CN114980906A - 用于增加细胞活力和寿命并减少分子老化的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了有助于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复力和/或促进寿命延长的组合物和方法。示例性的组合物包括嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、含金属的抗氧化剂和任选地另外的成分的组合，其中所述嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙和含金属的抗氧化剂可以是来自天然存在的实体如植物、细菌、酵母等的化学分离的化合物或提取物或其他制剂。有利地，所考虑的组合物有效减少和修复氧化应激、改善线粒体功能、增强DNA修复和端粒维持、增加脂肪酸代谢并调节组蛋白的脱乙酰化。更具体地，所考虑的组合物能够通过诱导OCT4、SOX和/或KLF4的表达和/或减少细胞衰老的生物标志物来增加细胞活力。

Description

用于增加细胞活力和寿命并减少分子老化的组合物和方法
本申请要求于2020年1月6日提交的第62/957573号美国临时申请的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及各种营养组合物的用途的组合物和方法，特别是当它们涉及减少细胞衰老，改善细胞应激恢复(cellular stress resilience)、自噬/线粒体自噬、机能恢复、细胞再生潜能，调节炎症和/或寿命包括通过影响细胞转录因子和表观遗传时钟对细胞进行重编程，以及减少细胞衰老的方法时。
背景技术
背景描述包括可有助于理解本公开内容的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。如果并入的参考文献中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语的定义并且不适用在该参考文献中该术语的定义。
本领域已知许多组合物和方法来调节哺乳动物的一种或多于一种代谢参数(例如，胰岛素或二甲双胍来调节葡萄糖)。然而，这些组合物中的许多是具有副作用的药剂。而且，大多数药物化合物特异性靶向受体或酶并因此只对系统提供孤立的作用。对其他代谢参数或途径的远端影响通常是无意的。
在营养物质方法中，已知具有多效性的各种化合物可以单独给予，或者与药物或第二营养物质一起给予，以增加(在某些情况下协同地)对通路或信号级联的期望效果。例如，如EP 2731599中所述，可以施用单独的槲皮素，或亮氨酸与低剂量二甲双胍以刺激sirtuin通路的输出。如在US 2018/0104248中所述的另一种已知的方法，使用苦茶碱和咖啡因或山嵛菜提取物的协同组合以调节情绪、精力、注意力、性欲、焦虑或疲劳。虽然在至少一些情况下这种组合可能是满足需要的，但是这种组合仅在主观层面上显示有效，并且未显示出对细胞衰老、细胞应激恢复和/或寿命的一个或多于一个方面有实质性影响。如Lopez-Otin等人，2013，Cell，153:1194-1217中报道的，衰老有几个标志，涵盖了许多遗传和表观遗传因素。因此，用于增加细胞活力和减少细胞衰老的优选的组合物将影响多于一种衰老因子。例如，用于逆转哺乳动物中的表观遗传时钟的细胞机制包括诱导表观遗传时钟基因的表达—例如通过上调Yamanaka转录因子—Oct4、Sox2和/或Klf4。另外，如Schafer等人，2020，JCI Insight，5:e133668中所述，细胞衰老至少部分特征在于衰老相关分泌表型(SASP)。
如US8759304中所教导的，为了解决衰老的至少一些方面，测试了各种端粒酶激活化合物，并且它们中的一些甚至用于营养补充品中。在此，所选的与黄芪总苷和人参皂苷相关的化合物用于增加端粒酶。然而，没有报道进一步的多效性。另一方面，如US9327005中所教导的，报道了通过施用腐殖型页岩的冷水提取物和/或苹果果实或苹果果实的皮的提取物，在体内增加了耗氧率、胞外酸化率和ATP的产生。然而，再一次地，尽管是满足需要的，生物效应被局限在相对狭窄的效果内。
因此，尽管在本领域中已知各种对细胞和生物体提供一种或多于一种有益效果的营养物质，但它们全部或几乎全部都有各种缺点。因此，需要提供改进的组合物和方法，其具有广谱多效活性，特别是减少细胞老化，改善细胞应激恢复、自噬/线粒体自噬、机能恢复、细胞再生，调节炎症和/或增加细胞寿命包括通过影响细胞转录因子、表观遗传时钟对细胞进行重编程，和/或减少细胞衰老。
发明内容
本文公开了各种组合物和方法，其帮助减少细胞老化，改善细胞应激恢复、自噬/线粒体自噬、机能恢复、细胞再生，调节炎症和/或提供增加的寿命机能恢复包括通过影响细胞转录因子、表观遗传时钟对细胞进行重编程，和/或减少细胞衰老。有利地，这样的组合物是包含药学上或营养学上可接受的成分的营养组合物，所述成分可以配制成多种形式用于口服施用和局部施用。
在本发明主题的一个方面，本发明人考虑用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复、优化细胞自噬/线粒体自噬、调节炎症的组合物，其包含细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂、和任选地(d)一种或多于一种另外的成分的组合。最典型地，将细胞保护制剂与营养学上或药学上可接受的载体一起配制用于口服施用。
在一些实施方案中，将包含细胞保护制剂的所考虑的组合物施用至对象(例如，哺乳动物)，用于增加细胞活力和/或减少细胞衰老的生物标志物。细胞衰老的示例性生物标志物包括生长分化因子15(GDF15)、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员6(FAS)、骨桥蛋白(OPN)、TNF受体1(TNFR1)、激活素A、趋化因子(C-C基序)配体3(CCL2)和/或IL-15。
另外或替代地，将包含细胞保护制剂的所考虑的组合物施用于对象，用于调节SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT6、Nrf2、SOD3、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、NAMPT、NMNAT、TOMM40、FOXO3/4/6、GLD-1、HSP25、SKN-1、CCL8、KLOTHO、PDK1、DRP1、POT1和/或DNA甲基化表观遗传时钟中的一种或多于一种的表达或细胞活性。
在一些实施方案中，本发明的主题包括用于逆转哺乳动物中的表观遗传时钟的组合物。例如，由嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙以及含金属的抗氧化剂制成的细胞保护组合物可以诱导OCT4、SOX2和KLF4中的一种或多于一种的表达。
在另外的或替代的实施方案中，由嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙以及含金属的抗氧化剂制成的细胞保护组合物可以通过调节一种或多于一种SASP因子来减少衰老相关分泌表型(SASP)，从而减少细胞衰老。本文公开的细胞保护组合物可以调节一种或多于一种SASP因子，所述SASP因子选自生长分化因子15(GDF15)、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员6(FAS)、骨桥蛋白(OPN)、TNF受体1(TNFR1)、激活素A、趋化因子(C-C基序)配体3(CCL2)和/或IL-15。优选地，本文公开的细胞保护组合物调节GDF15、OPN、FAS和/或激活素A中的一种或多于一种。更优选地，本文公开的细胞保护组合物调节GDF15、OPN和/或FAS中的一种或多于一种。最优选地，本文公开的细胞保护组合物调节(例如，减少)GDF15和/或OPN中的一种或多于一种。在相关的实施方案中，SASP因子中的一种的调节与暴露于或施用本文公开的细胞保护组合物之前的SASP因子的表达水平相关。在示例性实施方案中，在暴露于或施用本文公开的细胞保护组合物后观察到一种或多于一种SASP因子的调节，其中与在相应的按时间顺序比较的细胞中观察到的SASP水平相比，任意一种SASP因子在SASP之前的表达水平上调。
因此，从不同的角度来看，本发明人还预期了减少哺乳动物中的细胞衰老和炎症，改善细胞应激恢复、自噬/线粒体自噬和/或延长寿命的方法，其包括将细胞保护组合物以有效减少哺乳动物中的细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的量施用于哺乳动物的步骤。优选地，细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂、和任选地(d)一种或多于一种另外的成分的组合。在这样的方法中，进一步优选将细胞保护制剂与营养学上或药学上可接受的载体一起配制用于口服施用。
在本发明的主题的具体方面，本发明人考虑调节哺乳动物中的Yamanaka转录因子—Oct4、Sox2和/或Klf4的方法，其包括将本公开的细胞保护组合物以有效诱导哺乳动物中的OCT4、SOX2和/或KLF4表达的量施用于哺乳动物的步骤。所公开的细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。诱导OCT4、SOX2和/或KLF4表达的细胞保护组合物还可以包含一种或多于一种另外的成分。诱导多能性(例如重编程)包括上调OCT4、SOX2和KLF4基因中至少一种的表达。优选地，OCT4、SOX2和KLF4基因中的至少两种进行了上调。更优选地，OCT4、SOX2和KLF4基因中的每一种都进行了上调。
在本发明的主题的另一个具体方面，所考虑的方法包括通过调节(例如，减少或增加)表观遗传生物标志物，来调节(例如，部分逆转)哺乳动物的表观遗传时钟，其中所述方法包括将本公开的细胞保护组合物以有效减少或增加表观遗传时钟生物标志物的量施用于哺乳动物的步骤。在一些实施方案中，表观遗传生物标志物是衰老相关的DNA甲基化(DNAma)状态，其对应于DNAma时钟，因此在所公开的细胞保护组合物的存在下，所述状态可以被部分逆转。
在本发明的主题的另一个方面，本发明人考虑支持哺乳动物中线粒体功能的方法，其包括将细胞保护组合物以有效支持线粒体功能的量施用于哺乳动物的步骤，其中细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含至少(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。
在本发明的主题的另一个方面，本发明人考虑减少哺乳动物细胞中的氧化应激的方法，其包括将细胞保护组合物以有效减少氧化应激的量施用于哺乳动物的步骤，其中细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含至少(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。
在本发明的主题的另一个方面，本发明人还考虑减少哺乳动物中炎症的方法，其包括将细胞保护组合物以减少炎症的量施用于哺乳动物的步骤，其中细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含至少(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。
因此，本发明人还考虑刺激哺乳动物中的代谢的方法，其包括将细胞保护组合物以有效刺激代谢的量施用于哺乳动物的步骤。优选地，细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含至少(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。
在一些示例性实施方案中，嘌呤生物碱存在于Camilla属、可可(Theobroma)属、冬青(Ilex)属或咖啡(Coffea)属提取物中并作为其提供，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙存在于芸苔(Brassica)属提取物中并作为其提供，和/或含金属的抗氧化剂包含作为有机部分的配体的铜或锌。在其他实施方案中，嘌呤生物碱是苦茶碱、甲基大果咖啡碱、大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是异硫氰酸烯丙酯或2-苯乙基异硫氰酸酯，和/或含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物(或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物，较不优选氧化亚铜)。在其他实施方案中，嘌呤生物碱存在于Camilla属、可可属、冬青属或咖啡属提取物中并作为其提供，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙存在于芸苔属提取物中并作为其提供，和含金属的抗氧化剂包含作为有机部分的配体的铜或锌。在其他实施方案中，嘌呤生物碱是苦茶碱、甲基大果咖啡碱、大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是异硫氰酸烯丙酯或2-苯乙基异硫氰酸酯，和含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物(或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物)。在其他优选的实施方案中，嘌呤生物碱是苦茶碱，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙存在于块茎山萮菜(Eutremajaponicum)提取物中并作为其提供，和含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物。另外，所考虑的组合物还可以包括另外的营养成分，所述营养成分包括本文进一步公开的一种或多于一种外源性肠道支持和/或生酮放大化合物。
可以理解的是，所有成分可以是合成的、等同天然的、或天然来源的天然的、部分加工的、精制的或纯化的形式。例如，嘌呤生物碱可以是由前体合成，或从植物部分如茶叶、咖啡豆和/或咖啡果中分离。同样，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙可以是完全合成的，或从各种植物材料中分离的。而且，应该注意的是，所有的成分都可以置于营养学上可接受的基质中(例如，在原植物材料、发酵材料中，其可以包含或不包含微生物)或其它合适的载体中。因此，所考虑的成分可以是或来源于天然材料和提取物、重组DNA技术、微生物发酵、全有机合成及其任何合理的组合。
在特别优选的实施方案中，细胞保护制剂包含选自苦茶碱、大果咖啡碱、甲基大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因的嘌呤生物碱；选自铜-(I)-烟酸络合物或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物的含金属的抗氧化剂，以及选自块茎山萮菜提取物的异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙。更具体地，嘌呤可以是苦茶碱，含金属的抗氧化剂是烟酸亚铜，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是山嵛菜，并且细胞保护制剂还包含三丁酸甘油酯。最优选地，细胞保护制剂包含约60mg至1500mg的NAD3TM(由苦茶碱、烟酸亚铜和山嵛菜制成)与约200mg至1000mg的三丁酸甘油酯的组合。
另外，应该理解，所考虑的细胞保护制剂还可以包含另外的营养成分，所述营养成分包括一种或多于一种外源性肠道支持和/或生酮放大化合物(例如，三丁酸甘油酯、乙酰乙酸酯、三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、β-羟基丁酸酯(BHB)、丁酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、微生物部分、功能蛋白质、分泌的多糖、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖衍生的胞壁肽、酚类衍生的后生元及其组合)、SIRT增强剂或sirtuin激活化合物(STAC)(例如丁酸酯、中链和短链脂肪酸、油酸、非瑟酮、白藜芦醇、槲皮素、各种儿茶素、姜黄素、各种姜黄色素、酪醇、小檗碱、二氢小檗碱、阿魏酸)、非金属(类金属)硒、腐殖型页岩提取物、富里酸盐或富里酸及其衍生物、三丙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、棕榈油酸、油酸、γ-亚麻酸(GLA)、γ-生育三烯酚、γ-生育酚、铬、小檗碱、小檗碱衍生物、脱落酸、α硫辛酸、NAD增强剂(例如，烟酰胺、烟酰胺单核苷酸(NMN)和/或烟酸)、一种或多于一种植物大麻素(例如，大麻二酚(CBD)、大麻萜酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚酸)、姜辣素、姜酚、姜酮异构体、多酚和类黄酮(例如，黄烷-3-醇、黄酮醇、花青素、原花青素、表儿茶素、没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素3-O-没食子酸酯、咖啡酸衍生物、奎尼酸和绿原酸衍生物、可水解单宁衍生物(例如，石榴提取物中的鞣花单宁和没食子单宁、榄仁树属提取物、橡木提取物、阿米拉(印度醋栗)果实提取物)、L-麦角硫因和/或三萜、二萜和倍半萜、以及茶提取物，特别是绿茶或红茶提取物(其可以标准化或不标准化以具有特定的茶黄素和/或茶红素含量)。
优选地，用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的所考虑的组合物还包含一种或多于一种另外的营养成分。一种或多于一种另外的营养成分的实例包括生酮和/或肠道支持微生物组衍生的后生元化合物。示例性生酮和/或肠道支持微生物组衍生的后生元化合物包括乙酰乙酸酯、三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、β-羟基丁酸酯(BHB)、丁酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、微生物部分、功能蛋白质、分泌的多糖、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖衍生的胞壁肽、酚类衍生的后生元(例如，微生物代谢物，包括尿石素、异尿石素、雌马酚、肠内酯、肠二醇和8-异戊烯基柚皮素)。
用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的所考虑的组合物还包含作为一种或多于一种营养成分的SIRT增强剂。示例性SIRT增强剂包括非瑟酮、白藜芦醇、槲皮素、油酸和/或儿茶素。
如本文更详细公开的，所考虑的组合物可以包括赋予组合效应或甚至协同效应的另外的成分的组合。
为了提高功效，用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的所考虑的组合物包括细胞保护制剂，该制剂是(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙和(c)含金属的抗氧化剂和(d)另外的营养成分的组合，其中细胞保护制剂与营养学上或药学上可接受的载体一起配制用于口服施用。
另外，所考虑的主题包括减少哺乳动物细胞中氧化应激、自噬和/或增加或保持抗氧化活性的方法。该方法包括将细胞保护组合物以有效减少氧化应激的量施用于哺乳动物；其中细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂和任选地(d)一种或多于一种本文公开的另外的成分的组合。
有利地，本发明的主题还包括用于增加哺乳动物细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)酶活性的方法和组合物，其包括将本文公开的细胞保护组合物以有效增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)酶活性的量施用于哺乳动物。用于增加NAD+活性的所考虑的方法还包括抑制NAD+的降解。用于抑制NAD+降解的典型方法包括抑制细胞中CD38和/或CD157的活性。优选地，用于增加NAD+活性的方法包括施用本文公开的细胞保护组合物，其中细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂和任选地(d)一种或多于一种本文公开的另外的成分的组合。
最典型地，但不是必须地，该组合物可以配制成胶囊、片剂或粉末，和/或在单个剂量单位中递送25mg至1500mg的细胞保护制剂。例如，该组合物的至少50重量％可以是细胞保护制剂，或单个剂量单位包含至少50mg的细胞保护制剂。在其他实例中，嘌呤生物碱可以在单个剂量单位中以5mg至500mg的量存在，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙可以在单个剂量单位中以25mg至1000mg的量存在，和/或含金属的抗氧化剂可以在单个剂量单位中以1mg至100mg的量存在。
根据以下优选实施方案的详细描述以及附图，各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，同时附图中相同的数字表示相同的组分。
附图说明
图1A至图1F描述了用本文所示和所述的A、B、C或D组处理进行3小时(hr)处理的SIRT6、SIRT1、NRF2、p27、CDKN2B、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、Tomm40和SIRT4的mRNA数据的示例性结果。进行单向方差分析(ANOVA)以确定处理是否显著不同，并进行最小显著差异法(LSD)事后检验以确定显著性发生的位置。具有不同上标字母(a、b、c或d)的处理表示彼此不同的处理。
图2A至图2F描述了用本文所示和所述的A、B、C或D组处理进行24hr处理的SIRT6、SIRT1、NRF2、p27、CDKN2B、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、Tomm40和SIRT4的mRNA数据的示例性结果。进行单向ANOVA以确定处理是否显著不同，并进行LSD事后检验以确定显著性发生的位置。具有不同上标字母(a、b、c或d)的处理表示彼此不同的处理。
图3描述了用A、B、C或D组处理3小时和24小时的SIRT活性的示例性结果，如本文所示和所述。进行单向ANOVA以确定处理是否显著不同，并进行LSD事后检验以确定显著性发生的位置。具有不同上标字母的处理表示彼此不同的处理。
图4描述了用A、B、C或D组处理24小时后柠檬酸合酶活性(线粒体容量标记)的示例性结果，如本文所示和所述。进行单向ANOVA以确定处理是否显著不同，但是ANOVA得出p＝0.367。
图5A描述了在没有过氧化氢的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用过氧化氢(H2O2)孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的细胞活力(DNA/孔(ug))的示例性结果。
图5B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的总抗氧化能力(Trolox)的示例性结果。
图6A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图6B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的DNA损伤的示例性结果。
图6C描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的细胞氧化应激的示例性结果。
图7A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照，仅载剂(veh))和用所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图7B描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照，仅载剂(veh))和用所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯孵育的细胞中的NAMPT蛋白质水平的示例性结果。
图7C描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照，仅载剂(veh))和用所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯孵育的细胞中的PGC1α蛋白质水平的示例性结果。
图8A描述了在没有过氧化氢的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用过氧化氢(H2O2)孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的细胞活力(DNA/孔(ug))的示例性结果。
图8B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的总抗氧化能力(Trolox)的示例性结果。
图9A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图9B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的DNA损伤的示例性结果。
图9C描述了通过测量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞中NLRP3蛋白质的量来定量炎症小体诱导的示例性结果。
图10A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图10B描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的NAMPT蛋白质水平的示例性结果。
图10C描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的PGC1α蛋白质水平的示例性结果。
图10D描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的总SIRT活性的示例性结果。
图11A描述了C2C12(肌肉细胞)的代表性蛋白质凝胶，其中显示了p-H2AX、LC3I、LC3II、4HNE和NLRP3的免疫印迹分析，以及丽春红蛋白染色，如所示。
图11B描述了EOMA(内皮细胞)的代表性蛋白凝胶，其中显示了p-H2AX、LC3I、LC3II、4HNE和NLRP3的免疫印迹分析，以及丽春红蛋白染色，如所示。
具体实施方式
本发明人现已发现，可以制备对细胞衰老、细胞应激恢复、寿命以及与其相关的通路和通路元件有显著影响的营养组合物。在特别优选的方面，所考虑的组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合，其中这些成分可以是分离的和/或纯化的(例如，具有至少90摩尔％的化学纯度)，或者其中这些成分可以以来自植物、酵母或动物的提取物或其他制剂的形式存在或提供。
值得注意的是，在另外优选的方面，所考虑的组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂、和(d)一种或多于一种另外的成分的组合，所述另外的成分选自：甲基供体基团、一种或多于一种外源性肠道支持和/或生酮放大化合物、SIRT增强剂或sirtuin激活化合物(STAC)、非金属(类金属)硒、腐殖型页岩提取物、富里酸盐或富里酸及其衍生物、三丙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、棕榈烯酸、油酸、γ-亚麻酸(GLA)、γ-生育三烯酚、γ-生育酚、铬、小檗碱、小檗碱衍生物、脱落酸、α硫辛酸、NAD增强剂(例如，烟酰胺、烟酰胺单核苷酸(NMN)和/或烟酸)、一种或多于一种植物大麻素(例如，大麻二酚(CBD)、大麻萜酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚酸)、姜辣素、姜酚、姜酮异构体、多酚(例如，咖啡酸衍生物、奎尼酸和绿原酸衍生物)和类黄酮(例如，黄烷-3-醇、黄酮醇、花青素、原花青素)、水解单宁衍生物(例如，石榴提取物中的鞣花单宁和没食子单宁、榄仁树属提取物、橡木提取物、阿米拉(印度醋栗)果实提取物)、L-麦角硫因和/或三萜、二萜和倍半萜、以及茶提取物。
许多嘌呤生物碱可用于细胞保护制剂组合物中。在一些示例性实施方案中，嘌呤生物碱存在于Camilla属、可可属、冬青属或咖啡属提取物、或古布阿苏
Figure BDA0003730617610000112
植物提取物、或锦葵科物种种子提取物中并作为其提供。在其他优选的实施方案中，嘌呤生物碱是苦茶碱、甲基大果咖啡碱、大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因。同样地，在一些优选的实施方案中，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙存在于芸苔属提取物(例如，山嵛菜提取物)中并作为其提供，而在其他优选的实施方案中，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是异硫氰酸烯丙酯或2-苯乙基异硫氰酸酯。另外，合适的冬青属物种的特定实例包括代茶冬青(Yaupon)、瓜尤萨(Guayusa)和马黛茶(Yerba Mate)。
此外，在一些优选的实施方案中，含金属的抗氧化剂包括作为有机部分的配体的铜(或其他过渡金属)或锌，而在其他优选的实施方案中，含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物(当然，在替代的实施方案中是与乳清酸盐、氨基酸等的铜-II-络合物或螯合物，甚至认为胶体铜也是合适的)。
因此，如下面更详细描述的，用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的一种示例性组合物将包括细胞保护制剂，所述制剂包含至少本文公开的(a)苦茶碱，(b)作为异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙来源的山萮菜提取物，(c)作为抗氧化剂的铜-(I)-烟酸络合物；和任选地(d)一种或多于一种另外的成分的组合。在使用苦茶碱的情况下，可以使用各种来源。例如，可以使用苦茶碱形式的市售
Figure BDA0003730617610000111
如这里所提到的，所有成分可以是合成的、等同天然的、或天然来源的天然的、部分加工的、精制的或纯化的形式。例如，嘌呤生物碱可以是由前体合成，或从植物部分如茶叶、咖啡豆和/或咖啡果中分离。同样，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙可以是完全合成的，或从各种植物材料中分离的。而且，应该注意的是，所有的成分都可以置于营养学上可接受的基质中(例如，在原植物材料、发酵材料中，其可以包含或不包含微生物)或其它合适的载体中。因此，所考虑的成分可以是或来源于天然材料和提取物、重组DNA技术、微生物发酵、全有机合成及其任何合理的组合。
在本发明主题的具体方面，本发明人考虑调节哺乳动物细胞中的Yamanaka转录因子—Oct4、Sox2和/或Klf4的方法。Yamanaka因子在本领域中称为“重编程”因子，因为它们能够在细胞培养条件下重置体细胞表观基因组。参见例如Schmidt等人，2012，GenomeBiology，13:251。因此，本发明的主题包括用于诱导Yamanaka转录因子表达的方法，所述方法包括将本公开的细胞保护组合物以有效诱导OCT4、SOX2和/或KLF4基因表达的量施用于哺乳动物的步骤，其中细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。细胞保护组合物还可以包含另外的成分。优选地，细胞保护组合物诱导OCT4、SOX2和KLF4基因中的每一种的表达。
另外，或替代地，所考虑的方法包括通过调节(例如，减少或增加)表观遗传生物标志物，来逆转哺乳动物的表观遗传时钟，其中所述方法包括将本公开的细胞保护组合物以有效减少或增加表观遗传时钟生物标志物的量施用于哺乳动物的步骤。在一些实施方案中，表观遗传生物标志物是衰老相关的DNA甲基化(DNAma)状态，其对应于DNAma时钟。更具体地，本发明的主题包括通过将所公开的细胞保护组合物施用于哺乳动物来至少部分逆转Horvath表观遗传时钟的方法。参见Horvath和Raj，2018，Nature Reviews Genetics，19:371-384；和Fahy等人，2019，Aging Cell，18:e13028。
能够上调OCT4、SOX2和/或KLF4中的一种或多于一种的基因表达或引起表观遗传时钟(例如，表观遗传时钟生物标志物)部分逆转的所考虑的细胞保护组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合。典型地，嘌呤生物碱是Camilla属、可可属、冬青属或咖啡属的提取物、苦茶碱、大果咖啡碱、甲基大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因。更典型地，嘌呤生物碱是苦茶碱、甲基大果咖啡碱或大果咖啡碱。本发明人已出人意料地发现，添加NAD3TM(由嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙和含金属的抗氧化剂制成)对细胞衰老产生另外的有益效果，包括上调Yamanaka因子和/或引起表观遗传时钟生物标志物的部分逆转。
在另外的方面，细胞保护制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂、和(d)甲基供体基团的组合。甲基供体基团的非限制性实例包括S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)、甜菜碱、左旋叶酸((6S)-5-MTHF)、甲磺酰甲烷(MSM)和甲基钴胺素(维生素B12的形式)。
基于下文更详细呈现的实验发现和数据，认为细胞保护制剂的成分具有处理多个生物系统的多种所需和多效性。特别地，认为所考虑的组合物和方法支持并改善线粒体功能和完整性(例如，通过SIRT1、SIRT4、整体SIRT1-7活性、PGC-1α、TOMM40上调)，提供抗炎作用和免疫调节(例如，通过NLRP3/炎症小体下调)，刺激长寿基因表达/活性(例如，通过上调SIRT蛋白)，优化NAD代谢通路以增加能量代谢(例如，通过上调PGC-1α)，改善DNA修复过程(例如，通过SIRT1和SIRT6上调)，和/或增加端粒稳定性/长度(例如，通过SIRT1和SIRT6上调)。
更特别地，所考虑的组合物和方法将有利地影响一种或多于一种生理标志物，所述生理标志物与调节细胞重编程、表观遗传时钟调节(例如，DNA甲基化)、线粒体完整性和功能、炎症和细胞应激反应、能量代谢、特别是脂肪酸氧化、寿命、DNA修复和/或端粒维持/延长的通路相关。例如，如下文更详细描述的，所考虑的组合物能够有利地调节控制细胞完整性的各种应激反应机制和通路。在其他通路中，所考虑的组合物可以影响应激反应蛋白(例如，通过上调)，例如热休克蛋白-Hsp70、Hsp16和/或Hsp90，和/或超氧化物歧化酶3(SOD3)以及Wnt/β-连环蛋白或Lin-44/Wnt信号通路，包括ELT-3转录因子的衰老相关通路，或者可以下调包括Mom-2/Wnt或Cwn-2/Wnt信号的通路。因此，从系统的角度来看，所考虑的组合物将有益地调节自噬和/或线粒体自噬，增加应激抗性和应激反应，帮助维持DNA完整性和修复，并促进端粒完整性，所有这些都被认为是长寿的标志。而且，由于本文所述组合物的多效性，相互作用的信号通路受到影响，因此提供了多机制的细胞保护作用，其驱动细胞代谢和修复以及对与健康和寿命相关的特征的应激反应。认为这种作用在细胞水平、组织水平、甚至全身水平上起作用。
在第一实施方案中，标志物是SIRT1，这是一种NAD依赖性蛋白脱乙酰酶，其将转录调节直接与细胞内能量联系起来，还已知它参与协调几种分离的细胞功能，包括细胞周期、对DNA损伤的反应、代谢、凋亡和自噬。而且，SIRT1可以通过组蛋白的脱乙酰化来调节染色质功能，从而可以促进组蛋白和DNA甲基化的改变，导致受甲基化或其他表观遗传变化影响的基因的转录抑制。另外，已知SIRT1使多种转录因子和共调节剂脱乙酰化，从而正调节和负调节靶基因表达。例如，SIRT1显示脱乙酰化并影响PGC1-α/ERR-α复合物的两个成员的活性，它们是必需的代谢调节转录因子。
关于SIRT1对能量代谢的功能，应该理解，SIRT1作为NAD(+)/NADH的胞质比的传感器，其受葡萄糖剥夺和与热量限制相关的代谢变化所改变。而且，SIRT1也是eNoSC(能量依赖性核仁沉默复合物)的组成部分，eNoSC是介导rDNA沉默以响应细胞内能量状态并通过募集组蛋白修饰酶来发挥作用的复合物。eNoSC复合物能够感知细胞的能量状态：在葡萄糖饥饿时，NAD(+)/NADP(+)比率的升高激活SIRT1。
关于DNA修复，提出SIRT1还通过端粒长度的正调节有助于基因组的完整性，并且SIRT1通过抑制参与DNA修复的基因(如XPC和TP73)、脱乙酰化XRCC6/Ku70以及促进另外的因子募集到受损DNA的位点而参与DNA损伤反应。例如，SIRT1脱乙酰化的NBN可以募集ATM以启动DNA修复，并且SIRT1脱乙酰化的XPA可以与RPA2相互作用。而且，SIRT1还使WRN脱乙酰化，从而调节其解旋酶和核酸外切酶活性，并调节WRN核转位以响应DNA损伤。另外，SIRT1使APEX1脱乙酰化，并通过促进APEX1与XRCC1结合来刺激细胞AP(无嘌呤位点)核酸内切酶活性。最后，还认为SIRT1使XRCC6/Ku70在Lys-539和Lys-542处脱乙酰化，导致其将BAX与线粒体隔离，从而抑制应激诱导的凋亡。
在第二实施方案中，标记物是SIRT4，它通常位于细胞的细胞质、线粒体和细胞核中，并且广泛表达。认为SIRT4具有多种催化功能，并报道了其作为NAD依赖性蛋白硫辛酰胺酶(lipoamidase)、ADP-核糖基转移酶和脱乙酰酶发挥作用。在大多数情况下，与催化除去乙酰赖氨酸修饰相比，SIRT4更有效地催化除去硫辛酰赖氨酸修饰和生物素赖氨酸修饰。因此，丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)的活性可以通过来自E2组分DLAT的硫辛酰胺辅因子的酶促水解，以不依赖磷酸化的方式进行抑制。SIRT4还催化ADP-核糖基转移到靶蛋白上，包括线粒体GLUD1(谷氨酸脱氢酶1)，抑制GLUD1酶活性。因此，SIRT4可以通过介导GLUD1的单ADP-核糖基化作为线粒体谷氨酰胺代谢的负调节剂：表达以响应DNA损伤，并通过抑制GLUD1负调节回补，导致谷氨酰胺代谢进入三羧酸循环受阻，并促进细胞周期停滞。响应于mTORC1信号，SIRT4表达受到抑制，从而促进回补和细胞增殖。而且，SIRT4还作为NAD依赖性蛋白脱乙酰酶，介导MLYCD的Lys-471的脱乙酰化，抑制其活性，从而作为脂质稳态的调节剂。最后，还报道了SIRT4通过抑制PPARA转录激活来控制脂肪酸氧化。
在第三实施方案中，标志物是SIRT6。顾名思义，SIRT6是NAD依赖性酶的sirtuin家族的成员，与细胞应激抗性、基因组稳定性、衰老和能量稳态有关。SIRT6定位于细胞核，表现出ADP-核糖基转移酶和组蛋白脱乙酰酶活性，并在DNA修复、端粒染色质的维持、炎症、脂质和葡萄糖代谢中起作用。而且，还报道了SIRT6为应激反应蛋白脱乙酰酶和单ADP核糖基转移酶。
关于DNA修复，报道了SIRT6为染色质相关蛋白，其是哺乳动物细胞DNA损伤正常碱基切除修复所需的。而且，SIRT6对组蛋白H3K9Ac和H3K56Ac具有脱乙酰酶活性，并在细胞周期的S期调节端粒染色质中组蛋白H3的乙酰化。值得注意的是，还报道了SIRT6使NF-kappa-B靶启动子上的组蛋白H3K9Ac脱乙酰化，并因此可以下调NF-kappa-B靶基因子集的表达。另外，SIRT6还可以作为转录因子HIF1A的辅阻遏物，从而控制多个糖酵解基因的表达，以调节葡萄糖稳态，这对能量代谢具有重要影响。
因此，在功能层面上，SIRT6可视为基因组稳定性的必需因子、TNF产生的调节剂以及细胞衰老和凋亡的调节剂。
在第四实施方案中，标志物是NRF2(核因子(红细胞衍生2)-样2)，已知其调节各种抗氧化蛋白的表达，保护以免受由损伤和炎症引发的氧化损伤。因此，NRF2的系统和局部功能在针对氧化应激和炎症介质信号和炎症的细胞保护中是重要的。从机制上来看，NRF2作为转录激活剂，其与靶基因启动子区的抗氧化应答(ARE)元件结合，所述靶基因启动子区带有这些元件。因此，NRF2是响应氧化应激所需基因协同上调的关键介质。
在第五实施方案中，标志物是p27(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B),其作为细胞周期进程的调节剂。更具体地，认为p27抑制与细胞周期蛋白A结合的CDK2的激酶活性，但认为其对与SPDYA结合的CDK2几乎没有抑制活性。P27也是细胞周期蛋白E-复合物和细胞周期蛋白A-CDK2复合物的有效抑制剂，与细胞周期蛋白D-CDK4复合物形成复合物，并参与CCND1-CDK4复合物激活的组装、稳定性和调节。值得注意的是，p27可以作为细胞周期蛋白D-CDK4复合物的抑制剂或激活剂，这取决于其磷酸化状态和/或化学计量。在功能层面上，认为p27是肿瘤抑制剂，因为其具有作为细胞周期的调节剂的功能，因此有助于维持细胞稳态和完整性。
在第六实施方案中，标志物是CDKN2B/p15。这种蛋白质作为细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂B(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)，其与CDK4或CDK6形成复合物，从而阻止CDK激酶的激活。因此，在功能层面上，CDKN2B作为控制细胞周期G1进程的细胞生长调节剂发挥作用，并因此有助于维持细胞稳态和完整性。
在第七实施方案中，本文公开的细胞保护组合物对标志物ATG12(也称为自噬相关蛋白12)的细胞水平产生影响。ATG12是参与自噬泡形成的泛素样蛋白。自噬是大量蛋白质降解的过程，其中包括细胞器的细胞质成分被包裹在称为自噬体的双膜结构中，并递送到溶酶体或液泡中进行降解。通过泛素样缀合系统与ATG5缀合，所述缀合系统还涉及作为E1样激活酶的ATG7(作为E2样缀合酶的ATG10对其功能是必需的)。ATG12-ATG5缀合物作为E3样酶，是ATG8家族蛋白脂质化及其与囊泡膜结合所必需的。因此，ATG12参与细胞维持、支持细胞完整性和蛋白质更新。而且，还报道了ATG12与ATG3的缀合有助于调节线粒体稳态(可能通过与Bcl-2的相互作用)和细胞死亡。在这种情况下，其他合适的标记物包括与调节线粒体自噬/自噬相关的标记物，特别是转录因子、共激活剂和调节蛋白，例如HMGB1、BNIP3、NIX、ACAA2、GABARAPL1等。
在第八实施方案中，本文公开的细胞保护组合物对标志物LCB3(SPTLC3)的细胞水平产生影响：LCB3是丝氨酸棕榈酰转移酶，与LCB1/SPTLC1形成的异二聚体构成催化核心。丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)复合物的组成决定了底物偏好。SPTLC1-SPTLC3-SPTSSA同工酶使用C14-CoA和C16-CoA作为底物，而SPTLC1-SPTLC3-SPTSSB能够在没有明显偏好的情况下使用更广泛的酰基辅酶A。因此，LCB3是鞘脂代谢的重要调节剂。值得注意的是，已证明鞘脂代谢物，如神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸是涉及凋亡、增殖、应激反应、坏死、炎症、自噬、衰老和分化的信号级联中的重要介质。因此，LCB3是调节应激反应、自噬和衰老的重要因子。参考图6A，在用β-羟基丁酸酯(BHB)、大麻二酚(CBD)或硒孵育的细胞中观察到自噬增加。
在第九实施方案中，本文公开的细胞保护组合物对标志物NLRP3(cryoporin)的细胞水平产生影响。传统上认为NLRP是一种PRP(病原体识别受体)，并且其主要在巨噬细胞中表达。而且，NLRP3也是炎症小体的组成部分，并检测受损细胞的产物，如胞外ATP。作为NLRP3炎症小体的传感器部分，NLRP3在先天免疫和炎症中起着关键作用。响应于病原体和其他损伤相关信号，NLRP3启动炎症小体聚合复合物的形成，其由NLRP3、PYCARD和CASP1(可能还有CASP4和CASP5)制成。proCASP1在炎症小体中的募集促进其激活和CASP1催化的IL1B和IL18在胞外环境中的成熟和分泌。炎症小体还可以诱导细胞焦亡，即程序性细胞死亡的炎症形式。在静息状态下，NLRP3是自动抑制的。NLRP3激活刺激包括胞外ATP、活性氧、K(+)渗出量、尿酸二氢钠或胆固醇晶体、β-淀粉样纤维、环境或工业颗粒和纳米颗粒、胞质dsRNA等。与炎症小体激活无关，调节辅助型细胞2(Th2)的分化，并在Th2细胞依赖性哮喘和肿瘤生长中发挥作用。因此，NLRP3是细胞对细胞损伤和氧化应激的应激反应中的重要参与者。
在第十实施方案中，本文公开的细胞保护组合物对标志物PGC-1α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1-α)的细胞水平产生影响。PGC-1α作为类固醇受体和核受体的转录共激活剂起作用，从而增加解偶联蛋白启动子上PPARG和甲状腺激素受体的转录活性。而且，PGC-1α可以调节有助于适应性产热程序的关键线粒体基因，并通过协调葡萄糖和脂肪酸代谢中涉及的大量基因的表达来进一步在响应饮食可用性的代谢重编程中发挥重要作用。因此，PGC-1α是调节参与能量代谢的基因的重要标志物(并且可以视为线粒体生物发生的主要调节剂)。值得注意的是，也认为PGC-1α参与了昼夜节律的整合，以及能量代谢的整合(因为PGC-1α是时钟基因如ARNTL/BMAL1和NR1D1的振荡表达所必需的)。
在第十一实施方案中，本文公开的细胞保护组合物对标志物TOMM40(线粒体外膜40同源物转位酶(酵母))的细胞水平产生影响。TOMM40是一种位于线粒体外膜的蛋白质，是线粒体外膜(TOM)复合物转位酶的通道形成亚基，对将蛋白质前体输入到线粒体非常重要。因此，TOMM40可用作线粒体功能和健康的合适标志物。
在第十二实施方案中，本文公开的细胞保护组合物使Dicer蛋白的水平升高。Dicer蛋白(即内切核糖核酸酶Dicer或具有RNase基序的解旋酶)是由DICER基因编码的酶，其切割双链RNA(dsRNA)和前体微RNA(pre-miRNA)。据报道，降低Dicer水平会导致退行性疾病和退变组织。充足水平的Dicer提供了病毒免疫和DNA修复，后者的缺乏经常导致致癌突变。
在第十三实施方案中，本文公开的细胞保护组合物对烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1(NMNAT1)的细胞水平产生影响(例如增加)。NMNAT1是催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成的酶。据报道，NMNAT1细胞水平的降低和NMNAT1基因的突变与细胞和组织的变性有关。参见例如，Koenekoop等人，2013，Nat.Genet.44:1035-1039。
在第十四实施方案中，本文公开的细胞保护组合物通过调节(例如，增加或减少)一种或多于一种SASP因子来降低衰老相关分泌表型(SASP)的细胞水平。本文公开的细胞保护组合物可以调节一种或多于一种SASP因子，所述SASP因子选自生长分化因子15(GDF15)、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员6(FAS)、骨桥蛋白(OPN)、TNF受体1(TNFR1)、激活素A、趋化因子(C-C基序)配体3(CCL2)和/或IL-15。优选地，本文公开的细胞保护组合物调节GDF15、OPN、FAS和/或激活素A中的至少一种或多于一种。更优选地，本文公开的细胞保护组合物调节GDF15、OPN和/或FAS中的至少一种或多于一种。最优选地，本文公开的细胞保护组合物调节GDF15和/或OPN中的一种或多于一种。
在相关的实施方案中，一种或多于一种SASP因子的调节与暴露于或施用本文公开的细胞保护组合物之前的任意表达水平相关。例如，在暴露于或施用本文公开的细胞保护组合物后可以观察到一种或多于一种SASP因子的降低，其中与在相应的按时间顺序比较的细胞中观察到的SASP水平相比，任意一种SASP因子在SASP之前的表达水平上调。按时间顺序比较的细胞可以是在暴露于本文公开的细胞保护组合物之前所测定的相同细胞类型。参见例如Schafer等人，2020，JCI Insight，5:e133668。在具体实施方案中，一种或多于一种SASP因子的降低为降低至少约5％，优选至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％。
当然，应该理解，本文提出的所考虑的组合物和方法将不仅有利地影响一种上述标志物，而且可以调节两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或所有上述标志物，可能以协同方式发挥多效性。例如，在一种组合物中用成分的组合可以观察到多效性，其中成分的组合以前没有在一种组合物中组合在一起。另外或替代地，可以从成分的组合中观察到协同效应，其中每种成分单独施用与成分的组合作为一种组合物施用或同时施用以充分组合地向对象提供成分时不产生相同的结果。
因此，所考虑的组合物将配制成不仅影响一种上述标志物，而且可以调节两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或所有上述标志物(可能以协同方式)。因此，可以通过多种通路实现(优选协同)关于线粒体完整性和功能、炎症和细胞应激反应、能量代谢、特别是脂肪酸氧化、寿命、DNA修复和/或端粒维持/延长中至少一种的效果。
为此，本发明人考虑，组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂、和任选地(d)一种或多于一种另外的成分的组合。优选地，细胞保护制剂中组分的组合的量和比例能有效改善线粒体完整性和功能、炎症和细胞应激反应、表观遗传时钟的调节、细胞衰老标志物的调节、能量代谢，特别是脂肪酸氧化、自噬/线粒体自噬、再生干细胞潜能、寿命、DNA修复和/或端粒维持/延长中的至少一种。
在优选的实施例中，考虑的细胞保护制剂组合物将在单个剂量单位中递送10mg至500mg，或10mg至800mg，或20mg至1000mg，或30mg至1200mg，或50mg至1500mg，或100mg至2000mg，或甚至更多的细胞保护制剂。从不同的角度来看，组合物的至少20重量％，或至少30重量％，或至少40重量％，或至少50重量％，或至少60重量％，或至少70重量％，或至少80重量％，或至少90重量％将是细胞保护制剂。因此，优选的口服单个剂量单位(或推荐的日摄入量)为20mg至200mg，或40mg至400mg，或60mg至600mg，或80mg至800mg，或100mg至1000mg，或200mg至2000mg，在某些情况下甚至更高。
优选地，在单个剂量单位中，嘌呤生物碱在所考虑的制剂中以10mg至400mg，例如10mg至100mg，或20mg至200mg，或30mg至300mg，或40mg至400mg，或50mg至500mg，或50mg至750mg，或100mg至1000mg，或200mg至2000mg的量存在。同样，在使用提取物或植物制剂的单个剂量单位中，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙以10mg至150mg，或20mg至400mg，或50mg至750mg，或75mg至1000mg，或100mg至1500mg，或250mg至2500mg的量存在。当使用分离的异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙时，在单个剂量单位中，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙以1mg至15mg，或2mg至40mg，或5mg至75mg，或10mg至100mg，或20mg至150mg，或50mg至250mg，或甚至更高的量存在。根据含金属的抗氧化剂的类型，在单个剂量单位中，含金属的抗氧化剂可以以1mcg至1mg，或10mcg至100mcg，或100mcg至1mg，或1mg至20mg，或5mg至75mg，或10mg至100mg，或20mg至150mg，或50mg至250mg，或甚至更高的量存在。
例如，一种示例性的组合物将包括苦茶碱(例如，纯度至少90摩尔％，更优选至少95摩尔％)、作为异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙来源的山嵛菜提取物(优选标准化为异硫氰酸酯)和作为含金属的抗氧化剂的烟酸亚铜。在其他优选的实施例中，将组合物配制成用于口服施用(例如，作为剂量单位的胶囊或片剂)，并且在单个剂量单位中包含10mg至500mg的量的苦茶碱，在单个剂量单位中包含50mg至1000mg的量的山嵛菜提取物，和在单个剂量单位中包含1mcg至100mg的量的烟酸亚铜。
与嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙和含金属的抗氧化剂组合(例如，NAD3TM)的所考虑的另外的成分包括一种或多于一种外源性肠道支持和/或生酮放大化合物、SIRT增强剂或sirtuin激活化合物(STAC)、非金属(类金属)硒、腐殖型页岩提取物、富里酸盐或富里酸及其衍生物、三丙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、棕榈油酸、油酸、γ-亚麻酸(GLA)、γ-生育三烯酚、γ-生育酚、铬、小檗碱、小檗碱衍生物、脱落酸、α硫辛酸、NAD增强剂(例如，烟酰胺、烟酰胺单核苷酸(NMN)和/或烟酸)、一种或多于一种植物大麻素(例如，大麻二酚(CBD)、大麻萜酚、大麻二酚酸、四氢大麻酚酸)、姜辣素、姜酚、姜酮异构体、多酚(例如，咖啡酸衍生物、奎尼酸和绿原酸衍生物)和类黄酮(例如，黄烷-3-醇、黄酮醇、花青素、原花青素)、水解单宁衍生物(例如，石榴提取物中的鞣花单宁和没食子单宁、榄仁树属提取物、橡木提取物、阿米拉(印度醋栗)果实提取物)、L-麦角硫因和/或三萜、二萜和倍半萜、以及茶提取物，特别是绿茶或红茶提取物(其可以标准化或不标准化以具有特定的茶黄素和/或茶红素含量)。
许多肠道支持和/或生酮放大化合物可以作为一种或多于一种另外的营养成分掺入细胞保护制剂组合物中。本文所用的肠道支持微生物组衍生的后生元和/或生酮放大也可称为肠道支持微生物组衍生的后生元和/或生酮免疫调节成分。肠道支持微生物组衍生的后生元和/或生酮放大成分的合适实例包括乙酰乙酸酯、三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、β-羟基丁酸酯(BHB)、丁酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、微生物部分、功能蛋白质、分泌的多糖、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖衍生的胞壁肽、酚类衍生的后生元(例如，微生物代谢物，包括尿石素、异尿石素、雌马酚、肠内酯、肠二醇和8-异戊烯基柚皮素)。
另外或替代地，所考虑的细胞保护制剂可以包括SIRT增强剂或sirtuin激活化合物(STAC)，其实例包括丁酸酯、中链和短链脂肪酸、油酸、非瑟酮、白藜芦醇、槲皮素、各种儿茶素、姜黄素、类姜黄素、酪醇、小檗碱、二氢小檗碱和阿魏酸。
如本文所述，所考虑的细胞保护制剂可以包括类黄酮，其实例包括黄烷-3-醇、黄酮醇、花青素和原花青素。更具体的实例包括表儿茶素、没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素3-O-没食子酸酯。
此外，除了富里酸盐或富里酸之外，所考虑的细胞保护制剂可以是富里酸盐或富里酸的衍生物，其非限制性实例公开在US2016/0066603和US6440436中，这两者的全部内容通过引用并入本文。
值得注意的是，本发明人已出人意料地发现，向NAD3TM中添加三丁酸甘油酯可对炎症和衰老产生额外的有益效果，其中NAD3TM的组合物由嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙和含金属的抗氧化剂组成。不受其作用机制的任何特定理论的束缚，三丁酸甘油酯有助于在结肠上皮细胞中形成更紧密的连接，从而减少血液中循环的肠道废物和全身性炎症，进而减少衰老。本发明人出人意料地发现，这种特定的组合物具有协同效应，并且对于肠-脑-心-迷走神经轴是理想的，因为Cu(I)改善心脏健康，并且苦茶碱作用于脑细胞以改善情绪、精力和注意力。
在典型的实施方案中，用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的细胞保护制剂组合物的嘌呤生物碱是苦茶碱、大果咖啡碱、甲基大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因。在其他典型的实施方案中，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是异硫氰酸烯丙酯或2-苯乙基异硫氰酸酯。在其他典型的实施方案中，含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物。
在具体实施例中，细胞保护制剂包含嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、含金属的抗氧化剂，并且可以施用烟酸和/或三丁酸甘油酯以减少细胞衰老，其中细胞保护制剂包含嘌呤生物碱、异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、含金属的抗氧化剂，逆转哺乳动物的表观遗传时钟包括诱导表观遗传时钟基因的表达—例如通过上调Yamanaka转录因子—Oct4、Sox2和/或Klf4。另外，如Schafer等人，2020，JCI Insight，5:e133668中所述，细胞衰老至少部分特征在于衰老相关分泌表型(SASP)。
如示例性结果(例如，图7B和10B)所示，本公开的方法和组合物支持烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)细胞浓度和净状态，如NMNAT基因表达、NAMPT蛋白水平增加和NLRP3诱导水平降低所示。因此，用于减少细胞衰老、改善细胞应激恢复和/或延长寿命的所考虑的方法和组合物包括所公开的具有细胞保护制剂的细胞保护组合物，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂和任选地(d)一种或多于一种另外的成分的组合，所述另外的成分包括硒、多酚、三丁酸甘油酯和/或BHB。除了增加NAD+合成的方法和组合物，本发明的主题还包括减少NAD+降解。通常，细胞保护方法和组合物通过抑制CD38和/或CD157的活性来抑制NAD+降解。参见例如Wang等人，2019，Front Physiol.，10:1-10和Ruan等人，2018，Pharmacol Res.128:345-358，这两者的全部内容通过引用并入本文。
除了三丁酸甘油酯之外，丁酸酯、BHB和PHB以及其他脂肪酸也考虑存在于组合物中。这种脂肪酸的实例包括油酸、三丙酸甘油酯和三乙酸甘油酯。此外，短链脂肪酸如棕榈油酸或γ-亚麻酸(GLA)可改善皮肤状况，如湿疹、特应性皮炎。
然而，应该理解，除了上述化合物之外或作为上述化合物的替代物，细胞保护制剂中可以包括许多替代化合物。例如，苦茶碱可以由一种或多于一种苦茶碱前药、苦茶碱代谢物和/或苦茶碱类似物替代(或补充)。例如，这种化合物包括大果咖啡碱或甲基大果咖啡碱、咖啡因、甲基化或乙酰化的苦茶碱等。同样，山嵛菜提取物可以用属于十字花科(Brassicaceae)科的植物或芽(例如，辣根(Armoracia rusticana))的部分的各种替代提取物或制剂(如干燥的、粉末化的等)替代或补充。其他合适的植物制剂包括野樱梅(Aronia)，其可以是榨汁(可进一步加工)、干燥粉末或提取物的形式。替代地，或另外，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙也可以是化学分离的或合成的异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙。例如，合适的异硫氰酸酯特别包括异硫氰酸烯丙酯和或2-苯乙基异硫氰酸酯。当然，应该理解，合适的化合物也可以作为前体存在，最典型的是那些可被黑芥子酶裂解的化合物，例如各种硫代葡萄糖甙(特别是芥子油苷)。同样，含金属的抗氧化剂不需要限于铜-(I)-烟酸络合物，而是铜的所有营养学上可接受的形式，例如铜-I/II-络合物和螯合物(例如，用乳清酸盐、氨基酸等限定的络合物，或如在复杂食物基质(例如，US8642651)中未限定的)也是明确考虑的。而且，认为含有(过渡)金属部分的各种其它抗氧化剂适用于本文(参见例如CurrTop Med Chem.2011；11(21):2703-13)。特别合适的金属抗氧化剂不仅提供抗氧化能力，而且还将所需量的金属作为辅因子递送至细胞中的线粒体和/或各种酶(例如SIRT)。因此，所考虑的(过渡)金属特别包括铜、锌、铁和锰。在这种情况下，应该注意的是，铜、锌、锰和其他金属可以共同施用(或者甚至替代烟酸亚铜)，并且这些金属的施用通常遵循已知的剂量和量。
如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指药物组合物或药物的直接和间接施用，其中药物组合物或药物的直接施用通常由医疗保健专业人员(例如医师、护士等)进行，其中间接施用包括向医疗保健专业人员提供或使其获得药物组合物或药物以直接施用(例如，通过注射、输注、口服递送、局部递送等)的步骤。
在典型的实施方案中，本文公开了用于口服或局部施用的细胞保护组合物，其中所述组合物包括细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、(c)含金属的抗氧化剂和任选地(d)一种或多于一种本文公开的另外的成分的组合。
对于局部施用，本发明的主题包括局部(例如，营养药物)细胞保护组合物。通常，用于局部和口服施用的组合物是本领域技术人员所理解的。例如，用于皮肤和皮肤癌治疗以及用于炎症小体激活的局部治疗的NAD3TM增强组合物是本领域已知的。参见例如Garcia-Peterson等人，2017，Skin Pharmacol Physiol.，30:216-224和Rong-Jane Chen等人，2016，Int.J.Mol.Sci,17:1-16。
而且，应该理解，所考虑的组合物还可以包括另外的功能性成分，其可进一步增强本文所述的期望效果。例如，合适的延长寿命的成分包括乙酰乙酸酯和β-羟基丁酸酯，而有助于增强SIRT和SIRT靶标的化合物包括反式白藜芦醇、槲皮素、和厚朴酚、千层纸素-A、EGCG、小檗碱、羟基酪醇(所有这些都交叉调节有助于保护线粒体功能、代谢灵活性、内皮/血管功能的靶标，同时抑制全身性炎症、凋亡和纤维化)。另外的成分包括小檗碱、姜黄素、四氢姜黄素、各种芪类化合物如白皮杉醇、L-麦角硫因、生物活性尿石素(如尿石素A、B、C、D)、油橄榄素、奎尼酸和咖啡酸衍生物、一种或多于一种查耳酮、儿茶素和黄酮醇如紫铆因、植物大麻素和NAD前体。而且，还可以添加合适的另外的成分作为吸收促进剂，因此包括各种香草素、胡椒碱、抗坏血酸等。如果需要，另外的成分还包括各种酶，特别是那些支持抗氧化系统的酶。因此，认为超氧化物歧化酶是示例性的另外的成分。
因此，除了(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯和(c)细胞保护制剂的含金属的抗氧化剂之外，另外的成分可以包括更多的生物利用度增强剂，包括例如多酚、胡椒素、胡椒碱、黑胡椒、香柠檬素、二羟基香柠檬素(CYP3A4抑制剂)、类黄酮(包括单独的和组合的橙皮苷、柚皮苷、桔皮苷、槲皮素和川陈皮素)、姜黄、三萜类化合物(例如β-石竹烯、d-柠檬烯、柠檬醇、月桂烯等)、紫檀芪、非瑟酮。合适的止痛剂和抗炎剂包括布洛芬、水杨酸、水杨苷、鱼油(omega-3脂肪酸和特异性小脂质前消散衍生物)、橄榄油(橄榄苦苷、oleocanthol、羟基酪醇)、棕榈酰乙醇酰胺、大麻二酚(CBD)、酸樱桃提取物或浓缩物、磷虾油、虾青素、蛋白水解酶、硫酸氨基葡萄糖、硫酸软骨素、MSM(甲基磺酰甲烷)、SAMe(S-腺苷甲硫氨酸)和/或三萜类化合物。
对于多酚，考虑了多种可能的多酚。多酚包括类黄酮、酚酸、茋类化合物和木脂素。在特定方面，可以将原花青素添加到含三丁酸甘油酯的组合物中。原花青素包括在许多植物，最显著的是苹果、沿海松树皮和大多数其他松树种的树皮、肉桂、野樱梅果、可可豆、酸樱桃、葡萄籽、葡萄皮、一些红酒、越桔、蓝莓、蔓越莓、接骨木果、石榴、黑加仑、绿茶、槲皮素和红茶中发现的前花青素、原翠雀素和原天竺葵素，它们中的每一种都可以单独添加或与任何其他原花青素组合添加。通常，原花青素多酚的来源包括葡萄籽提取物、蓝莓、野樱梅、印度醋栗、接骨木果、石榴、绿茶和/或槲皮素中的一种或多于一种。可可豆含有最高浓度，葡萄籽提取物是容易获得的来源。每个单个剂量中原花青素的量可以为50mg至500mg。
所考虑的组合物还可以包括来自儿茶(Acacia catechu)、穿心莲(Andrographispaniculata)、黄芩(Scutalleria baicalensis)、硫酸胍基丁胺、刺荨麻(StingingNettle)、沙棘(Sea Buckthorn)、姜黄素、翡翠阁(Cissus Quadrilangularis)、齿叶乳香树(Cissus Quadrilangularis)、鸸鹋油(Emu Oil)、山金车(Arnica)、芒果(Mangiferaindica L.，漆树科(Anacardiaceae))、瓠瓜(Lagenaria breviflora)和/或生姜(Zingiberofficinale，姜和姜辣素/姜酚/姜酮)中的一种或多于一种的提取物。这种另外的药剂可用于例如增加和增强痛觉调节和/或控制炎症反应的方法中。适用于本文的所考虑的提取物还可以提供抗氧化性质，特别优选的提取物包括绿茶和/或红茶提取物。虽然不是必需的，但通常优选的是将这种提取物标准化为特定组分或组分类别，特别是茶黄素、茶红素、单体或聚合形式的儿茶素等。例如，红茶提取物可以标准化为茶黄素。
进一步考虑的组合物可以包括一种或多于一种代谢增强剂，包括丽杯角(hoodiagordonii)、育亨宾(yohimbine)、辛弗林(synephrine)、可可碱、类黄酮、二氢黄酮苷如柚皮苷和橙皮苷、铬(例如，作为吡啶甲酸盐或甘氨酸盐，或与复合食物基质结合)、生育酚、茶碱、α-育亨宾、共轭亚油酸(CLA)、章鱼胺、吴茱萸碱、西番莲、红辣椒、辣椒、覆盆子酮、印度没药、绿茶、瓜拉那、可乐果、β-苯乙胺、金合欢(Acacia rigidula)和/或毛喉素(毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlli))。这样的另外的成分可用于例如以下的方法中：增强1)产热/脂肪和碳水化合物代谢；2)脂肪减少、体重管理和改善身体组成(减少身体脂肪，同时保留或保持瘦体重/无脂肪体重/肌肉)；和/或3)食欲控制/食欲调节。
进一步考虑的组合物可以包括抗疲劳、集中注意力和/或增强精力的成分，例如肌酸、可可碱、茶碱、辛弗林、育亨宾、红景天(rhodiola)、南非醉茄(ashwagandha)、人参、银杏(ginkgo biloba)、西伯利亚人参(siberian ginseng)、黄芪、甘草、绿茶、灵芝、脱氢表雄酮(DHEA)、孕烯醇酮、酪氨酸、N-乙酰-酪氨酸、葡萄糖醛酸内酯、牛磺酸、胆碱、CDP-胆碱、α-GPC、乙酰-L-肉碱、5-羟基色氨酸、色氨酸、β-苯乙胺、坎纳(Sceletium tortuosum，松叶菊碱生物碱)、石斛(Dendrobium)属、金合欢、PQQ(吡咯喹啉醌)、泛醌(泛醇)、烟酰胺核糖、匹卡米隆(picamilon)、石杉碱甲(Huperzine A，中国石杉)或蛇足石杉(Huperzia serrata)、左旋多巴、刺毛黎豆(Mucuna pruriens)、毛喉素(毛喉鞘蕊花)。这种另外的成分可以用于例如增强认知功能的方法中，所述认知功能包括注意力、专注力、持续注意力、工作记忆、选择和非选择反应时间、执行功能、语言和非语言学习、视觉空间记忆和言语流畅性。
通常，所公开的细胞保护组合物是(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯、(c)含金属的抗氧化剂、和任选地(d)一种或多于一种另外的成分的制剂。本文公开的适用于每种所考虑的成分类型的有效制剂的示例性化合物也可以包括本文公开的植物。本文提及的任何植物(例如，使用其植物学/通用名或其科学物种名)包括植物整体、植物材料或部分和/或植物提取物。因此，所公开的植物类型包括整个植物或仅其部分(例如，在植物中发现的特别“活性”或期望的成分)。例如，所考虑的组合物可以包括野樱梅、接骨木果、石榴、绿茶和/或红茶中的一种或多于一种。任何这些植物以及本文公开的任何植物可以加工成各种形式中的一种形式的所考虑细胞保护组合物，以产生适合于所选择的施用类型(例如，口服、局部、注射或输注)的组合物形式。
更具体地，尽管可以将任何公开的植物类型的整体作为整体进行加工以掺入到所考虑的细胞保护组合物中，但是也可以使用每种植物类型的提取物。本文公开的任何植物类型的提取物(例如，野樱梅提取物、阿米拉/醋栗提取物、蓝莓提取物、橡树提取物、接骨木果提取物、石榴提取物、绿茶提取物和红茶提取物)可以是天然到精制到纯化(例如，90％至100％纯度)形式的来自植物的所需成分，其没有或具有最少的污染物。天然提取物可以包括新鲜的植物部分，包括叶、根、果肉、外壳、茎、花和/或籽。较不天然或较精制的植物提取物形式富含较大比例的所需植物成分或已知的或认为对人或哺乳动物健康有益的成分。例如，干燥的绿茶叶是多酚儿茶素表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的来源。因此，绿茶植物的天然提取物包括干燥的绿茶叶，较不天然或较精制的提取物包括由EGCG浓度增加的绿茶叶加工的任何产品。
根据所考虑的细胞保护组合物，所公开的用于掺入组合物的所需植物提取物可以是机械加工的植物材料(例如，冻干粉末，或其他粉碎和脱水的材料，或从植物部分提取的液体)。还应该理解，植物提取物可以(例如，在机械加工步骤之后)进行化学加工，特别合适的化学加工步骤包括溶剂提取或分馏。例如，所公开的植物可以进行粉碎并用水和/或醇溶剂提取，以获得富含一种或多于一种所需成分的溶液(和/或获得除去了一种或多于一种不需要成分的材料)。如此制备的提取物可以使用色谱法(例如，离子交换、尺寸排阻或过滤)或通过添加植物的组分或片段来进一步精制和/或富集特定组分。根据所需组分，还应认识到，植物提取物还可以从相应植物的选定部分(例如，包括植物的叶、根、果肉、粘液、茎、花和/或外壳中的一种或多于一种)制备。
关于合适的制剂，本发明人考虑激活分子可以与营养学上可接受的载体混合，以形成膳食补充剂或食品，或者与药学上可接受的载体混合，以形成用于口服施用或通过全身或局部注射施用的药物组合物。
关于合适的口服制剂，所有已知的用于口服递送的制剂都认为适用于本文。例如，口服制剂包括片剂、糖衣丸、胶囊、粉末、含水或非含水溶液或悬浮液、糖浆等。最典型地，这种制剂将包括至少一种药学上或营养学上可接受的载体，并且通常制备成允许以单个剂量单位形式施用推荐的日剂量。或者，如果需要，也可以选择剂量单位，使每天多个剂量单位提供推荐的日剂量。或者，所考虑的组合物也可以包含在已知的口服制剂中。因此，所考虑的制剂包括多种维生素制剂，并且所有已知的制剂都认为适用于本发明。
而且，所考虑的组合物也可包含在可食用载体中，以增加可食用载体的实际或感知的营养价值。最优选地，这种可食用载体为即食形式，并且可以是能量饮料、瓶装水产品、碳酸饮料等，或小吃棒、谷类食物、糖果、含植物纤维的产品等。在较不优选的方面，也考虑了非肠道施用，并且优选包括注射、经粘膜递送和舌下施用。
实施例
在一组实验中，本发明人在各种体外测定中暴露肌肉细胞，其中细胞用苦茶碱(作为
Figure BDA0003730617610000251
商购)、山嵛菜提取物和烟酸铜(I)的组合处理，如下文更详细描述的。将所有细胞暴露3小时和24小时，并分析细胞的以下标志物：作为整体SIRT活性的标志物的SIRT1、SIRT4和SIRT6；作为端粒稳定复合物基因活性的标志物的TOMM40；作为抗氧化蛋白状态的标志物的Nrf2 mRNA表达；作为细胞周期和凋亡/自噬的标志物的p27 mRNA表达；作为线粒体体积/容量的标志物的柠檬酸合酶；作为炎症小体存在/活性的标志物的NLRP3；作为细胞周期、整体炎症、自噬激活的下游标志物的CDK2、TOMM40、ATG mRNA表达；NAD代谢组目前正在研究中。
图1A至图1F、图2A至图2F、图3和图4的示例性方案：
在标准培养条件下(37℃，5％CO2气氛中)，第6代C2C12成肌细胞以3×105的接种密度在8个6孔板上的生长培养基(DMEM，10％FBS，1％青霉素/链霉素和0.1％庆大霉素)中生长。一旦在接种后约48h成肌细胞生长达到80％至90％汇合，则通过除去生长培养基并用分化培养基[DM；DMEM，2％(体积/体积)马血清，1％青霉素/链霉素和0.1％庆大霉素]替代来诱导分化。然后每24h更换一次DM，持续7天，以允许肌管生长。
将处理条件A、B、C和D混合到分化培养基中，并在第4天的分化期间施用于肌管处理24小时(n＝每个处理6个孔或1个板)。第二天，也对肌管施用处理条件A、B、C和D持续3小时。因此，这导致了短暂的3h的急性治疗以及24h的长期治疗。
在所有处理后，除去分化/处理培养基，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞一次。此后，虹吸出PBS，然后从板上刮下细胞亚群，并转移到250μL的Trizol中用于RNA分离。根据基于Trizol的RNA分离方法，使用Nanodrop Lite分光光度计(Thermo Fisher Scientific)分析总RNA浓度，并根据制造商的建议使用商业qScript cDNA SuperMix(QuantaBiosciences，Gaithersburg，MD)合成1μg cDNA。使用基因特异性引物和SYBR绿色化学进行实时PCR，并且所有
PCR反应被证实仅产生一种熔融产物。使用2-ΔΔCT方法计算相对表达值，其中2-ΔCT[管家基因CT-感兴趣的基因CT]和2-ΔΔCT(或倍数变化)＝[2-ΔCT值/2-ΔCT对照治疗平均值]。亲环蛋白(CYCLO)用作管家基因。
在上述RNA刮除后，将250μl冰冷的细胞裂解缓冲液施加到每个孔中[20mM TrisHCl(pH 7.5)，150mM NaCl，1mM Na-EDTA，1mM EGTA，1％Triton，20mM焦磷酸钠，25mM氟化钠，1mMβ-甘油磷酸盐，1mM Na3VO4，和1μg/ml亮肽素；Cell Signaling；Danvers,MA]。然后刮板，除去上清液。通过微型小杵对细胞进行均质处理，匀浆以500g离心5分钟。离心后，除去不溶性蛋白，并在-80℃下储存含有可溶性细胞材料的上清液。使用此程序以进行代谢组学分析，鉴定整体SIRT活性并定量柠檬酸合酶活性。
将处理分成四组(A至D)，结果如图1a至图1f所示。更具体地，A组是苦茶碱(例如
Figure BDA0003730617610000271
)、山萮菜提取物(来自山嵛菜的提取物，标准化为异硫氰酸酯)和烟酸亚铜一起构成NAD3TM组合物的一种示例性组合。B组与A组相同，但山萮菜提取物由槲皮素二水合物替代。C组是烟酰胺核糖(作为对比物)，其浓度和活性剂量比A组(即NAD3TMTM)高60％，以证明NAD3TM的作用不仅仅是相加性的，而是协同性的益处，其结果也高于并超过主要对比物。D组是仅含赋形剂的作为阴性对照的二氧化硅。
图5A至图5B、6A至图6C和7A至图7C的示例性方案：
处理和细胞。用以下化合物之一进行6小时和24小时的细胞培养处理：1.对照或“载剂”(仅DMSO+磷酸盐缓冲盐水)；2.
Figure BDA0003730617610000272
(烟酰胺核糖(NR)(5μg/mL)；3.BHB(β-羟基丁酸酯)(30ug/mL)；4.CBD(大麻二酚)(5ug/mL)；5.橄榄叶(5ug/mL)；6.Dynamine(1ug/mL)；7.硒(2ug/mL)；8.三丁酸甘油酯(5ug/mL)
处理材料和方法。在没有过氧化氢(H2O2)的情况下，用如上所列的化合物1至8处理C2C12细胞6小时(全文称为“未受干扰的细胞”)；或者用上述化合物1至8处理细胞24小时，伴随有400uM过氧化氢(H2O2)。
C2C12细胞系类似于成熟的肌细胞，因为它们是多核的并且已经过了快速生长/增殖期。
分子标志物和测定。
通过测定LC3II/I比来评估自噬流(或活性)。认为该测定是自噬监测中的“黄金标准”(参见例如Autophagy，2007年11月-12月；3(6):542-5)。
使用Trolox等效抗氧化能力(TEAC)测定来评估总抗氧化能力。
使用H2AX的磷酸化测定来评估DNA损伤。认为该测定是常用的测定的生物标志物，其中这种标志物的增加与DNA损伤的增加有关(参见例如Methods Mol Biol.2012；920:613-26)。
使用细胞脂质氧化的产物4HNE测定来评估氧化应激(例如参见Am J PhysiolCell Physiol.2016Oct 1；311(4):C537–C543)。
通过测量每个孔的DNA含量来分析细胞活力，其中较低的值表明更多的细胞死亡和细胞活力降低。
通过测定PGC-1α蛋白水平来评估线粒体生物发生；PGC-1α是线粒体生物发生的主要调节剂(例如参见Am J Clin Nutr.2011Apr；93(4):884S–890S)。
评估NAMPT蛋白水平以检测NAD补救通路的关键内源性调节剂。
图8A至图8B、图9A至图9C和图10A至图10D的示例性方案
处理和细胞。用以下化合物之一进行6小时和24小时的细胞培养处理：1.对照或“载剂”(仅DMSO+磷酸盐缓冲盐水)；2.NAD3TM(5μg/mL)；3.NAD3TM(5μg/mL)和CBD(大麻二酚)(1.25ug/mL)；4.NAD3TM(5μg/mL)和橄榄叶(2.5ug/mL)；5.NAD3TM(5μg/mL)和BHB(β-羟基丁酸酯)(30ug/mL)；6.NAD3TM(5μg/mL)和Dynamine(1ug/mL)；7.NAD3TM(5μg/mL)和硒(2ug/mL)；8.NAD3TM(5μg/mL)和葡萄籽提取物(5ug/mL)。
处理材料和方法。在没有过氧化氢(H2O2)的情况下，用如上所列的化合物1至8处理EOMA(内皮)细胞6小时(全文称为“未受干扰的细胞”)；或者用上述化合物1至8处理细胞24小时，伴随有200uM过氧化氢(H2O2)。
EOMA细胞系类似于血管内皮细胞。
分子标志物和测定。
通过测定LC3II/I比来评估EOMA细胞中的自噬流(或活性)。认为该测定是自噬监测中的“黄金标准”(参见例如Autophagy，2007年11月-12月；3(6):542-5)。
使用Trolox等效抗氧化能力(TEAC)测定来评估EOMA细胞的总抗氧化能力。
使用H2AX的磷酸化测定来评估DNA损伤。H2AX是常用的测定的生物标志物，其中这种标志物的增加与DNA损伤的增加有关(参见例如Methods Mol Biol.2012；920:613-26)。
使用细胞脂质氧化的产物4HNE测定来评估氧化应激(例如参见Am J PhysiolCell Physiol.2016 Oct 1；311(4):C537–C543)。
通过测量每个孔的DNA含量来分析细胞活力，其中较低的值表明更多的细胞死亡和细胞活力降低。
通过测定PGC-1α蛋白水平来评估线粒体生物发生；PGC-1α是线粒体生物发生的主要调节剂(例如参见Am J Clin Nutr.2011 Apr；93(4):884S–890S)。
评估EOMA细胞中的NAMPT和NLRP3蛋白水平以检测NAD补救通路的关键内源性调节剂。
将所有条件与对照条件进行统计比较。使用检测C2C12和EOMA细胞中p-H2AX蛋白、LC3I、LC3II、4HNE和NLRP3蛋白的抗体进行免疫印迹分析。丽春红染色用于蛋白质染色。
示例性结果：
图1A至图1F描述了用本文所示和所述的A、B、C或D组处理进行3小时(hr)处理的SIRT6、SIRT1、NRF2、p27、CDKN2B、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、Tomm40和SIRT4的mRNA数据的示例性结果。进行单向方差分析(ANOVA)以确定处理是否显著不同，并进行最小显著差异法(LSD)事后检验以确定显著性发生的位置。具有不同上标字母(a、b、c或d)的处理表示彼此不同的处理。
图2A至图2F描述了用本文所示和所述的A、B、C或D组处理进行24hr处理的SIRT6、SIRT1、NRF2、p27、CDKN2B、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、TOMM40和SIRT4的mRNA数据的示例性结果。进行单向ANOVA以确定处理是否显著不同，并进行LSD事后检验以确定显著性发生的位置。具有不同上标字母(a、b、c或d)的处理表示彼此不同的处理。
图3描述了用A、B、C或D组处理3小时和24小时的SIRT活性的示例性结果，如本文所示和所述。进行单向ANOVA以确定处理是否显著不同，并进行LSD事后检验以确定显著性发生的位置。具有不同上标字母的处理表示彼此不同的处理。
图4描述了用A、B、C或D组处理24小时后柠檬酸合酶活性(线粒体容量标记)的示例性结果，如本文所示和所述。进行单向ANOVA以确定处理是否显著不同，但是ANOVA得出p＝0.367。
图5A描述了在没有过氧化氢的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用过氧化氢(H2O2)孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的细胞活力(DNA/孔(ug))的示例性结果。
图5B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的总抗氧化能力(Trolox)的示例性结果。如所示的，在H2O2的存在下，硒和三丁酸甘油酯增加或恢复抗氧化能力。
图6A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图6B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的DNA损伤的示例性结果。
图6C描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯共孵育的细胞的细胞氧化应激的示例性结果。
图7A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照，仅载剂(veh))和用所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图7B描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照，仅载剂(veh))和用所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯孵育的细胞中的NAMPT蛋白质水平的示例性结果。
图7C描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照，仅载剂(veh))和用所示的NAD3TM、BHB、CBD、橄榄叶、dynamine、硒或三丁酸甘油酯孵育的细胞中的PGC1α蛋白质水平的示例性结果。
图8A描述了在没有过氧化氢的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用过氧化氢(H2O2)孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的细胞活力(DNA/孔(ug))的示例性结果。
图8B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的总抗氧化能力(Trolox)的示例性结果。
图9A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图9B描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞的DNA损伤的示例性结果。
图9C描述了通过测量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育的细胞(对照，未受干扰的)、用H2O2孵育的细胞以及与所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽共孵育的细胞中NLRP3蛋白质的量来定量炎症小体诱导的示例性结果。
图10A描述了在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的自噬的示例性结果。
图10B描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的NAMPT蛋白质水平的示例性结果。
图10C描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的PGC1α蛋白质水平的示例性结果。
图10D描述了定量在没有过氧化氢(H2O2)的情况下孵育6小时的细胞(对照)和用所示的NAD3TM、NAD3TM+CBD、NAD3TM+橄榄叶、NAD3TM+BHB、NAD3TM+dynamine、NAD3TM+硒或NAD3TM+葡萄籽孵育的细胞的总SIRT活性的示例性结果。
图11A描述了C2C12(肌肉细胞)的代表性蛋白质凝胶，其中显示了p-H2AX、LC3I、LC3II、4HNE和NLRP3的免疫印迹分析，以及丽春红蛋白染色，如所示。
图11B描述了EOMA(内皮细胞)的代表性蛋白凝胶，其中显示了p-H2AX、LC3I、LC3II、4HNE和NLRP3的免疫印迹分析，以及丽春红蛋白染色，如所示。
从结果可以容易地看出，对于所考虑的组合，观察到对各种标志物的急性(3小时)和长期(24小时)影响。例如，除其他外，可观察到SIRT1、SIRT6和SIRT4以及p27、PGC1α和NLRP3的急性差异，而p27、CDKN2B、LCB3、NLRP3和TOMM40的长期结果较为明显。
此外，具体参考图5B，当细胞与三丁酸甘油酯或硒和H2O2共孵育时，观察到三丁酸甘油酯和硒增加(例如，恢复)总抗氧化活性。类似地，参考图8B，与用H2O2处理的细胞相比，NAD3TM和橄榄叶、NAD3TM和BHB、NAD3TM和硒以及NAD3TM和葡萄籽提取物都增加了总抗氧化能力。
另外，具体参考图6C，观察到β-羟基丁酸酯(BHB)降低了与H2O2和BHB共孵育的细胞中的细胞氧化应激。值得注意的是，参考图9C，NAD3TM与橄榄叶、BHB、dynamine、硒和葡萄籽提取物的组合在H2O2(氧化应激)的存在下降低了NLRP3的诱导。
NAD3TM和NAD3TM+三丁酸甘油酯的示例性方案
在对象(男性和女性)中进行的NAD3TM和NAD3TM+三丁酸甘油酯的研究，所述对象为40岁至60岁，符合研究设计标准的，并在研究前对健康史(包括血样)进行筛选/评估，以确认对象未受免疫损害、未在医学上不稳定(例如，静息心率小于或等于每分钟90次、收缩压/舒张压等于或小于140/90mm Hg、非糖尿病患者、身体质量指数(BMI)为18.5kg/m2至34.99kg/m2、无癌症史、无已知胃肠或代谢疾病、以及无已知炎症疾病)、尚未发现对要测试/研究的产品成分过敏、且未接受任何激素替代疗法。
研究是连续12周的数据收集，每天早上大约在同一时间(+/-1小时)摄取全剂量的安慰剂(仅赋形剂，如纤维素)、NAD3TM(312mg)或NAD3TM(312mg)+三丁酸甘油酯(500mg)。
在第0天、第1周、第4周、第8周和第12周，从每个对象采集血样(空腹血浆和PBMC)。
血样分析。至少在第0天和第1周、第4周、第8周和第12周中的至少一周测定所有血液样品中本文公开的标记物。例如，在第0天和第1周、第4周、第8周和第12周中的至少一周测定所收集的血样的血浆衰老标志物(GDF15、TNFr6-FAS、OPN、TNFR1、激活素A、CCL3和IL-15)、CMP、LP、CBC、胰岛素、C-反应蛋白、TNF-α、IL-6、BDNF、HbA1C、自然杀伤(NK)细胞和活化T细胞的水平。在第0天和第1周、第4周、第8周和第12周中的至少一周测定血样中的本文公开的衰老标志物，包括SIRT1-7整体酶活性和mRNA基因表达(例如，SIRT1、SIRT3、SIRT4和SIRT6、SIRT7)，和Nrf2、PGC1a、SOD3、LC3/ATG、ATG7/12、HSP70、HSP25、FOXO3/4/6、GLD-1、SKN-1、POT1、DRP1、KLOTHO、NLRP3、Dicer、NMNAT、NAMPT、Tomm40、Oct4、Sox2和/或KLF4的mRNA和/或蛋白水平。在第0天和第12周对血样进行表观遗传时钟的DNA甲基化组分析、白细胞端粒长度和[NAD+/NADH]细胞浓度测定，以评估净NAD+状态。
视觉模拟评分(VAS)问卷。对每个对象进行VAS问卷调查，以评估VAS情绪、VAS活力、VAS精力、VAS疲劳、VAS生产率和VAS胃肠/消化健康。至少在第0天和第1周、第4周、第8周和第12周中的至少一周记录每次VAS评估。在所有时间点和样本中对安慰剂、NAD3TM和NAD3TM+三丁酸甘油酯进行比较。
本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本公开的全范围，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于要求保护的发明的实践必不可少的任何未要求保护的元件。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文公开的发明构思的全范围的情况下，除了已经描述的可行的修改外可以进行更多的修改。因此，除了所附权利要求的范围之外，不限制所公开的主题。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的最广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他的方式指代元件、组分或步骤，指示所引用的元件、组分或步骤可以存在，或者被利用或与未明确引用的其它元件、组分或步骤组合。当说明书权利要求涉及选自A、B、C...和N中的至少一种时，文本应解释为只需要其中的一种元件，而不是A加N、或B加N等。

Claims (36)

1.一种用于增加细胞活力和/或减少细胞衰老的生物标志物的组合物，其包括：
细胞保护制剂，所述制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合；和
其中所述细胞保护制剂与营养学上或药学上可接受的载体一起配制用于口服施用。
2.根据权利要求1所述的组合物，其还包括生酮和/或肠道支持化合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中生酮和/或肠道支持化合物是三丁酸甘油酯、乙酰乙酸酯、三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、β-羟基丁酸酯(BHB)、丁酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、微生物部分、功能蛋白质、分泌的多糖、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖衍生的胞壁肽、酚类衍生的后生元或其组合。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中酚类衍生的后生元选自尿石素、异尿石素、雌马酚、肠内酯、肠二醇和8-异戊烯基柚皮素。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中生酮和/或肠道支持化合物是三丁酸甘油酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，
其中嘌呤生物碱是苦茶碱、大果咖啡碱、甲基大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因；
其中含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物；和
其中异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是来自块茎山萮菜的提取物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中嘌呤生物碱是苦茶碱，含金属的抗氧化剂是烟酸亚铜，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是山嵛菜。
8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中细胞保护制剂还包含三丁酸甘油酯。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中细胞保护制剂包括约60mg至1500mg的包含苦茶碱、烟酸亚铜和山嵛菜的NAD3TM，和约200mg至1000mg的三丁酸甘油酯。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其还包括SIRT增强剂。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中SIRT增强剂选自丁酸酯、中链和短链脂肪酸、油酸、非瑟酮、白藜芦醇、槲皮素、儿茶素、姜黄素、姜黄色素、酪醇、小檗碱、二氢小檗碱和/或阿魏酸中的一种或多于一种。
12.一种减少哺乳动物中细胞衰老的生物标志物的方法，其包括：
将细胞保护组合物以有效减少哺乳动物细胞中的细胞衰老的量施用于哺乳动物；
其中所述细胞保护制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合；和
其中所述细胞保护制剂与营养学上或药学上可接受的载体一起配制用于口服施用。
13.根据权利要求12所述的方法，其中细胞保护制剂还包含生酮和/或肠道支持化合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中生酮和/或肠道支持化合物是三丁酸甘油酯、乙酰乙酸酯、三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、β-羟基丁酸酯(BHB)、丁酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、微生物部分、功能蛋白质、分泌的多糖、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖衍生的胞壁肽、酚类衍生的后生元或其组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中酚类衍生的后生元选自尿石素、异尿石素、雌马酚、肠内酯、肠二醇和8-异戊烯基柚皮素。
16.根据权利要求13所述的方法，其中生酮和/或肠道支持化合物是三丁酸甘油酯。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，
其中嘌呤生物碱是苦茶碱、大果咖啡碱、甲基大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因；
其中含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物；和
其中异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是来自块茎山萮菜的提取物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中嘌呤生物碱是苦茶碱，含金属的抗氧化剂是烟酸亚铜，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是山嵛菜。
19.根据权利要求18所述的方法，其中细胞保护制剂包括约60mg至1500mg的包含苦茶碱、烟酸亚铜和山嵛菜的NAD3TM，和约200mg至1000mg的三丁酸甘油酯。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中细胞衰老包括衰老相关分泌表型(SASP)。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的方法，其中减少细胞衰老的生物标志物包括减少生长分化因子15(GDF15)、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员6(FAS)、骨桥蛋白(OPN)、TNF受体1(TNFR1)、激活素A、趋化因子(C-C基序)配体3(CCL2)和/或IL-15中的一种或多于一种。
22.根据权利要求21所述的方法，其中减少细胞衰老包括减少GDF15、FAS和/或OPN中的一种或多于一种。
23.根据权利要求12至22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括调节SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT6、Nrf2、SOD3、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、NAMPT、NMNAT、TOMM40、FOXO3/4/6、GLD-1、HSP25、SKN-1、CCL8、KLOTHO、PDK1、DRP1、POT1和/或DNA甲基化表观遗传时钟中的一种或多于一种的表达或细胞活性。
24.根据权利要求12至23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括增加OCT4、SOX2和/或KLF4的表达。
25.一种诱导哺乳动物细胞中的OCT4、SOX2和/或KLF4表达的方法，其包括：
将细胞保护组合物以有效诱导哺乳动物细胞中的OCT4、SOX2和/或KLF4表达的量施用于哺乳动物；
其中所述细胞保护制剂包含(a)嘌呤生物碱、(b)异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙、和(c)含金属的抗氧化剂的组合；和
其中所述细胞保护制剂与营养学上或药学上可接受的载体一起配制用于口服施用。
26.根据权利要求25所述的方法，其中细胞保护制剂还包含生酮和/或肠道支持化合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中生酮和/或肠道支持化合物是三丁酸甘油酯、乙酰乙酸酯、三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、β-羟基丁酸酯(BHB)、丁酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、微生物部分、功能蛋白质、分泌的多糖、胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、磷壁酸、肽聚糖衍生的胞壁肽、酚类衍生的后生元或其组合。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中酚类衍生的后生元选自尿石素、异尿石素、雌马酚、肠内酯、肠二醇和8-异戊烯基柚皮素。
29.根据权利要求26所述的方法，其中生酮化合物是三丁酸甘油酯。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，
其中嘌呤生物碱是苦茶碱、大果咖啡碱、甲基大果咖啡碱、可可碱、茶碱或咖啡因；
其中含金属的抗氧化剂是铜-(I)-烟酸络合物或营养学上可接受的铜-II-络合物或螯合物；和
其中异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是来自块茎山萮菜的提取物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中嘌呤生物碱是苦茶碱，含金属的抗氧化剂是烟酸亚铜，异硫氰酸酯或硫代葡萄糖甙是山嵛菜。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中细胞保护制剂还包含三丁酸甘油酯。
33.根据权利要求32所述的方法，其中细胞保护制剂包括约60mg至1500mg的包含苦茶碱、烟酸亚铜和山嵛菜的NAD3TM，和约200mg至1000mg的三丁酸甘油酯。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述方法还包括细胞衰老的生物标志物的减少，其中所述减少包括减少生长分化因子15(GDF15)、肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员6(FAS)、骨桥蛋白(OPN)、TNF受体1(TNFR1)、激活素A、趋化因子(C-C基序)配体3(CCL2)和/或IL-15中的一种或多于一种。
35.根据权利要求34所述的方法，其中减少细胞衰老的生物标志物包括减少GDF15、FAS和/或OPN中的一种或多于一种。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的方法，其中所述方法还包括调节SIRT1、SIRT3、SIRT4、SIRT6、Nrf2、SOD3、ATG12、LCB3、NLRP3、PGC1α、NAMPT、NMNAT、TOMM40、FOXO3/4/6、GLD-1、HSP25、SKN-1、CCL8、KLOTHO、PDK1、DRP1、POT1和/或DNA甲基化表观遗传时钟中的一种或多于一种的表达或细胞活性。
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