JP7423083B2 - 大腸癌の発癌リスクを検出する方法及びキット - Google Patents
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Description
本発明は、大腸癌の発癌リスクを検出する方法及びキットに関する。本願は、２０１９年４月１８日に、日本に出願された特願２０１９－０７９５３５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
潰瘍性大腸炎の患者は発癌リスクが高いことが知られている。しかしながら、潰瘍性大腸炎患者の発癌リスクを検出することができる信頼性の高いマーカーは知られていない。このため、潰瘍性大腸炎を８年以上患っている患者は、１～２年ごとに内視鏡検査を受けることが推奨されている。しかしながら、潰瘍性大腸炎患者の内視鏡検査は高度に熟練した専門医が行う必要があり、患者への身体的負担も少なくない。このため、潰瘍性大腸炎患者の発癌リスクを簡便に検出する技術が求められている。
例えば、特許文献１には、ガレクチン－３及びガレクチン－４が大腸癌マーカーであることが記載されている。
本発明は、大腸癌の発癌リスクを検出する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］大腸癌の発癌リスクを検出する方法であって、被験者由来の大腸上皮組織試料における、インターロイキン（ＩＬ）－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程を含み、前記機能欠失変異が存在することが、前記被験者は大腸癌の発癌リスクが高いことを示す、方法。
［２］ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる前記遺伝子が、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｚｅｔａ（ＮＦＫＢＩＺ）遺伝子、ＴＲＡＦ３ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＴＲＡＦ３ＩＰ２）遺伝子、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（ＩＬ１７ＲＡ）遺伝子、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）又はＮｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ２（ＮＯＳ２）遺伝子である、［１］に記載の方法。
［３］ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する前記工程が、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質の免疫染色により行われ、前記免疫染色の結果、前記大腸上皮組織試料中に、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質の発現が認められない細胞の存在が検出されることが、前記機能欠失変異が存在することを示す、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子の機能的欠失変異を検出するためのプローブ、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子を増幅するためのプライマー、又は、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質及びＮＯＳ２タンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上のタンパク質に対する特異的結合物質、を含む、大腸癌の発癌リスクを検出するためのキット。
［１］大腸癌の発癌リスクを検出する方法であって、被験者由来の大腸上皮組織試料における、インターロイキン（ＩＬ）－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程を含み、前記機能欠失変異が存在することが、前記被験者は大腸癌の発癌リスクが高いことを示す、方法。
［２］ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる前記遺伝子が、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｚｅｔａ（ＮＦＫＢＩＺ）遺伝子、ＴＲＡＦ３ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＴＲＡＦ３ＩＰ２）遺伝子、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（ＩＬ１７ＲＡ）遺伝子、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）又はＮｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ２（ＮＯＳ２）遺伝子である、［１］に記載の方法。
［３］ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する前記工程が、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質の免疫染色により行われ、前記免疫染色の結果、前記大腸上皮組織試料中に、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質の発現が認められない細胞の存在が検出されることが、前記機能欠失変異が存在することを示す、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子の機能的欠失変異を検出するためのプローブ、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子を増幅するためのプライマー、又は、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質及びＮＯＳ２タンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上のタンパク質に対する特異的結合物質、を含む、大腸癌の発癌リスクを検出するためのキット。
本発明によれば、大腸癌の発癌リスクを検出する技術を提供することができる。
［大腸癌の発癌リスクを検出する方法］
１実施形態において、本発明は、大腸癌の発癌リスクを検出する方法であって、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程を含み、前記機能欠失変異が存在することが、前記被験者は大腸癌の発癌リスクが高いことを示す方法を提供する。本実施形態の方法において、被験者は潰瘍性大腸炎患者であることが好ましい。また、大腸上皮組織試料は、炎症を起こした領域の試料であることが好ましい。
１実施形態において、本発明は、大腸癌の発癌リスクを検出する方法であって、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程を含み、前記機能欠失変異が存在することが、前記被験者は大腸癌の発癌リスクが高いことを示す方法を提供する。本実施形態の方法において、被験者は潰瘍性大腸炎患者であることが好ましい。また、大腸上皮組織試料は、炎症を起こした領域の試料であることが好ましい。
本実施形態の方法は、大腸癌の発癌リスクを検出するためのデータを収集する方法であるということもできる。すなわち、本実施形態の方法は、大腸癌の発癌リスクを検出するためのデータを収集する方法であって、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程を含み、前記機能欠失変異が存在することが、前記被験者は大腸癌の発癌リスクが高いことを示すデータである方法であるということもできる。
実施例において後述するように、発明者らは、潰瘍性大腸炎患者の炎症を起こした領域には、高頻度でＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異が存在することを明らかにした。
更に、発明者らは、大腸上皮組織にＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を有する潰瘍性大腸炎患者は、大腸炎関連腫瘍を伴っている場合が多いことを明らかにした。
したがって、被験者由来の大腸上皮組織における、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の存在は、前記被験者の大腸癌の発癌リスクが高いことを示す。本明細書において、被験者の発癌リスクが高いとは、被験者が近いうちに大腸炎関連腫瘍を生じる可能性が高いこと、被験者が既に良性又は悪性の腫瘍を有している可能性が高いこと、被験者が既に有している大腸炎関連腫瘍が悪性化する可能性が高いこと等を意味する。
本実施形態の方法において、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子としては、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子、ＮＯＳ２遺伝子等が挙げられる。
ＰＩＧＲ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００２６４４．３等である。本明細書ではＰＩＧＲ遺伝子にコードされるタンパク質をＰＩＧＲタンパク質という場合がある。ＰＩＧＲタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００２６３５．２等である。
ＮＦＫＢＩＺ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１００５４７４．２、ＮＭ＿０３１４１９．３等である。本明細書ではＮＦＫＢＩＺ遺伝子にコードされるタンパク質をＮＦＫＢＩＺタンパク質という場合がある。ＮＦＫＢＩＺタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿１１３６０７．１、ＮＰ＿００１００５４７４．１等である。
ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１１６４２８１．２、ＮＭ＿００１１６４２８３．２、ＮＭ＿１４７２００．２、ＮＭ＿１４７６８６．３、ＮＭ＿００１１６４２８２．１等である。本明細書ではＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子にコードされるタンパク質をＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質という場合がある。ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿６７１７３３．２、ＮＰ＿００１１５７７５３．１、ＮＰ＿６７９２１１．２等である。
ＩＬ１７ＲＡ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１２８９９０５．１、ＮＭ＿０１４３３９．６等である。本明細書ではＩＬ１７ＲＡ遺伝子にコードされるタンパク質をＩＬ１７ＲＡタンパク質という場合がある。ＩＬ１７ＲＡタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１２７６８３４．１、ＮＰ＿０５５１５４．３等である。
ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００１３２３５５０．１、ＮＭ＿００１３２３５５１．１、ＮＭ＿０２５０７９．２等である。本明細書ではＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子にコードされるタンパク質をＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質という場合がある。ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０７９３５５．２、ＮＰ＿００１３１０４８０．１、ＮＰ＿００１３１０４７９．１等である。
ＮＯＳ２遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０００６２５．４、ＮＭ＿１５３２９２．１等である。本明細書ではＮＯＳ２遺伝子にコードされるタンパク質をＮＯＳ２タンパク質という場合がある。ＮＯＳ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０００６１６．３等である。
ＩＬ－１７（ＩＬ－１７Ａ）の受容体は、ＩＬ１７ＲＡタンパク質とＩＬ１７ＲＣタンパク質のヘテロダイマーからなる。ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質（Ａｃｔ１タンパク質）は、ＩＬ－１７受容体アダプターであり、下流にあるＮＦ－κＢシグナルの活性化に必須である。
ＮＦＫＢＩＺタンパク質（ＩκＢζタンパク質）はＮＦ－κＢシグナルの活性化により活性化され、ポジティブフィードバック制御によりＮＦ－κＢを活性化する。ＩＬ－１７刺激は、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＰＩＧＲタンパク質等の発現を上方制御する。
したがって、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子は、ＰＩＧＲタンパク質の発現に関わる遺伝子であるということもできる。
免疫グロブリンの一種であるＩｇＡは、粘膜下の粘膜固有層に存在する多数の形質細胞から分泌され、粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現するＰＩＧＲタンパク質にＪ鎖で結合し、そのままＰＩＧＲタンパク質と共に上皮細胞内に取り込まれる。続いて、取り込まれたＩｇＡ－ＰＩＧＲ複合体は細胞内を横断（トランスサイトーシス）し、粘膜面側でＰＩＧＲタンパク質の一部（Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣ）が切断される。その結果、ＩｇＡ－ＳＣタンパク質複合体（分泌型ＩｇＡ）が粘膜面側に放出される。分泌型ＩｇＡは、Ｊ鎖により結合された二量体のＩｇＡにＳＣタンパク質（分泌成分）が更に結合したものであるといえる。
Ｊ鎖はＪｏｉｎｉｎｇ Ｃｈａｉｎ Ｏｆ Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ＩｇＡ Ａｎｄ ＩｇＭ（ＪＣＨＡＩＮ）遺伝子にコードされるタンパク質である。ＪＣＨＡＩＮ遺伝子のｃＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿１４４６４６．３等である。本明細書ではＪＣＨＡＩＮ遺伝子にコードされるタンパク質をＪＣＨＡＩＮタンパク質、Ｊ鎖等という場合がある。ＪＣＨＡＩＮタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿６５３２４７．１等である。
本実施形態の方法では、上述した、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子のいずれか１種について機能欠失変異を検出してもよいし、２種以上について機能欠失変異を検出してもよい。これらの遺伝子に機能欠失変異が存在した場合、被験者は大腸癌の発癌リスクが高いと判断することができる。
また、機能欠失変異は片アレルに存在していてもよいし、両アレルに存在していてもよいが、両アレルに機能欠失変異が存在する場合、片アレルに機能欠失変異を有している場合と比較して、被験者の大腸癌の発癌リスクはより高いと判断することができる。
また、機能欠失変異を有する遺伝子の数が多いほど、被験者の大腸癌の発癌リスクはより高いと判断することができる。
機能欠失変異としては、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる機能的なタンパク質が発現しなくなる変異であれば特に限定されず、例えば、ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異（短縮型変異）が挙げられる。ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異としては、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシング部位における変異等が挙げられる。
機能欠失変異を検出する工程は、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子、すなわち、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子、ＮＯＳ２遺伝子等のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのシーケンシングにより行ってもよい。あるいは、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質、ＮＯＳ２タンパク質等の免疫染色により行ってもよい。
機能欠失変異を検出する工程を免疫染色により行う場合、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質、ＮＯＳ２タンパク質のうちいずれか１種について免疫染色を行ってもよいし、２種以上について免疫染色を行ってもよい。なかでも、ＰＩＧＲタンパク質又は分泌型ＩｇＡタンパク質の免疫染色が好ましい。
分泌型ＩｇＡタンパク質の免疫染色は、抗ＩｇＡ抗体で染色することにより行ってもよいし、ＰＩＧＲタンパク質の一部であるＳＣタンパク質（分泌成分）に対する抗体（抗ＳＣ抗体）で染色することにより行ってもよいし、ＩｇＡ分子同士を結合して二量体ＩｇＡ分子を形成するＪ鎖に対する抗体（抗Ｊ鎖抗体）で染色することにより行ってもよい。
実施例において後述するように、免疫染色の結果、大腸上皮組織試料中にＰＩＧＲタンパク質又は分泌型ＩｇＡタンパク質の発現が認められない細胞の存在が検出された場合、ＰＩＧＲタンパク質の発現に関わる遺伝子の機能欠失変異が存在すると判断することができる。
より詳細には、免疫染色の結果、ＰＩＧＲタンパク質の発現が消失した腸陰窩が検出された場合、あるいは、細胞質内におけるＩｇＡ（分泌型ＩｇＡ）タンパク質が消失した腸陰窩が検出された場合、ＰＩＧＲタンパク質の発現に関わる遺伝子の機能欠失変異が存在すると判断することができる。
［キット］
１実施形態において、本発明は、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子の機能的欠失変異を検出するためのプローブ、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子を増幅するためのプライマー、又は、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質及びＮＯＳ２タンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上のタンパク質に対する特異的結合物質、を含む、大腸癌の発癌リスクを検出するためのキットを提供する。
１実施形態において、本発明は、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子の機能的欠失変異を検出するためのプローブ、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子を増幅するためのプライマー、又は、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質及びＮＯＳ２タンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上のタンパク質に対する特異的結合物質、を含む、大腸癌の発癌リスクを検出するためのキットを提供する。
本実施形態のキットを用いることにより、上述した大腸癌の発癌リスクを検出する方法を実施することができる。
本実施形態のキットがプローブを含む場合、プローブとしては、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子又はＮＯＳ２遺伝子のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、シーケンシング又は変異の同定が可能なものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイを構成していることが好ましい。
プローブにこれらの遺伝子のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡをハイブリダイズさせ、シーケンシング又は変異の同定を行った結果、これらの遺伝子にＩＬ－１７シグナル伝達に関わる機能的なタンパク質が発現しなくなる変異が存在していた場合、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異が存在すると判断することができる。
本実施形態のキットがプライマーを含む場合、当該プライマーを用いたＰＣＲ反応等により、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、Ｃ３Ｈ１２Ａ遺伝子又はＮＯＳ２遺伝子のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを増幅し、続いて、得られた増幅産物の塩基配列をシーケンシングする。
その結果、これらの遺伝子にＩＬ－１７シグナル伝達に関わる機能的なタンパク質が発現しなくなる変異が存在していた場合、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異が存在すると判断することができる。
ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる機能的なタンパク質が発現しなくなる変異としては、例えば、ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異（短縮型変異）が挙げられる。ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異としては、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシング部位における変異等が挙げられる。
本実施形態のキットが、ＰＩＧＲタンパク質、分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質に対する特異的結合物質を含む場合、当該特異的結合物質を用いて被験者由来の大腸上皮組織試料を免疫染色する。
その結果、大腸上皮組織試料中に、ＰＩＧＲタンパク質又は分泌型ＩｇＡタンパク質の発現が認められない細胞の存在が検出された場合、ＰＩＧＲタンパク質の発現に関わる遺伝子の機能欠失変異が存在すると判断することができる。
上述したように、分泌型ＩｇＡタンパク質に対する特異的結合物質は、ＩｇＡに対する特異的結合物質であってもよいし、ＳＣタンパク質（分泌成分）に対する特異的結合物質であってもよいし、Ｊ鎖に対する特異的結合物質であってもよい。
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、マウス等の動物を免疫することによって作製したものであってもよく、ファージライブラリ等の抗体ライブラリのスクリーニングにより作製したものであってもよい。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、対象物質に対する特異的結合能を有する物質であれば特に限定されず、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程と、前記機能欠失変異が存在した場合に、前記被験者に潰瘍性大腸炎の治療薬及び／又は抗癌剤を投与する工程と、を含む、大腸癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、被験者由来の大腸上皮組織試料における、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程と、前記機能欠失変異が存在した場合に、前記被験者に潰瘍性大腸炎の治療薬及び／又は抗癌剤を投与する工程と、を含む、大腸癌の治療方法を提供する。
本実施形態において、被験者としては、例えば、潰瘍性大腸炎患者が挙げられる。また、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子、当該遺伝子の機能欠失変異については上述したものと同様である。
また、抗癌剤としては、例えば、オキサリプラチン、イリノテカン、５－フルオロウラシル、カペシタビン等の殺細胞性抗癌剤；ベバシズマブ、ラムシルマブ、アフリベルセプト、セツキシマブ、パニツムマブ等の分子標的抗癌剤等が挙げられるがこれらに限定されない。また、上記殺細胞性抗癌剤と共にロイコボリンを投与してもよい。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（オルガノイドの調製）
実験は慶應義塾大学医学部倫理委員会の承認に基づいて行った（承認番号２０１２００５７、２０１３０５１２、Ｇ３５５３－（７））。インフォームドコンセントを受け、大腸内視鏡検査又は手術を受けた潰瘍性大腸炎患者から、腸組織試料を採取した。
（オルガノイドの調製）
実験は慶應義塾大学医学部倫理委員会の承認に基づいて行った（承認番号２０１２００５７、２０１３０５１２、Ｇ３５５３－（７））。インフォームドコンセントを受け、大腸内視鏡検査又は手術を受けた潰瘍性大腸炎患者から、腸組織試料を採取した。
健常者由来の腸組織試料の場合、腸組織から間質を除去し、上皮組織を約１ｍｍ３の大きさに裁断した。上皮組織の破片は少なくとも５回氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。続いて、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ中で穏やかに撹拌しながら４℃で１時間処理し、腸陰窩を遊離させた。
続いて、遊離した腸陰窩をマトリゲル（登録商標、ＢＤバイオサイエンス社）に懸濁し、２５μＬずつの液滴として４８ウェルプレートに播種した。マトリゲルがゲル化した後、表１に示す組成の培地を積層した。
潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こしていない領域の試料（以下、「ＵＣｕｎｉｎｆ」という場合がある。）、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こした領域の試料（以下、「ＵＣｉｎｆ」という場合がある。）、及び、潰瘍性大腸炎患者由来の大腸炎関連腫瘍試料（以下、「ＣＡＮ」という場合がある。）の場合、断片化した粘膜組織をリベラーゼ（「リベラーゼＴＨ、研究グレード」、ロシュ社）を用いて３７℃で１時間消化した。続いて、残った断片をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて３７℃で２０分間消化した。続いて、消化した組織をマトリゲルに埋め込み、上述した培地を積層した。
培地は２日ごとに新しい培地に交換した。また、形成されたオルガノイドはＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて１週間に１回、１：１０の分割比でパッセージした。オルガノイドの樹立後２日間及びパッセージ後２日間は、培地に１０μＭのＹ－２７６３２（富士フィルムワコー純薬）を添加した。
その結果、４５人の潰瘍性大腸炎患者及び１３人の健常者に由来する１２２個の正常オルガノイド株（クローン）を得た。４５人の潰瘍性大腸炎患者のうち２２人は大腸炎関連腫瘍を有していた。そして、対応する正常オルガノイドを有しない５株を含む、１９株の大腸炎関連腫瘍に由来するオルガノイドを得た。
以下、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こしていない領域に由来するオルガノイドを「ＵＣｕｎｉｎｆオルガノイド」という場合がある。また、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こした領域に由来するオルガノイドを「ＵＣｉｎｆオルガノイド」という場合がある。また、健常者に由来するオルガノイドを「ＨＣオルガノイド」という場合がある。また、大腸炎関連腫瘍に由来するオルガノイドを「ＣＡＮオルガノイド」という場合がある。
［実験例２］
（ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の検討１）
実験例１で樹立した各オルガノイドクローンの全エクソームシーケンシングにより、ＵＣｉｎｆオルガノイドに特異的な遺伝子変異が蓄積しているか否かを検討した。機能欠失変異の原因となる可能性がある、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシング部位における変異を含むｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異（短縮型変異）に着目した。
（ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の検討１）
実験例１で樹立した各オルガノイドクローンの全エクソームシーケンシングにより、ＵＣｉｎｆオルガノイドに特異的な遺伝子変異が蓄積しているか否かを検討した。機能欠失変異の原因となる可能性がある、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライシング部位における変異を含むｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異（短縮型変異）に着目した。
図１は解析結果を示す図である。図１中、横軸は各オルガノイドクローンのクローン名を示す。また、「ＵＣｉｎｆ」はＵＣｉｎｆオルガノイドであることを示し、「ＵＣｕｎｉｎｆ」はＵＣｕｎｉｎｆオルガノイドであることを示し、「ＨＣ」はＨＣオルガノイドであることを示す。また、「ＣＡＮ」において、黒四角は潰瘍性大腸炎患者が大腸炎関連腫瘍を有していることを示す。また、「Ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ」はｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異を示す。
また、「ＮＦＫＢＩＺ」はＮＦＫＢＩＺ遺伝子を示し、「ＰＩＧＲ」はＰＩＧＲ遺伝子を示し、「ＴＲＡＦ３ＩＰ２」はＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子を示し、「ＴＰ５３」はＴＰ５３遺伝子を示し、「ＡＲＩＤ１Ａ」はＡＲＩＤ１Ａ遺伝子を示す。
また、黒四角はヘテロ接合性消失変異（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓｉｔｙ、ＬＯＨ）を有していることを示し、黒三角は片アレルにｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異を有していることを示し、白斜線の入った黒四角は両アレルにｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異を有していることを示し、「Ｈｏｔｓｐｏｔ ａｍｉｎｏ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ」はホットスポットにアミノ酸置換変異を有していることを示す。
その結果、ＵＣｉｎｆオルガノイドでは、粘膜における免疫機能に関与するＮＦＫＢＩＺ遺伝子及びＰＩＧＲ遺伝子にｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が繰り返し生じていることが明らかとなった。
更に、５株のＵＣｉｎｆオルガノイドが、両アレルに、互いに変異パターンが異なるＮＦＫＢＩＺ遺伝子又はＰＩＧＲ遺伝子のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異を有していた。この結果は、潰瘍性大腸炎の炎症環境下において特異的な選択が行われていることを示す。
また、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子及びＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子におけるｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異は、２株のＵＣｉｎｆオルガノイドにおいてヘテロ接合性消失変異（ＬＯＨ）を伴っていることが明らかとなった。
ＨＣオルガノイドではヘテロ接合性消失変異（ＬＯＨ）は稀であったのに対し、全エクソームシーケンシングデータの１塩基多型解析の結果、２９株のＵＣｉｎｆオルガノイドのうちの７株においてヘテロ接合性消失変異（ＬＯＨ）変異が検出された（データは示さず）。この結果は、潰瘍性大腸炎の炎症環境下において特異的な選択が行われていることを更に支持するものである。
図２は、ＵＣｉｎｆオルガノイドの例数を増やして解析した結果を示す図である。図２中、横軸は各オルガノイドクローンのクローン名を示す。また、「ＵＣｉｎｆ」はＵＣｉｎｆオルガノイドであることを示す。また、「ＰＩＧＲ」はＰＩＧＲ遺伝子を示し、「ＮＦＫＢＩＺ」はＮＦＫＢＩＺ遺伝子を示し、「ＩＬ１７ＲＡ」はＩＬ１７ＲＡ遺伝子を示し、「ＴＲＡＦ３ＩＰ２」はＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子を示し、「ＺＣ３Ｈ１２Ａ」はＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子を示し、「ＮＯＳ２」はＮＯＳ２遺伝子を示す。また、「ＣＡＮ」において、黒四角は潰瘍性大腸炎患者が大腸炎関連腫瘍を有していることを示す。
また、四角はｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が存在していたことを示し、四角の濃さは各遺伝子に存在していた異なる変異体の数に対応する。また、「ＶＡＦ」はＶａｒｉａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎを示し、各ドットは全リードに対する変異したアレルのリードの割合を示す。
その結果、ＰＩＧＲ遺伝子及びＮＦＫＢＩＺ遺伝子にｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が頻繁に生じていることが確認された。また、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子、ＮＯＳ２遺伝子にものｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が見出された。この結果は、ＵＣｉｎｆオルガノイドにおいてＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子にｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が蓄積することを更に支持するものである。
［実験例３］
（ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の検討２）
実験例２ではオルガノイドクローンを用いてｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異の蓄積を検討した。本実験例では、４パッセージ以下の培養しか行っていないポリクローナルなＵＣｉｎｆオルガノイド、ＵＣｕｎｉｎｆオルガノイド及びＨＣオルガノイドからゲノムＤＮＡを抽出し、標的遺伝子をシーケンシングすることにより、ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異の蓄積を検討した。標的遺伝子としては、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子及び散発性大腸癌のドライバー遺伝子を含む３７遺伝子を検討した。
（ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の検討２）
実験例２ではオルガノイドクローンを用いてｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異の蓄積を検討した。本実験例では、４パッセージ以下の培養しか行っていないポリクローナルなＵＣｉｎｆオルガノイド、ＵＣｕｎｉｎｆオルガノイド及びＨＣオルガノイドからゲノムＤＮＡを抽出し、標的遺伝子をシーケンシングすることにより、ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異の蓄積を検討した。標的遺伝子としては、ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子及び散発性大腸癌のドライバー遺伝子を含む３７遺伝子を検討した。
図３は解析結果を示す図である。図３中、横軸はそれぞれ独立して行った実験結果を示す。また、「ＵＣｉｎｆ」はＵＣｉｎｆオルガノイドであることを示し、「ＵＣｕｎｉｎｆ」はＵＣｕｎｉｎｆオルガノイドであることを示し、「ＨＣ」はＨＣオルガノイドであることを示す。
また、「ＰＩＧＲ」はＰＩＧＲ遺伝子を示し、「ＮＦＫＢＩＺ」はＮＦＫＢＩＺ遺伝子を示し、「ＡＲＩＤ１Ａ」はＡＲＩＤ１Ａ遺伝子を示し、「ＩＬ１７ＲＡ」はＩＬ１７ＲＡ遺伝子を示し、「ＴＲＡＦ３ＩＰ２」はＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子を示し、「ＺＣ３Ｈ１２Ａ」はＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子を示す。
また、四角はｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が存在していたことを示し、四角の濃さは各遺伝子に存在していた異なる変異体の数に対応する。また、「ＶＡＦ」はＶａｒｉａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎを示し、各ドットは全リードに対する変異したアレルのリードの割合を示す。
その結果、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子及びＰＩＧＲ遺伝子にｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が頻繁に生じていることが確認された。また、４つのＵＣｉｎｆオルガノイドにおいて実験例２では検出されなかった、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が見出された。この結果は、ＵＣｉｎｆオルガノイドにおいてＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子にｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が蓄積することを更に支持するものである。
［実験例４］
（ＰＩＧＲタンパク質の免疫染色１）
実験例２及び３において、ＵＣｉｎｆオルガノイドにはＰＩＧＲ遺伝子のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が高い頻度で生じていることが明らかとなった。本実験例では、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こした領域の大腸上皮組織試料の薄切切片を免疫染色し、ＰＩＧＲタンパク質の発現を検討した。
（ＰＩＧＲタンパク質の免疫染色１）
実験例２及び３において、ＵＣｉｎｆオルガノイドにはＰＩＧＲ遺伝子のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異が高い頻度で生じていることが明らかとなった。本実験例では、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こした領域の大腸上皮組織試料の薄切切片を免疫染色し、ＰＩＧＲタンパク質の発現を検討した。
また、比較のために、健常者由来の大腸上皮組織試料の薄切切片を免疫染色し、ＰＩＧＲタンパク質の発現を検討した。また、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こしていない領域の大腸上皮組織試料についても同様の検討を行った。
また、場合により、分泌型ＩｇＡタンパク質、サイトケラチン２０（ＣＫ２０）タンパク質の免疫染色も行った。なお、ＣＫ２０は腺上皮細胞のマーカーであり、免疫染色の際に試料のタンパク抗原の保持を確認するために染色した。ＰＩＧＲタンパク質の染色には抗ＰＩＧＲ抗体（カタログ番号「ＨＰＡ０１２０１２」、シグマ－アルドリッチ社）を使用した。分泌型ＩｇＡタンパク質の染色には抗ＳＣ抗体（カタログ番号「ａｂ３９２４」、アブカム社）を使用した。ＣＫ２０タンパク質の染色には抗ＣＫ２０抗体（カタログ番号「Ｍ７０１９」、ダコ社）を使用した。
図４（ａ）～（ｃ）は潰瘍性大腸炎患者由来の大腸上皮組織試料の免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。図４（ａ）はＰＩＧＲタンパク質を検出した結果であり、図４（ｂ）は分泌型ＩｇＡタンパク質を検出した結果であり、図４（ｃ）はＣＫ２０タンパク質を検出した結果である。
図４（ａ）～（ｃ）中、上部は低倍率の顕微鏡写真を示し、下部は低倍率の顕微鏡写真における四角で囲んだ領域を拡大した高倍率の顕微鏡写真を示す。低倍率の顕微鏡写真のスケールバーは５００μｍであり、高倍率の顕微鏡写真のスケールバーは１００μｍである。
また、図４（ｄ）は健常者由来の大腸上皮組織試料の大腸上皮組織試料の免疫染色により、ＰＩＧＲタンパク質の発現を検出した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。図４（ｄ）中、上部は低倍率の顕微鏡写真を示し、下部は低倍率の顕微鏡写真における四角で囲んだ領域を拡大した高倍率の顕微鏡写真を示す。
その結果、図４（ａ）に示すように、健常者由来の大腸上皮組織試料、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こしていない領域の大腸上皮組織では、ＰＩＧＲタンパク質が遍在していたのに対し、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こした領域の大腸上皮組織では、ＰＩＧＲタンパク質の発現が消失した腸陰窩のクラスターが観察された。この結果は、ＰＩＧＲ遺伝子におけるｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異によるものであると考えられた。
更に、図４（ｂ）に示すように、ＰＩＧＲタンパク質の発現が消失した腸陰窩では、細胞質における分泌型ＩｇＡタンパク質の存在も消失していた。この結果は、潰瘍性大腸炎患者由来の炎症を起こした領域ではＰＩＧＲ遺伝子に機能欠失変異が生じたことを更に支持するものである。
［実験例５］
（ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の検討３）
実験例１で樹立した大腸炎関連腫瘍に由来するオルガノイド（以下、「ＣＡＮオルガノイド」という場合がある。）クローンの全エクソームシーケンシングにより、実験例２で検討したＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＰＩＧＲ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＴＰ５３遺伝子及びＡＲＩＤ１Ａ遺伝子に特異的な遺伝子変異が蓄積しているか否かを検討した。
（ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異の検討３）
実験例１で樹立した大腸炎関連腫瘍に由来するオルガノイド（以下、「ＣＡＮオルガノイド」という場合がある。）クローンの全エクソームシーケンシングにより、実験例２で検討したＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＰＩＧＲ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＴＰ５３遺伝子及びＡＲＩＤ１Ａ遺伝子に特異的な遺伝子変異が蓄積しているか否かを検討した。
図５は解析結果を示す図である。図５中、横軸は各オルガノイドクローンを示す。また、「ＣＡＮ」はＣＡＮオルガノイドであることを示す。また、「ＮＦＫＢＩＺ」はＮＦＫＢＩＺ遺伝子を示し、「ＰＩＧＲ」はＰＩＧＲ遺伝子を示し、「ＴＲＡＦ３ＩＰ２」はＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子を示し、「ＴＰ５３」はＴＰ５３遺伝子を示し、「ＡＲＩＤ１Ａ」はＡＲＩＤ１Ａ遺伝子を示す。
また、黒三角は片アレルにｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異を有していることを示し、白斜線の入った黒四角は両アレルにｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異を有していることを示し、灰色の三角は片アレルにミスセンス変異を有していることを示し、白斜線の入った灰色の四角は両アレルにミスセンス変異を有していることを示す。
その結果、ＣＡＮオルガノイドでは、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子及びＰＩＧＲ遺伝子のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異は稀であり、変異を有していてもヘテロ接合性であることが明らかとなった。この結果は、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子及びＰＩＧＲ遺伝子のｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ変異は、大腸炎に関連した発癌には直接的には寄与しないことを示唆するものである。
本発明によれば、大腸癌の発癌リスクを検出する技術を提供することができる。
Claims (3)
- 炎症性腸疾患患者の炎症領域が大腸癌を発癌するリスクを検出する方法であって、
前記患者由来の大腸の炎症領域の上皮組織試料における、インターロイキン（ＩＬ）－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する工程を含み、
前記機能欠失変異が存在することが、前記患者は大腸癌の発癌リスクが高いことを示し、
ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる前記遺伝子が、ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｚｅｔａ（ＮＦＫＢＩＺ）遺伝子、ＴＲＡＦ３ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＴＲＡＦ３ＩＰ２）遺伝子、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（ＩＬ１７ＲＡ）遺伝子、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ＣＣＣＨ－Ｔｙｐｅ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）遺伝子、Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ２（ＮＯＳ２）遺伝子から選択される少なくとも一つである、方法。 - ＩＬ－１７シグナル伝達に関わる遺伝子の機能欠失変異を検出する前記工程が、前記患者由来の大腸の炎症領域の上皮組織試料における、ＰＩＧＲタンパク質若しくはＰＩＧＲタンパク質の機能を反映する上皮細胞の細胞質における分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質の免疫染色により行われ、
前記免疫染色の結果、前記上皮組織試料中に、ＰＩＧＲタンパク質若しくはＰＩＧＲタンパク質の機能を反映する上皮細胞の細胞質における分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質又はＮＯＳ２タンパク質の発現が認められない細胞の存在が検出されることが、前記機能欠失変異が存在することを示す、請求項１に記載の方法。 - ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子の機能的欠失変異を検出するためのプローブ、
ＰＩＧＲ遺伝子、ＮＦＫＢＩＺ遺伝子、ＴＲＡＦ３ＩＰ２遺伝子、ＩＬ１７ＲＡ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子及びＮＯＳ２遺伝子からなる群より選択される１種又は２種以上の遺伝子を増幅するためのプライマー、又は、
ＰＩＧＲタンパク質又はＰＩＧＲタンパク質の機能を反映する上皮細胞の細胞質における分泌型ＩｇＡタンパク質、ＮＦＫＢＩＺタンパク質、ＴＲＡＦ３ＩＰ２タンパク質、ＩＬ１７ＲＡタンパク質、ＺＣ３Ｈ１２Ａタンパク質及びＮＯＳ２タンパク質からなる群より選択される１種又は２種以上のタンパク質に対する特異的結合物質、
を含む、炎症性腸疾患患者の炎症領域が大腸癌を発癌するリスクを検出するためのキット。
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