JP7414067B2 - 細胞足場材、細胞培養支持体、及び細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
近年拡大している再生医療では、iPS細胞等に代表される幹細胞を生体外で細胞培養して増殖し、動物又はヒト等の体内へ適用することが研究されている。細胞培養では、細胞を継代しながら細胞を増殖させていくが、細胞の分化が抑制されて細胞が増殖していくことが好ましい。一部の細胞が分化すると細胞増殖の進行が妨げられ、特に大量培養においては細胞増殖が抑制される場合がある。また、培養系に分化段階が異なる細胞が存在する場合、特定の分化段階の細胞を単離する必要が生じるが、純度高く細胞を単離することは技術的に困難を伴う。
これまで、幹細胞の培養において、ラミニン、フィブロネクチン等が細胞足場材として検討されているが、十分な性能が得られていない。
特開2018-068192号公報には、この化合物を細胞伸展・増殖調節剤として、培地に添加して用いることが提案されている。
細胞足場材には、基材と細胞との接着性を備えながら、細胞の増殖に悪影響を与えないことが求められる。さらに、細胞足場材を用いた細胞培養においては、分化を抑制しつつ細胞を増殖させることが望まれる場合がある。
[1]ポリ乳酸構造単位(A)と、ポリカーボネート構造単位(B)と、を有する共重合体を含む、細胞足場材。
[2]前記ポリカーボネート構造単位(B)は、置換基として、アルコキシアルキルオキシカルボニル基を有する単位を少なくとも1つ含む、[1]記載の細胞足場材。
[3]前記ポリカーボネート構造単位(B)は、置換基として、メトキシエチルオキシカルボニル基を有する単位を少なくとも1つ含む、[1]又は[2]に記載の細胞足場材。
(一般式(I)中、Xは水素原子又は炭素数5以下のアルキル基である。)
[5]前記一般式(I)中、Xはメチル基である、[4]に記載の細胞足場材。
[6]前記共重合体は、一方端又は両端部がポリ乳酸構造単位(A)であるブロック共重合体である、[1]から[5]のいずれかに記載の細胞足場材。
[7]前記共重合体は、AB型、ABA型、又はABAB型のブロック共重合体である、[6]に記載の細胞足場材。
[8]前記共重合体は、ABA型ブロック共重合体である、[7]に記載の細胞足場材。
[9]前記ポリ乳酸構造単位(A)は、ポリD-乳酸構造単位、又はポリL-乳酸構造単位である、[1]から[8]のいずれか記載の細胞足場材。
[11][1]から[9]のいずれかに記載の細胞足場材を用意すること、前記細胞足場材を培養系に配置すること、及び前記細胞足場材の存在下で、細胞を培養することを含む、細胞の培養方法。
[12]前記培養系が、無血清培地で構成される、[11]に記載の細胞の培養方法。
一実施形態によれば、細胞の分化を抑制して、細胞の増殖を促進することができる。
ポリ乳酸構造単位(A)としては、例えば、ポリD-乳酸構造単位、ポリL-乳酸構造単位、ポリDL-乳酸構造単位等が挙げられる。好ましくは、ポリ乳酸構造単位(A)は、ポリD-乳酸構造単位、又はポリL-乳酸構造単位であり、より好ましくはポリD-乳酸構造単位である。共重合体に2個以上のポリ乳酸構造単位(A)が含まれる場合は、共重合体の1分子中に含まれるポリ乳酸構造単位(A)は、全て同一であっても全て又は一部が異なってもよいが、全て同一であることが好ましい。
ポリカーボネート構造単位としては、主鎖にカーボネート結合を有する重合体の構造単位であって、脂肪族ポリカーボネート構造単位又は芳香族ポリカーボネート構造単位のいずれであってもよいが、脂肪族ポリカーボネート構造単位であることが好ましい。
脂肪族ポリカーボネート構造単位としては、例えば、ポリエチレンカーボネート構造単位、ポリプロピレンカーボネート構造単位、ポリトリメチレンカーボネート構造単位等、これらの共重合体の構造単位、又はこれらに側鎖を導入した誘導体の構造単位等が挙げられる。芳香族ポリカーボネート構造単位としては、例えば、ポリアリールカーボネート構造単位等、又はこれらの誘導体等が挙げられる。ポリアリールカーボネート構造単位としては、例えば、ポリフェニルカーボネート構造単位等が挙げられる。
共重合体に2個以上のポリカーボネート構造単位(B)が含まれる場合は、共重合体の1分子中に含まれる構造単位(B)は、全て同一であっても全て又は一部が異なってもよいが、全て同一であることが好ましい。
アルコキシアルキルオキシカルボニル基は、主鎖のカーボネート結合の炭素原子に直接結合して導入されることが好ましい。
また、アルコキシアルキルオキシカルボニル基において、アルコキシ基は、直鎖又は分岐であってもよく、炭素数5以下のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数3以下のアルコキシ基であり、さらに好ましくはエトキシ基又はメトキシ基であり、特に好ましくはメトキシ基である。
具体的には、アルコキシアルキルオキシカルボニル基は、メトキシエチルオキシカルボニル基、メトキシプロピルオキシカルボニル基、エトキシエチルオキシカルボニル基、エトキシプロピルオキシカルボニル基等が挙げられ、特にメトキシエチルオキシカルボニル基が好ましい。
ポリカーボネート構造単位において、一般式(II)で表されるカーボネート単位は少なくとも1個含まれてもよく、2個以上含まれてもよく、ポリカーボネート構造単位に含まれるカーボネート単位の全単位に対して80モル%以上含まれてよい。さらに、ポリカーボネート構造単位に含まれるカーボネート単位の全てが一般式(II)で表される単位であってよい。
また、ポリカーボネート構造単位に複数の一般式(II)で表される単位が含まれる場合では、複数の一般式(II)で表される単位は全てが互いに同一であっても異なってもよく、又は一部が異なってもよい。
Lは、主鎖とZとのリンカーであり、アルキレン基、エーテル結合、エステル結合、単結合、-C(=O)-、又はこれらの組み合わせを有する2価の基であってよく、なかでも、エーテル結合、エステル結合、単結合、-C(=O)-、又はこれらの組み合わせを有する2価の基が好ましく、エステル結合、又は-C(=O)-を有する2価の基がより好ましい。
鎖状エーテル基としては、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール等のアルキレングリコール又はその重合体の構造を有することが好ましい。
Zの具体例としては、下記一般式(III)において、Rがエチレン基又はプロピレン基であり、R’が水素原子又は炭素数5以下の直鎖又は分岐のアルキル基であり、nは1~30の整数である。
-(R-O)n-R’ (III)
一般式(III)において、Rは好ましくはエチレン基である。また、R’は好ましくはメチル基又はエチル基であり、より好ましくはメチル基である。また、nは好ましくは1~5であり、より好ましくは1又は2である。
より好ましくは、Zは、アルコキシアルキル基であり、例えば、メトキシエチル基、メトキシプロピル基、エトキシエチル基、エトキシプロピル基、プロピルオキシエチル基、プロピルオキシプロピル基等が挙げられ、なかでもメトキシエチル基が好ましい。
Xにおいて、炭素数5以下のアルキル基は直鎖又は分岐であってよい。また、Xは好ましくはメチル基又はエチル基であり、より好ましくはメチル基である。
ポリカーボネート構造単位において、一般式(I)で表されるカーボネート単位は少なくとも1個含まれてもよく、2個以上含まれてもよく、ポリカーボネート構造単位に含まれるカーボネート単位の全単位に対して80モル%以上含まれていることが好ましい。さらに、ポリカーボネート構造単位に含まれるカーボネート単位の全てが一般式(I)で表される単位であってよい。
また、ポリカーボネート構造単位に複数の一般式(I)で表される単位が含まれる場合では、複数の一般式(I)で表される単位は全てが互いに同一であっても異なってもよく、又は一部が異なってもよい。
ブロック共重合体のブロック構造において、一方端又は両端部がポリ乳酸構造単位(A)であることで、ポリ乳酸構造単位(A)は基材への接着性を備えるため、基材に細胞足場材をより安定して付着させることができる。
さらに、ABA型のように、両端部がポリ乳酸構造単位(A)であることで、ブロック共重合体の両端部においてポリ乳酸構造単位(A)が基材に接着し、中間部分のポリカーボネート構造単位(B)が基材から浮き上がるようにして、ブロック共重合体が基材に付着されると考えられる。この構成では、浮き上がったポリカーボネート構造単位(B)の部分で細胞を捕獲しながら、基材への細胞の接着性をより高めることができる。
一般式(V)において、a、b、c及びdは、上記した一般式(IV)と同じであるため、説明を省略する。
一実施形態による共重合体の1分子の分子量分布(Mw/Mn)は、特に限定されるものではないが、例えば、2.0以下、好ましくは1.5以下、より好ましくは1.2以下である。
また、ポリ乳酸構造単位(A)の分子量分布(Mw/Mn)は、特に限定されないが、1.0~10が好ましく、1.0~8がより好ましく、1.05~5がさらに好ましい。
また、ポリカーボネート構造単位(B)の分子量分布(Mw/Mn)は、特に限定されないが、1.0~10が好ましく、1.0~8がより好ましく、1.05~5がさらに好ましい。
また、数平均分子量(Mn)及び重量平均分子量(Mw)は、標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて測定することができる。また、分子量分布は、数平均分子量(Mn)に対する重量平均分子量(Mw)の比(Mw/Mn)から求めることができる。
一実施形態による共重合体において、共重合体全体を構成するモノマー単位の全単位に対し、ポリ乳酸構造単位(A)を構成するモノマー単位の全単位は、10モル%以上が好ましく、30モル%以上がより好ましく、40モル%以上がさらに好ましい。
また、別の一実施形態による共重合体において、共重合体全体を構成するモノマー単位の全単位に対し、ポリ乳酸構造単位(A)を構成するモノマー単位の全単位は、90モル%以下が好ましく、70モル%以下がより好ましく、60モル%以下がさらに好ましい。
共重合体全体を構成するモノマー単位の全単位に対し、ポリ乳酸構造単位(A)を構成するモノマー単位の全単位は、10~90モル%が好ましく、30~70モル%がより好ましく、40~60モル%がさらに好ましい。
また、別の一実施形態による共重合体において、共重合体全体を構成するモノマー単位の全単位に対し、ポリカーボネート構造単位(B)を構成するモノマー単位の全単位は、90モル%以下が好ましく、70モル%以下がより好ましく、60モル%以下がさらに好ましい。
共重合体全体を構成するモノマー単位の全単位に対し、ポリカーボネート構造単位(B)を構成するモノマー単位の全単位は、10~90モル%が好ましく、30~70モル%がより好ましく、40~60モル%がさらに好ましい。
一実施形態による共重合体において、共重合体全体を構成するモノマー単位の全単位に対し、ポリ乳酸構造単位(A)を構成するモノマー単位の全単位及びポリカーボネート構造単位(B)を構成するモノマー単位の全単位の合計単位は、80モル%以上が好ましく、90モル%以上が好ましい。さらには、一実施形態による共重合体は、ポリ乳酸構造単位(A)及びポリカーボネート構造単位(B)から構成されてもよい。
また、ポリカーボネートを用意し、ポリカーボネートの一方端又は両端にモノマーとして乳酸、乳酸ラクチド、又はこれらの組み合わせを重合させて結合させて合成することも可能である。
また、ポリ乳酸を用意し、ポリ乳酸の一方端又は両端にモノマーであるカーボネートを重合させて結合させて合成することも可能である。
また、乳酸とカーボネートとを用いて、ランダム重合してもよく、又は重合試薬を用いてブロック共重合することも可能である。
ポリ乳酸の数平均分子量は、ブロック共重合体に導入する構造単位(A)の目的とする分子量に応じて適宜設定することが好ましい。
ポリ乳酸を構成するモノマー成分である乳酸としては、D-乳酸、L-乳酸、DL-乳酸等を単独で、又はこれらを組み合わせて用いることができるが、D-乳酸又はL-乳酸を単一成分として用いることが好ましく、D-乳酸を単一成分として用いることがより好ましい。
モノマー成分である乳酸ラクチドとしては、D-乳酸ラクチド、L-乳酸ラクチド、DL-乳酸ラクチド等を単独で、又はこれらを組み合わせて用いることができるが、D-乳酸ラクチド又はL-乳酸ラクチドを単一成分として用いることが好ましく、D-乳酸ラクチドを単一成分として用いることがより好ましい。
モノマー成分として乳酸と乳酸ラクチドとを組み合わせて用いてもよいが、それぞれ単独で用いてもよい。
ポリカーボネートとしては、置換基としてアルコキシアルキルオキシカルボニル基を有するカーボネート単位を少なくとも1個含むポリカーボネート誘導体を好ましく用いることができ、さらには、この置換基はメトキシエチルオキシカルボニル基であることが好ましい。
また、ポリカーボネートとしては、一般式(II)で表されるカーボネート単位を少なくとも1個含むポリカーボネート誘導体を用いることが好ましい。さらには、一般式(I)で表されるカーボネート単位を少なくとも1個含むポリカーボネート誘導体を用いることが好ましい。一般式(II)で表されるカーボネート単位としては、置換基としてアルコキシアルキルオキシカルボニル基を有するカーボネート単位が好ましい。また、一般式(I)で表されるカーボネート単位としては、置換基としてメトキシエチルオキシカルボニル基を有するカーボネート単位が好ましい。
ポリカーボネートの数平均分子量は、ブロック共重合体に導入するポリカーボネート構造単位(B)の目的とする分子量に応じて適宜設定することが好ましい。
重合溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン(THF)、トルエン等が挙げられる。
重合触媒としては、例えば、1-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)-3-シクロヘキシル-2-チオウレア(TU)等の二官能基化チオウレア等が挙げられる。
重合反応の終了は、モノマー成分等が反応系に存在しているか否かで判断することができ、1H-NMR、TLC等の方法により確認することができる。重合反応が十分に進行したら、反応停止剤を加えることによって重合反応を終了させることができる。反応停止剤としては、例えば、酢酸、塩酸、硫酸、安息香酸等が挙げられる。
より具体的な例として、一般式(II)で表されるカーボネート単位を含むポリカーボネート誘導体の合成方法について説明する。
例えば、一般式(II)においてm=m’=1である単位を有するポリトリメチレンカーボネートの誘導体を重合するためには、トリメチレンカーボネートの炭素原子に、Mで表される基及びYで表される基を導入したトリメチレンカーボネート誘導体をモノマーとして用いることができる。M及びYは、上記一般式(II)において説明した通りである。
より詳細には、特開2014-161675号公報に記載の方法にしたがって合成することができる。
また、一実施形態による細胞足場材は、溶媒に添加された状態で細胞足場材組成物として提供されてもよい。溶媒としては、水、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。水としては、溶媒として使用する水に加えて、一実施形態による共重合体の中間水であってもよい。有機溶媒としては、ジクロロメタン、メタノール等が挙げられる。細胞足場材組成物は、必要に応じて、後述する培地用添加剤、その他の添加成分等をさらに含むことができる。
一実施形態による細胞培養支持体は、細胞の分化を抑制し且つ増殖を促す作用を奏することができるため、特定の分化段階の細胞を培養により増殖させることに好適に用いることができる。
具体的には、基材として、細胞培養基材として使用されているものを特に制限することなく用いることができ、例えば、ディッシュ、平底ウェルプレート、丸底ウェルプレート等のウェルプレート;シャーレ等の細胞容器;マイクロビーズ、マイクロキャリア、三次元ブロック体;細胞シート等を用いることができる。
例えば、細胞足場材を有機溶媒に溶解した後、液体組成物の状態で基材に付与することができる。
溶媒としては、ジクロロメタン、メタノール等を用いることができる。また、液体組成物は、細胞足場材に加えて、後述する培地用添加剤、その他の添加成分等をさらに含むことができる。液体組成物全量に対して細胞足場材は0.05~10質量%が好ましく、0.1~1質量%がより好ましい。
基材への細胞足場材の付与量としては、基材の種類、細胞足場材の種類、培養対象となる細胞の種類、付与の方法等によって適宜調整が可能である。基材への細胞足場材の付与量は、単位面積当たりの固形分量で、例えば0.05μg/mm2~500μg/mm2とすることができる。スピンコーターを用いた付与方法を用いる場合には、単位面積当たりの固形分量で、例えば、0.01μg/mm2~10μg/mm2とすることができ、0.05μg/mm2~5μg/mm2とすることができ、又は0.1μg/mm2~3.0μg/mm2とすることができる。
一実施形態による細胞の培養方法は、細胞足場材を用意すること、細胞足場材を培養系に配置すること、及び細胞足場材の存在下で、細胞を培養することを含むことができる。
ここで、細胞足場材には、上記した一実施形態による細胞足場材を用いることができる。これによって、細胞の分化を抑制し、細胞の増殖を促進し、未分化の細胞を大量に生産することができる。
培養対象となり得る細胞として、例えば、初代培養細胞、培養細胞株、組換培養細胞株等を用いることができる。細胞の由来については、特に限定されず、例えば、ヒト、チンパンジー、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター等の哺乳類;ニワトリ等の鳥類等が挙げられる。また、種の異なる2つ以上の細胞をハイブリッドさせた細胞を用いてもよい。
細胞が由来する器官、組織としては、特に限定されず、例えば、血球・リンパ系、血管系、脳・神経系、骨髄、筋組織、胸腺、唾液腺、口腔、食道、胃、肝臓、胆嚢、脾臓、小腸、大腸、直腸、皮膚、角膜、肺、甲状腺、哺乳器、子宮、子宮頸部、卵巣、精巣、膵臓、腎臓、副腎皮質、膀胱、胎盤、臍帯、胎仔、胎子、尾、間葉系幹細胞、癌細胞等が挙げられる。
細胞培養に用いる培地としては、細胞が生存し、増殖可能であるものであれば特に限定されず、培養する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
培地としては、血清培地又は無血清培地のいずれであってもよいが、一実施形態による細胞足場材は無血清培地での培養に好ましく用いることができる。
無血清培地としては、例えば、イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地(低グルコース又は高グルコース)、イーグルMEM培地、αMEM培地、IMDM培地、ハムF10培地、ハムF12培地、RPMI1640培地等、又はこれらのブレンド培地が挙げられる。
血清培地は、無血清培地に血清を添加して調製することができる。無血清培地に血清を添加する場合は、例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、ウマ血清、ヒト血清等の血清等を用いることができる。血清を添加する場合は、血清の濃度は30%以下が好ましい。
また、一実施形態によれば、細胞足場材の製造のための、ポリ乳酸構造単位(A)と、ポリカーボネート構造単位(B)とを有する共重合体の使用を提供することができる。
ここで、ポリ乳酸構造単位(A)と、ポリカーボネート構造単位(B)とを有する共重合体については、上述した一実施形態による細胞足場材における共重合体に関して記述した事項をそのまま援用する。例えば、本共重合体中、ポリカーボネート構造単位(B)は、置換基として、アルコキシアルキルオキシカルボニル基を有する単位を少なくとも1つ含んでいてもよく、また、ポリカーボネート構造単位(B)は、上述した一般式(I)で表される単位を少なくとも1つ含んでいてもよい。また、本共重合体中、ポリ乳酸構造単位(A)は、ポリD-乳酸構造単位、又はポリL-乳酸構造単位であってもよい。さらに、本共重合体は、ABA型ブロック共重合体であってもよい。これらの任意の組み合わせであってもよい。一例では、本共重合体中、ポリカーボネート構造体(B)は、置換基として、アルコキシアルキルオキシカルボニル基を有する単位を少なくとも1つ含むか、又は上述した一般式(I)で表される単位を少なくとも1つを含み、ポリ乳酸構造単位(A)は、ポリD-乳酸構造単位、又はポリL-乳酸構造単位である。この一例の共重合体は、ABAがブロック共重合体であってもよい。
実施例において得られた生成物の分子量、構造の確認、重合の進行度は、以下の手順によって評価した。
(1)分子量
数平均分子量(Mn)及び重量平均分子量(Mw)は、Chromaster GPC分析システム(株式会社日立ハイテクサイエンス製)にGPCカラム(株式会社日立化成テクノサービス製「Gelpack GL-R420,R430,R440」)を接続して、THFを溶出液として1.75mL/minで溶出し測定した。
分子量分布は、上記(1)の方法で求めた重量平均分子量(Mw)と数平均分子量(Mn)の値を用い、その比(Mw/Mn)として求めた。
モノマー及びポリマーの構造解析については、NMR測定装置(日本電子株式会社製、JEOL 500MHz JNM-ECX)を用い、1H-NMR測定を行った。なお、ケミカルシフトはCDCl3(1H:7.26ppm)を基準とした。
2,2-ビス(メチロール)プロピオン酸(bis-MPA:98%)、2-メトキシエタノール(99.8%)、Amberlyst-15(登録商標)(dry,moisture≦1.5%)はシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入し、そのまま使用した。酢酸エチル(99.5%)、ジクロロメタン(DCM:99.5%)、ピリジン(99.5%)、塩化アンモニウム(98.5%)、炭酸水素ナトリウム(99.5~100.3%)、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU:99.0%)、安息香酸(99.5%)、ジエチルエーテル(99.0%)、ヘキサン(95.0%)、トリメチレンカーボネート(TMC:98.0%)、メタノール(99.8%)、テトラヒドロフラン(THF:99.5%)、(+)-sparteine(Sp)、2-プロパノール(99.7%)は関東化学株式会社より購入した。脱水グレードのTHF、DCMは関東化学株式会社製ソルベントサプライシステムから供給した(水分量<10ppm)。塩酸(35.0~37.0質量%)、硫酸マグネシウム(95.0%)は富士フイルム和光純薬株式会社より、トリホスゲン(98%)、ベンジルアルコール、2-メトキシエチルアクリレート(>98.0%)、1,4-ジオキサン(>99.0%)、2,2-アゾビス(イソブチロニトリル)(AIBN>98.0%)は東京化成工業株式会社より購入し、そのまま使用した。1-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)-3-シクロヘキシル-2-チオウレア(TU)は既報の手法を参考に合成した。モノマー類、TUはTHFに溶解させCaH2(水素化カルシウム)にて乾燥させた。DBUはCaH2を用いて減圧蒸留したものを使用した。
D-乳酸ラクチド(D-lactide)は、Purac社より購入した。
Lipidure(登録商標)-CM5206(以下、PMBとも記す)は、日油株式会社より購入した。
TU(5.8mg,1.49mmol)及びD-lactide(77.1mg,0.535mmol)をDCM(240mg)中に溶解させ、室温で撹拌した。2時間の反応後、反応溶液を2-プロパノール(30mL)中に再沈殿し、真空下で乾燥させて白色の固体PDLAを得た。
ベンジルアルコール(4.32mg,0.04mmol)、トリメチレンカーボネート(2.01g,20mmol)、DBU(182.4mg,1.4mmol)及びTU(447.1mg,1.4mmol)をDCM(20mL)に溶解させ、撹拌した。24時間後、安息香酸を加えて反応を停止し、反応溶液を2-プロパノール中に再沈殿後、上澄み液を遠心分離した。得られた粘性体をDCMに溶解させて回収し、エバポレーターで濃縮後、乾燥させ、PTMCを得た。
15gの2-メトキシエチルアクリレート(130.14g/mol,115mmmol)、60gの1,4-ジオキサンに溶解し、30分間窒素バブリングを行った。その後、開始剤である15mgのAIBN(0.091mmol)を少量の1,4-ジオキサンに溶解して加え、窒素バブリングしながら75℃で6時間重合を行った。その後、重合溶媒をn-ヘキサン1000mlに滴下することで重合で生成したポリマーを沈殿物として回収した。得られた粗生成物を、THF/n-ヘキサン系で沈殿操作を3回繰り返し、精製した。精製後のポリマーはTHFに溶解させて回収し、エバポレーターで濃縮後、60℃で30時間、真空乾燥させ、PMEAを得た。
ポリマーとして、合成例1で得られたPDMED、合成例1の中間体であるPMEMTC、合成例2で得られたPDLA、合成例3で得られたPTMC、合成例4で得られたPMEA、PMB(日油株式会社製「LIPIDURE(登録商標)-CM5206」)を用いて、以下の評価を行った。
直径15mmで円形に打ち抜いた厚み125μmのPETフィルム(三菱ケミカル株式会社製「Diafoil、T100E125 E07」)を、メタノールに一晩浸漬し脱脂処理を行った。その後、各ポリマーをDCMもしくはメタノールに溶解し、0.2質量%の濃度に調整した。この溶液を上記処理済みのPETフィルムに100μLを2度スピンコーターで塗布して、室温にて一日静置した後に一晩純水に浸漬して洗浄した。これを乾燥した後、ポリマー塗布PETフィルム(以下、支持体)をクリーンベンチ内で、スポットUV照射装置(ウシオ電機株式会社製「SP-11」)にて4W/cm2の出力で10分間照射して滅菌した。また、対照として、脱脂処理をした後に、ポリマーを塗布しない未処理の支持体(PET支持体)を用意した。
直径15mmで円形に打ち抜いた厚み125μmのPETフィルム(三菱ケミカル株式会社製「Diafoil、T100E125 E07」)を、メタノールに一晩浸漬し脱脂処理を行った。基板の裏面に0.1質量%のBSA(ウシ血清アルブミン)を1質量%TritonX-100含有のリン酸バッファー液(PBS pH7.4)に溶解し、100μLを2度スピンコーターで塗布して、室温にて一日静置した後に一晩純水に浸漬して洗浄、これを乾燥することでPETへの非特異吸着を防止した。その後、各ポリマーをDCMもしくはメタノールに溶解し、0.2質量%の濃度に調整した。この溶液を上記処理済みのPETフィルムの表面に100μLを2度スピンコーターで塗布して、室温にて一日静置した後に一晩純水に浸漬して洗浄した。
得られた支持体を細胞培養向け24穴プレート(コーニング社製「Coster 24 wells」)に沈め、蛍光標識BSA(FITC標識)を0.1w/v%でPBSに溶解し、500μL/wellを添加して、37℃、60minで搖動した(傾斜角:6°,30r/min)。対照として、ポリマーを塗布しない未処理の支持体(PET支持体)を用いて、同様に処理した。
搖動後、PBSで洗浄し、蛍光顕微鏡(株式会社キーエンス製「BZ-X」)にて、吸着の状態を観察し、吸着量を蛍光強度から評価した。その結果を図1に示す。図1は、PET支持体の蛍光強度を基準として、各ポリマーを塗布した支持体を用いた場合の蛍光標識BSAの蛍光強度を相対的に示すグラフである。
(3-1)ヒト正常線維芽細胞
上記(1)細胞足場材の調製で調製したPDMED支持体、PMB支持体、PET支持体を、24穴組織培養用プレートの各ウェルの底面にセットした。また、支持体をセットしないウェルを用意した。各ウェルに、5×103cells/cm2の播種密度でヒト皮膚正常線維芽細胞(NHDF)を播種した。各ウェルにEagle MEM培地に10%ウシ胎仔血清(FBS)を添加して調製した培地を添加した。
このプレートを37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。細胞培養開始から1時間後、1日後、2日後、3日後、7日後にそれぞれ細胞の状況を観察するとともに、培養上清を1000μL取り出し、7000rpmで1分間遠心分離し、その上澄みを500μL取り出し、FGF-2(線維芽細胞成長因子2)の定量評価に供試した。
蛍光差顕微鏡(オリンパス株式会社製「MVX10」)を用いて、細胞増殖の状態を観察するとともに、細胞数を計測した。図2は、蛍光差顕微鏡によって観察した写真であり、細胞開始から(a)1時間後、(b)1日後、(c)2日後、(d)3日後、(e)7日後である。図3に、細胞培養時間に対する細胞数のグラフを示す。
(ii)細胞分化抑制の評価方法
各細胞培養時間に採取した培養上清をヒトFGF-2測定ELISAキット(R&D system社製)にて測定した。図4に、細胞培養時間に対するFGF-2の濃度のグラフを示す。
細胞の増殖の観察からも、PDMEDは、ヒト線維芽細胞としての機能である塊状増殖をすることなく、増殖のみが優先して起こっていることが示唆された。これはFGF-2の安定した放出からも明らかである。
上記(1)細胞足場材の調製と同様の方法で、支持体の直径を50mmとし、PDMED支持体、PMB支持体、対照としての未処理のPET支持体、対照としてのラミニン(株式会社ニッピ製「iMatrix511」)支持体を用意した。各支持体を60mmディッシュ(IWAKI社製「3010-060」)の底面にセットした。京都大学由来フィーダーフリーiPS細胞を各ディッシュ(それぞれ、「PDMEDディッシュ」、「PMBディッシュ」、「PETディッシュ」、「iMatrixディッシュ」という)に、2.5×104cells/ディッシュの量で播種した。
表1に、培養7日目の未分化細胞率と、培養5日目のIL-6及びTNFαの濃度を示す。
未分化細胞率(%)が100(%)に近いほど、細胞の分化が抑制されていることを意味する。また、IL-6の濃度が0に近いほど、細胞の分化が抑制されていることを意味する。さらに、TNFαの濃度が0に近いほど、細胞の分化が抑制されていることを意味する。
また、PMBディッシュ及びPETディッシュでは、培養7日目での未分化細胞率がPDMEDディッシュよりも低く、また、培養5日目でのIL-6の放出も認められた。なお、PMBディッシュについては、培養2日目で約2pg/mLのTNFαの放出が確認された(データ示さず)。このことから、PMBディッシュ及びPETディッシュでも、細胞の分化が十分に抑制されていないことが示された。
これらに対して、PDMEDディッシュでは、培養7日目での未分化細胞率が高く、また培養初日から5日目までの間で各サイトカインの放出が認められなかった。このことからも、PDMEDを細胞足場材として使用した場合、細胞の分化を抑制しながら、増殖に寄与できることがわかった。
Claims (5)
- 前記共重合体の標準ポリスチレンで校正したゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて測定する数平均分子量(Mn)は、5,000~18,000である、請求項1に記載の組成物。
- (a)請求項1若しくは2に記載の組成物、又は(b)請求項1若しくは2に記載の組成物と当該組成物を表面上に有する基材とを含む細胞培養支持体、を用意すること、
前記(a)組成物又は(b)細胞培養支持体を培養系に配置すること、及び、
前記(a)組成物又は(b)細胞培養支持体の存在下で、人工多能性幹細胞を培養すること
を含む、人工多能性幹細胞の培養方法。 - 前記(b)細胞培養支持体を用意することを含み、前記基材は、ディッシュ、ウェルプレート、細胞容器、マイクロビーズ、マイクロキャリア、三次元ブロック体、又は細胞シートである、請求項3に記載の細胞の培養方法。
- 前記培養系が、無血清培地で構成される、請求項3又は4に記載の細胞の培養方法。
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