JP7377805B2 - 確実で自動の質量スペクトル分析 - Google Patents
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Description
米国特許第6,983,213号、第7,493,225号、および第7,577,538号;2004年4月28日出願の国際特許出願PCT/US2004/013096;米国特許第7,348,553号;2005年10月28日出願の国際特許出願PCT/US2005/039186;米国特許第8,010,306号、2006年4月11日出願の国際特許出願PCT/US2006/013723;米国特許第7,781,729号、2007年5月28日出願の国際特許出願PCT/US2007/069832;ならびに2007年6月2日出願の米国特許仮出願第60/941,656号、およびWO2008/151153として公開された国際特許出願PCT/US2008/065568。
a.最も一般的に使用される単位質量分解能のMSシステムでは質量精度が不足している。重心計算プロセスでは、質量誤差±1Daの整数m/zまたは少なくとも±0.1Daの他のm/z値の質量値が報告されているのに対して、米国特許第6,983,213号に開示されている方法を使用して適切に較正された生のプロファイルモードMSデータ(重心計算なし)は、±0.005Daまで正確とすることができ、これは約100倍の改善である。
b.ピーク積分誤差が大きい。MSピーク形状較正を含む完全な質量スペクトル較正を伴わない重心計算は、質量スペクトルピーク形状の不確実性、その変動性、同位体ピーク、ベースラインおよび他の背景信号、ランダム雑音を伴い、強いまたは弱い質量スペクトルピークに対して系統誤差とランダム誤差の両方を招く。
c.同位体存在比誤差が大きい。単位質量分解能を有する従来のMSシステムにおいて密接して位置する様々な同位体(たとえば、AおよびA+1)からの寄与を分離すると、隣接する同位体ピークからの寄与を無視し、または過大評価し、その結果、支配的な同位体ピークに対する誤差および弱い同位体ピークに対する大きいバイアスが生じ、またはさらにより弱い同位体が完全に排除される。
d.演算が非線形である。重心計算は典型的に、各段に多くの経験的に調整可能なパラメータを有する多段分離プロセス(multi-stage disjointed process)を使用する。各段で系統誤差(バイアス)が生成され、制御されない予測不能な非線形的な形で後の段へ伝播され、アルゴリズムがデータ処理品質および信頼性の尺度として意味のある統計を報告することが不可能になる。
e.支配的な系統誤差が生じる。産業用プロセス制御および環境監視からタンパク質同定またはバイオマーカ発見に及ぶMS用途のほとんどにおいて、計器の感度または検出限度は常に注目されており、測定誤差または信号内の雑音寄与を最小にするために、多くの計器システムにおいて大きな労力が費やされてきた。残念ながら、現在使用されている典型的な重心計算プロセスは、生データのランダム雑音よりさらに大きい系統誤差の発生源となっており、したがって計器感度の制約要因となっている。
f.数学的および統計的な矛盾を招く。重心計算で現在使用されている多くの経験的手法では、処理全体が数学的または統計的に矛盾している。ピーク処理の結果は、ランダム雑音のないわずかに異なるデータまたはわずかに異なる雑音のある同じ合成データに対して、劇的に変化する可能性がある。言い換えれば、ピーク重心計算の結果は頑強性を欠き、特定の実験またはデータ獲得に応じて不安定になる可能性がある。
g.計器ごとまたは調整ごとの変動性がある。通常、異なるMS計器からの生の質量スペクトルデータを直接比較することは、機械的、電磁的、または環境的公差の変動のために困難である。実際の生のプロファイルモードMSデータに典型的な重心計算が適用された場合、重心計算プロセスおよび重心データの量子化特性のため、異なるMS計器からの結果を定量的に比較する困難さが増すだけでなく、MSデータが重心データに減らされた後、変動性の発生源または潜在的な原因を追跡することが、不可能でない場合でも困難になる。
1.関連する分離時間窓(separation time window)内で獲得された対応するプロファイルモード質量スペクトルデータの主成分分析(PCA)などの多変量統計分析(multivariate statistical analysis)によって、クロマトグラフピーク内に含まれる独立した検体を判定するための正確な手法が得られる。現在使用されている重心データではなく、プロファイルモード質量スペクトルデータを使用することが重要である。
2.1組のクロマトグラフ標準を使用することによって、関係する基本的なクロマトグラフピーク形状関数を完全にモデル化するための正確な手法が得られる。米国特許第6,983,213号および第7,493,225号を参照されたい。
3.クロマトグラフピーク形状が完全に画成された場合、たとえば反復改善および多重線形回帰(MLR)を介した初期ピーク位置のシンプレックス最適化(Simplex optimization)によって、関係する独立した検体のピーク(たとえば、中心)位置のみを判定して、クロマトグラフピーク内に隠された相互に重複する成分を完全に画成および分解する必要がある。
4.各クロマトグラフピークが明確に画成された場合、定性的同定(たとえば、NISTライブラリ検索による)または多重線形回帰による定量的分析のために、各検体に対する純粋質量スペクトルの算出が実行可能である。米国特許第7,577,538号を参照されたい。
5.ライブラリ(たとえば、NISTライブラリ)内の既知の化合物の同定信頼度の増大、またはライブラリ内に含まれていない未知のもしくは新しい化合物の解明の支援のために、正確な質量およびスペクトル精度分析を適用して、分子イオンまたはそのフラグメントイオンを確証する。
6.化合物ライブラリ(たとえば、NISTライブラリ)内にすでに含まれている化合物に利用可能な保持指標を使用することによって、追加の同定信頼度を得ることもできる。
7.試料または製品タイプの分析の目的で、試料を区別するために、所与の分離時間窓で獲得された複数の質量スペクトル走査を組み合わせて、類似のまたは異なる試料を比較する手法が得られる。
a.図2に示すTICから、すべてのクロマトグラフピークを検出する。これは、知られている純粋クロマトグラフピーク形状関数によって分離時間範囲全体にわたって最善に実現することができ、分離時間範囲は、必要とされる保持時間範囲に及ぶように異なる炭素数を有するアルカンなどの1組の知られている標準を使用して、同じクロマトグラフ分離条件下で測定することができる。また、米国特許第6,983,213号で質量スペクトルピーク形状較正が実行される方法と同様に、クロマトグラフピーク形状較正を実行して、実際のピーク形状を標的ピーク形状に変換することもでき、この方法は、2006年4月10日出願の米国特許出願第11/402,238号にさらに開示されている。実際の測定または較正によってクロマトグラフピーク形状が明確に画成された後、米国特許第6,983,213号からのピーク検出および分析方法を利用して、図2Bに示すようにクロマトグラム内のすべてのクロマトグラフピークを検出することができ、そのピーク検出結果が、図3に示されている。
b.図3Bは、検出されたピークの統計的有意性に対する統計的標示であるピーク検出からのt-値を示し、ここでは典型的に、2.0のt-値は約95%の信頼度に対応し、3.0のt-値は99%の信頼度に対応する。検出されたピークのいくつかは純粋であり、したがってライブラリ検索(同定)または定量的分析の準備ができているが、いくつかは純粋ではなく、いずれにも好適でないはずである。これらのクロマトグラフピークを同定して、その純度を評価し、不純物または共溶出検体が存在する相互干渉を理論上分離することが重要である。純度検出ならびに不純物または共溶出の場合の確実な逆畳み込みを実現するためには、クロマトグラフピークまたは分離時間窓内に含まれる独立した検体を判定するための確実な手法を有することが必須である。これは、分離時間窓に対応して、獲得したプロファイルモード質量スペクトル走査データ(生またはPFTBA較正済み)上で多変量統計分析を実行することによって実現される。多変量統計分析は、特異値分解またはNIPALSアルゴリズムに基づいて、主成分分析(PCA)または部分最小二乗など、当技術分野で知られている十分に確立された様々なアルゴリズムを使用することで実現することができる(S.Wold、P.Geladi、K.Esbensen、J.Ohman、J.Chemometrics、1987、1(1)、41)。図3Cは、検出された有意の各クロマトグラフピークに対して判定された独立した成分(検体)の数を示す。
c.成分の正しい数が判定された後、次の工程は、後のより正確な化合物同定のために、獲得された生の形式で、または好ましくはPFTBA較正済み形式で、同じプロファイルモード質量スペクトルデータを使用して、混合物からのこれらの成分(重複成分)の所与の数を逆畳み込みすることである(MS較正フィルタを適用した影響により信号対雑音がより良好になるという利点に加えて)。
d.クロマトグラフピーク形状が完全に画成された場合、たとえばシンプレックス最適化によって、関係する独立した検体または成分のピーク(たとえば、中心)位置のみを判定して、クロマトグラフピーク内に隠された重複成分を完全に画成および分解する必要がある。図4Aに示すRt約2.66分で検出された3成分混合物の場合、シンプレックス検索によって、1組の初期値から開始して、3つの基本的な重複するクロマトグラフピークを判定することができ、1組の初期値は、米国特許第6,983,213号に開示されており、米国特許出願第11/402,238号にさらに開示されている方法を使用して、目的関数として多重線形回帰(MLR)からの適合残差によって反復して精製され、その結果が、平坦なベースラインも含む図4Aに示されている。平坦なベースライン以外の他のタイプのベースラインを含むこともできる。図4Bは、図4Aに示すように判定されたそれぞれの分離時間プロファイルを有するこれらの成分/検体を使用して、実際のTICに対する優れた適合を示す。
e.混合物質量スペクトルデータを各検体に対する各純粋質量スペクトルに逆畳み込みする。図4Aからの逆畳み込みされた純粋クロマトグラムによって、米国特許第7,577,538号および第6,983,213号に参照されている方法論を使用して、多重線形回帰(MLR)によって、図5A、図5B、および図5Cに示すように、各個別検体に対する対応する純粋質量スペクトルを算出することが可能である。
f.次いで、逆畳み込みされた純粋質量スペクトルは、スペクトル強度を使用することによって、または一連の濃度標準による較正によって、定性的同定(たとえば、NISTライブラリ検索)または定量的分析に使用される。同様に、イオン移動度またはプラズマグラムを使用した爆発物検出などの関心化合物の定性的分析および同定のために、異なる爆発物化合物が異なる特有のドリフト時間を有することに基づいて、逆畳み込みされた分離時間プロファイルを使用することができる。分離時間プロファイルはまた、プロファイル強度を使用することによって、または一連の濃度標準によって、定量的分析に使用することもできる。GC/MSまたはLC/MSの場合、逆畳み込みされた時間プロファイルおよび純粋質量スペクトルの両方を正規化し、後の定量的分析のために倍率の形式で定量的な情報を残すことができる。
g.試料実行(図2A)中にPFTBA調整ガスが調整される好ましい実施形態では、正確な質量およびスペクトル精度分析を適用して、EI MSからの分子イオンおよびフラグメントイオンの両方を分析するという追加の利点がある。GC/MSは、標的の化合物および未知の化合物(化合物ID)の両方の同定のための強力なツールである。この技法の基本は、電子衝撃(EI)を介して溶出分子がイオン化されたとき、比較的活動的なソースが、分子構造を示す特徴的なパターンを提供するように、分子をフラグメント化することに依拠する。分子のパターン、フラグメント、および相対存在比が、公称質量分解能で獲得された測定スペクトルのライブラリに対して検索され、単純なマッチングアルゴリズムに基づいて分類される。この技法は、1)化合物が純粋であること(背景または共溶出なし)、および2)化合物がライブラリ内にあることを条件として、非常によく機能する。加えて、検索結果は、常に完全に決定的であるとは限らず、分子の同一性を確証するために、追加の直交測定を有することが有用である。CLIPS(Calibrated Line-shape Isotope Profile Search)検索(2005年10月28日出願の国際特許出願PCT/US2005/039186を参照されたい)は、正確な質量およびスペクトル精度を組み合わせて、または利用可能な場合、分子イオン(フラグメント化されていない分子)の追加の情報(式ID)を提供することによって、これらの頑強な低分解能MS計器を、ライブラリ検索結果の認証を支援するための強力なツールに変換する。化合物同定(ID)(分子構造の判定)と式ID(分子式の判定)とを区別することが重要である。通常の手法は、分子イオンを選択し、CLIPS検索を実行して、認証のためにNIST検索と比較することができる式IDを提供することであり、または本当の未知試料がライブラリ内にない場合、式IDを提供して、化合物が何であるかについて最初の洞察を提供することである。しかし、分子イオンならびにすべてのフラグメント上で式IDを行うことも可能である。これは、構造の「推量」を行うのに非常に強力であり、現在は、公称質量値のみを使用して少数の「専門家」(IRスペクトル解釈の専門家のように廃れつつある)によって行われている。これは、一般に生成されるいくつかのフラグメントが、質量差を測定することによって分子イオンから簡単に推定することができることから行うことができる。しかし、これが最善の技術であり、相当な技能を必要とする。イオンフラグメント式IDのすべてを自動的かつ正確に判定し、おそらくいくつかの可能な化合物IDをさらに提案することが可能であることが、非常に望ましく、有用である。これは、すべてのイオンフラグメント上で一連のCLIPS検索を使用し、次いで結果を相互比較することによって行うことができる。どのイオンフラグメントも、分子イオンの部分集合であるはずであり、したがってすべてのフラグメントが関係付けられているはずであり、したがって自動スペクトル解釈を利用するには強力な制約がある。この情報を生成することができる1つの可能な一連の工程について、以下に述べる。
i.クロマトグラフピーク上で、平均的な較正済みプロファイルスペクトルを測定する。
ii.ピーク検出によって、すべてのモノアイソトピックピークを特定する。
iii.報告された正確な質量によって、各イオンフラグメント上でCLIPS検索を実行する。
iv.2005年10月28日出願の国際特許出願PCT/US2005/039186に開示されているように、スペクトル精度(以下、「SA」)を使用して、CLIPS検索ヒットリストを相互比較する。
v.フラグメントのSAが90%を上回り、分子イオンの部分集合である場合、フラグメントの正しい式が同定されている。
vi.フラグメントのSAが90%を上回るが、分子イオンの部分集合ではない場合、これは異なる化合物(混合物)に由来する可能性があり、次の化合物候補のために上記のヒットリストを検索し、そのフラグメントを検査することができる。
vii.フラグメントのSAが90%を下回る場合、フラグメントはスペクトル的に純粋ではなく、したがって異なる化合物のフラグメントイオンからの干渉を受ける可能性が高い。これが当てはまる場合、他のフラグメントを調査し、第2の化合物に関係するかどうかを判定する。最後に、1組またはそれ以上の組のフラグメント化が判定される。MSの「専門家」とは異なり、SAはフラグメントの式IDを正確に確証する。混合物が発見された場合、論理フラグメントが提案され、関連するフラグメントを結びつけるためのCLIPS検索が実行され、SAが90%を上回るとき、正しい答えを提供する。不純フラグメントに伴う1つの一般的な問題は、フラグメントを有するがフラグメント-Hを有する傾向があり、これらのイオンが重複することである。これは、分析のために複数のイオンを含むように拡張することができるCLIPS検索で容易に処理される。
viii.フラグメント式IDおよび混合物逆畳み込みを自動的に提供することが非常に有用である。しかし、数百万の化合物を有し、式IDおよびいくつかのフラグメント化規則を使用する化学化合物の商用データベース(たとえば、ChemSpiderという市販のデータベース)を使用して、最初から構造を実際に提案することが可能である。
ix.分子イオンが存在しない場合(珍しいことではない)、この手順を逆に利用することができる。たとえば、一般的なフラグメントのリストが利用可能であり、構造的な手掛かりになる。簡単な事例(利用可能な純粋分子イオン)から開始し、次いで複雑さを増して、各事例に対する最善の手法を見出すことができる。異なるクロマトグラフ分解能で実行される多くの知られている化合物によって、分解されていない混合物を制御された形で生成および調査することができる。
Claims (27)
- 経時的な分離と質量分析計による検出とを組み合わせた関心化合物の分析方法であって、
a.生プロファイルモードの質量スペクトルデータを獲得する工程と;
b.生プロファイルモード質量スペクトルデータを、スペクトル精度に対する既知の1組の標準イオンによって較正する工程と;
c.可能な関心化合物の存在に対して関連する時間窓を選択する工程と;
d.関連する時間窓内で質量スペクトル生プロファイルモードデータの多変量統計分析を実行して、存在する化合物の数を判定する工程と;
e.関連する時間窓内で検出された関心化合物およびそれぞれの時間位置に対する分離時間プロファイルを取得する工程と;
f.それぞれの分離時間プロファイルまたは時間位置に対応するすべての関心化合物に対する純粋質量スペクトルを算出する工程と;
g.スペクトルライブラリを検索し、そして化合物同定のための少なくとも1つのライブラリマッチスコアとスペクトル精度を用いる工程と;
を含む、前記方法。 - 分離のための技法は、ガスクロマトグラフィ(GC/MS)、液体クロマトグラフィ(LC/MS)、超臨界流体クロマトグラフィ、イオンクロマトグラフィ(IC/MS)、キャピラリ電気泳動(CE/MS)、ゲル電気泳動、イオン移動度、および熱分解のうちの1つである、請求項1に記載の方法。
- 質量分析計は、セクタ質量分析計、四重極質量分析計、飛行時間(TOF)質量分析計、オービトラップ質量分析計、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT ICR)質量分析計のうちの1つである、請求項1に記載の方法。
- 関心化合物に対する時間プロファイルは、測定された実際の時間プロファイルである、請求項1に記載の方法。
- 可能な関心化合物の存在の検出は、検出されたピークまたは化合物に対する可能性または信頼度を示すt-統計量を有する実際または標的の時間プロファイルのうちの1つを使用した回帰を含む、請求項1に記載の方法。
- 関連する時間窓内の質量スペクトル生プロファイルモードデータを主成分分析によって分析して、存在する化合物の統計的に有意な数を判定する、請求項1に記載の方法。
- 主成分分析は、特異値分解および非線形反復部分最小二乗(NIPALS)アルゴリズムのうちの1つによって実行することができる、請求項6に記載の方法。
- 純粋成分質量スペクトルは、測定された質量スペクトルおよび取得された分離時間プロファイルから算出される、請求項1に記載の方法。
- 演算は、測定された質量スペクトルと取得された分離時間プロファイルとの間の回帰分析として実行される、請求項8に記載の方法。
- 回帰分析は、マトリックス演算、マトリックス反転、特異値分解、主成分分析、および部分最小二乗のうちの1つの使用による多重線形回帰である、請求項9に記載の方法。
- 取得された分離時間プロファイル、算出された純粋成分質量スペクトル、およびそれぞれの尺度または強度に関係する情報のうちの1つの使用によって、定量的分析が実行される、請求項1に記載の方法。
- 定量的分析は、既知の濃度を有する標準の使用によって実行される、請求項11に記載の方法。
- 定量的分析は、検出された関連する化合物間で、時間プロファイルおよび純粋質量スペクトルのうちの1つの相対強度の使用によって実行される、請求項11に記載の方法。
- 既知の化合物スペクトルライブラリに対する算出された純粋成分質量スペクトルの検索、測定された分離時間プロファイル位置とライブラリ内の既知の化合物の分離時間位置との比較、イオン候補に対する質量精度の算出、イオン候補に対するスペクトル精度の算出のうちの1つによって、定性的分析が実行される、請求項1に記載の方法。
- ライブラリ検索スコアが、分離時間プロファイル位置、質量精度、およびスペクトル精度のうちの少なくとも1つからのマッチング品質とともに、全体的なスコアに組み合わされて、正しい同定の可能性を示す、請求項14に記載の方法。
- イオン候補は、獲得された質量スペクトルデータ内で観察された、分子イオンおよびフラグメントイオンのうちの1つであり、ライブラリ内に含まれる化合物に属することが分かっている、請求項14に記載の方法。
- イオン候補は、獲得された質量スペクトルデータ内で観察された分子イオンおよびフラグメントイオンのうちの1つであり、未知の化合物に由来する、請求項14に記載の方法。
- 測定された分離時間プロファイル位置、関連する誤差限界、既知の化合物の時間プロファイル位置、および関連する誤差限界を比較することによって、可能な化合物が暫定的に同定される、請求項1に記載の方法。
- 暫定的に同定された化合物のライブラリスペクトルと、関連する時間窓内の獲得された質量スペクトルとの間の回帰分析を実行して、それぞれの暫定的に同定された化合物の推定される相対濃度およびそれらの有意性を示す対応する統計的尺度を取得する、請求項18に記載の方法。
- 統計的尺度は、推定される相対濃度のt-値である、請求項19に記載の方法。
- 獲得された生プロファイルモード質量スペクトルデータは、時間に基づく有効な化合物分離中の質量スペクトルの1つの終了と別の終了の間の有限の走査時間から生じる質量スペクトルスキューに対して補正される、請求項1に記載の方法。
- スキュー補正は、補間によって実現され、各走査の質量スペクトルが、分離プロセス中の同じ時点に対応するように補間される、請求項21に記載の方法。
- 分離時間プロファイルは、液体またはガスクロマトグラフ分離からのクロマトグラムであり、分離時間プロファイル位置は、対応する保持時間である、請求項1に記載の方法。
- 保持時間は、分離中に化合物が予期される時間位置を示す保持指標に変換される、請求項1に記載の方法。
- 算出された純粋質量スペクトルは、定性的同定または定量的分析のためにセントロイドへ処理される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1~25のいずれか1項に記載の方法のいずれかに応じて動作する質量分析計。
- 質量分析計に付随するコンピュータとともに使用するためのコンピュータ可読媒体であって、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法に応じて該質量分析計を動作させるように該コンピュータによって可読のコンピュータ可読プログラム命令を有する、前記コンピュータ可読媒体。
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