了小分子与3CLpro蛋白位点的结合能力，绝对值越高表明二者结合的越稳定越匹配。KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物与COVID-19靶蛋白活性位点的对接分数见表3-2。表3-2表明KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物对COVID-19参与RNA复制的核心蛋白3CL pro的活性位点结合理论分值具有意义，其中KD-1和KD-2-GLU结合分值很高，进而说明这些化合物对核心蛋白3CL pro都具有不同程度靶向性。

表3-2 KD-1及其衍生物与COVID-19的3CLpro靶蛋白位点对接分数汇总表

通过分子对接KD-1与3CLpro靶蛋白的三维模拟图及平面图，可以看出KD-1化合物进入了蛋白质的分子口袋(图2.上)。KD-1与3CL pro蛋白活性位点的氨基酸His41残基形成π-π共轭，与Gly143，Asn142，Glu166的肽键形成3个氢键，与Met165形成疏水相互作用结合于3CL pro蛋白(图2.下)。说明不同的氨基酸残基，如His、Gly、Asn、Glu和Met等，可以在空间上与KD-1的结构相匹配，从而确定复合物的构象，推测KD-1化合物对3CL pro蛋白靶向性，阻止3CL pro蛋白参与COVID-19参与RNA复制产生病毒。

通过分子对接KD-2-GLU与3CLpro靶蛋白的三维模拟图及平面图，可以看出KD-2-GLU进入了蛋白质的分子口袋(图3.上)。KD-2-GLU与3CL pro蛋白活性位点Gly143，Thr43，Thr25的肽键形成3个氢键，与Tyr54形成疏水相互作用结合于3CL pro蛋白(图3.下)。说明不同的氨基酸残基，如Gly、Thr和Tyr等，可以在空间上与KD-2-GLU的结构相匹配，从而确定复合物的构象。推测KD-2-GLU化合物对3CL pro蛋白靶向性，阻止3CL pro蛋白参与COVID-19参与RNA复制产生病毒。

通过分子对接KD-2-SO₃H与3CLpro靶蛋白的三维模拟图及平面图，可以看出KD-2-GLU进入了蛋白质的分子口袋(图4.上)。KD-2-SO₃H与Gly143，Asn142形成氢键相互作用，与Tyr54，Val42，Cys44，Cys145形成疏水相互作用(图4.下)。说明不同的氨基酸残基，如Gly、Asn和Val等，可以在空间上与KD-2-SO₃H的结构相匹配，从而确定复合物的构象。

KD-1及其衍生物与3CLpro蛋白活性位点的相互作用见表3-3。结果表明，连翘苷及两种衍生物与3CLpro蛋白活性位点之间的相互作用不完全是疏水性的，还发生了氢键和π-π共轭作用，可能通过氢键和π-π共轭相互作用有助于稳定络合物。发现KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物与3CLpro蛋白共同通过一个GLY143氢键相互作用，分子中的氢原子间距分别为和/>然而，疏水作用和静电作用在3CLpro蛋白和KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物的结合过程中起着重要作用，不同化合物与3CLpro蛋白结合的残基不同，这也解释了它们结合结果的差异。

表3-3 KD-1及其衍生物与3CLpro蛋白的相互作用

破碎后的蛋白经镍柱纯化，分子量为34kd图5(左)。经离子交换层析后进行SDSPAGE检测为样品3CL pro蛋白，蛋白浓度为65mg/ml图5(右)。

基于分子对接虚拟筛结果，通过紫外-可见吸收试验方法，在体外进行KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物与3CLpro蛋白结合试验，进一步证明该化合物对3CLpro蛋白具有靶向性。图6展示了通过紫外-可见光光谱法测定KD-1和3CLpro蛋白及其混合物的吸光度。结果表明，3CL pro蛋白在278nm处有吸收峰，加入KD-1后，吸光度增大，峰发生偏移。KD-1与3CL pro蛋白发生相互作用，有可能抑制了酶的活性。KD-1与3CL pro可能形成了新的复合物，KD-1可能与3CL pro蛋白发生氢键或者疏水结合。

图7展示了通过紫外-可见光光谱法测定KD2-GLU和3CLpro及其混合物的吸光度。结果表明，3CL pro蛋白在278nm处有吸收峰，在加入KD2-GLU后，吸光度增大，峰发生偏移。KD2-GLU与3CL pro蛋白发生相互作用，有可能抑制了酶的活性。KD2-GLU与3CL pro可能形成了新的复合物，二者可能发生氢键和疏水结合。

图8展示了通过紫外-可见光光谱法测定KD2-SO₃H和3CLpro及其混合物的吸光度。结果表明，在加入KD2-SO₃H后，吸光度增大，3CL pro蛋白的峰发生偏移。KD2-SO₃H与3CL pro蛋白发生相互作用，有可能抑制了酶的活性。KD2-SO₃H可能与3CL pro蛋白发生氢键或者疏水结合，二者之间可能形成了新的复合物。

四、实验结论

通过分子对接结果表明KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物对COVID-19病毒参与RNA复制的核心蛋白3CL pro蛋白质的结合理论分值具有意义，其中KD-1和KD-2-GLU结合分值很高。通过分析表明KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物与3CL pro蛋白质的活性位点中肽键发生了氢键和疏水结合，与氨基酸残基形成π-π共轭，其理论数据能证明使3CL pro蛋白质结构发生变化。在体外利用光谱实验，结果KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物对3CLpro蛋白质278nm处特征峰都具有偏移和增大现象，其中KD-1化合物最为明显。因此KD-1、KD-2-GLU和KD-2-SO₃H化合物都具有对3CL pro蛋白质靶向作用，阻止COVID-19病毒的3CLpro蛋白质参与病毒的复制的化合物，可成为一种COVID-19病毒的靶向抑制剂。

实施例4体内抗新冠病毒的药效研究

一、实验材料

小鼠：hACE2小鼠，6-7周龄，20-40g，共120只雄性，实验动物供应商：江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2018-0008，实验动物合格证号：No.320727201100243581，饲料供应商：江苏美迪森生物医药有限公司。

药物：连翘苷/连翘脂素组合物，其中连翘苷与连翘脂素的重量比为90∶10(大连富生天然药物开发有限公司)。

二、实验方法

(1)药物对COVID-19小鼠疾病进展的保护作用

将hACE2转基因C57BL/6小鼠分为正常组、SARS-CoV-2感染组、药物80mg/kg、40mg/kg剂量组，阳性对照组(瑞德西韦50mg/kg)，每组8只。除正常组滴鼻给予PBS以外，其它各组小鼠滴鼻感染10⁵PFU的SARS-CoV-2病毒。感染后2小时，药物组小鼠灌胃给予连翘苷，连续5日，1次/日。感染后每日记录体重变化，计算5日死亡率。

(2)药物对COVID-19小鼠感染诱导过度炎症药效研究

将ACE2转基因C57BL/6小鼠分为正常组、SARS-CoV-2感染组、药物80mg/kg、40mg/kg剂量组，阳性对照组(瑞德西韦50mg/kg)。除正常组滴鼻给予PBS以外，其它各组小鼠滴鼻感染10⁵PFU的SARS-CoV-2病毒。感染后2小时，药物组小鼠灌胃给予连翘苷，连续5日，1次/日。动物在感染后第5日解剖取肺，对肺组织进行匀浆检测病毒滴度；并采用Trizol法对肺组织匀浆上清进行提取总RNA，RT-qPCR检测相关炎症因子mRNA的表达。

三、实验结果

(1)药物抗新冠病毒死亡保护研究结果

死亡保护结果如表4-1所示，结果表明：药物两种剂量(80mg/kg和40mg/kg)给药组对感染新冠病毒小鼠保护作用分别为87.5％和42.86％；病毒感染组71.43％小鼠死亡，药物80mg/kg组死亡保护率与瑞德西韦相当。

表4-1新型冠状病毒感染小鼠死亡保护检测结果(n＝3)

(2)药物对新冠病毒感染小鼠肺组织病毒滴度检测结果

如表4-2所示，药物两种剂量(80mg/kg和40mg/kg)给药组对感染小鼠的肺病毒滴度显著降低，80mg/kg给药组抑制肺病毒滴度与瑞德西韦无统计学差异。

表4-2新型冠状病毒感染小鼠肺组织病毒滴度检测结果

注：与病毒感染组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

(3)药物对新型冠状病毒感染小鼠诱导过度炎症检测结果

对感染小鼠炎症指标检测结果如表4-3所示，新冠病毒感染小鼠第五天，病毒感染组的IL-1β、IFN-γ、MCP-1及IFN-α表达显著升高，药物干预后，两给药剂量组(80mg/kg和40mg/kg)对IL-1β、IFN-γ、MCP-1及IFN-α炎症因子均有的抑制作用；且80mg/kg给药组抑制炎症介质过度表达的能力优于瑞德西韦。

表4-3药物对感染小鼠肺匀浆中IL-1β、IFN-γ、MCP-1及IFN-αmRNA表达量的影响

注：与病毒感染组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

四、结论

上述实验结果表明本发明的药物对新冠病毒感染小鼠的死亡具有显著的保护作用，对新冠病毒感染鼠死亡保护率达87.5％，与瑞德西韦疗效相当，能显著抑制新冠病毒感染小鼠肺组织病毒滴度，且对新冠病毒感染诱导的过度炎症因子IL-1β，IFN-α、MCP-1和IFN-γ的mRNA表达，从而起到治疗新冠病毒感染的作用。

Claims (2)

1.KD-2-GLU在制备用于抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的试剂中的应用，

其中，KD-2-GLU的结构式如下所示：

2.KD-2-SO₃H在制备用于抑制COVID-19病毒的3CLpro蛋白的试剂中的应用，

其中，KD-2-SO₃H的结构式如下所示：