JP7373622B2 - 筋萎縮を阻害するための組成物、及び、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、筋萎縮を阻害するための組成物に関する。
本発明はまた、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物に関する。

高齢化社会が進行している我が国では、加齢による筋萎縮であるサルコペニアや寝たき
りによる筋萎縮である廃用性筋萎縮の患者が増加すると考えられる。こうした筋萎縮は入
院を要することが考えられ、それによる医療費の増大や病床の占有率も問題となる。

サルコペニアや廃用性筋萎縮の治療は困難であり、その予防や治療法の開発が研究され
ている。一方で、運動は筋萎縮を抑えるための有効な手段として知られているが、高齢者
や寝たきり状態の患者は日常的に運動することが困難である。従って骨格筋萎縮対策とし
て食品からのアプローチが注目されている。食品は日常生活に取り入れやすいことから、
骨格筋萎縮抑制効果を有する食品への期待は大きい。

骨格筋萎縮対策に有用な食品に関する発明は、例えば以下の文献に開示されている。
特許文献１には、ウコン抽出物を有効成分とする剤により、筋芽細胞を活性化し、筋肉
を増強させることで、筋肉萎縮を回復できることが記載されている。また、ウコン抽出物
にはセスキテルペン類が含まれていることが記載されている。

特許文献２には、ウコン抽出物とその他１成分とを含む組成物により、ＡＴＰ、一酸化
窒素、ｅ．Ｎｏｓ、ＭＡＯ、ＡＣＨＥ、筋肉タンパク質、ミオゲニンから選択されるバイ
オマーカーを改善し、筋細胞増殖を増強する方法が記載されている。

非特許文献１では、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与糖尿病モデルマウス（Ｔ１ＤＭ
）の下肢骨格筋萎縮がクルクミン投与により軽減されたこと、クルクミン投与により大腿
直筋，腓腹筋において萎縮が有意に抑制されたことが記載されている。また、非特許文献
１では、ＳＴＺ群で増加したＭｕＲＦ１，Ａｔｒｏｇｉｎ－１／ＭＡＦｂｘのｍＲＮＡ発
現は、クルクミン投与でいずれも有意に減少したことが記載されている。

特開２００８－１５６２９４号公報 特表２０１６－５０５６１５号公報

小野太祐，「クルクミンはタンパク質分解亢進を抑制して糖尿病に伴う下肢骨格筋の萎縮を軽減する」，北海道大学博士論文，甲第９８０９号，平成２３年３月２４日学位授与

特許文献１及び２には、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することで筋萎縮を阻害するこ
とについて記載されていない。

非特許文献１では、クルクミン以外のウコン成分による筋萎縮原因遺伝子に対する作用
に関する記載は無い。

本発明は、骨格筋の萎縮を阻害することが可能な組成物、又は、筋萎縮原因遺伝子の発
現を抑制することが可能な組成物を提供することを目的とする。

本発明は、以下の発明を包含する。
（１）水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物。
（２）ビサクロンを０．１重量％以上含む、（１）に記載の組成物。
（３）クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下である、（１）
又は（２）に記載の組成物。
（４）ビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物。
（５）飲食品である、（１）～（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するた
めの組成物。
（７）ビサクロンを０．１重量％以上含む、（６）に記載の組成物。
（８）クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下である、（６）
又は（７）に記載の組成物。
（９）ビサクロンを有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成
物。
（１０）飲食品である、（６）～（９）のいずれかに記載の組成物。

本発明により、骨格筋の萎縮を阻害することが可能な組成物、及び、筋萎縮原因遺伝子
の発現を抑制することが可能な組成物が提供される。

図１は、試料Ｎｏ．１～５の細胞障害率の測定結果を示す。 図２Ａは、試料Ｎｏ．１～５により処理した骨格筋細胞におけるＤＥＸ誘導性Ｍａｆｂｘ遺伝子の発現量を示す。図２Ｂは、試料Ｎｏ．１～５により処理した骨格筋細胞におけるＤＥＸ誘導性Ｍｕｒｆ１遺伝子の発現量を示す。図２Ａ及び図２Ｂでは、ＤＥＸ添加,試料未添加群（ｃｏｎｔｒｏｌ／ＤＥＸ＋）での各遺伝子の発現量に対する割合（％）で示す。 図３上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ－１添加群（ＩＧＦ－１）のマウス骨格筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料とした実験２に記載のウェスタンブロッティングで得られたＰＶＤＦ膜上のＭＡＦｂｘ及びβ－ａｃｔｉｎ（内部標準）のバンドを示す。図３下段は、実験２に記載のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液中での、β－ａｃｔｉｎのタンパク質量に対する、ＭＡＦｂｘのタンパク質量を示す。 図４は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））の対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）のＣ２Ｃ１２でのＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量（ＰｐｉａのｍＲＮＡ発現量に対する相対値）を示す。 図５上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ－１添加群（ＩＧＦ－１）のＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料とした実験４に記載のウェスタンブロッティングで得られたＰＶＤＦ膜上のリン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）及びリン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のバンドを示す。図５下段は、実験４に記載のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液中での、リン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパク質量に対する、リン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパク質量を示す。 図６Ａは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））の、対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均値（μｍ）と標準偏差を示す。図６Ｂは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））、対照群（ＣＯＮ）又はビサクロン添加群（ＢＣ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均値（μｍ）と標準偏差を示す。

＜ウコン＞
本発明においてウコンとは、ショウガ科ウコン属の植物であるＣｕｒｃｕｍａ ｌｏｎ
ｇａを指す。Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａは「秋ウコン」と呼ばれる場合もある。

＜水溶性ウコン抽出物＞
水溶性ウコン抽出物は、ウコン植物原料の、後述する親水性抽出溶媒による抽出物（ウ
コンエキス）をいい、必要に応じてさらに加熱及び／又は減圧等により抽出溶媒を揮発し
、乾燥させたものであってもよい。これらの加熱、減圧、乾燥の方法は特に限定されず、
例えば従来公知の方法を使用することができる。

ウコン植物原料としては、ウコンの根茎が挙げられる。ウコンの根茎は土中から採取し
洗浄したものをそのまま使用してもよいし、根茎の適当な部位を原型のまま、あるいは適
当な寸法又は形状にカットしたもの、あるいは粉砕物の形態にしたものを使用することが
できる。ウコン植物原料は乾燥されたものであってよい。

植物原料からのウコン抽出物の抽出方法は特に限定されず、従来公知の方法を使用する
ことができる。

親水性抽出溶媒としては、水及び親水性有機溶媒からなる群から選択される少なくとも
１種であることが好ましく、水、親水性有機溶媒、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒
がより好ましく、水、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒が特に好ましい。親水性有機
溶媒は複数種の親水性有機溶媒の混合溶媒であってもよい。「水」とは熱水も包含する。
親水性有機溶媒としては少なくとも１種のアルコール（複数種のアルコールの混合溶媒で
あってもよい）が挙げられ、アルコールとしては、特に限定されないが、エタノールが好
ましい。

親水性抽出溶媒として親水性有機溶媒と水との混合溶媒を用いる場合、両者の混合比は
特に限定されないが、例えば親水性有機溶媒：水の重量比は１０：９０～９０：１０の範
囲が好ましく、２０：８０～５０：５０の範囲がより好ましい。抽出する際の温度は、特
に限定されない。

親水性抽出溶媒を用いて抽出された水溶性ウコン抽出物は、抽出溶媒として酢酸エチル
等の疎水性有機溶媒を用いて抽出された非水溶性ウコン抽出物と比較して、水溶性のより
高い化合物を含有する。従って、水溶性ウコン抽出物と非水溶性ウコン抽出物とは、含有
される成分が互いに異なる。

本発明において、水溶性ウコン抽出物としては、上述のようにして得られたウコン根茎
の親水性抽出溶媒による抽出物をそのまま使用することができるし、該ウコン根茎の親水
性抽出溶媒による抽出物を、さらに、希釈、濃縮、乾燥等の処理を施したものを使用する
こともできる。希釈、濃縮、乾燥等の方法は、従来公知の方法を使用することができる。

本発明に用いる水溶性ウコン抽出物は、好ましくは、ビサクロンを含むことを特徴とす
る。ビサクロンは、水溶性ウコン抽出物全量に対して好ましくは０．１重量％以上、より
好ましくは０．１５重量％以上、特に好ましくは０．２重量％以上含有される。水溶性ウ
コン抽出物中のビサクロンの量は、水溶性ウコン抽出物を酢酸エチルと混合し、遠心分離
して得られた上澄み液から酢酸エチルを減圧留去後、アセトニトリルに溶解した液を分析
サンプルとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付すことにより求めること
ができる。

本発明に用いる水溶性ウコン抽出物は、好ましくは、クルクミンを含まない、又はクル
クミンを含んでいたとしても０．５重量％以下である。本発明に用いる水溶性ウコン抽出
物は、更に好ましくは、クルクミノイド（クルクミン及びその類縁物質の総称）を含まな
い、又はクルクミノイドを含んでいたとしても合計で０．５重量％以下である。

クルクミン及びクルクミノイドの量は、水溶性ウコン抽出物を５０％アセトニトリルで
溶解させ、遠心分離した上清液を高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００
）により測定することができる。

＜ビサクロン＞
本発明においてビサクロンとは、ビサボラン型セスキテルペン類に分類される化合物で
あり、下記の平面構造式を有する化合物又はその塩を意味する。ビサクロンは平面構造式
中＊印で示した位置に不斉炭素を有し、そのため数種の光学異性体が存在するが、本明細
書におけるビサクロンとはそのいずれの光学異性体も包含する概念である。

本発明の一実施形態に係る、ビサクロンを含む組成物は、上記の、ビサクロンを含む水
溶性ウコン抽出物を含む組成物であることが好ましいが、これには限定されず、他の起源
からのビサクロンを含む組成物であってもよい。他の起源からのビサクロンとしては、人
為的に合成されたビサクロンや、ショウガ科ウコン属の植物（秋ウコンに限らない）から
抽出され精製されたビサクロンが使用できる。

＜水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物、及び、その用途＞
本発明の一実施形態は、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物に関する。
水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、水溶性ウコン抽出物からなる組成
物（即ち水溶性ウコン抽出物自体）であってもよいし、水溶性ウコン抽出物と、少なくと
も１種の他の成分とを含む組成物であってもよい。該組成物が、水溶性ウコン抽出物と、
少なくとも１種の他の成分とを含む場合、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の
成分とを混合した組成物であってもよいし、水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他
の成分とを適当な手段で製剤化した組成物であってもよいし、水溶性ウコン抽出物と、少
なくとも１種の他の成分との製剤化した組成物を、更に他の成分と混合した組成物であっ
てもよい。本発明における、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物の形状は、
特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状などの何れの
形状であってもよい。

前記の、少なくとも１種の他の成分としては、特に限定されないが、好ましくは、飲食
品、医薬品等の最終的な形態において許容される成分であって、経口摂取可能な成分が例
示できる。

このような他の成分としては例えば、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類、増粘
剤、乳化剤、酸化防止剤、水等が挙げられる。また、必要により、色素、香料、保存料、
防腐剤、防かび剤、更なる生理活性物質等を添加してもよい。

甘味料としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、麦芽糖、パラチノース、トレハロー
ス、キシロース等の単糖や二糖、異性化糖（ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、砂糖
混合異性化糖等）、糖アルコール（エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、パラ
チニット、ソルビトール、還元水飴等）、はちみつ、高甘味度甘味料（スクラロース、ア
セスルファムカリウム、ソーマチン、ステビア、アスパルテーム等）等が挙げられる。

酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、酒石酸、乳酸、リン酸、又はこれ
らの塩等があり、これらのうちの１種又は２種以上を利用することができる。

ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタ
ミンＥ、ナイアシン、イノシトール等が挙げられる。
ミネラル類としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等が挙げられる。

増粘剤としては、カラギーナン、ジェランガム、キサンタンガム、アラビアガム、タマ
リンドガム、グアーガム、ローカストビーンガム、カラヤガム、寒天、ゼラチン、ペクチ
ン、大豆多糖類、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等が挙げられる。

乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪
酸エステル、レシチン、植物性ステロール、サポニン等が挙げられる。

酸化防止剤としては、ビタミンＣ、トコフェロール（ビタミンＥ）、酵素処理ルチン、
カテキン等が挙げられる。

前記他の成分は、それぞれ当業者が飲食品、医薬品等の組成物に通常採用する範囲内の
量で適宜配合することができる。

水溶性ウコン抽出物と、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物
の形態は、カプセル剤、錠剤（糖衣錠等のコーティング錠又は多層錠、口中崩壊剤、チュ
アブル錠等を含む）、散剤もしくは顆粒剤等の固形組成物の形態であってもよいし、液体
組成物の形態であってもよい。

本発明における、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、それ自体が飲食
品又は医薬品であることが好ましく、飲食品であることがより好ましい。ここで飲食品と
は食品添加物や、他の食品素材と組み合わせて飲食品の製造に用いられる飲食品原料の形
態も包含する。水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物が飲食品である場合、或
いは、他の食品素材と組み合わせて飲食品の製造に用いられる飲食品原料である場合にお
いて、「飲食品」は、好ましくは機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補給のためのサ
プリメント等であり、その形態は特に限定されないが、例えば、菓子類（例えば、ガム、
キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック菓子、ゼリー、グミ、錠
菓等）、麺類（例えば、そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（例えば、ミルク、アイス
クリーム、ヨーグルト等）、調味料（例えば、味噌、醤油等）、スープ類、飲料（例えば
、ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）等が挙げられ、好ましく
は飲料である。

水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、好ましくは、ビサクロンを、組成
物全量に対して好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．１５重量％以上、特に
好ましくは０．２重量％以上含有する。前記組成物中のビサクロンの量は、前記組成物を
酢酸エチルと混合し、遠心分離して得られた上澄み液から酢酸エチルを減圧留去後、アセ
トニトリルに溶解した液を分析サンプルとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）に付すことにより求めることができる。

水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、好ましくは、クルクミンを含まな
い、又はクルクミンを含んでいたとしても組成物全量に対し０．５重量％以下である。前
記組成物は、更に好ましくは、クルクミノイドを含まない、又はクルクミノイドを含んで
いたとしても合計で組成物全量に対し０．５重量％以下である。クルクミン及びクルクミ
ノイドの量は、前記組成物を５０％アセトニトリルで溶解させ、遠心分離した上清液を高
速液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）により測定することができる。

水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、本発明の一実施形態において、筋
萎縮を阻害するための組成物である。ここで「筋萎縮を阻害する」とは、ヒト又は非ヒト
動物、好ましくはヒト、において、サルコペニア、廃用性筋萎縮等の筋肉の萎縮を予防、
軽減又は治療することを指す。本発明の一実施形態に係る、筋萎縮を阻害するための組成
物は、加齢により衰える筋肉もしくは筋力を維持又は改善するため、又は、加齢により衰
える歩行能力を維持又は改善するために摂取することができる。

水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む組成物は、本発明の他の一実施形態において
、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物である。ここで「筋萎縮原因遺伝子」
とは、代表的には、ヒトにおけるＭａｆｂｘ遺伝子及びＭｕｒｆ１遺伝子のうち一種以上
である。これらの筋萎縮原因遺伝子は、筋萎縮患者において発現が亢進し、筋萎縮の原因
となることが知られている。「筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制する」とは、筋萎縮の予防
が求められるヒト等の対象において筋萎縮原因遺伝子の発現の亢進を未然に予防すること
、及び、筋萎縮の症状を有するヒト等の対象において筋萎縮原因遺伝子の発現の亢進を軽
減することを指す。本発明の一実施形態に係る、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するため
の組成物もまた、加齢により衰える筋肉を維持又は改善するため、或いは、加齢により衰
える歩行能力を維持又は改善するために摂取することができる。筋萎縮原因遺伝子の発現
が抑制されていることは、本発明の組成物を摂取した対象から細胞、好ましくは筋細胞（
骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等）を採取し、細胞中のＲＮＡからｃＤＮＡを調製し
、ｃＤＮＡを鋳型とし、筋萎縮原因遺伝子を増幅し得るプライマーセットを用いたＰＣＲ
により増幅産物量を検出することで確認することができる。Ｍａｆｂｘ遺伝子を増幅する
ためのプライマーセットは配列番号１に示す塩基配列を含むプライマーと、配列番号２に
示す塩基配列を含むプライマーとのセットが例示できる。Ｍｕｒｆ１遺伝子を増幅するた
めのプライマーセットは配列番号３に示す塩基配列を含むプライマーと、配列番号４に示
す塩基配列を含むプライマーとのセットが例示できる。

筋萎縮原因遺伝子の発現が抑制されていることは、本発明の組成物を摂取した対象から
細胞、好ましくは筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等）を採取し、細胞中の、
筋萎縮原因遺伝子に由来するタンパク質を検出することで確認することもできる。例えば
、Ｍａｆｂｘ遺伝子に由来するタンパク質であるＭＡＦｂｘ、Ｍｕｒｆ１遺伝子に由来す
るタンパク質であるＭｕＲＦ１等の、筋萎縮原因遺伝子に由来するタンパク質の量が細胞
中で低減している場合に、筋萎縮原因遺伝子の発現が抑制されていることが確認できる。

骨格筋の筋萎縮は、ユビキチン・プロテアソーム分解経路を含むタンパク質分解系によ
るタンパク質分解が、タンパク質合成系によるタンパク質合成を上回る場合に生じると推
定される。

タンパク質分解系を構成するユビキチン・プロテアソーム分解経路は、ユビキチン活性
化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、及び、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の酵
素群からなるユビキチン化システム（分解すべきタンパク質にポリユビキチンを連結する
）と、ポリユビキチンを認識して分解するプロテアソームの二つの系からなる。筋萎縮原
因遺伝子に由来するタンパク質であるＭＡＦｂｘ及びＭｕＲＦ１は、ユビキチンリガーゼ
の一例である。低栄養、飢餓等のストレス環境下では、ホルモンであるグルココルチコイ
ドが、細胞膜上のグルココルチコイド受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を経て、筋萎
縮原因遺伝子の発現が促進される。細胞内シグナル伝達に含まれ、筋萎縮原因遺伝子の発
現を促進するタンパク質として、フォークヘッド型転写因子（ＦＯＸＯ）サブファミリー
が知られている。ＦＯＸＯサブファミリーの１つにＦＯＸＯ３がある。本発明の組成物は
、グルココルチコイドにより誘導される、Ｆｏｘｏ３遺伝子の発現を抑制することができ
（実験３参照）、それにより筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制することができる。

タンパク質合成系の１つに、内分泌物質であるインスリン様成長因子結合タンパク質１
（ＩＧＦ－１）が、細胞膜上のＩＧＦ－１受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を経て、
Ｓ６リボソームタンパク質がリン酸化され、タンパク質合成が促進される経路が知られて
いる。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化に関与するタンパク質が、ｐ７０Ｓ６キナー
ゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）である。ｐ７０Ｓ６Ｋは、リン酸化されることで活性化され、Ｓ６リ
ボソームタンパク質をリン酸化する。本発明の組成物は、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を促進
することができ（実験４参照）、それによりタンパク質合成系を促進することができる。

＜ビサクロンを有効成分として含む組成物、及び、その用途＞
本発明の一実施形態は、ビサクロンを有効成分として含む組成物に関する。
ビサクロンを有効成分として含む組成物は、ビサクロンからなる組成物（即ちビサクロ
ン自体）であってもよいし、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分とを含む組成物で
あってもよい。該組成物が、ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分とを含む場合、ビ
サクロンと、少なくとも１種の他の成分とを混合した組成物であってもよいし、ビサクロ
ンと、少なくとも１種の他の成分とを適当な手段で製剤化した組成物であってもよいし、
ビサクロンと、少なくとも１種の他の成分との製剤化した組成物を、更に他の成分と混合
した組成物であってもよい。本発明における、ビサクロンを有効成分として含む組成物の
形状は、特に限定されず、例えば、液体状、流動状、ゲル状、半固形状、又は固形状など
の何れの形状であってもよい。

前記の、少なくとも１種の他の成分としては、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含
む組成物に関して記載したものと同じものが使用できる。

ビサクロンを有効成分として含む組成物の好適な形態は、水溶性ウコン抽出物を有効成
分として含む組成物に関して説明した好適な形態と同様である。

ビサクロンを有効成分として含む組成物は、好ましくは、ビサクロンを、組成物全量に
対して好ましくは０．１重量％以上、より好ましくは０．１５重量％以上、特に好ましく
は０．２重量％以上含有する。前記組成物中のビサクロンの量は、前記組成物を酢酸エチ
ルと混合し、遠心分離して得られた上澄み液から酢酸エチルを減圧留去後、アセトニトリ
ルに溶解した液を分析サンプルとして、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付す
ことにより求めることができる。

ビサクロンを有効成分として含む組成物は、好ましくは、クルクミンを含まない、又は
クルクミンを含んでいたとしても組成物全量に対し０．５重量％以下である。前記組成物
は、更に好ましくは、クルクミノイドを含まない、又はクルクミノイドを含んでいたとし
ても合計で組成物全量に対し０．５重量％以下である。クルクミン及びクルクミノイドの
量は、前記組成物を５０％アセトニトリルで溶解させ、遠心分離した上清液を高速液体ク
ロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）により測定することができる。

ビサクロンを有効成分として含む組成物は、本発明の一実施形態において、筋萎縮を阻
害するための組成物である。「筋萎縮を阻害するための組成物」の具体的な態様は、水溶
性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物に関して説明した
態様と同様である。

ビサクロンを有効成分として含む組成物は、本発明の他の一実施形態において、筋萎縮
原因遺伝子の発現を抑制するための組成物である。「筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制する
ための組成物」の具体的な態様は、水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原
因遺伝子の発現を抑制するための組成物に関して説明した態様と同様である。

＜実験１：秋ウコン抽出物及びビサクロンのユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価
（ｍＲＮＡレベル）＞
[試料]
下記表に示す試料を用いた。

各試料の詳細は以下の通りである。
＜Ｎｏ．１ ビサクロン高濃度品（実施例）＞
ビサクロンは、精製された（≧９９％（ＨＰＬＣ））ビサクロン試薬を長良サイエンス
株式会社から入手して、メタノールで適時希釈して使用した。

＜Ｎｏ．２ 水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽出物）（実施例）＞
水溶性ウコン抽出物は、秋ウコンと通称される学名Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの根茎
の親水性抽出溶媒による抽出物を指す。ウコンの根茎部分を水等の抽出溶媒を用いて抽出
し、加熱及び／又は減圧して抽出溶媒を揮発させたものを使用した。

実験に用いた水溶性ウコン抽出物は、ビサクロンを０．１５重量％以上含有し、クルク
ミノイドを０．１重量％以下含有するものであった。

＜Ｎｏ．３ ウコン色素（比較例）＞
ウコン色素は、Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａの根茎部分より、アルコールやヘキサン、
アセトン等の有機溶媒で抽出したものを使用した。このようにして得られたウコン色素は
主にクルクミン等のクルクミノイドを含む。
使用したウコン色素は、クルクミンを６０重量％以上含有するものであった。

＜Ｎｏ．４ ガジュツ水抽出物（比較例）＞
ガジュツは、ショウガ科ウコン属の１種の、紫ウコンと通称される学名Ｃｕｒｃｕｍａ
ｚｅｄｏａｒｉａを指し、秋ウコンとは別種である。ガジュツは秋ウコンに比べてビサ
クロンの含有量が少ない。ガジュツの根茎部分を、水を用いて抽出し、加熱及び／又は減
圧して抽出溶媒を揮発させたものを、試料Ｎｏ．４として使用した。

＜Ｎｏ．５ ガジュツアルコール抽出物（比較例）＞
ガジュツの根茎部分を、エタノールを用いて抽出し、加熱及び／又は減圧して抽出溶媒
を揮発させたものを、試料Ｎｏ．５として使用した。

［実験方法］
細胞障害率の測定
マウス骨格筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）添加ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
にて３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ_２条件下で培養した。培養に使用したＤＭＥＭ培地
は１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
）とフィルター滅菌した１０％ＦＢＳを添加した。細胞継代の際は、リン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄した後、トリプシン溶液で細胞を剥がした。ＰＢＳはＰＢＳ１０×，
ｐＨ７．４（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）をｄＨ_２Ｏで１０倍希釈し
、オートクレーブ滅菌した。トリプシン溶液は０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（１
×）（ｇｉｂｃｏ）を用いた。２日に一度培地交換を行い、細胞が４０％ｃｏｎｆｌｕｅ
ｎｔになったところでＢｉｏｃｏａｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｅｌｌ ｗａｒｅ ２
４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に播種した。細胞が９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎ
ｔになったところで、４％ウマ血清（ＨＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）添加ＤＭＥ
Ｍに培地交換することにより分化誘導をかけた。培地交換は２日に一度行った。

細胞障害率の測定にはＬＤＨ－細胞毒性キット（Ｗａｋｏ）を使用した。分化誘導６日
目にＰＢＳで洗浄後、無血清ＤＭＥＭで１２時間培養した。培地を除去しＰＢＳで洗浄後
、各ｗｅｌｌに、前記試料Ｎｏ．１～５のいずれか１つを２００μｇ／ｍＬまでになるよ
うに添加したＤＭＥＭを１ｍＬ加えて１２時間培養した。その後、培地上清を全量回収し
た。また、上清を除いた各ｗｅｌｌに１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＤＭＥＭを５００μ
Ｌずつ添加し、３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ_２条件下で１０分間インキュベート後、
ピペッティングにより細胞を回収した。回収した上清及び細胞懸濁液を遠心（３０００ｇ
、５分、２５℃）後、各上清を９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ分注した。これにキット
付属の反応開始薬を５０μＬずつ添加し、室温で５分間放置後、同じくキット付属の反応
停止液の２倍希釈液を１００μＬ添加し、９０分以内にマイクロプレートリーダーにより
５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

（ＬＤＨ放出率）
＝１００×（培地上清の吸光度）／（培地上清の吸光度＋細胞懸濁液の吸光度）
という式によりＬＤＨ放出率を算出し、各試料未添加群に対するＬＤＨ放出率の割合（％
）を細胞障害率とした。細胞障害率が１５０％以下となる最大濃度を、次に示す、ユビキ
チンリガーゼ遺伝子発現への影響評価時の試料の添加濃度とした。

各試料のユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価（ｍＲＮＡレベル）
試料Ｎｏ．１～５のデキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性ユビキチンリガーゼ発現に対する
評価を行った。マウス骨格筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、９
０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔになったところで、４％ＨＳ添加ＤＭＥＭに培地交換することに
より分化誘導をかけた。培地交換は２日に一度行った。分化誘導６日目にＰＢＳで洗浄後
、無血清ＤＭＥＭで１２時間培養した。培地を除去しＰＢＳで洗浄後、各ｗｅｌｌに１０
０ｎＭとなるようにＤＥＸ（Ｓｉｇｍａ）を、細胞障害率の測定で決定された濃度となる
ように各試料を添加した無血清ＤＭＥＭを１ｍＬ加えて１２時間培養した。ＤＥＸはＥｔ
ＯＨ（関東化学株式会社、東京）にて１００μＭとなるように溶解し、－２０℃にて保存
した。その後、上清を除去し、ＰＢＳ １ｍＬにて洗浄し、ＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ Ｒｅａｇ
ｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、東京）１ｍＬによって細胞を回収し、－８０℃で保存ま
たはそのまま次の操作に用いた。凍結保存した場合はＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ
を融解した後、クロロホルム（関東化学株式会社、東京）２００μＬを添加・撹拌し、室
温で３分間放置後、４℃で１５分間遠心（１６，０００ｇ）した。その後、上層の水層部
を４００μＬ取り出し、２－プロパノール（関東化学株式会社、東京）５００μＬを添加
・撹拌し、室温で１０分間放置後、４℃で１０分間遠心（１２，０００ｇ）した。その後
、上清を除去し、７５％ＥｔＯＨ（関東化学株式会社、東京）ｉｎ ＲＮａｓｅ ｆｒｅ
ｅ ｗａｔｅｒを７５０μＬ添加し、４℃で５分間遠心（７，６００ｇ）した。再び上清
を除去し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ５０μＬ、１００％ＥｔＯＨ １２５μ
Ｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム１０μＬを添加し、－２０℃で一晩または２時間静置した。その
後、４℃で１５分間遠心（１６，０００ｇ）し、上清を除去後、７５％ＥｔＯＨ ｉｎ
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １ｍＬを添加し４℃で５分間遠心（１６，０００ｇ
）した。再び上清を除去し、９０％ＥｔＯＨ ｉｎ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ
１ｍＬを添加し４℃で５分間遠心（１６，０００ｇ）した。その後上清を除去し、残存
ＥｔＯＨを揮発させて得られたＲＮＡを２０μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに
溶解した。ＲＮＡの濃度はＮａｎｏ Ｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定を行った。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５００ｎｇ
からＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅ
ａｌ Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を使用してｃＤＮＡを合成した。調製したｃＤＮＡは
－２０℃で保存した。その後リアルタイムＰＣＲによってＭａｆｂｘ、Ｍｕｒｆ１及び内
部標準遺伝子としてＰｐｉａの発現レベルを検討した。リアルタイムＰＣＲにはＴｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（Ｔ
ａＫａＲａ）を用いた。ＰＣＲ反応溶液の組成は、１サンプルにつきＳＹＢＲ^{（登録商標
）} Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ^ＴＭ（Ｔｌｉ ＲｎａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲ
ａ）６．２５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ４．２５μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ
ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．５μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０
．５μＬ、ｃＤＮＡ １μＬとした。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９５℃１０秒間で行
い、その後９５℃５秒間→６０℃３０秒間（４０サイクル）→９５℃１５秒間→６０℃３
０秒間→９５℃１５秒間とした。各プライマーはウェブアプリケーションＰＲＩＭＥＲ３
ＩＮＰＵＴにより設計し、合成をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
に依頼した。プライマー配列は以下に示した。

実験結果の統計処理には、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔを用いた。

［結果］
細胞障害率の測定
試料Ｎｏ．１～５の細胞障害率の測定結果を図１に示す。細胞障害率が１５０％以下と
なる最大濃度から添加濃度をＮｏ．１は２０ｎｇ／ｍＬ、Ｎｏ．２，４～５は２００μＬ
／ｍＬ、Ｎｏ．３は５０μｇ／ｍＬとした。

試料のユビキチンリガーゼ遺伝子発現への影響評価（ｍＲＮＡレベル）
骨格筋細胞におけるＤＥＸ誘導性Ｍａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１発現に及ぼす、試料Ｎｏ．
１～５の影響を見るために、分化させたＣ２Ｃ１２にＤＥＸ処理をし、各試料により１２
時間処理した。

結果を図２に示す。ＤＥＸ添加,試料未添加群（ｃｏｎｔｒｏｌ／ＤＥＸ＋）に対する
割合（％）で示した。図２ＡではＭａｆｂｘの、図２ＢではＭｕｒｆ１の結果を示した。

Ｎｏ．１，Ｎｏ．３～５にはＭａｆｂｘ発現低下作用が見られなかったが、Ｎｏ．２（
ウコン抽出物）はＤＥＸ誘導性Ｍａｆｂｘ発現レベルを有意に低下させた（図２Ａ）。

また、Ｎｏ．４及び５にはＭｕｔｆ１発現低下作用が見られなかったが、Ｎｏ．１（ビ
サクロンとＮｏ．２（ウコン抽出物）はＤＥＸ誘導性Ｍｕｒｆ１発現レベルを有意に低下
させた（図２Ｂ）。一方、Ｎｏ．３は、ＤＥＸ誘導性Ｍｕｒｆ１発現レベルを有意に亢進
した（図２Ｂ）。

［考察］
ウコン抽出物は、ＤＥＸ誘導性のＭａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現低下作用を
示した。また、ビサクロンはＤＥＸ誘導性のＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現低下作用を示した
。

Ｍａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１は種々の骨格筋萎縮時に発現が亢進することが知られており
、骨格筋のタンパク質分解機構に関わるため、以上の結果からウコン抽出物及びビサクロ
ンは骨格筋萎縮を抑制することができる。

＜実験２：秋ウコン抽出物（ＡＥ）のＭＡＦｂｘタンパク質発現への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽
出物）」を用いた。

６ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２～１６時間
のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）有無の条件
下で、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地に交換
し、１２時間培養した。培養終了後、各ウェルの上清を除去し、細胞を氷冷したＰＢＳ
１ｍＬで２回洗浄した後、液体窒素によりプレートごと凍結し、－８０℃で保存した。凍
結保存した細胞を融解させ、各ウェルにＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ添加し、５
分程静置した。その後、セルスクレーパーで細胞をプレートから剥がして得られた細胞溶
解液を４℃で１時間ローテート（３０ｒｐｍ）し、ソニケーション（５秒、５回）を行っ
た。これを２℃で３０分間遠心（１６，０００ｇ）し、上清を回収してタンパク質抽出液
を得た。抽出液のタンパク質濃度測定はＢｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎを基
準としたＢｒａｄｆｏｒｄ法により行い、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－ｒａｄ
）を用いて波長６００ｎｍの吸光度を測定した。抽出した細胞内タンパク質を用いてウェ
スタンブロッティングによりＭＡＦｂｘのタンパク質量を測定した。ポジティブコントロ
ールとして、１０ｎＭ Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１（
ＩＧＦ－１）を用いた。対照（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰ
ＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培地を用いた以
外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養し、そのタンパク質抽出液中のＭＡＦｂｘのタンパク
質量を測定した。ウェスタンブロッティングの方法は以下に示した。

細胞内タンパク質を１５－１００μｇを含むタンパク質抽出液に２×あるいは３×Ｌａ
ｅｍｍｌｉ’ｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを加えて５分間煮沸処理したものを２０μ
Ｌ／ｌａｎｅアプライしＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは８～１２％ポリ
アクリルアミドゲルを用い２０ｍＡ／ｇｅｌで１時間半程度行った。泳動槽はＭｉｎｉ－
ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた。泳動終了後、
ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ， Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）への転写を、セミドライブ
ロッター（アテナック）を用いたセミドライ式（１ｍＡ／ＰＶＤＦ膜１ｃｍ^２、４５～６
０分）あるいはＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ^{（登録商標）} Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－ｒａ
ｄ）を用いたウェット式（１００Ｖ、１００分）で行った。転写終了後メンブレンをＴｒ
ｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ－Ｔ）で
洗浄後、ＰＶＤＦ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉ
ｇｎａｌ^{（登録商標）} （ＴＯＹＯＢＯ）に浸し、室温で１時間あるいは４℃で一晩ブロ
ッキングした。ブロッキング終了後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、一次抗体溶
液に浸して４℃で一晩振盪した。その後ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、二次抗体溶液に浸して
室温で１時間振盪した。再度ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または
ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａ
ｇｅｎｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により１分間化学発光させた。Ｅｚ－Ｃａｐｔ
ｕｒｅ ＭＧ（ＡＴＴＯ）を用いて検出し、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ３．０（ＡＴＴＯ）
を用いてデンシトメトリー解析を行った。

用いた抗体及び希釈倍率を以下に示す。一次抗体はＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ^{（登
録商標）} Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（
ＴＯＹＯＢＯ）、二次抗体はＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ^{（登録商標）} Ｉｍｍｕｎｏ
ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈し
た。タンパク質発現の内部標準にはβ－ａｃｔｉｎを用いた。

〈一次抗体〉
ａｎｔｉ－ＭＡＦｂｘ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ，ａｂ１６８３７２）
希釈倍率：１０００倍
ａｎｔｉ－β－Ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３７
００）
希釈倍率：２０００倍
〈二次抗体〉
ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３４）
ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３１）

［結果］
図３上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））
で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ－１添加群（ＩＧＦ－
１）のＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料とした上記のウェスタンブロッティング
で得られたＰＶＤＦ膜上のＭＡＦｂｘ及びβ－ａｃｔｉｎ（内部標準）のバンドを示す。

図３下段は、上記のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ
１２からのタンパク質抽出液中での、β－ａｃｔｉｎのタンパク質量に対する、ＭＡＦｂ
ｘのタンパク質量を示す。

ＭＡＦｂｘのタンパク質量はＩＧＦ－１添加群を除き、Ｄｅｘ（＋）群でＤｅｘ（－）
群と比較して有意に増加した。一方、ＡＥ／Ｄｅｘ（＋）群及びＩＧＦ－１／Ｄｅｘ（＋
）群はＣＯＮ／Ｄｅｘ（＋）群と比較して有意に減少した（図３下段）。

＜実験３：秋ウコン抽出物（ＡＥ）のユビキチンリガーゼ上流転写因子のｍＲＮＡ発現へ
の影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽
出物）」を用いた。

実験１においてＭａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現亢進抑制効果が認められた秋
ウコン抽出物（ＡＥ）に関して、ユビキチンリガーゼ上流転写因子のｍＲＮＡ発現に対す
る影響評価を行った。２４ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清
培地で１２～１６時間のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭ Ｄｅｘ有無の条
件下で、終濃度２００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地に交
換し、１２時間培養した。培養終了後の細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出し
たｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、ユビキチンリガー
ゼ上流転写因子の１つであるＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量を測定した。プライマー配列は
以下に示した。遺伝子発現の内部標準にはＰｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ ｉｓｏｍｅｒ
ａｓｅ Ａ（Ｐｐｉａ）を用いた。対照群（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬと
なるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培
地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養しＦｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量を測定し
た。

Ｆｏｘｏ３
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＣＧＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＣＧＴ－３’（配列番号
７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴ－３’（配列番号８）
Ｐｐｉａ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣ－３’（配列番号５
）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴ－３’（配列番号
６）

［結果］
図４は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））の対
照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）のＣ２Ｃ１２でのＦｏｘｏ３のｍＲＮ
Ａ発現量（ＰｐｉａのｍＲＮＡ発現量に対する相対値）を示す。

Ｆｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現量は対照群（ＣＯＮ）において、Ｄｅｘ（＋）群でＤｅｘ（
－）群と比較して有意に増加したが、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）においては有意な増
加が認められなかった。ＣＯＮ／Ｄｅｘ（＋）群とＡＥ／Ｄｅｘ（＋）群間においても有
意な差は認められなかった。

＜実験４：秋ウコン抽出物（ＡＥ）のｐ７０Ｓ６Ｋ（７０ ｋＤａ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ
Ｓ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽
出物）」を用いた。

６ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２～１６時間
のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭ Ｄｅｘ有無の条件下で、終濃度２００
μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した秋ウコン抽出物（ＡＥ）を添加した培地に交換
し、６時間培養した。培養終了後の細胞からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティ
ングによりｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を測定した。ポジティブコントロールとして１０ｎＭ
ＩＧＦ－１を用いた。ウェスタンブロッティングは実験２に記載の手順で行った。対照
群（ＣＯＮ）として、終濃度２００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加
した培地の代わりに、同量のＰＢＳを添加した培地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１
２を培養しタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングによりｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸
化を測定した。

［結果］
図５上段は、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））
で、対照群（ＣＯＮ）、秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）又はＩＧＦ－１添加群（ＩＧＦ－
１）のＣ２Ｃ１２からのタンパク質抽出液を試料としたウェスタンブロッティングで得ら
れたＰＶＤＦ膜上のリン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）及びリン酸化され
ていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のバンドを示す。

図５下段は、上記のウェスタンブロッティングで求められた、各条件で培養したＣ２Ｃ
１２からのタンパク質抽出液中での、リン酸化されていないｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ７０Ｓ６Ｋ
）のタンパク質量に対する、リン酸化されたｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ）のタンパ
ク質量を示す。

ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は６時間刺激後のＣ２Ｃ１２において、ＡＥ／Ｄｅｘ（－）群
及びＩＧＦ－１／Ｄｅｘ（－）群はＣＯＮ／Ｄｅｘ（－）群と比較して有意に増加した。
また、ＡＥ／Ｄｅｘ（＋）群はＣＯＮ／Ｄｅｘ（＋）群と比較して増加する傾向が認めら
れ（ｐ＝０．０９０８）、ＩＧＦ－１／Ｄｅｘ（＋）群は有意に増加した（図５下段）。

＜実験５：秋ウコン抽出物（ＡＥ）とビサクロン（ＢＣ）の筋管直径への影響評価＞
［実験材料及び実験方法］
秋ウコン抽出物（ＡＥ）として、実験１で調製した「水溶性ウコン抽出物（秋ウコン抽
出物）」を用いた。

ビサクロン（ＢＣ）として、実験１と同様に、精製された（≧９９％（ＨＰＬＣ））ビ
サクロン試薬を長良サイエンス株式会社から入手して用いた。

６ｗｅｌｌプレートで培養した分化６日目のＣ２Ｃ１２を無血清培地で１２～１６時間
のｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った後、１００ｎＭ Ｄｅｘ有無の条件下で、終濃度２００
μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥまたは終濃度１μｇ／ｍｌとなるようにＰ
ＢＳで希釈したＢＣを添加した培地に交換し、１２時間培養した。培養終了後の細胞から
各群４枚の画像を取得し、それぞれの画像から３０本の筋管直径を画像処理ソフトウェア
Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて測定し、各画像の上位１０本から平均と標準偏差を算出した。尚
、１本の筋管直径は３ヶ所の測定結果の平均とした。対照群（ＣＯＮ）として、終濃度２
００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したＡＥを添加した培地の代わりに、同量のＰ
ＢＳを添加した培地を用いた以外は同様の手順でＣ２Ｃ１２を培養し筋管直径を測定した
。

［結果］
図６Ａは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））、
対照群（ＣＯＮ）又は秋ウコン抽出物添加群（ＡＥ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の
平均値（μｍ）と標準偏差を示す。

図６Ｂは、Ｄｅｘの不存在下（Ｄｅｘ（－））又はＤｅｘの存在下（Ｄｅｘ（＋））、
対照群（ＣＯＮ）又はビサクロン添加群（ＢＣ）で培養したＣ２Ｃ１２の筋管直径の平均
値（μｍ）と標準偏差を示す。
Ｄｅｘ誘導性の筋管直径の減少をＡＥ（図６Ａ）、ＢＣ（図６Ｂ）がともに抑制した。

＜実験２～５の考察＞
秋ウコン抽出物（ＡＥ）はＤｅｘ誘導性のＭＡＦｂｘタンパク質発現量の増加を有意に
減少させた（実験２）。このことは、実験１で確認されたｍＲＮＡ発現の結果に加え、Ａ
ＥがＤｅｘ誘導性骨格筋萎縮抑制効果を持つことを裏付ける。さらに、ＡＥ添加によりＦ
ｏｘｏ３の有意なｍＲＮＡ発現亢進が認められなかった（実験３）。このことから、ＡＥ
添加は、Ｆｏｘｏ３のｍＲＮＡ発現亢進を減弱させ、ユビキチンリガーゼの発現を促進す
る転写因子の発現量自体を減少させることで、Ｍａｆｂｘ及びＭｕｒｆ１のｍＲＮＡ発現
亢進抑制及びＭＡＦｂｘタンパク質発現亢進抑制を行うことが示唆された。さらに、ＡＥ
添加は、Ｄｅｘ誘導性のｐ７０Ｓ６Ｋの脱リン酸化を阻害する傾向も認められた（実験４
）。このｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の促進はＤｅｘ未添加群においても認められたことから
、ＡＥはタンパク質合成経路へも影響を及ぼし、タンパク質合成を促進する可能性も示唆
された。また、ＡＥ及びその成分であるビサクロン（ＢＣ）は筋管直径の萎縮を抑制した
ことから（実験５）、表現型における効果も示された。

本発明に係る、筋萎縮を阻害するための組成物は、飲食品及び医薬品の分野において有
用である。

Claims (6)

1. 水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物であって、ビサクロンを０．１重量％以上含み、前記水溶性ウコン抽出物は水、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒による抽出物である、組成物。
2. 水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮を阻害するための組成物であって、クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下であり、前記水溶性ウコン抽出物は水、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒による抽出物である、組成物。
3. 飲食品である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、ビサクロンを０．１重量％以上含み、前記水溶性ウコン抽出物は水、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒による抽出物である、組成物。
5. 水溶性ウコン抽出物を有効成分として含む、筋萎縮原因遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、クルクミンを含まない又はクルクミンの含有量が０．５重量％以下であり、前記水溶性ウコン抽出物は水、又は、水と親水性有機溶媒の混合溶媒による抽出物である、組成物。
6. 飲食品である、請求項４又は５に記載の組成物。

Images