JP7341478B2 - 心筋細胞の薬剤応答性試験方法 - Google Patents

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Description

本発明は、心筋細胞の薬剤応答性試験方法に関する。
現在、新薬の開発には１０年以上の歳月と数百億円のコストがかかると言われており、特にコストと時間のかかる動物試験などの前臨床試験を、in vitroの培養細胞を用いた試験で代替する、あるいは効率化させることが期待されている。また薬剤候補物質の薬効を、in vitroの培養細胞を用いて評価し、ハイスループットスクリーニング（創薬スクリーニング）することが可能であると考えられている。
心臓は命に直結する臓器で、先進国では心臓病患者が圧倒的に多い。また我々が服用するあらゆる薬は全て心臓への副作用に細心の注意を払う必要がある（安全性薬理）。新薬開発における動物試験などの前臨床試験を加速するために、ｉＰＳ細胞から作製されたヒト心筋細胞を用いて、薬剤応答性評価および心毒性評価の手法の開発が行われている。
ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を薬剤応答性評価に用いた例が多く報告されている（例えば、非特許文献１：J Pharmacol Toxicol Methods. 2017 Mar - Apr; 84: 111-127. doi: 10.1016/j.vascn.2016.12.003. Epub 2016 Dec 10.）。非特許文献１は、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を、トリプシン溶液で処理した後、心筋細胞の培養液に播種し、培養することで、拍動するシート状の心筋細胞を作成し、得られたシート状の心筋細胞に薬剤を一定の濃度範囲で添加し、心筋細胞の電気生理学的変化を細胞外電位記録によって測定することを開示する。
J Pharmacol Toxicol Methods. 2017 Mar - Apr; 84: 111-127. doi: 10.1016/j.vascn.2016.12.003. Epub 2016 Dec 10.
本発明者らは、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を用いて薬剤応答性を評価したところ、評価中に心筋細胞の拍動停止が起こったり、あるいは予想される薬剤応答（例えば、頻脈応答や、早期後脱分極（early afterdepolarization（EAD））による不整脈応答）が見られなかったりするなど、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現できない場合があるという問題を発見した。したがって、本発明は、この新たに見出された問題の解決のための技術を提供すること、即ち、心筋細胞の薬剤応答性を試験するための技術であって、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現することを可能にする技術を提供することを目的とする。
第１実施形態によれば、
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第２実施形態によれば、
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第３実施形態によれば、
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に含有される培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第４実施形態によれば、
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第５実施形態によれば、
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
他の実施形態によれば、
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
a）前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、
b）前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液に酸素含有ガスをバブリングしながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、酸素含有ガスをバブリングしている培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、
c）前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液を振盪しながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、振盪している培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、あるいは
d）前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
別の側面によれば、酸素運搬体を含む、心筋細胞の拍動停止抑制剤、あるいは酸素運搬体を含む、心筋細胞の薬剤応答性増強剤が提供される。
更に別の側面によれば、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを含む、薬剤応答性試験用キットが提供される。
更に別の側面によれば、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを含む、薬剤応答性試験用培養液が提供される。
本発明によれば、心筋細胞の薬剤応答性を試験するための技術であって、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現することを可能にする技術を提供することができる。
「培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離」を説明するための模式図。 薬剤添加前のサンプル２Ｄの波形図。 薬剤添加後のサンプル２Ｄの波形図。 ヘモグロビン濃度と拍動停止率との関係を示すグラフ。 薬剤添加前のサンプル３Ｄの波形図。 薬剤添加後のサンプル３Ｄの波形図。 薬剤添加前のサンプル３Ｊの波形図。 薬剤添加後のサンプル３Ｊの波形図。 液面距離と拍動停止率との関係を示すグラフ。 薬剤添加後のサンプル４Ｂの波形図。 薬剤添加前のサンプル４Ｄの波形図。 薬剤添加後のサンプル４Ｄの波形図。 培養容器の種類と拍動停止率との関係を示すグラフ。 薬剤添加後のサンプル５Ｃの波形図。 薬剤添加前のサンプル５Ｄの波形図。 薬剤添加後のサンプル５Ｄの波形図。 薬剤応答性試験の条件と拍動停止率との関係を示すグラフ。 薬剤添加後のサンプル５Ｇの波形図。 薬剤添加前のサンプル５Ｈの波形図。 薬剤添加後のサンプル５Ｈの波形図。 薬剤応答性試験の条件と拍動停止率との関係を示すグラフ。 薬剤添加後のサンプル５Ｋの波形図。 薬剤添加前のサンプル５Ｌの波形図。 薬剤添加後のサンプル５Ｌの波形図。 薬剤応答性試験の条件と拍動停止率との関係を示すグラフ。 薬剤添加後のサンプル５Ｏの波形図。 薬剤添加前のサンプル５Ｐの波形図。 薬剤添加後のサンプル５Ｐの波形図。 薬剤添加前のサンプル６Ｂの波形図。 薬剤添加後のサンプル６Ｂの波形図。 薬剤添加後のサンプル６Ｆの波形図。 薬剤添加後のサンプル６Ｇの波形図。 薬剤添加後のサンプル６Ｈの波形図。 薬剤添加後のサンプル６Ｉの波形図。 Ca2+持続時間の変化率を示すグラフ。 ＥＡＤ発生率を示すグラフ。 酸素分圧の測定結果および薬剤応答性試験の結果を示す図。 培養液ｐＨの変化に対する心筋細胞の応答性を示すグラフ。
本発明者らが、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を用いて薬剤応答性を評価したところ、心臓への薬理作用が既知である薬剤を添加した際に、予想されるよりも限られた薬剤濃度範囲でしか、期待される薬剤応答が検出できないという問題を発見した（後述の実施例１を参照）。本発明者らは、この問題を解決するために鋭意検討し、心筋細胞への酸素供給量を高めるための構成を採用することで上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
以下、本発明について説明する。ただし、以下の説明は、本発明を詳説することを目的とし、本発明を限定することを意図していない。
１．薬剤応答性試験方法
１－１．第１実施形態
第１実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法は、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
第１実施形態において、心筋細胞は、酸素運搬体を含む培養液中で試験してもよいし、酸素運搬体を含む培養液中に置いた直後に試験してもよい。前者は、文字通り、試験が、酸素運搬体を含む培養液中で行われることを意味する。後者は、心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中に置き、その直後に、試験が、酸素運搬体を含まない培養液中または酸素運搬体を含む培養液中の何れで行われてもよいことを意味する。
後者の場合、「直後」は、典型的には２時間以内、好ましくは１時間以内、より好ましくは３０分以内を指す。また、後者の場合、心筋細胞を試験前に所定の条件下に置く期間（この実施形態では、心筋細胞を試験前に、酸素運搬体を含む培養液中に置く期間）は、心筋細胞に十分な量の酸素を予め供給するのに必要な期間であり、例えば、１分以上、好ましくは１０分以上とすることができる。この期間の上限は、例えば１２０分とすることができる。ただし、心筋細胞は長期間培養することが可能であるため、この期間の上限は特に限定されず、心筋細胞を試験前に、酸素運搬体を含む培地中で長期間培養ないし保管してもよい。
心筋細胞は、多能性幹細胞から分化誘導した心筋細胞であってもよいし、生物の心臓から単離された初代培養心筋細胞であってもよい。また、市販されている多能性幹細胞由来の心筋細胞（例えば、CDI社のiCell、タカラバイオ社のMiraCell、Axogenesis社のCor.4Uなど）であってもよい。「多能性幹細胞」は、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能とを有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。心筋細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞（以下、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞ともいう）である。ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞は、公知の心筋分化誘導法、例えば、プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法（ＷＯ２０１５／１８２７６５を参照）により作製することができる。
心筋細胞は、任意の生物の心筋細胞であってもよいが、好ましくは哺乳類の心筋細胞、より好ましくはヒトの心筋細胞である。
心筋細胞は、正常な心筋細胞であってもよいし、遺伝子変異を含む心筋細胞や疾患モデル心筋細胞であってもよい。あるいは、心筋細胞は、薬剤に対する応答性を調べたい被検体に由来する心筋細胞であってもよい。正常な心筋細胞は、正常な（すなわち、遺伝性心臓疾患を有していない）被検体に由来する心筋細胞であってもよいし、商業的に入手可能な心筋細胞であってもよい。遺伝子変異を含む心筋細胞は、遺伝子変異を有する被検体に由来する心筋細胞であってもよいし、遺伝子変異を正常な心筋細胞に導入することにより得られた心筋細胞であってもよい。疾患モデル心筋細胞は、遺伝性心臓疾患を有する被検体に由来する心筋細胞であってもよいし、遺伝性心臓疾患の原因遺伝子を正常な心筋細胞に導入することにより得られた心筋細胞であってもよい。
以上より、心筋細胞は、好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞であり、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞には、正常な心筋細胞や疾患モデル心筋細胞が含まれる。より好ましくは、心筋細胞は、ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞であり、ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞には、正常な成熟心筋細胞や疾患モデルの成熟心筋細胞が含まれる。
ここで、「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、当該技術分野で、ヒトｉＰＳ細胞由来の未熟心筋細胞と対比して使用される用語であり、ヒトｉＰＳ細胞由来の未熟心筋細胞と比べて、高いイオンチャネル機能を有する。
「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、例えば、ｉＰＳ細胞の分化誘導を開始してから１４日以上経過した細胞である。ここで、ｉＰＳ細胞の分化誘導を開始した日は、未分化状態で維持されたｉＰＳ細胞を、分化状態に移行させるための処理に晒した日であり、この日を０日目とする。また、成熟心筋細胞は、分化状態を維持したまま長期間培養することが可能であるため、分化誘導を開始してからの日数の上限は特に限定されず、成熟心筋細胞を、分化状態を維持したまま長期間培養ないし保管してもよい。例えば、成熟心筋細胞は、ｉＰＳ細胞の分化誘導を開始してから３６５日以上経過した細胞であっても問題ない。「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、好ましくは、プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法によりｉＰＳ細胞の分化誘導を開始してから１４日以上経過した細胞をいう。
「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来の未熟心筋細胞と比べて酸素要求性が高いため、本発明の効果をより顕著に発現させることができる。
心筋細胞は、単一細胞の形態で試験されてもよいが、後述の実施例に記載するとおり、複数の心筋細胞が互いに接合して形成された心筋細胞シートの形態、あるいは心筋細胞塊の形態で試験されることが好ましい。
第１実施形態では、酸素運搬体を含む培養液が使用される。
酸素運搬体は、細胞に酸素を運ぶ機能を有する物質であり、好ましくは、高酸素濃度下では酸素と結合し、低酸素濃度下では酸素を分離する性質を有する物質である。酸素運搬体としては、例えば、赤血球、酸素運搬タンパク質や人工の酸素運搬体が挙げられ、好ましくは、酸素運搬タンパク質である。酸素運搬タンパク質としては、例えば、ヘモグロビン、修飾ヘモグロビン（例えば、ヘモグロビン－アルブミン複合体であるヘモアクト、ＷＯ２０１２／１１７６８８を参照）、ミオグロビン、ヘムエリスリン、ヘモシアニン、エリスロクルオリン、ビンナグロビン、ヴァナビンス、レグヘモグロビン、クロロクルオリン、あるいはこれらの変異体が挙げられる。人工の酸素運搬体としては、例えば、ナノカプセル型酸素運搬体、人工赤血球、Hb小胞体が挙げられる。赤血球としては、ヒトや哺乳類の血液から調整した赤血球などが挙げられる。その他、過フッ素化合物（パーフルオロケミカル）等の細胞に酸素を運ぶ機能を有する化学物質も酸素運搬体に含まれる。
酸素運搬体の培地中の濃度は特に限定されないが、酸素運搬体は、好ましくは、細胞に酸素を運ぶ機能を果たすのに十分な濃度で培養液中に含まれる。例えば、酸素運搬体が、ヘモグロビンなどの酸素運搬タンパク質である場合、酸素運搬タンパク質は、培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％、更に好ましくは２．０～５．０質量％の量で、培養液中に含まれる。
酸素運搬体が添加される培養液は、心筋細胞の培養用の培養液として公知のものであってもよいし、心筋細胞の電位測定用の培養液として公知のものであってもよい。好ましくは、酸素運搬体が添加される培養液は、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、およびナトリウム塩を含む無機塩類と、緩衝液とを含む。より好ましくは、酸素運搬体が添加される培養液は、DMEM、RPMI、IMDM、Ham-12などの基礎培地を用いてもよい。基礎培地は、例えばシグマアルドリッチジャパンより入手可能である。あるいは、酸素運搬体が添加される培養液は、下記組成を有する培養液を用いてもよい：
０．０１～０．５ｇ／Ｌ（例えば、０．１８２ｇ／Ｌ）のＣａＣｌ2、
０～１．０ｇ／Ｌ（例えば、０．０９７６７ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4、
０．１～１．０ｇ／Ｌ（例えば、０．４ｇ／Ｌ）のＫＣｌ、
０～１０．０ｇ／Ｌ（例えば、３．３６２ｇ／Ｌ）のＮａＨＣＯ3、
１．０～２０．０ｇ／Ｌ（例えば、５．４５２５ｇ／Ｌ）のＮａＣｌ、
０～１．０ｇ／Ｌ（例えば、０．１０９ｇ／Ｌ）のＮａ2ＨＰＯ4、および
０～２０．０ｇ／Ｌ（例えば、５．９５８ｇ／Ｌ）のＨＥＰＥＳ。
上記組成を有する培養液は、血清を含んでいなくてもよいし、培養液に対して４０質量％以下の量で血清を含んでいてもよい。酸素運搬体が添加される培養液のｐＨは特に限定されないが、好ましくは６．０～９．０、より好ましくは７．０～８．０である。
培養容器としては、細胞の接着培養のために使用される任意の容器を使用することができる。培養容器は、一般には平底容器、例えば、培養皿やマイクロタイタープレートを使用することができる。より具体的には、培養容器は、直径３．５～１０ｃｍの細胞培養皿、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、細胞培養バッグなどを用いることができる。
後述の実施例に記載されるとおり、９６ウェルプレートを使用した場合、例えば、約２×１０４～約８×１０４［細胞／ウェル］となるように心筋細胞を播種し、培養液中で培養して心筋細胞シートを作製し、これを薬剤応答性試験に使用することができる。すなわち、例えば、約０．６２５×１０５～約２．５×１０５［細胞／ｃｍ２］となるように心筋細胞を培養容器に播種し、培養液中で培養して心筋細胞シートを作製し、これを薬剤応答性試験に使用することができる。
薬剤応答性試験は、心筋細胞を含む培養液に薬剤を添加し、心筋細胞の拍動を公知の手法を用いて解析することにより行うことができる。例えば、薬剤応答性試験は、細胞の電気生理学的解析および／または細胞のモーション解析ができる機器を用いて行うことができる。より具体的には、薬剤応答性試験は、蛍光顕微鏡によるカルシウムイメージング法、モーションアナライザーによる拍動の解析、多電極システムによる細胞外電位解析、MEA（Multi-electrode array）解析、ホールセルパッチクランプによる細胞内電位解析などにより行うことができる。
薬剤応答性試験において、薬剤は、心筋細胞への作用が知られている物質であってもよく、例えば、イソプロテレノール（ＩＳＯ）、ベラパミル、Ｅ－４０３１、テルフェナジン、アステミゾール、クロマノール２９３ｂ、メキシレチン、ニフェジピン、プロプラノール、ミルリノン、背景技術の欄に記載の文献（J Pharmacol Toxicol Methods. 2017 Mar - Apr; 84: 111-127. doi: 10.1016/j.vascn.2016.12.003. Epub 2016 Dec 10）に記載の薬剤などである。ＩＳＯは、非選択的β作動薬で、頻脈効果、強心効果を有する。ミルリノンは、ホスホジエステラーゼIII阻害剤で、同じく頻脈効果、強心効果を有する。ベラパミルは、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤である。Ｅ－４０３１は、ｈＥＲＧ型カリウムチャネル阻害剤である。テルフェナジンは、抗アレルギー薬で、ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。アステミゾールは、抗アレルギー薬で、ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。クロマノール２９３ｂは、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＱ１阻害剤である。メキシレチンは、電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤である。ニフェジピンは、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤である。プロプラノールは、β遮断薬で、徐脈効果を有する。
あるいは、薬剤は、心筋細胞への作用を調べたい物質であってもよく、例えば、新薬候補物質、心毒性を有することが疑われる物質、または心筋細胞に薬剤応答を引き起こす候補物質である。心筋細胞に薬剤応答を引き起こす候補物質は、例えば、以下からなる群より選択される薬剤応答を引き起こす候補物質とすることができる：薬剤応答性QT延長応答、徐脈応答（陰性変時作用）、頻脈応答（陽性変時作用）、強心応答（陽性変力作用）、弱心応答（陰性変力作用）、早期後脱分極（EAD）応答、遅延後脱分極（DAD）応答、トルサード・ド・ポワント（TdP）応答、トリガードアクティビティ不整脈応答、およびリエントリー不整脈応答。薬剤は、低分子医薬品に包含される低分子化合物であってもよいし、高分子医薬品に包含される、タンパク質、抗体、核酸、多糖などの高分子化合物であってもよい。
薬剤の添加濃度は、薬剤の種類に応じて、公知技術に従って適宜選択することができ、例えば、背景技術の欄に記載の文献（J Pharmacol Toxicol Methods. 2017 Mar - Apr; 84: 111-127. doi: 10.1016/j.vascn.2016.12.003. Epub 2016 Dec 10）を参照することができる。この文献および技術常識から明らかなとおり、薬剤の添加濃度は、薬剤の種類によって異なるが、薬剤は、培養液に、例えば０．００００１～１００００μＭの範囲の濃度となるように添加することができる。
例えば、薬剤として、心筋細胞への作用が知られている物質を使用し、心筋細胞として、薬剤に対する応答性を調べたい被検体に由来する心筋細胞を使用した場合、被検体の心筋細胞に対する薬剤の効果を調べることができる。あるいは、薬剤として、心筋細胞への作用を調べたい物質を使用し、心筋細胞として、正常な心筋細胞を使用した場合、正常な心筋細胞に対する薬剤の効果を調べることができる。あるいは、薬剤として、心筋細胞への作用を調べたい物質を使用し、心筋細胞として、上述の疾患モデル心筋細胞を使用した場合、遺伝性疾患を有する被検体の心筋細胞に対する薬剤の効果を調べることができる。
より具体的には、本発明の方法は、創薬プロセスにおいて、医薬品の安全性や有効性を評価するために利用することができる。すなわち、薬剤として新薬候補物質を使用し、心筋細胞として正常な心筋細胞を使用して、新薬候補物質の心毒性を評価することができる。また、薬剤として新薬候補物質を使用し、心筋細胞として疾患モデル心筋細胞を使用して、その疾患の治療に有効な化合物を探すことができる。
第１実施形態では、薬剤応答性試験において、酸素運搬体を含む培養液を使用することにより、以下の効果を得ることができる。すなわち、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができる（後述の実施例２および５を参照）。また、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができる（後述の実施例２および５を参照）。また、薬剤添加によって起こる波形の変化（例えば、ＱＴ延長に相当する、活動電位波形もしくはＣａ2+波形の持続時間の延長、または早期後脱分極（early afterdepolarization（EAD））による不整脈など）を、より明瞭な波形の変化として検出することができる（後述の実施例６を参照）。
第１実施形態では、酸素運搬体が培養液に含まれていることにより、心筋細胞への酸素供給速度が高まり、その結果、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現できたと考えられる。
本発明により上記効果が得られる理由は定かではないが、本発明者らによる検討によれば、一つの可能性として、以下のことが考えられる。薬剤応答性試験の際に、拍動回数や筋収縮の活発化、細胞内シグナル伝達系やイオンポンプの活発化、これらによるATPの消費、その他の理由により、心筋細胞の酸素要求量が高まり、培地中の酸素量が不足し、結果として拍動停止や、予想される薬剤効果（例えば、頻脈応答やEADによる不整脈応答）が現れないという現象が発生する。このような現象は、本発明により心筋細胞に対する酸素供給量を高めるための構成を採用することで抑制できると考えられる。
１－２．第２実施形態
第２実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法は、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
以下の説明では、第１実施形態と異なる部分についてのみ説明し、第１実施形態と重複する説明は省略する。すなわち、第１実施形態では、薬剤応答性試験において「酸素運搬体を含む培養液」を使用したが、第２実施形態では、「培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（以下、液面距離ともいう）が５．０ｍｍ以下である条件」を使用する。したがって、この条件についてのみ以下で説明する。
第２実施形態において、心筋細胞は、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件下で試験してもよいし、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に試験してもよい。前者は、文字通り、試験が、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件下で行われることを意味する。後者は、心筋細胞を、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置き、その直後に、試験が、上記条件を満たしていない条件下または上記条件下の何れで行われてもよいことを意味する。
上述のとおり、「直後」は、典型的には２時間以内、好ましくは１時間以内、より好ましくは３０分以内をいう。また、上述のとおり、心筋細胞を試験前に所定の条件下に置く期間（この実施形態では、心筋細胞を試験前に、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置く期間）は、例えば、１分以上、好ましくは１０分以上とすることができる。この期間の上限は、例えば１２０分とすることができる。ただし、心筋細胞は長期間培養することが可能であるため、この期間の上限は特に限定されず、心筋細胞を試験前に、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件下で長期間培養ないし保管してもよい。
なお、後述の実施形態においても、「心筋細胞を、・・・に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験する」という同様の表現が使用されるが、この表現は、上記説明と同様の意味を有し、上記説明を参照することができる。
「培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（すなわち、液面距離）」は、図１に示される距離を指す。ここで、「培養容器底面」は、培養容器の内側底面を指す。上述のとおり、培養容器は、細胞の接着培養のために使用される容器であり、一般には平底容器、例えば、培養皿やマイクロタイタープレートである。図１は平底容器を示すが、培養容器がＶ底容器であってもよく、この場合、液面距離は、「培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面の最深部までの距離」を指す。
液面距離は、５．０ｍｍ以下、好ましくは３．５ｍｍ以下、より好ましくは１．５ｍｍ以下、更に好ましくは１．０ｍｍ以下である。液面距離の下限は、例えば０．１ｍｍである。液面距離は、培養液の量を変えることにより変化させることができる。
第２実施形態において薬剤応答性試験は、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件を使用したこと以外、第１実施形態と同様に行うことができる。
第２実施形態では、薬剤応答性試験において、液面距離が５．０ｍｍ以下である条件を使用することにより、第１実施形態と同様、以下の効果を得ることができる。すなわち、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができる（後述の実施例３および５を参照）。また、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができる（後述の実施例３および５を参照）。また、薬剤添加によって起こる波形の変化（例えば、ＱＴ延長に相当する、活動電位波形もしくはＣａ2+波形の持続時間の延長、またはEADによる不整脈など）を、より明瞭な波形の変化として検出することができる（後述の実施例６を参照）。
第２実施形態では、液面距離を短くすることにより、培養容器底面に接している心筋細胞と大気との距離が近くなり、心筋細胞への酸素供給速度が高まり、その結果、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現できたと考えられる。
第２実施形態において、心筋細胞の細胞密度が２．５×１０５細胞／ｃｍ２以上である場合、液面距離が１．５ｍｍ以下であることが好ましい。第２実施形態において、心筋細胞の細胞密度が１．２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、２．５×１０５細胞／ｃｍ２未満の場合、液面距離が３．５ｍｍ以下であることが好ましい。第２実施形態において、心筋細胞の細胞密度が０．６２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、１．２５×１０５細胞／ｃｍ２未満の場合、液面距離が５．０ｍｍ以下であることが好ましい。
１－３．第１実施形態と２実施形態の組合せ
第１実施形態と第２実施形態を組み合わせて実施してもよい。すなわち、組み合わされた実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
この組み合わされた実施形態によれば、第１実施形態および第２実施形態で述べた発明の効果を、より確実に発揮することができる（後述の実施例５および６を参照）。
１－４．第３実施形態
第３実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
以下の説明では、第１実施形態と異なる部分についてのみ説明し、第１実施形態と重複する説明は省略する。すなわち、第１実施形態では、薬剤応答性試験において「酸素運搬体を含む培養液」を使用したが、第３実施形態では、「酸素透過性を有する容器」を使用する。したがって、この容器についてのみ以下で説明する。
「酸素透過性を有する容器」は、具体的には、細胞培養で通常使用されるプラスチック素材の容器と比べて高い酸素透過性を有する素材を含む容器であり、より具体的には、７５０ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上の酸素透過性を有する素材を含む容器、好ましくは７５０～５００００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍの酸素透過性を有する素材を含む容器である。「酸素透過性を有する容器」は、例えば、ガス透過性膜を底面に備えた容器であり、例えば、VECELLプレート（ベセル社）、G-Rex Cell Culture Devices（アルゴステクノロジー社）が挙げられる。「酸素透過性を有する容器」に、プラスチック等の低い酸素透過性を有する素材のみで作られた容器は含まれない。
第３実施形態では、薬剤応答性試験において、酸素透過性を有する容器を使用することにより、第１実施形態と同様、以下の効果を得ることができる。すなわち、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができる（後述の実施例４を参照）。また、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができる（後述の実施例４を参照）。
第３実施形態では、酸素透過性を有する容器を使用することにより、心筋細胞への酸素供給速度が高まり、その結果、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現できたと考えられる。
１－５．第４実施形態
上述の第１実施形態から第３実施形態では、心筋細胞への酸素供給速度が高まったことにより本発明の効果が達成されると考えられる。したがって、上述の実施形態に限定されず、「心筋細胞への酸素供給速度を高める手段」の下で薬剤応答性試験を行えば、上述の本発明の効果が得られると考えられる。
したがって、第４実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
「心筋細胞への酸素供給速度を高める手段」は、当該手段を使用した場合に、当該手段を使用しなかった場合と比べて、心筋細胞への酸素供給速度を高めることができる任意の手段を指す。
１－６．第５実施形態
第５実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
以下の説明では、第１実施形態と異なる部分についてのみ説明し、第１実施形態と重複する説明は省略する。すなわち、第１実施形態では、薬剤応答性試験において「酸素運搬体を含む培養液」を使用したが、第５実施形態では、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件（以下、高酸素分圧条件ともいう）」を使用する。したがって、高酸素分圧条件についてのみ以下で説明する。
高酸素分圧条件における「酸素分圧」は、以下のとおり決定された値をいう。心筋細胞を９６ウェルプレートに播種し、培養液中で培養して心筋細胞シートを作製する。心筋細胞シートに新たな培養液を添加して、薬剤応答性試験で使用されるのと同じ心筋細胞含有培養液を重複して３ウェル調製する。それぞれの心筋細胞含有培養液を調製してから０．５時間以上静置した後に、それぞれの心筋細胞含有培養液の酸素分圧を、細胞外フラックスアナライザーXFe96（Agilent Technologies）を用いて測定し、平均値を求める。このようにして決定された値を酸素分圧という。なお、本明細書において「心筋細胞含有培養液」は、薬剤応答性試験で使用される心筋細胞を（一般的には、培養容器底面に接着した状態で）含んでいるが、薬剤応答性試験で使用される薬剤を含んでいない培養液を指す。
心筋細胞含有培養液は、調製直後は、酸素分圧の値が安定せず落ち着いていないため、上述のとおり、調製から０．５時間以上静置した後に酸素分圧を測定する。また、酸素分圧の測定時に、培養液に測定装置を入れることにより培養液の液面が揺れて、酸素分圧の測定値が一時的に上昇するため、培養液に測定装置を入れてから１２分以降に測定された値を測定値として採用する。すなわち、測定は、培養液の液面の揺れが確実に収まってから行う。
心筋細胞含有培養液が、高酸素分圧条件を満たしているか否か、すなわち、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持されるか否かは、以下のとおり確認することができる。具体的には、心筋細胞含有培養液を調製してから約０．５時間静置した後に、酸素分圧を決定し、酸素分圧が１２５ｍｍＨｇ以上である場合に、心筋細胞含有培養液が、高酸素分圧条件を満たしていると判断される。このように、酸素分圧の値が安定して落ち着いている代表的な時点（すなわち、心筋細胞含有培養液の調製から約０．５時間後）において酸素分圧が１２５ｍｍＨｇ以上の所定の値を示すことが確認できた場合、心筋細胞が培養液中の酸素を消費したとしても大気中から培養液に酸素が補充される環境が整っているため、その他の時点においても培養液の酸素分圧が所定の値とほぼ同じ値に維持されているとみなすことができる（後述の実施例７を参照）。
「高酸素分圧条件」は、好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１３０ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、より好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１３５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、更に好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１４０ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、更に好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１４５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件」である。酸素分圧の上限は、例えば７６０ｍｍＨｇである。
心筋細胞含有培養液が、上述の好ましい高酸素分圧条件を満たしているか否か、すなわち、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態でＸｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持されるか否かは、上述のとおり確認することができる。具体的には、心筋細胞含有培養液を調製してから約０．５時間静置した後に、酸素分圧を決定し、酸素分圧の値がＸｍｍＨｇ以上である場合に、心筋細胞含有培養液が、好ましい高酸素分圧条件を満たしていると判断される。
「高酸素分圧条件」は、パスカルの単位に換算すると、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１６．７ｋＰａ以上（すなわち１２５ｍｍＨｇ以上）の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１７．３ｋＰａ以上（すなわち１３０ｍｍＨｇ以上）の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、より好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１８．０ｋＰａ以上（すなわち１３５ｍｍＨｇ以上）の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、更に好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１８．７ｋＰａ以上（すなわち１４０ｍｍＨｇ以上）の酸素分圧を有するように維持される条件」であり、更に好ましくは、「心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１９．３ｋＰａ以上（すなわち１４５ｍｍＨｇ以上）の酸素分圧を有するように維持される条件」である。
「高酸素分圧条件」は、培養液の酸素分圧に影響を及ぼす構成を、酸素分圧を高めるように採用することにより作り出すことができる。「培養液の酸素分圧に影響を及ぼす構成」は、上述の第１実施形態から第３実施形態、および後述の第６実施形態から第９実施形態を参考にすることができ、例えば、酸素運搬体の培養液への添加、培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（以下、液面距離ともいう）の短縮、酸素透過性を有する容器の使用などが挙げられる。
「高酸素分圧条件」は、例えば、液面距離の短縮によって作り出すことができる。具体的には、「高酸素分圧条件」は、液面距離を５．０ｍｍ以下、好ましくは３．５ｍｍ以下、より好ましくは１．５ｍｍ以下、更に好ましくは１．０ｍｍ以下にすることにより作り出すことができる。液面距離の下限は、例えば０．１ｍｍである。
「高酸素分圧条件」は、好ましくは、液面距離の短縮および細胞密度の調整によって作り出すことができる。具体的には、「高酸素分圧条件」は、心筋細胞の細胞密度が２．５×１０５細胞／ｃｍ２以上である場合、液面距離を１．５ｍｍ以下にすることにより作り出すことができる。あるいは、「高酸素分圧条件」は、心筋細胞の細胞密度が１．２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、２．５×１０５細胞／ｃｍ２未満の場合、液面距離を３．５ｍｍ以下にすることにより作り出すことができる。あるいは、「高酸素分圧条件」は、心筋細胞の細胞密度が０．６２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、１．２５×１０５細胞／ｃｍ２未満の場合、液面距離を５．０ｍｍ以下にすることにより作り出すことができる。
第５実施形態では、薬剤応答性試験において、「高酸素分圧条件」を使用することにより、以下の効果を得ることができる。すなわち、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができる（後述の実施例７を参照）。また、薬剤添加によって起こる波形の変化（例えば、ＱＴ延長に相当する、活動電位波形もしくはＣａ2+波形の持続時間の延長、またはEADによる不整脈など）を、より明瞭な波形の変化として検出することができる（後述の実施例７を参照）。
第５実施形態では、「高酸素分圧条件」を使用することにより、心筋細胞への酸素供給速度が高まり、その結果、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現できたと考えられる。
１－７．他の実施形態
「心筋細胞への酸素供給速度を高める手段」の他の例を以下に示す。以下の説明では、第１実施形態と異なる部分についてのみ説明し、第１実施形態と重複する説明は省略する。
第６実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第６実施形態では、薬剤応答性試験は、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中で行われるか、あるいは心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中に置いた直後に行われる。高酸素濃度雰囲気は、具体的には、培養液を収容した培養容器を、気密性のボックスで覆って大気と隔離し、隔離された内部を高酸素濃度の気体で満たすことによりつくることができる。気密性のボックスとしては、例えば、顕微鏡インキュベーターや顕微鏡チャンバなどを使用することができる。また、高酸素濃度雰囲気は、密閉空間内の酸素濃度を制御するデバイス（酸素コントローラー）を用いて維持することができる。
高酸素濃度雰囲気は、大気中の酸素濃度（すなわち、約２０体積％）より高い酸素濃度を有する雰囲気を指し、例えば、酸素濃度が２５～１００体積％である雰囲気である。
第７実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液に酸素含有ガスをバブリングしながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素含有ガスをバブリングしている培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第７実施形態では、薬剤応答性試験は、培養液に酸素含有ガスをバブリングしながら行われるか、あるいは心筋細胞を、酸素含有ガスをバブリングしている培養液中に置いた直後に行われる。酸素含有ガスのバブリングは、具体的には、培養液にチューブを挿入し、酸素含有ガスを培養液に送ることにより行うことができる。バブリングの速度は、例えば０．１～１０００ｍＬ／分とすることができる。酸素含有ガスは、大気であってもよいし、酸素濃度が２５体積％以上のガスであってもよいし、酸素ガスであってもよい。
第８実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液を振盪しながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、振盪している培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第８実施形態では、薬剤応答性試験は、培養液を振盪しながら行われるか、あるいは心筋細胞を、振盪している培養液中に置いた直後に行われる。振盪によって、培養液の液面が揺れ大気と培養液との接触が高まり培養液中の酸素濃度を高めることができる。また、振盪によって培養液が攪拌されることにより、液面付近の培養液に集中しがちな酸素を細胞付近の培養液まで均一に分散させることができる。振盪は、具体的には、培養皿やマイクロタイタープレートのための振盪培養装置を用いて行うことができる。振盪条件は、例えば、振幅１～１０００ｃｍ、速度１～１０００ｒｐｍとすることができる。
第９実施形態によれば、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
第９実施形態では、薬剤応答性試験は、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中で行われるか、あるいは心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中に置いた直後に行われる。この実施形態は、具体的には、高い酸素溶存量を有する培養液を、灌流培養装置を用いて心筋細胞に供給することにより行うことができる。培養液中の酸素溶存量は、例えば３～１０００ｍｇ／Ｌとすることができ、培養液の循環速度は、例えば１～１０００ｍｌ／分とすることができる。
上述の第６実施形態から第９実施形態においても、各実施形態に示される手段の採用により、心筋細胞への酸素供給速度が高まると考えられ、その結果、薬剤応答性試験において心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現できると考えられる。
第１実施形態と第２実施形態を組み合わせて実施してもよいことについては既に述べたが、これに限定されず、上述の第１実施形態から第９実施形態は、技術的に可能であれば適宜組み合わせて実施することができる。
２．別の側面
２－１．培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法
上述の第１実施形態から第９実施形態の方法は、薬剤の添加により引き起こされる培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法であるが、培養液温度の変化、培養液の塩濃度の変化、培養液ｐＨの変化など、任意の培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法に一般化することができる。
第１実施形態から第９実施形態の方法では、心筋細胞に対する酸素供給量を高めるための構成を採用し、これにより、心筋細胞への酸素供給速度を高め、その結果、心筋細胞が薬剤に対する応答効果を適切に発現することができた。したがって、第１実施形態から第９実施形態の方法に従って心筋細胞に対する酸素供給量を高めるための構成を採用すれば、心筋細胞への酸素供給速度を高め、その結果、任意の培養環境変化に対する心筋細胞の応答効果を適切に発現できると考えられる。
任意の培養環境変化には、薬剤の添加による培養液組成の変化に加えて、培養液温度の変化、培養液の塩濃度の変化、培養液ｐＨの変化などが含まれる。心筋細胞培養液の温度を、例えば、通常の細胞培養環境の温度である３７℃から２０～４３℃の範囲で低下あるいは上昇させると、心筋細胞の拍動回数が減少あるいは増加し、一定の低温や高温に達すると拍動が停止することが観察されている。また、心筋細胞培養液のｐＨを、例えば、通常の細胞培養環境のｐＨである７．０～７．４の値から６．０～９．０の範囲で下降あるいは上昇させると、心筋細胞の拍動回数が減少あるいは増加し、一定のｐＨ条件で拍動が停止することが観察されている。また、心筋細胞培養液のＫＣｌ塩濃度を、例えば、通常の細胞培養環境のＫＣｌ塩濃度である約５ｍＭから０～１００ｍＭの範囲で減少あるいは増加させると、心筋細胞の拍動回数が減少あるいは増加し、一定のＫＣｌ塩濃度の条件で拍動が停止することが観察されている。このような拍動回数の減少または増加や、拍動の停止が見られる培養環境下においても、第１実施形態から第９実施形態の方法に従って心筋細胞に対する酸素供給量を高めるための構成を採用すれば、培養環境変化に対する心筋細胞の応答効果を適切に発現することができる（後述の実施例８を参照）。
したがって、第１実施形態は、以下の方法に一般化することができる：
培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること
を含む方法。
第２実施形態は、以下の方法に一般化することができる：
培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法であって、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること
を含む方法。
第３実施形態は、以下の方法に一般化することができる：
培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法であって、
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること
を含む方法。
第４実施形態は、以下の方法に一般化することができる：
心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること
を含む方法。
第５実施形態は、以下の方法に一般化することができる：
培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法であって、
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること
を含む方法。
第６～第９実施形態は、以下の方法に一般化することができる：
培養環境変化に対する心筋細胞の応答性を試験する方法であって、
a）前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること、
b）前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液に酸素含有ガスをバブリングしながら、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、酸素含有ガスをバブリングしている培養液中に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること、
c）前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液を振盪しながら、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、振盪している培養液中に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること、あるいは
d）前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中で、培養環境変化に対する応答性について試験すること、または前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中に置いた直後に、培養環境変化に対する応答性について試験すること
を含む方法。
上述の一般化された方法は、第１実施形態から第９実施形態と同様の手順に従って実施することができる。培養環境変化が培養液温度の変化である場合、心筋細胞培養液の温度を例えば２０～４３℃の範囲で変化させることができる。培養環境変化が培養液ｐＨの変化である場合、心筋細胞培養液のｐＨを例えば６．０～９．０の範囲で変化させることができる。培養環境変化が培養液の塩濃度の変化である場合、例えばＫＣｌ塩濃度を例えば０～１００ｍＭの範囲で変化させることができる。
２－２．薬剤応答性試験用培養液
別の側面によれば、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを含む、薬剤応答性試験用培養液が提供される。ここで「心筋細胞の培養液」は、第１実施形態の欄で説明した「酸素運搬体が添加される培養液」であり、「酸素運搬体」は、第１実施形態の欄で説明したとおりである。薬剤応答性試験用培養液において、酸素運搬体は、心筋細胞の培養液中に溶解している。
薬剤応答性試験用培養液は、
心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。
薬剤応答性試験用培養液は、
心筋細胞の培養液と、
心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％、更に好ましくは２．０～５．０質量％の量の酸素運搬体と
を含み、ここで酸素運搬体は、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンである。
好ましくは、薬剤応答性試験用培養液は、
DMEM、RPMI、IMDM、Ham-12などの基礎培地から構成される心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。ここで、心筋細胞の培養液中の酸素運搬体の含有量は、心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％、更に好ましくは２．０～５．０質量％である。
あるいは、好ましくは、薬剤応答性試験用培養液は、
０．０１～０．５ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０～１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．１～１．０ｇ／ＬのＫＣｌ、
０～１０．０ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
１．０～２０．０ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０～１．０ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、および
０～２０．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ
から構成される心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。ここで、心筋細胞の培養液は、血清を含んでいなくてもよいし、心筋細胞の培養液に対して４０質量％以下の量で血清を更に含んでいてもよい。また、ここで、心筋細胞の培養液中の酸素運搬体の含有量は、心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％、更に好ましくは２．０～５．０質量％である。
一例を挙げると、薬剤応答性試験用培養液は、
０．１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０．０９７６７ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、
３．３６２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
５．４５２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０．１０９ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、および
５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ
から構成される心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。ここで、心筋細胞の培養液は、血清を含んでいなくてもよいし、心筋細胞の培養液に対して４０質量％以下の量で血清を更に含んでいてもよい。また、ここで、心筋細胞の培養液中の酸素運搬体の含有量は、心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％、更に好ましくは２．０～５．０質量％である。
薬剤応答性試験用培養液のｐＨは特に限定されないが、好ましくは６．０～９．０、より好ましくは７．０～８．０である。
２－３．薬剤応答性試験用キット
更に別の側面によれば、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを含む、薬剤応答性試験用キットが提供される。ここで「心筋細胞の培養液」は、第１実施形態の欄で説明した「酸素運搬体が添加される培養液」であり、「酸素運搬体」は、第１実施形態の欄で説明したとおりである。薬剤応答性試験用キットは、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを、別々のパッケージで含む。したがって、薬剤応答性試験用キットに含まれる「心筋細胞の培養液」および「酸素運搬体」を混合して、心筋細胞の培養液中に酸素運搬体を溶解させれば、上述の薬剤応答性試験用培養液を得ることができる。
薬剤応答性試験用キットは、
心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。
薬剤応答性試験用キットは、
心筋細胞の培養液と、
心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％の量の酸素運搬体と
を含み、ここで酸素運搬体は、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンである。
好ましくは、薬剤応答性試験用キットは、
DMEM、RPMI、IMDM、Ham-12などの基礎培地から構成される心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。ここで、心筋細胞の培養液中の酸素運搬体の含有量は、心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％である。
あるいは、好ましくは、薬剤応答性試験用キットは、
０．０１～０．５ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０～１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．１～１．０ｇ／ＬのＫＣｌ、
０～１０．０ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
１．０～２０．０ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０～１．０ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、および
０～２０．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ
から構成される心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。ここで、心筋細胞の培養液は、血清を含んでいなくてもよいし、心筋細胞の培養液に対して４０質量％以下の量で血清を更に含んでいてもよい。また、ここで、心筋細胞の培養液中の酸素運搬体の含有量は、心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％である。
一例を挙げると、薬剤応答性試験用キットは、
０．１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０．０９７６７ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、
３．３６２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
５．４５２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０．１０９ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、および
５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ
から構成される心筋細胞の培養液と、
酸素運搬体、好ましくは酸素運搬タンパク質、より好ましくはヘモグロビンと
を含む。ここで、心筋細胞の培養液は、血清を含んでいなくてもよいし、心筋細胞の培養液に対して４０質量％以下の量で血清を更に含んでいてもよい。また、ここで、心筋細胞の培養液中の酸素運搬体の含有量は、心筋細胞の培養液に対して、好ましくは０．１～１０質量％、より好ましくは０．５～５．０質量％である。
２－４．心筋細胞の拍動停止抑制剤および心筋細胞の薬剤応答性増強剤
更に別の側面によれば、酸素運搬体を含む、心筋細胞の拍動停止抑制剤、あるいは酸素運搬体を含む、心筋細胞の薬剤応答性増強剤が提供される。ここで「酸素運搬体」は、第１実施形態の欄で説明したとおりである。心筋細胞の拍動停止抑制剤は、心筋細胞の培養液に添加することにより、心筋細胞の薬剤応答性試験で使用することができる。同様に、心筋細胞の薬剤応答性増強剤は、心筋細胞の培養液に添加することにより、心筋細胞の薬剤応答性試験で使用することができる。
本発明の心筋細胞の拍動停止抑制剤、または心筋細胞の薬剤応答性増強剤は、剤型は特に限定されず、例えば酸素運搬タンパク質を含むものであれば、プラスチック容器に入った粉末形態や水溶液の形態など、ヘモグロビンの一般的な販売形態と同様の形態とすることができる。
また、本発明は、上記酸素運搬体の心筋細胞の拍動停止抑制のための使用、あるいは上記酸素運搬体の心筋細胞の薬剤応答性増強のための使用も含む。
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。また、各実施形態は適宜組み合わせて実施してもよく、その場合組み合わせた効果が得られる。更に、上記実施形態には種々の発明が含まれており、開示される複数の構成要件から選択された組み合わせにより種々の発明が抽出され得る。例えば、実施形態に示される全構成要件からいくつかの構成要件が削除されても、課題が解決でき、効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
３．好ましい実施形態
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
上述のとおり、第１実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第１実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第２実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第２実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第１実施形態と第２実施形態との組合せによると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、第１実施形態と第２実施形態との上記組合せにおいて、前記方法は、
前記心筋細胞を、酸素運搬体を含む培養液中で、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が５．０ｍｍ以下である条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第３実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第３実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第４実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、培養液中、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第４実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記心筋細胞への酸素供給速度を高める手段の下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第５実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第５実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第６実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第６実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、高酸素濃度雰囲気下に置かれた培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第７実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液に酸素含有ガスをバブリングしながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、酸素含有ガスをバブリングしている培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第７実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液に酸素含有ガスをバブリングしながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第８実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液を振盪しながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、振盪している培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第８実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、培養液中で、前記培養液を振盪しながら、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
上述のとおり、第９実施形態によると、心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む方法が提供される。
好ましい実施形態によると、上記第９実施形態において、前記方法は、
前記心筋細胞を、高い酸素溶存量を有する培養液を供給する循環式の培養システムにおいて、前記培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
を含む。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記直後は、２時間以内、好ましくは１時間以内、より好ましくは３０分以内である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記心筋細胞は、多能性幹細胞から分化誘導した心筋細胞、好ましくはｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記心筋細胞は、哺乳類の心筋細胞、好ましくはヒトの心筋細胞である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記心筋細胞は、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞であり、好ましくはヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した成熟心筋細胞である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記心筋細胞は、心筋細胞シートの形態または心筋細胞塊の形態であり、好ましくは心筋細胞シートの形態である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記酸素運搬体は、赤血球、酸素運搬タンパク質、または人工の酸素運搬体であり、好ましくは酸素運搬タンパク質であり、より好ましくはヘモグロビンである。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記酸素運搬体は、前記培養液に対して、０．１～１０質量％、好ましくは０．５～５．０質量％、より好ましくは２．０～５．０質量％で、前記培養液中に含まれる。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記培養液は、心筋細胞の培養液であり、例えば、心筋細胞の培養用の培養液または心筋細胞の電位測定用の培養液である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記培養液は、培養容器に収容されており、前記培養容器は、平底容器である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記薬剤は、前記心筋細胞への作用が知られている物質、または前記心筋細胞への作用を調べたい物質である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記薬剤は、新薬候補物質である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記薬剤は、新薬候補物質であり、前記心筋細胞は、正常な心筋細胞であり、前記方法は、前記試験結果に基づいて、前記新薬候補物質の心毒性を評価することを更に含む。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記薬剤は、新薬候補物質であり、前記心筋細胞は、疾患モデル心筋細胞であり、前記方法は、前記試験結果に基づいて、前記疾患の治療に対する前記新薬候補物質の有効性を評価することを更に含む。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離は、３．５ｍｍ以下、好ましくは１．５ｍｍ以下、より好ましくは１．０ｍｍ以下である。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離は、０．１～５．０ｍｍ、好ましくは０．１～３．５ｍｍ、より好ましくは０．１～１．５ｍｍ、更に好ましくは０．１～１．０ｍｍである。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記試験は、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で、１２５ｍｍＨｇ以上、好ましくは１３０ｍｍＨｇ以上、より好ましくは１３５ｍｍＨｇ以上、更に好ましくは１４０ｍｍＨｇ以上、更に好ましくは１４５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で行われる。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記試験は、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で、１２５～７６０ｍｍＨｇ、好ましくは１３０～７６０ｍｍＨｇ、より好ましくは１３５～７６０ｍｍＨｇ、更に好ましくは１４０～７６０ｍｍＨｇ、更に好ましくは１４５～７６０ｍｍＨｇの酸素分圧を有するように維持される条件下で行われる。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、
前記心筋細胞が、前記培養液中で、２．５×１０５細胞／ｃｍ２以上の細胞密度を有している場合、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（液面距離）が１．５ｍｍ以下であり、
前記心筋細胞が、前記培養液中で、１．２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、２．５×１０５細胞／ｃｍ２未満の細胞密度を有している場合、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（液面距離）が３．５ｍｍ以下であり、
前記心筋細胞が、前記培養液中で、０．６２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、１．２５×１０５細胞／ｃｍ２未満の細胞密度を有している場合、前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（液面距離）が５．０ｍｍ以下である。
上述のとおり、別の実施形態によると、酸素運搬体を含む、心筋細胞の拍動停止抑制剤が提供される。また、別の実施形態によると、酸素運搬体を含む、心筋細胞の薬剤応答性増強剤が提供される。
上述のとおり、別の実施形態によると、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを含む、薬剤応答性試験用キットが提供される。好ましい実施形態によると、上記実施形態に係るキットにおいて、前記キットは、前記心筋細胞の培養液と前記酸素運搬体とを、別々のパッケージで含む。
上述のとおり、別の実施形態によると、心筋細胞の培養液と酸素運搬体とを含む、薬剤応答性試験用培養液が提供される。好ましい実施形態によると、上記実施形態に係る薬剤応答性試験用培養液において、前記酸素運搬体は、前記心筋細胞の培養液中に溶解している。
上述のとおり、別の実施形態によると、酸素運搬体の心筋細胞の拍動停止抑制のための使用が提供される。また、別の実施形態によると、酸素運搬体の心筋細胞の薬剤応答性増強のための使用が提供される。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記酸素運搬体は、赤血球、酸素運搬タンパク質、または人工の酸素運搬体であり、好ましくは酸素運搬タンパク質であり、より好ましくはヘモグロビンである。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記酸素運搬体は、前記培養液に対して、０．１～１０質量％、好ましくは０．５～５．０質量％、より好ましくは２．０～５．０質量％で、前記培養液中に含まれる。
好ましい実施形態によると、上記実施形態の何れか１つにおいて、前記培養液は、心筋細胞の培養液であり、例えば、心筋細胞の培養用の培養液または心筋細胞の電位測定用の培養液である。
実施例１（従来例）
［１－１］ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞シートの作製
心筋細胞は、ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１、理研バイオリソースセンター）、または、カルシウムと結合して蛍光を発するＧＣａＭＰ遺伝子を導入したヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）を、プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法により心筋細胞に分化誘導することにより作製した（ＷＯ２０１５／１８２７６５を参照）。得られた心筋細胞は、心筋分化培地（ＩＭＤＭ ２４５ｍｌ、ＤＭＤＭ ２４５ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００） ５ｍｌ、０．２Ｍ Ｌ－グルタミン ５ｍｌ、１Ｍ Ｌ－カルニチン １００μｌ、アスコルビン酸 ５０ｍｇ、０．５Ｍクレアチン １ｍｌ含有）で維持した。
心筋細胞を、薬剤応答性試験の一週間程前に、９６ウェルプレートに播種した。トリプシン溶液（０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher Scientific））を添加し、５～８分間インキュベーター内で処理した後、単一の細胞に分離した。１０μｇ／ｍＬ濃度のラミニンｉＭａｔｒｉｘで９６ウェルプレートをコーティングし、１ウェル当たり細胞数４～８×１０4となるよう播種した。その後、７日間、培養液中で培養し、拍動する心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを薬剤応答性試験で使用した。なお、心筋細胞は、心筋細胞シートを製造するための培養中に増殖しないため、播種時の細胞密度は、明らかな細胞死が見られない場合、心筋細胞シートにおいても基本的に維持されている。
［１－２］薬剤応答性試験の方法
薬剤応答性試験は、蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージングによって行った。具体的には、薬剤応答性試験は、蛍光顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３で、心筋細胞の拍動カルシウム蛍光動画を取得することにより行った。
薬剤応答性試験では、以下の組成を有する培養液をｐＨ７．４に調整して、心筋細胞の培養液として使用した：
０．１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０．０９７６７ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、
３．３６２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
５．４５２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０．１０９ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、
５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、および
１０質量％のＦＢＳ（Fetal bovine serum, Invitrogen）
本実施例では、薬剤応答性試験の間、培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離は８．３３ｍｍであった。
顕微鏡上で細胞培養液に薬剤を添加し、１０分後に、カルシウムセンサータンパク質ＧＣａＭＰまたはカルシウム指示薬Ｃａｌ－５２０を用いてカルシウムシグナルを測定した。本明細書では、測定された細胞内カルシウムイオン（Ｃａ2+）濃度の波形を「Ｃａ2+波形」と呼ぶ。データ解析にはＩｍａｇｅＪベースの画像解析ソフトウェアを使用した。
薬剤としては、イソプロテレノール、ミルリノン、ベラパミル、Ｅ－４０３１、またはテルフェナジンを使用した。なお、実施例全体にわたって、薬剤の濃度は、培養液中の最終濃度を示す。
［１－３］結果
イソプロテレノールを添加した場合、一定濃度未満（１００ｎＭ以上、２００ｎＭ未満）では、予想された薬剤応答（頻脈応答）が検出されたが、一定濃度以上（２００～１０００ｎＭ）においては拍動が停止してしまい、薬剤応答波形が評価できない現象が時折認められた。
ミルリノンを添加した場合、一定濃度未満（１００ｎＭ以上、３００ｎＭ未満）では、予想された薬剤応答（頻脈応答）が検出されたが、一定濃度以上（３００～５００μＭ）においては拍動が停止してしまい、薬剤応答波形が評価できなかったか、または、予想される薬剤応答（頻脈応答）が検出されなかった。
ベラパミルを添加した場合、一定濃度未満（１００ｎＭ以上、２００ｎＭ未満）では、予想された薬剤応答（Ｃａ2+波形の振幅低下および徐脈応答）が検出されたが、一定濃度以上（２００～５００ｎＭ）において拍動停止が起こり、薬剤応答波形が評価できなかった。
Ｅ－４０３１を添加した場合、一定濃度未満（１００ｎＭ以上、３００ｎＭ未満）では、予想された薬剤応答（Ｃａ2+波形の持続時間の延長応答）が検出されたが、一定濃度以上（３００～１０００ｎＭ）において拍動が停止した。
テルフェナジンを添加した場合、一定濃度未満（１００ｎＭ以上、３００ｎＭ未満）では、予想された薬剤応答（Ｃａ2+波形の持続時間の延長応答）が検出されたが、一定濃度以上（３００～１０００ｎＭ）において拍動が停止したか、または、テルフェナジンの副作用として予想されているEAD応答が見られなかった。
このように、心筋細胞の薬剤応答性試験では、添加される薬剤が一定の濃度を超えると、予想される薬剤応答を評価することができなかった。
実施例２
実施例２では、ヘモグロビンを含む培養液を用いて薬剤応答性試験を行った。
［２－１］培養液の調製
ヘモグロビンを含む培養液は、以下のとおり調製した：
以下の組成を有する培養液に、０．５質量％または１．０質量％のウシヘモグロビン（Nacalai tesque 17553-92）を添加してヘモグロビンを懸濁させ、５Ｎ ＮａＯＨまたは１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。
０．１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０．０９７６７ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、
３．３６２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
５．４５２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０．１０９ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、
５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、および
１０質量％のＦＢＳ（Fetal bovine serum, Invitrogen）
ヘモグロビンを含まない培養液は、ヘモグロビンを添加しなかったこと以外は、ヘモグロビンを含む培養液と同様に調製した。
［２－２］薬剤応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、以下のサンプルについて薬剤応答性試験を行った。実施例１と同様、心筋細胞を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり細胞数４×１０4～８×１０4（すなわち、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2～２．５×１０5細胞／ｃｍ2）となるよう播種し、培養して、拍動する心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを薬剤応答性試験で使用した。
Figure 0007341478000001
本実施例では、薬剤応答性試験の間、培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離は６．６７ｍｍであった。
拍動停止率は、以下のとおり求めた。
拍動停止率（％）＝｛（薬剤添加後１０分以内に拍動停止した心筋細胞シートの数）／（薬剤応答性試験を行った心筋細胞シートの数）｝×１００
［２－３］結果
心筋細胞シートを、ヘモグロビンを含まない培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答（頻脈応答）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル２Ａ）。一方、心筋細胞シートを、ヘモグロビンを含まない培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル２Ｂ）。
心筋細胞シートを、ヘモグロビンを０．５質量％の濃度で含む培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル２Ｃ）。また、心筋細胞シートを、ヘモグロビンを０．５質量％の濃度で含む培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合でも、予想された薬剤応答が検出され、拍動停止は全く起こらなかった（サンプル２Ｄ）。サンプル２Ｄの結果を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａは、薬剤添加前の波形を示し、図２Ｂは、薬剤添加後の波形を示す。
心筋細胞シートを、ヘモグロビンを１．０質量％の濃度で含む培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル２Ｅ）。また、心筋細胞シートを、ヘモグロビンを１．０質量％の濃度で含む培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合でも、予想された薬剤応答が検出され、拍動停止は全く起こらなかった（サンプル２Ｆ）。
サンプル２Ａ～２Ｆの結果をまとめて図３に示す。図３は、横軸にヘモグロビン濃度を示し、縦軸に拍動停止率を示す。図３は、ヘモグロビンを培養液に添加することにより、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、図３は、ヘモグロビンを培養液に添加することにより、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができることを示す。
実施例３
実施例３では、培養液の液面（すなわち、酸素濃度約20体積％の雰囲気と接している培養液の液面）から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（図１参照）を変化させて薬剤応答性試験を行った。この距離は、培養液量を変えることにより変化させた。以下、この距離を「液面距離」ともいう。
［３－１］薬剤応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、以下のサンプルについて薬剤応答性試験を行った。実施例１と同様、心筋細胞を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり細胞数４×１０4～８×１０4（すなわち、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2～２．５×１０5細胞／ｃｍ2）となるよう播種し、培養して、拍動する心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを薬剤応答性試験で使用した。
Figure 0007341478000002
［３－２］結果
心筋細胞シートを、液面距離８．３３ｍｍの培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答（頻脈応答）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル３Ａ）。一方、心筋細胞シートを、液面距離８．３３ｍｍの培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル３Ｂ）。
心筋細胞シートを、液面距離６．６７ｍｍの培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル３Ｃ）。一方、心筋細胞シートを、液面距離６．６７ｍｍの培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル３Ｄ）。サンプル３Ｄの結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。図４Ａは、薬剤添加前の波形を示し、図４Ｂは、薬剤添加後の波形を示す。
心筋細胞シートを、液面距離５．００ｍｍの培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル３Ｅ）。一方、心筋細胞シートを、液面距離５．００ｍｍの培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、拍動停止の発生頻度は約５０％に抑えられ、液面距離が６．６７ｍｍの場合に比べて大幅に改善した（サンプル３Ｆ）。
心筋細胞シートを、液面距離３．３３ｍｍの培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル３Ｇ）。また、心筋細胞シートを、液面距離３．３３ｍｍの培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合でも、予想された薬剤応答が検出され、拍動停止はほとんど起こらなかった（サンプル３Ｈ）。
心筋細胞シートを、液面距離１．６７ｍｍの培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル３Ｉ）。また、心筋細胞シートを、液面距離１．６７ｍｍの培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合でも、予想された薬剤応答が検出され、拍動停止は全く起こらなかった（サンプル３Ｊ）。サンプル３Ｊの結果を図４Ｃおよび４Ｄに示す。図４Ｃは、薬剤添加前の波形を示し、図４Ｄは、薬剤添加後の波形を示す。
サンプル３Ａ～３Ｊの結果をまとめて図５に示す。図５は、横軸に液面距離を示し、縦軸に拍動停止率を示す。図５は、液面距離を約５．０ｍｍ以下にすることにより、好ましくは液面距離を約３．５ｍｍ以下にすることにより、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、図５は、液面距離を約５．０ｍｍ以下にすることにより、好ましくは液面距離を約３．５ｍｍ以下にすることにより、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができることを示す。
実施例４
実施例４では、酸素透過性を有する底面を備えた培養容器（以下、酸素透過容器ともいう）を用いて薬剤応答性試験を行った。具体的には、酸素透過容器として、VECELL ９６ウェルプレート（ベセル社）を使用した。この容器は、底面にガス透過性膜を有する。コントロール容器として、CELLBIND ９６ウェルプレート（コーニング社）を使用した。この容器は、ポリスチレン素材で作られた容器である。
［４－１］薬剤応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、以下のサンプルについて薬剤応答性試験を行った。実施例１と同様、心筋細胞を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり細胞数４×１０4～８×１０4（すなわち、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2～２．５×１０5細胞／ｃｍ2）となるよう播種し、培養して、拍動する心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを薬剤応答性試験で使用した。
Figure 0007341478000003
本実施例では、薬剤応答性試験の間、培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離は６．６７ｍｍであった。
［４－２］結果
心筋細胞シートを、コントロール容器に収容される培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答（頻脈応答）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル４Ａ）。一方、心筋細胞シートを、コントロール容器に収容される培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル４Ｂ）。サンプル４Ｂの結果を図６Ａに示す。図６Ａは、薬剤添加後の波形を示す。
心筋細胞シートを、酸素透過容器に収容される培養液中に置き、１００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル４Ｃ）。また、心筋細胞シートを、酸素透過容器に収容される培養液中に置き、１０００ｎＭイソプロテレノールを添加した場合でも、拍動停止は低い頻度でしか起こらなかった（サンプル４Ｄ）。サンプル４Ｄの結果を図６Ｂおよび図６Ｃに示す。図６Ｂは、薬剤添加前の波形を示し、図６Ｃは、薬剤添加後の波形を示す。
サンプル４Ａ～４Ｄの結果をまとめて図７に示す。図７は、横軸に培養容器の種類を示し、縦軸に拍動停止率を示す。図７は、酸素透過容器を使用することにより、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、図７は、酸素透過容器を使用することにより、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができることを示す。
実施例５
実施例５では、イソプロテレノール以外の薬剤、すなわちベラパミル、Ｅ－４０３１、テルフェナジンおよびミルリノンを用いて薬剤応答性試験を行った。
［５－１］薬剤応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、以下のサンプルについて薬剤応答性試験を行った。実施例１と同様、心筋細胞を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり細胞数４×１０4～８×１０4（すなわち、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2～２．５×１０5細胞／ｃｍ2）となるよう播種し、培養して、拍動する心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを薬剤応答性試験で使用した。
Figure 0007341478000004
［５－２］ベラパミルの結果
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．１μＭベラパミルを添加した場合、予想された薬剤応答（Ｃａ2+波形の振幅低下、徐脈応答）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ａ）。また、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．１μＭベラパミルを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｂ）。
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．３μＭベラパミルを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル５Ｃ）。サンプル５Ｃの結果を図８Ａに示す。図８Ａは、薬剤添加後の波形を示す。一方、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．３μＭベラパミルを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｄ）。サンプル５Ｄの結果を図８Ｂおよび図８Ｃに示す。図８Ｂは、薬剤添加前の波形を示し、図８Ｃは、薬剤添加後の波形を示す。
サンプル５Ａ～５Ｄの結果をまとめて図９に示す。図９は、横軸に薬剤応答性試験の条件（すなわち、液面距離およびヘモグロビン濃度）を示し、縦軸に拍動停止率を示す。図９は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、ベラパミルの場合も同様に、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、図９は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、ベラパミルの場合も同様に、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができることを示す。
［５－３］Ｅ－４０３１の結果
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．１μＭ Ｅ－４０３１を添加した場合、予想された薬剤応答（Ｃａ2+波形の持続時間の延長応答やEAD不整脈）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｅ）。また、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．１μＭ Ｅ－４０３１を添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｆ）。
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．３μＭ Ｅ－４０３１を添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル５Ｇ）。サンプル５Ｇの結果を図１０Ａに示す。図１０Ａは、薬剤添加後の波形を示す。一方、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．３μＭ Ｅ－４０３１を添加した場合、予想された薬剤応答（EAD不整脈）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｈ）。サンプル５Ｈの結果を図１０Ｂおよび図１０Ｃに示す。図１０Ｂは、薬剤添加前の波形を示し、図１０Ｃは、薬剤添加後の波形（EAD不整脈応答）を示す。
サンプル５Ｅ～５Ｈの結果をまとめて図１１に示す。図１１は、横軸に薬剤応答性試験の条件（すなわち、液面距離およびヘモグロビン濃度）を示し、縦軸に拍動停止率を示す。図１１は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、Ｅ－４０３１の場合も同様に、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、図１１は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、Ｅ－４０３１の場合も同様に、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができることを示す。
［５－４］テルフェナジンの結果
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．１μＭテルフェナジンを添加した場合、予想された薬剤応答（ＱＴ延長）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｉ）。また、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．１μＭテルフェナジンを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｊ）。
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．７μＭテルフェナジンを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル５Ｋ）。サンプル５Ｋの結果を図１２Ａに示す。図１２Ａは、薬剤添加後の波形を示す。一方、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．７μＭテルフェナジンを添加した場合、予想された薬剤応答（Ｃａ2+波形の持続時間の延長）が検出され、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｌ）。サンプル５Ｌの結果を図１２Ｂおよび図１２Ｃに示す。図１２Ｂは、薬剤添加前の波形を示し、図１２Ｃは、薬剤添加後の波形を示す。
サンプル５Ｉ～５Ｌの結果をまとめて図１３に示す。図１３は、横軸に薬剤応答性試験の条件（すなわち、液面距離およびヘモグロビン濃度）を示し、縦軸に拍動停止率を示す。図１３は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、テルフェナジンの場合も同様に、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、図１３は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、テルフェナジンの場合も同様に、薬剤応答性試験で適用可能な薬剤濃度の範囲を広げることができることを示す。
［５－５］ミルリノンの結果
「心拍数変化率」を以下のように求めた。 心拍数変化率（％）＝（薬剤添加後の心拍数／薬剤添加前の心拍数）×１００。
心拍数は一分間あたりのＣａ2+波形の波の数で求めた。
変化がない場合、変化率は１００％で表され、頻脈になると１００％以上の値を取る。
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、３００μＭミルリノンを添加した場合、予想された薬剤応答（頻脈応答）は検出されず（心拍数変化率７９％）、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｍ）。また、２．０質量％のヘモグロビンを含み、１．０ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、３００μＭミルリノンを添加した場合、予想された薬剤応答が検出され（心拍数変化率１１８％）、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｎ）。
ヘモグロビンを含まず、６．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、５００μＭミルリノンを添加した場合、高頻度で拍動が停止した（サンプル５Ｏ）。サンプル５Ｏの結果を図１４Ａに示す。図１４Ａは、薬剤添加後の波形を示す。一方、２．０質量％のヘモグロビンを含み、１．０ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、５００μＭミルリノンを添加した場合、予想された薬剤応答（頻脈応答）が検出され（心拍数変化率１５４％）、拍動の停止は起こらなかった（サンプル５Ｐ）。サンプル５Ｐの結果を図１４Ｂおよび図１４Ｃに示す。図１４Ｂは、薬剤添加前の波形を示し、図１４Ｃは、薬剤添加後の波形を示す。
これらの結果から、ヘモグロビンを培養液中により高い濃度で添加し、かつ液面距離をより短くすると、ミルリノンの場合も同様に、薬剤応答性試験中に心筋細胞の拍動が停止してしまうという不具合の発生を抑制することができることを示す。また、これらの結果は、iPS細胞由来の心筋細胞では従来検出が難しかったミルリノンによる頻脈応答が検出できるようになることを示す。
実施例６
実施例６では、テルフェナジンを用いて薬剤応答性試験を行い、ＱＴ延長に相当するＣａ2+波形の持続時間の延長と、EAD不整脈について評価した。
［６－１］薬剤応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、以下のサンプルについて薬剤応答性試験を行った。実施例１と同様、心筋細胞を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり細胞数４×１０4～８×１０4（すなわち、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2～２．５×１０5細胞／ｃｍ2）となるよう播種し、培養して、拍動する心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを薬剤応答性試験で使用した。
Figure 0007341478000005
薬剤添加前におけるＣａ2+波形の立ち上がりからの持続時間（ＴB）と、薬剤添加後におけるＣａ2+波形の立ち上がりからの持続時間（ＴA）とを測定し、これらの値から「Ｃａ2+持続時間の変化率」を以下の式により求めた。
Ｃａ2+持続時間の変化率（％）＝（ＴA／ＴB）×１００
変化がない場合、変化率は１００％で表される。
また、「EAD発生率」については、カルシウム蛍光値が上昇しベースラインに戻るまでの波形を１つのＣａ2+波形とみなし、１つのＣａ2+波形内に２つ以上のピークが連続して発生している波形をEADとみなし、そのＣａ2+波形が１つ以上見られた場合を、「EADが発生した心筋シート」とみなした。
EAD発生率（％）＝（EADが発生した心筋シートの数/EADが発生しなかった心筋シートの数）×１００
［６－２］結果
０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．３μＭテルフェナジンを添加した場合、予想された薬剤応答が明瞭な波形の変化として検出された（サンプル６Ａ）。また、０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．５μＭテルフェナジンを添加した場合、予想された薬剤応答が極めて明瞭な波形の変化として検出された（サンプル６Ｂ）。サンプル６Ｂの結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。図１５Ａは、薬剤添加前の波形を示し、図１５Ｂは、薬剤添加後の波形を示す。
０．５質量％のヘモグロビンを含み、１．６７ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．７μＭ、０．９μＭ、１．５μＭのテルフェナジンをそれぞれ添加した場合、予想されたＣａ2+波形の持続時間の延長応答が検出されたが、EADは検出されなかった（サンプル５Ｌ、６Ｃ、６Ｄ）。そこで、２．０質量％のヘモグロビンを含み、１．０ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．７μＭ、０．９μＭ、１．５μＭのテルフェナジンをそれぞれ添加した場合、明瞭なEADが検出された（サンプル６Ｅ、サンプル６Ｆ、サンプル６Ｇ）。サンプル６Ｆの結果を図１５Ｃ、サンプル６Ｇの結果を図１５Ｄに示す。また、２．０質量％のヘモグロビンを含み、１．０ｍｍの液面距離を有する培養液中に心筋細胞シートを置き、０．９μＭ、１．５μＭのテルフェナジンをそれぞれ添加した場合に、波形の振幅とピーク間隔が変化する、トルサード・ド・ポワント（TdP）様の波形がいくつか検出された（サンプル６Ｈ、サンプル６Ｉ）。サンプル６Ｈの結果を図１５Ｅ、サンプル６Ｉの結果を図１５Ｆに示す。
サンプル６Ａおよび６Ｂの「Ｃａ2+持続時間の変化率」を図１６に示す。サンプル６Ａおよび６Ｂの「Ｃａ2+持続時間の変化率」は、それぞれ、約１３５％および約１７０％であった。図１６は、ヘモグロビンを培養液に添加し、かつ液面距離を短くすると、「Ｃａ2+持続時間の変化率」を増大させることができることを示す。
サンプル６Ｃ～６Ｇを含むサンプルの「EAD発生率」を図１７に示す。図１７は、横軸に薬剤応答性試験の条件（すなわち、液面距離およびヘモグロビン濃度）を示し、縦軸にEAD発生率を示す。図１７は、ヘモグロビンを培養液中に、より高い濃度で添加し、かつ液面距離を、より短くすると、「EAD発生率」を増大させることができることを示す。また、サンプル６Ｅ～６Ｉの結果は、iPS細胞由来の心筋細胞では従来検出が難しかったテルフェナジンによるEADやTdPが検出できるようになることを示す。
以上の実施例の結果から、本発明の方法は、種々の薬剤の添加によって起こる種々の薬剤応答を、心筋細胞の拍動を停止させることなく検出できることに加えて、薬剤添加によって起こる波形の変化（頻脈応答、ＱＴ延長応答、EAD応答、TdP応答など）を、より明瞭な波形の変化として検出することができることが示された。ここで述べた「種々の薬剤応答」としては、薬剤応答性QT延長応答、徐脈応答（陰性変事作用）、頻脈応答（陽性変事作用）、強心応答（陽性変力作用）、弱心応答（陰性変力作用）、早期後脱分極（EAD）応答、遅延後脱分極（DAD）応答、トルサード・ド・ポワント（TdP）応答、トリガードアクティビティ不整脈応答、リエントリー不整脈応答などが挙げられ、本発明により、これらの薬剤応答が検出されることが予想される。またここで言う「心筋細胞」とは、動物心臓から取り出した初代培養細胞、多能性幹細胞由来の心筋細胞（CDI社のiCell、タカラバイオ社のMiraCell、Axogenesis社のCor.4Uなど）などに相当し、本発明によりこれらの心筋細胞で上記の薬剤応答が検出されることが予想される。
実施例７
実施例７では、心筋細胞含有培養液の酸素分圧と薬剤応答との関係を調べた。
［７－１］酸素分圧の測定
表６に記載されるとおり液面距離および細胞密度を変化させることにより、酸素分圧が異なる心筋細胞含有培養液（サンプル７Ａ～７Ｆ）を調製した。具体的には、細胞外フラックスアナライザー XFe96（Agilent Technologies）付属の専用９６ウェルプレートに、心筋細胞を表６に記載の細胞密度で播種し、その後、培養液中で培養して心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを、表６に記載の液面距離を有する培養液中に置いて、心筋細胞含有培養液（サンプル７Ａ～７Ｆ）を調製した。同一サンプルを重複して３ウェル調製した。調製された心筋細胞含有培養液において、心筋細胞シートは、プレート底面に接着した状態で存在している。
Figure 0007341478000006
それぞれの心筋細胞含有培養液を約０．５時間静置した後に、それぞれの心筋細胞含有培養液の酸素分圧を、細胞外フラックスアナライザーXFe96（Agilent Technologies）を用いて測定し、平均値（酸素分圧Ｐ１）を求めた。酸素分圧Ｐ１の値を表６に示す。その後、それぞれの心筋細胞含有培養液を、更に０．１時間静置した後に、細胞外フラックスアナライザーXFe96（Agilent Technologies）を用いて培養液の酸素分圧を測定し、平均値（酸素分圧Ｐ２）を求めた。
サンプル７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｅにおいて、心筋細胞含有培養液は、１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有していた。また、サンプル７Ａ～７Ｆのすべてにおいて、酸素分圧Ｐ２の値は、酸素分圧Ｐ１の値とほとんど同じであった。したがって、サンプル７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｅにおいては、心筋細胞含有培養液が、１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持されていることが確認された。また、酸素分圧は、薬剤応答性試験で使用される薬剤の添加によって実質的に変動しないことが確認された。
上記結果から、酸素分圧の値が安定して落ち着いている代表的な時点（すなわち、心筋細胞含有培養液の調製から約０．５時間後）において酸素分圧が１２５ｍｍＨｇ以上の所定の値を示すことが確認できた場合、心筋細胞が培養液中の酸素を消費したとしても大気中から培養液に酸素が補充される環境が整っているため、その他の時点においても培養液の酸素分圧が所定の値とほぼ同じ値に維持されていることが分かる。
［７－２］薬剤応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、サンプル７Ａ～７Ｆについて薬剤応答性試験を行った。まず、心筋細胞を表６に記載の細胞密度で９６ウェルプレートに播種し、その後、培養液中で培養して心筋細胞シートを作製した。得られた心筋細胞シートを、表６に記載される液面距離を有する培養液中に置き、実施例１と同様の手法に従って薬剤応答性試験を行った。薬剤として、テルフェナジンを使用し、培養液に、１０００ｎＭの濃度となるように添加した。
［７－３］結果
酸素分圧Ｐ１の測定結果および薬剤応答性試験の結果を図１８に示す。
サンプル７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｅは、テルフェナジン添加によって起こる薬剤応答（すなわち、Ｃａ2+波形の持続時間の延長応答やEAD不整脈）を明瞭な波形の変化として検出することができた。上述のとおり、これらのサンプルの心筋細胞含有培養液は、テルフェナジンを含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持されていた。これらのサンプルでは、高い酸素分圧を有する心筋細胞含有培養液を用いて薬剤応答性試験を行ったため、心筋細胞が、薬剤応答性試験の間に、培養液中の酸素を代謝や拍動のために消費したとしても、培養液に酸素が速やかに供給され、心筋細胞が、薬剤に対する応答効果を適切に発現できたと考えられる。
一方、サンプル７Ｄおよび７Ｆは、テルフェナジン添加によって起こる薬剤応答（すなわち、Ｃａ2+波形の持続時間の延長応答やEAD不整脈）を検出することができなかった。サンプル７Ｄおよび７Ｆの心筋細胞含有培養液は、テルフェナジンを含まない状態で、それぞれ１２２ｍｍＨｇおよび９８ｍｍＨｇの酸素分圧を有していた。これらのサンプルでは、低い酸素分圧を有する心筋細胞含有培養液を用いて薬剤応答性試験を行ったため、心筋細胞が、薬剤応答性試験の間に、培養液中の酸素を代謝や拍動のために消費すると、培養液に酸素が速やかに供給されず、心筋細胞が、薬剤添加に対する応答効果を適切に発現できなかったと考えられる。
したがって、これらの結果から、心筋細胞の薬剤応答性試験を、心筋細胞含有培養液が、薬剤を含まない状態で１２５ｍｍＨｇ以上の酸素分圧を有するように維持される条件下で行えば、薬剤応答性試験を安定に実施できることが分かる。
実施例８
実施例８では、培養液ｐＨの変化に対する心筋細胞の応答性試験を実施し、この試験に液面距離が及ぼす影響を調べた。
［８－１］培養液ｐＨに対する応答性試験
実施例１と同様の手法に従って、以下のサンプルについて、培養液ｐＨに対する心筋細胞の応答性試験を行った。心筋細胞を９６ウェルプレートに細胞密度１．６×１０５細胞／ｃｍ２で播種し、培養して、拍動する心筋細胞シートを作製した。
得られた心筋細胞シートを用いて、以下の培養環境で試験を行った：
サンプル８Ａ：培養液ｐＨ７．２、液面距離１．０ｍｍ
サンプル８Ｂ：培養液ｐＨ７．２、液面距離６．６７ｍｍ
サンプル８Ｃ：培養液ｐＨ７．６、液面距離１．０ｍｍ
サンプル８Ｄ：培養液ｐＨ７．６、液面距離６．６７ｍｍ
サンプル８Ｅ：培養液ｐＨ８．０、液面距離１．０ｍｍ
サンプル８Ｆ：培養液ｐＨ８．０、液面距離６．６７ｍｍ
培養液ｐＨは、ＮａＯＨ溶液を添加することで調整した。
［８－２］結果
結果を図１９に示す。図１９において縦軸は、BPM（拍動数／分）を示す。液面距離が１．０ｍｍの場合、ｐＨが高くなるにつれて、BPMが上昇する傾向が見られた。すなわち、一般的な心筋細胞の性質として知られているように、高ｐＨによる頻脈応答が見られた。一方で、液面距離が６．６７ｍｍの場合、高ｐＨによる明確なBPMの上昇が見られず、ｐＨ８．０では拍動停止が見られた。
これらの結果から、薬剤に対する心筋細胞の応答（実施例３）と同様、培養液ｐＨの変化に対する心筋細胞の応答も、液面距離を短くすることで検出しやすくなることが分かった。液面距離を短くすることにより、培養容器底面に接している心筋細胞と大気との距離が近くなり、心筋細胞への酸素供給速度が高まり、その結果、心筋細胞は、培養液ｐＨの変化等の培養環境変化に対する応答効果を適切に発現できたと考えられる。

Claims (8)

  1. 心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
    前記心筋細胞を、７５０～５００００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍの酸素透過係数を有する素材を底面に備えた酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
    前記心筋細胞を、７５０～５００００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍの酸素透過係数を有する素材を底面に備えた酸素透過性を有する容器に収容される培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
    を含む方法。
  2. 心筋細胞の薬剤応答性試験方法であって、
    前記心筋細胞を、７５０～５００００ｍｌ・ｍｍ／ｍ ２ ・ｄａｙ・ａｔｍの酸素透過係数を有するガス透過性膜を底面に備えた酸素透過性を有する容器に収容される培養液中で、添加された薬剤に対する応答性について試験すること、または
    前記心筋細胞を、７５０～５００００ｍｌ・ｍｍ／ｍ ２ ・ｄａｙ・ａｔｍの酸素透過係数を有するガス透過性膜を底面に備えた酸素透過性を有する容器に収容される培養液中に置いた直後に、添加された薬剤に対する応答性について試験すること
    を含む方法。
  3. 前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が、前記心筋細胞の細胞密度が２．５×１０５細胞／ｃｍ２以上である場合は１．５ｍｍ以下で、前記心筋細胞の細胞密度が１．２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、２．５×１０５細胞／ｃｍ２未満である場合は３．５ｍｍ以下で、前記心筋細胞の細胞密度が０．６２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、１．２５×１０５細胞／ｃｍ２未満である場合は５．０ｍｍ以下で、添加された薬剤に対する応答性について試験する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が、前記心筋細胞の細胞密度が２．５×１０５細胞／ｃｍ２以上である場合は１．５ｍｍ以下で、前記心筋細胞の細胞密度が１．２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、２．５×１０５細胞／ｃｍ２未満である場合は３．５ｍｍ以下で、前記心筋細胞の細胞密度が０．６２５×１０５細胞／ｃｍ２以上、１．２５×１０５細胞／ｃｍ２未満である場合は５．０ｍｍ以下で、添加された薬剤に対する応答性について試験する、請求項２に記載の方法。
  5. 前記培養液が酸素運搬タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記培養液が酸素運搬タンパク質を含む、請求項２に記載の方法。
  7. 前記酸素運搬タンパク質がヘモグロビンである、請求項５に記載の方法。
  8. 前記酸素運搬タンパク質がヘモグロビンである、請求項６に記載の方法。
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