JP7341435B2 - メタボロームの分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、メタボロームの分離方法に関する。

メタボロミクスとは、病気の診断等に応用されている研究領域であり、細胞の代謝産物総体であるメタボロームを網羅的に分析し生命現象を理解することを目的とする研究領域である。メタボロームの分析手法としては、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、キャピラリー電気泳動／質量分析法（ＣＥ／ＭＳ）等が用いられている（非特許文献１参照）。

ＧＣ／ＭＳは、芳香族化合物等の揮発性代謝物の測定に適している。しかし、不揮発性代謝物質を測定する場合には誘導体化が必要であり、定量性に問題が生じる場合がある。また、代謝物の多くが不揮発性であるため、ＧＣの最大メリットである揮発性物質の測定は有機酸等に限定される傾向がある。

ＬＣ／ＭＳは、幅広い化学物質の代謝物の測定が可能であり、メタボローム研究で頻繁に利用されている。しかし、溶媒選択が複雑であること、イオン性代謝物質分析において、ＭＳと適合性を有しないこと等に課題がある。

ＣＥ／ＭＳは、アミノ酸、核酸代謝等に含まれる代謝中間体のほとんどがイオン性を有するので有用な分析法である。しかし、ＧＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳと比較して、濃度感度が劣ること、扱いが難しくユーザーが使用し難いこと等の問題がある。

近年、ＬＣ法におけるイオン交換等の分離方法においてもメタボローム成分の測定が検討されており、例えば、イオン交換でヌクレオチドを分離する例が報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、イオン性を有しない成分の分離が不充分であること、溶離液に有機溶剤を多く含んでしまうと、分離材の膨潤、収縮が発生して、カラムが破損し測定再現が確認できないこと等が問題点として懸念される。

特開２０１５－１２９７７５号公報

平山明由，和泉自泰，松田史生，石川貴正，杉浦悠毅，鈴木隆著、メタボロミクスにおける親水性代謝物解析、日本質量分析学会誌、Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ５，２０１７

本発明は、ＬＣを用いたメタボロームを含む試料からメタボロームを分離する方法を提供することを目的とする。

メタボローム解析が対象とする生体成分は高親水性成分が多く、ＬＣ法で一般的に用いられるＯＤＳカラム（オクタデシルシリカカラム）では、これら成分を保持することが困難となる傾向にある。このような傾向は、特に塩基性条件下において顕著である。本発明者らが鋭意検討したところ、ポリマー粒子において、特定の基を導入することによって、このような課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の［１］～［５］に記載のメタボロームの分離方法を提供する。

［１］メタボロームを含む試料を分離材が充填されたカラムに通液し、試料からメタボロームを分離する工程を備え、分離材が、ポリマー粒子と、ポリマー粒子に結合した、第四級アンモニウム基を含む有機基とを有する、メタボロームの分離方法。
［２］メタボロームが、アミノ酸、有機酸、核酸塩基、ヌクレオシド、及びヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］に記載の分離方法。
［３］ポリマー粒子が、（メタ）アクリレートに由来する構造単位を有するポリマーを含む、［１］又は［２］に記載の分離方法。
［４］分離材の平均粒子径が、２～５μｍである、［１］～［３］のいずれかに記載の分離方法。
［５］分離材の第四級アンモニウム基量が、１０～５００μｅｑ／ｇである、［１］～［４］のいずれかに記載の分離方法。

本発明によれば、ＬＣを用いたメタボロームを含む試料からメタボロームを分離する方法が提供される。

実施例のカラム評価におけるＨＰＬＣのグラジエント条件を示すグラフである。 実施例のカラム評価の結果を示すクロマトグラムのスコア表である。 （ａ）は、実施例１のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデニンのクロマトグラムであり、（ｂ）は、実施例２のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデニンのクロマトグラムである。 （ａ）は、実施例１のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデノシンのクロマトグラムであり、（ｂ）は、実施例２のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデノシンのクロマトグラムである。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸」又はこれに対応する「メタクリル酸」を意味し、「（メタ）アクリレート」等の他の類似の記載についても同様である。

＜メタボロームの分離方法＞
本実施形態に係るメタボロームの分離方法は、メタボロームを含む試料を分離材が充填されたカラムに通液し、試料からメタボロームを分離する工程を備える。

当該メタボロームの分離方法においては、まず、ポリマー粒子と、ポリマー粒子に結合した、第四級アンモニウム基を含む有機基とを有する分離材を準備する。このような分離材を用いることによって、塩基性条件下で使用した場合においても、メタボロームを含む試料からメタボロームを分離することが可能となる。

このような分離材は、例えば、ポリマー粒子を作製する工程（ポリマー粒子作製工程）と、作製したポリマー粒子に、第四級アンモニウム基を含む有機基を導入する工程（有機基導入工程）とを備える方法によって製造することができる。

（ポリマー粒子）
ポリマー粒子は、一般的に、シリカと比較し、耐塩基性に優れると考えられる。したがって、本実施形態に係る分離材は、ＯＤＳを基材とする分離材と比較して、耐塩基性に優れると考えられる。

ポリマー粒子は、特に制限はされないが、耐塩基性がさらに向上することから、例えば、メタクリル酸エステル又はアクリル酸エステル（（メタ）アクリル酸エステル）に由来する構造単位を有するポリマー（（メタ）アクリレート系ポリマー）を含んでいてよい。上記（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２－エチルヘキシル、アクリル酸ｎ－オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２－クロロエチル、アクリル酸フェニル、α－クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ－オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の直鎖状又は分岐状のアルキル基を有する単官能（メタ）アクリル酸エステル、グリセロールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３－ブタンジオールジアクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５－ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，７－ヘプタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，８－オクタンジオールジ（メタ）アクリレート、３－メチル－１，５－ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９－ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０－デカンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート等の多官能（メタ）アクリル酸エステルなどが挙げられる。これらの（メタ）アクリル酸エステルは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

ポリマー粒子は、メタボロームの回収率のさらなる向上の観点から、水酸基等の親水性基を有するポリマーを含むことが好ましく、ポリマー粒子は、親水性ポリマー粒子であることがより好ましい。すなわち、（メタ）アクリル酸エステルに由来する構造単位は、水酸基等の親水性基を有する（メタ）アクリル酸エステルに由来する構造単位を含むことが好ましい。

（ポリマー粒子作製工程）
ポリマー粒子は、特に制限されないが、シード重合法を用いて製造することが好ましい。

カラムの理論段数は、ポリマー粒子の粒子径が小さいほど大きくなると考えられる。一般的に、ポリマー粒子はシリカに比較して粒子径が小さい粒子を形成し難い傾向にあるが、シード重合法で形成されるポリマー粒子は、粒子径が小さい粒子を形成し易く、高い理論段数の分離材が得られ易い傾向にある。

シード重合法は、公知の方法に従って行うことができる。以下にシード重合法の一般的な方法を一例として説明するが、シード重合法はこの方法に限定されるものではない。

シード重合法は、例えば、シード粒子を作製し、当該シード粒子を、重合性モノマーを含む乳化液中で膨潤させた後（シード粒子に重合性モノマーを吸収させた後）、重合性モノマーを重合させる方法であってよい。すなわち、ポリマー粒子は、例えば、シード粒子に重合性モノマーを吸収させた後、上記重合性モノマーを重合して得られる粒子であってよい。ポリマー粒子は、例えば、シード粒子と、シード粒子の表面上に形成された、重合性モノマーに由来する構造単位を有するポリマーとを有するポリマー粒子であってよい。

シード粒子は、例えば、乳化重合法、ソープフリー乳化重合法、分散重合法等の公知の方法で作製することができる。

シード粒子は、例えば、（メタ）アクリル酸エステルを含むモノマーを重合して得られる粒子であってよい。すなわち、シード粒子は、（メタ）アクリル酸エステルに由来する構造単位を有するポリマー含むものであってよい。シード粒子は、（メタ）アクリル酸エステルに由来する構造単位を有するポリマーからなるものであってもよい。

シード粒子の作製に用いられる（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、上述のポリマー粒子の（メタ）アクリル酸エステルで例示した単官能（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。これらの（メタ）アクリル酸エステルは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

シード粒子の平均粒子径は、得られるポリマー粒子の設計粒子径に応じて調整することができる。シード粒子の平均粒子径は、重合性モノマーの吸収時間を短縮できることから、例えば、２．０μｍ以下又は１．５μｍ以下であってよい。シード粒子の平均粒子径は、均一かつ真球に近いシード粒子が得られ易いことから、例えば、０．１μｍ以上又は０．５μｍ以上であってよい。これらの観点から、シード粒子の平均粒子径は、０．１～２．０μｍ、０．５～２．０μｍ、又は０．５～１．５μｍであってもよい。

シード粒子の粒子径（直径）の変動係数（ＣＶ）は、得られるポリマー粒子の均一性が低下し難いことから、１０％以下又は７％以下であってよい。

シード粒子、ポリマー粒子、及び分離材の平均粒子径及び粒子径のＣＶ（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
（１）粒子を、超音波分散装置を使用して水に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。
（２）粒度分布計（ＭＴ－３３００ＥＸ ＩＩ、マイクロトラック・ベル株式会社製）を用いて、上記分散液を測定し平均粒子径及び粒子径のＣＶを算出する。

シード粒子と重合性モノマーから形成されるポリマーとの相互作用が充分になることから、シード粒子の粒子径に対する最終的に得られるポリマー粒子の粒子径の比は、３～１０倍、３～７倍、又は４～６倍となるように調整することが好ましい。

以下、重合性モノマーをシード粒子に吸収させ、次いで重合性モノマーを重合させる方法の一例を具体的に説明する。

まず、重合性モノマーと水性媒体とを含む乳化液を作製し、当該乳化液にシード粒子を添加する。

乳化液は、公知の方法に従って作製できる。例えば、重合性モノマーを水性媒体に添加して、ホモジナイザー、超音波処理機、ナノマイザー等の微細乳化機によって水性媒体に分散させることで、乳化液を得ることができる。乳化液は、必要に応じて重合開始剤を含んでいてよい。重合開始剤の添加は、使用される重合性モノマーの種類によって適宜設定することができる。得られた乳化液中の重合性モノマー液滴の粒子径は、シード粒子の粒子径よりも小さいと、重合性モノマーがシード粒子に効率よく吸収され易くなる傾向にある。

シード粒子を乳化液に添加する方法は、特に制限されず、乳化液に直接シード粒子を添加する方法であってもよく、シード粒子を水性分散体に分散させて分散液とし、当該分散液を乳化液に添加する方法であってもよい。

シード粒子を乳化液へ添加した後、シード粒子を膨潤させて重合性モノマーを吸収させる。重合性モノマーの吸収は、通常、シード粒子を添加した後の乳化液を、室温（２５℃）で０．５～２４時間撹拌することによって行うことができる。また、乳化液を３０～５０℃程度に加温することによって重合性モノマーの吸収を促進することができる。

シード粒子は、重合性モノマーの吸収によって膨潤する。シード粒子に対する重合性モノマーの混合比率が小さ過ぎると、形成されるポリマー粒子の粒子径の増加率が小さくなるため、ポリマー粒子の生産性が低下する傾向にある。一方、重合性モノマーの混合比率が大きくなり過ぎると、シード粒子に吸収されないで、水性媒体中で重合性モノマー自体が懸濁重合してしまい、目的とする粒子径以外の粒子が生成する場合がある。なお、重合性モノマーの吸収は、例えば、光学顕微鏡を用いてシード粒子を観察して粒子径の拡大から確認することができ、重合性モノマーの吸収を終了するか継続するかを判断することができる。

重合性モノマーとしては、重合性官能基を有するモノマーであれば特に制限されないが、例えば、上述のポリマー粒子の（メタ）アクリル酸エステルで例示した単官能（メタ）アクリル酸エステル、多官能（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。重合性モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

単官能（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２－エチルヘキシル、アクリル酸ｎ－オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２－クロロエチル、アクリル酸フェニル、α－クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ－オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等が挙げられる。

多官能（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、アルカンジオールジ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリロイル基を２つ有するジ（メタ）アクリレート化合物が挙げられる。

ジ（メタ）アクリレート化合物は、例えば、下記式（１）で表される化合物であってよい。

式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｌ^１はアルキレン基を示す。当該アルキレン基の炭素数は、例えば、１～５であってもよい。アルキレン基は、例えば、置換基で置換されていてもよい。置換基としては、例えば、水酸基が挙げられる。また、アルキレン基は、直鎖状、分岐状、又は環状であってもよい。

式（１）で表されるジ（メタ）アクリレート化合物としては、例えば、グリセロールジ（メタ）アクリレート、１，３－ブタンジオールジアクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５－ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，７－ヘプタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，８－オクタンジオールジ（メタ）アクリレート、３－メチル－１，５－ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９－ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０－デカンジオールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

ジ（メタ）アクリレート化合物は、例えば、エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１－トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレートであってもよい。

ジ（メタ）アクリレート化合物以外の多官能（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、３官能以上の（メタ）アクリレートが挙げられる。３官能以上の（メタ）アクリレートとしては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１－トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１－トリスヒドロキシメチルプロパントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。３官能以上の（メタ）アクリレートの市販品としては、例えば、新中村化学工業株式会社製のＮＫエステル（Ａ－ＴＭＰＴ－６Ｐ０、Ａ－ＴＭＰＴ－３Ｅ０、Ａ－ＴＭＭ－３ＬＭＮ、Ａ－ＧＬＹシリーズ、Ａ－９３００、ＡＤ－ＴＭＰ、ＡＤ－ＴＭＰ－４ＣＬ、ＡＴＭ－４Ｅ、Ａ－ＤＰＨ）等が挙げられる。

重合性モノマーは、単官能（メタ）アクリル酸エステル及び多官能（メタ）アクリル酸エステルであってよいが、これらに加えて、他の単官能モノマー又は多官能モノマーを含んでいてもよい。

単官能モノマーとしては、例えば、スチレン、ｏ－メチルスチレン、ｍ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、α－メチルスチレン、ｏ－エチルスチレン、ｍ－エチルスチレン、ｐ－エチルスチレン、２，４－ジメチルスチレン、ｐ－ｎ－ブチルスチレン、ｐ－ｔ－ブチルスチレン、ｐ－ｎ－ヘキシルスチレン、ｐ－ｎ－オクチルスチレン、ｐ－ｎ－ノニルスチレン、ｐ－ｎ－デシルスチレン、ｐ－ｎ－ドデシルスチレン、ｐ－メトキシスチレン、ｐ－フェニルスチレン、ｐ－クロロスチレン、３，４－ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ－ビニルピロール、Ｎ－ビニルカルバゾール、Ｎ－ビニルインドール、Ｎ－ビニルピロリドン等のＮ－ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらの単官能モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。ただし、単官能モノマーが、スチレン等の疎水性の高い単官能モノマーである場合、当該単官能モノマーの含有量は、親水性ポリマー粒子が得られ易く、分析対象成分との疎水吸着が生じ難いことから、重合性モノマーの全質量を基準として、２０質量％以下であることが好ましい。

多官能モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン等のジビニル化合物；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体などが挙げられる。これらの多官能性モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

重合性モノマーは、（メタ）アクリル酸エステルを含むことが好ましく、グリセロールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３－ブタンジオールジアクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，５－ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，７－ヘプタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，８－オクタンジオールジ（メタ）アクリレート、３－メチル－１，５－ペンタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９－ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０－デカンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、及びペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレートからなる群より選ばれる少なくとも一種を含むことがより好ましい。

水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてよい。界面活性剤は、アニオン系、カチオン系、ノニオン系、及び両性イオン系の界面活性剤のいずれかを用いることができる。

アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩等が挙げられる。

カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩などが挙げられる。

ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤などが挙げられる。

両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤などが挙げられる。

界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、重合性モノマーの重合時の分散安定性の観点から、界面活性剤は、アニオン系界面活性剤が好ましい。

必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５－トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ－ブチルパーオキシ－２－エチルヘキサノエート、ジ－ｔ－ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、１，１’－アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物などが挙げられる。重合開始剤の含有量は、重合性モノマー総量１００質量部に対して、０．１～７．０質量部であってよい。

次に、シード粒子に吸収させた重合性モノマーを重合させることによって、単分散性のポリマー粒子を得ることができる。

重合温度は、重合性モノマー及び重合開始剤の種類に応じて、適宜設定することができる。重合温度は、２５～１１０℃又は５０～１００℃であってよい。重合反応は、シード粒子が充分に膨潤し、重合性モノマー及び任意の重合開始剤が充分に吸収された後に、昇温させて行うことが好ましい。

ポリマー粒子は、必要に応じて重合液から遠心分離又はろ過によって水性媒体を除去し、水及び溶剤で洗浄した後、乾燥することで単離することができる。

上記重合工程において、シード粒子の分散安定性を向上させる観点から、乳化液に高分子分散安定剤を添加してもよい。

高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。高分子分散安定剤は、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物を併用してもよい。これらの中でも、高分子分散安定剤は、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンを含むことが好ましい。高分子分散安定剤の含有量は、重合性モノマー総量１００質量部に対して１～１０質量部であってよい。

水中で重合性モノマー自体が単独で乳化重合することを抑制するために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。

ポリマー粒子は、耐塩基性がさらに向上することから、メタクリル酸メチルに由来する構造単位を有するシード粒子と、シード粒子の表面上に形成された、グリセロールジ（メタ）アクリレートに由来する構造単位を有するポリマーとを有するポリマー粒子であってよい。

ポリマー粒子の平均粒子径は、高い理論段数が得られ易いことから、例えば、６μｍ以下、５μｍ以下、又は４μｍ以下であってよい。

ポリマー粒子の粒子径（直径）の変動係数は、高い理論段数が得られ易いことから、例えば、２５％以下、２０％以下、１５％以下、又は１０％以下であってよい。

ポリマー粒子は、例えば、多孔構造を有する粒子（多孔質ポリマー粒子）であってもよい。

（有機基導入工程）
次いで、作製したポリマー粒子に、第四級アンモニウム基を含む有機基を導入する。ポリマー粒子がシード重合法を用いて製造された場合、第四級アンモニウム基を含む有機基は、重合性モノマーに由来する構造単位を有するポリマーに導入され得る。第四級アンモニウム基を含む有機基は、スルホン酸基、リン酸基等のイオン性基をさらに含んでいてもよい。第四級アンモニウム基を含む有機基は、第四級アンモニウム基を含むアルキル基又は第四級アンモニウム基を含むアルコキシ基であってよく、これらのアルキル基又はアルコキシ基はリン酸基、スルホン酸基等のイオン性基をさらに有していてもよい。

第四級アンモニウム基を含む有機基をポリマー粒子に導入する方法としては、特に制限されないが、例えば、ポリマー粒子とエポキシ基を有する化合物とを反応させてエポキシ基を導入し、エポキシ基を有するポリマー粒子と第三級アミンとを反応させる方法、ポリマー粒子にオキソジオキソホスホリル基を有する化合物とを反応させてオキソジオキソホスホリル基を導入し、オキソジオキソホスホリル基を有するポリマー粒子と第三級アミンとを反応させる方法、２－クロロエチル（メタ）アクリレート等のハロゲン化アルキル基を有する（メタ）アクリレートを共重合させて得られるハロゲン化アルキル基を有するポリマー粒子に第三級アミンを反応させる方法、２－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート等の第三級アミノ基を有する（メタ）アクリレートを共重合させて得られる第三級アミノ基を有するポリマー粒子にヨウ化メチル等のハロゲン化アルキルを反応させる方法等が挙げられる。ここで、有機基は、ポリマー粒子と反応させるエポキシ基を有する化合物、オキソジオキソホスホリル基を有する化合物、ハロゲン化アルキル基を有する（メタ）アクリレート、第三級アミノ基を有する（メタ）アクリレート等に由来する基であり得る。

エポキシ基を導入する方法としては、例えば、水酸基等を有するポリマー粒子に、エピクロルヒドリン等のハロゲン基含有グリシジル化合物を反応させる方法などが挙げられる。

エポキシ基と反応させる第三級アミンとしては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、分岐状のポリエチレンイミン等が挙げられる。ポリエチレンイミンの市販品としては、例えば、ポリエチレンイミン（重量平均分子量６００）、ポリエチレンイミン（重量平均分子量１８００）（和光純薬工業株式会社製、商品名）等が挙げられる。第３級アミンは、スルホン酸基、リン酸基等のイオン性基をさらに有していてもよい。例えば、エポキシ基を有するポリマー粒子とスルホン酸基を有する第三級アミンとを反応させることによって、第四級アンモニウム基及びスルホン酸基を含む有機基を有する分離材を得ることができる。

第三級アミンと反応させた後に、例えば、未反応のエポキシ基を開環するために、硫酸洗浄等の処理を施してもよい。

オキソジオキソホスホリル基を導入する方法としては、例えば、水酸基等を有するポリマー粒子に、２－クロロ－オキソ－１，３，２－ジオキサホスホラン等のハロゲン基含有ジオキサホスホラン化合物を反応させる方法などが挙げられる。

オキソジオキソホスホリル基と反応させる第三級アミンとしては、例えば、エポキシ基と反応させる第三級アミンで例示したものと同様のものが挙げられる。オキソジオキソホスホリル基を有するポリマー粒子と第三級アミンとを反応させることによって、第四級アンモニウム基及びリン酸基を含む有機基を有する分離材を得ることができる。

このようにして得られる分離材は、ポリマー粒子と、ポリマー粒子に結合した、第四級アンモニウム基を含む有機基とを有する。有機基は、第四級アンモニウム基以外に、スルホン酸基、リン酸基等のイオン性基をさらに含んでいてもよいが、メタボロームに対して高い分離性を有し、クロマトグラムにおいてよりシャープなピークが得られる観点から、第四級アンモニウム基以外のイオン性基を含まないことが好ましい。

分離材の平均粒子径は、高い理論段数が得られ易いことから、例えば、２～５μｍ以下であってよい。分離材の平均粒子径は、２．５μｍ以上、３μｍ以上、又は３．２μｍ以上であってもよく、４．５μｍ以下、４μｍ以下、又は３．８μｍ以下であってもよい。

分離材の粒子径（直径）の変動係数は、高い理論段数が得られ易いことから、例えば、２５％以下、２０％以下、１５％以下、又は１０％以下であってよい。

分離材の第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）は、イオン性化合物に対するより高い分離性を示すことから、１０～５００μｅｑ／ｇであってよい。分離材の第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）は、１０μｅｑ／ｇ以上、３０μｅｑ／ｇ以上、又は６０μｅｑ／ｇ以上であってもよく、５００μｅｑ／ｇ以下、３００μｅｑ／ｇ以下、又は１００μｅｑ／ｇ以下であってもよい。

次いで、カラムを作製する。カラムは、上述の分離材を充填することによって製造できる。カラムに分離材を充填する方法は特に制限されず、公知の方法を適宜採用することができる。

次いで、メタボロームを含む試料を分離材が充填されたカラムに通液することによって、試料からメタボロームを分離する。

メタボロームは、アミノ酸、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び有機酸からなる群より選ばれる少なくとも１種であってよい。

アミノ酸としては、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、及び酸性型グルタチオン（ＧＳＳＧ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。アミノ酸は、より好ましくはアラニン（Ａｌａ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、及びアルギニン（Ａｒｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。

核酸塩基としては、例えば、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）、及びシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。

ヌクレオシドとしては、例えば、アデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）、及びシチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。

ヌクレオチドとしては、例えば、アデノシン－１－リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン－１－リン酸（ＧＭＰ）、チミジン－１－リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン－１－リン酸（ＵＭＰ）、及びシチジン－１－リン酸（ＣＭＰ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。

有機酸としては、例えば、クエン酸（Ｃｉｔ）、イソクエン酸（ＩｓｏＣｉｔ）、フマル酸（Ｆｕｍ）、マレイン酸（Ｍａｌ）、及びコハク酸（Ｓｕｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。

メタボロームの分離条件は、メタボロームの種類に合わせて適宜設定することができ、酸性条件、中性条件、及び塩基性条件のいずれであってもよいが、塩基性条件であってもよい。メタボロームを含む試料の通液速度も、メタボロームの種類に合わせて適宜設定することができる。

以下、本発明について実施例を挙げてより具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［分離材の作製］
（実施例１：第四級アンモニウム基を含む有機基を有する分離材）
＜シード粒子の作製＞
５００ｍＬのセパラブルフラスコに、メタクリル酸メチル７０ｇ、オクタンチオール２．１ｇ、及びイオン交換水３７０ｇを加え、窒素でバブリングするとともに、撹拌羽根で撹拌しながら３０℃で１時間保温した。その後、ペルオキソ二硫酸カリウム０．８７５ｇ及びイオン交換水３０ｇを加え、７０℃で６時間反応させ、シード粒子を含む反応液を得た。得られた反応液を冷却した後、反応液中の塊状物及び微粒子を除去して、シード粒子のスラリー（固形分濃度：３．５質量％）を得た。ここで、塊状物は、目開き１５０μｍの篩を用いて取り除いた。また、微粒子は、塊状物を取り除いた後の反応液（篩を通過したスラリー）を遠心脱水機で処理し、デカンテーションで上澄み液を廃棄することによって取り除いた。得られたスラリー中のシード粒子の平均粒子径及び粒子径のＣＶ（変動係数）を、粒度分布測定機（マイクロトラック・ベル株式会社製（ＭＴ－３３００ＥＸ ＩＩ）で粒度分布を測定することによって算出した。シード粒子の平均粒子径は７５０ｎｍであり、ＣＶは６．４％であった。

＜ポリマー粒子の作製＞
３Ｌのセパラブルフラスコに、グリセロールジ（メタ）アクリレート８０．６ｇ、酢酸ブチル７２．５ｇ、及びイソアミルアルコール４８．４ｇを加え、さらに、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル０．４ｇを加えて、溶解させた。次いで、セパラブルフラスコに、ラウリル硫酸トリエタノールアミンを４０質量％含む水溶液１１．６ｇ及びイオン交換水１５２９．７ｇをさらに加え、超音波ホーンで１０分間超音波分散させて乳化液を得た。得られた乳化液に、撹拌羽根で撹拌しながら、上記で作製したシード粒子のスラリー１４．０ｇ及びイオン交換水１２２ｇを加え、３０℃（フラスコ内の温度）で１時間保温して、シード粒子にグリセロールジ（メタ）アクリレートを吸収させた。次いで、ポリビニルアルコール水溶液（ポリビニルアルコール濃度：６質量％）１２１ｇを加え、窒素でバブリングしながら７８℃（フラスコ内の温度）で５時間重合させ、冷却した。重合によって生成した粒子を、イオン交換水、イオン交換水／メタノール混合液、メタノールの順で洗浄した後、目開き５μｍの篩で湿式分級して凝集物を除去した。凝集物除去後のスラリーから、重合によって生成した粒子をろ別し乾燥することによって、ポリマー粒子を得た。得られたポリマー粒子の平均粒子径及び粒子径のＣＶ（変動係数）を、粒度分布測定機（マイクロトラック・ベル株式会社製（ＭＴ－３３００ＥＸ ＩＩ）で粒度分布を測定することによって算出した。ポリマー粒子の平均粒子径は３．５μｍであり、ＣＶは６．８％であった。

＜エポキシ基を有するポリマー粒子の作製＞
３００ｍＬの三口フラスコに、乾燥したポリマー粒子１５ｇ、イオン交換水１１２．５ｇ、クロロメチルオキシラン２２．５ｇ、及び水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム濃度：３０質量％）８．８ｇを１分間超音波分散させ、撹拌羽根で撹拌しながら３０℃で１時間反応させた。反応後のポリマー粒子をろ別し、イオン交換水、メタノールの順で洗浄し、エポキシ基を有するポリマー粒子を得た。

＜分離材の作製＞
２Ｌのセパラブルフラスコに、上記で作製したエポキシ基を有するポリマー粒子全量、イオン交換水３００ｇ、及び分岐状のポリエチレンイミン（重量平均分子量１８００、和光純薬工業株式会社製）７５０ｇを加え、撹拌羽根で撹拌しながら、３０℃（フラスコ内の温度）で３時間反応させた。反応後のポリマー粒子をろ別し、イオン交換水、メタノールの順で洗浄してから、反応後のポリマー粒子、イオン交換水３００ｇ、及び硫酸水溶液（硫酸濃度：４７質量％）１．２ｇを加え、撹拌羽根で撹拌しながら、４０℃（フラスコ内の温度）で３時間洗浄した。洗浄後のポリマー粒子をろ別し、イオン交換水、メタノールの順で洗浄し、ポリマー粒子を乾燥することによって、第四級アンモニウム基を含む有機基を有する分離材を得た。得られた分離材の平均粒子径を、粒度分布測定機（マイクロトラック・ベル株式会社製（ＭＴ－３３００ＥＸ ＩＩ）で粒度分布を測定することによって算出した。平均粒子径は３．５８μｍであった。

＜イオン交換容量の測定＞
得られた分離材のイオン交換容量を以下の方法によって測定した。１００ｍＬビーカーに、分離材１ｇを秤量し、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を加えて撹拌し、分離材をロートで吸引ろ過によってろ別した。ろ別した粒子をイオン交換水に分散させ、ロートで吸引ろ過によってろ別し、ろ液が中性になるまでイオン交換水で分離材を洗浄した。１００ｍＬビーカーに、洗浄した分離材を移し、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液を加えて撹拌し、分離材をロートで吸引ろ過によってろ別した。ろ別した粒子をイオン交換水に分散させ、ロートで吸引ろ過によってろ別し、ろ液が中性になるまでイオン交換水で分離材を洗浄した。このときに得られたろ液（洗浄に用いたイオン交換水を含む）を５００ｍＬビーカーに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液で滴定することによって、イオン交換容量を測定した。分離材のイオン交換容量は１．７ｍｅｑ／ｇであった。

＜第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）の測定＞
得られた分離材の第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）を以下の方法によって測定した。１００ｍＬビーカーに、分離材１ｇを秤量し、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を加えて撹拌し、分離材をロートで吸引ろ過によってろ別した。ろ別した粒子をイオン交換水に分散させ、ロートで吸引ろ過によってろ別し、ろ液が中性になるまでイオン交換水で分離材を洗浄した。１００ｍＬビーカーに、洗浄した分離材を移し、１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を加えて撹拌し、分離材をロートで吸引ろ過によってろ別した。ろ別した粒子をイオン交換水に分散させ、ロートで吸引ろ過によってろ別し、ろ液が中性になるまでイオン交換水で分離材を洗浄した。このときに得られたろ液（洗浄に用いたイオン交換水を含む）を５００ｍＬビーカーに移し、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液で滴定することによって、第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）を測定した。分離材の第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）は７０μｅｑ／ｇであった。

（実施例２：第四級アンモニウム基及びスルホン酸基を含む有機基を有する分離材）
＜２－ジメチルアミノエタンスルホン酸（ＤＭＡＥＳ）の合成＞
２５０ｍＬのフラスコに、２－臭化エチルスルホン酸のＮａ塩１０．９ｇを加え、これに水１００ｍＬを加えて溶解させた。さらにジメチルアミン１２．４ｇを加えて、室温で４５分間放置し、得られた混合液を加熱還流下、７０～８０℃で１８時間反応させた。反応後、反応液を４０℃まで冷却し、活性炭約２ｇを加えてから１５分間煮沸した。その後、反応液を室温まで冷却し、活性炭を沈降させ、反応液の上澄みを吸引ろ過によってろ過した。水／エタノールで２回再結晶を行い、真空オーブンで５０℃、２４時間乾燥させることによって、ＤＭＡＥＳを得た。

＜分離材の作製＞
５００ｍＬセパラブルフラスコに、実施例１の条件で作製したエポキシ基を有するポリマー粒子全量、ＤＭＡＥＳ１６ｇ、及び０．２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）２００ｍＬを加え、撹拌羽根で撹拌しながら、内温５０℃、９０時間反応させた。反応後のポリマー粒子をろ別し、イオン交換水、メタノールの順で洗浄してから、反応後のポリマー粒子、イオン交換水３００ｇ、及び硫酸水溶液（硫酸濃度：４７質量％）１．２ｇを加え、撹拌羽根で撹拌しながら、４０℃（フラスコ内の温度）で３時間洗浄した。洗浄後ポリマー粒子をろ過し、イオン交換水、メタノールの順で洗浄し、ポリマー粒子を乾燥することによって、第四級アンモニウム基及びスルホン酸基を含む有機基を有する分離材を得た。得られた分離材の平均粒子径を、粒度分布測定機（マイクロトラック・ベル株式会社製（ＭＴ－３３００ＥＸ ＩＩ）で粒度分布を測定することによって算出した。平均粒子径は３．６μｍであった。実施例１と同様の方法で、第四級アンモニウム基量を測定したところ、分離材の第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）は５０μｅｑ／ｇであった。また、硫黄元素含有量から求めたスルホン酸基量は５０μｅｑ／ｇであった。

（実施例３：第四級アンモニウム基及びリン酸基を含む有機基を有する分離材）
＜分離材の作製＞
５００ｍＬ三口フラスコに、実施例１の条件で作製したポリマー粒子１５ｇ及び乾燥テトラヒドロフラン２００ｍＬを加え、撹拌しながら窒素雰囲気下－５℃に冷却させた。これに撹拌しながら、２－クロロ－オキソ－１，３，２－ジオキサホスホラン１００ｇを１時間かけて窒素雰囲気下で滴下し、５℃で４８時間反応させ、テトラヒドロフランを５℃以下の条件で減圧下留去した。トリエチルアミン７０ｇとテトラヒドロフラン２００ｍＬとを混合してトリエチルアミンのテトラヒドロフラン溶液を調製し、留去後の残さに時間をかけないように加えて、４０℃で２４時間反応させた。反応後のポリマー粒子をろ別し、イオン交換水、メタノールの順で洗浄することによって、第四級アンモニウム基及びリン酸基を含む有機基を有する分離材を得た。得られた分離材の平均粒子径を、粒度分布測定機（マイクロトラック・ベル株式会社製（ＭＴ－３３００ＥＸ ＩＩ）で粒度分布を測定することによって算出した。平均粒子径は３．６μｍであった。実施例１と同様の方法で、第四級アンモニウム基量を測定したところ、分離材の第四級アンモニウム基量（中性塩分解容量）は４０μｅｑ／ｇであった。また、リン元素含有量から求めたリン酸基量は４０μｅｑ／ｇであった。

［カラム評価］
＜カラムの作製（分離材の充填）＞
実施例１～３の分離材を用いて、カラムを作製した。１００ｍＬビーカーに、分離材０．８ｇと超純水及びアセトニトリルの２５：７５（容量比）の混合液とを加え、超音波を当てながら分散混合することによって充填スラリーを調製した。その後、２．１ｍｍφ×１５０ｍｍのステンレスカラム（株式会社杉山商事製）を取り付けたステンレスパッカーに充填スラリーを流し込んで密閉し、プランジャー式充填ポンプ（ユニフローズ株式会社製、ｕｆ－２００２０ＳＺＷＰ２ポンプ）で加圧充填した。充填後、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を０．１ｍＬ／分、３時間通液しカラム内を塩基性に置換した。水酸化ナトリウム水溶液を通液した後、超純水及びアセトニトリルの２５：７５（容量比）の混合液を通液し、過剰の塩基性成分（水酸化ナトリウム水溶液）を洗い落とすことによって、カラムを作製した。

＜カラム評価＞
作製した実施例１～３のカラムを用いて、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に取り付けて、酸性条件、中性条件、及び塩基性条件下で、メタボロームを含む試料からメタボロームの分離によってカラム評価を行った。

（ＨＰＬＣ条件（酸性））
検出：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（株式会社島津製作所製、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣ／ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ超高速トリプル四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムＬＣＭＳ－８０６０）
移動相Ａ：５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液９５体積％－アセトニトリル５体積％（酢酸でｐＨ３．６に調整）
移動相Ｂ：５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液５体積％－アセトニトリル９５体積％
流量：０～１５分、０．２５ｍＬ／分、２５～３５分、０．４０ｍＬ／分
グラジエント条件：図１

（ＨＰＬＣ条件（中性））
温度：４０℃
検出：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（株式会社島津製作所製、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣ／ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ超高速トリプル四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムＬＣＭＳ－８０６０）
移動相Ａ：５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液９５体積％－アセトニトリル５体積％（酢酸でｐＨ６．８に調整）
移動相Ｂ：５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液５体積％－アセトニトリル９５体積％
流量：０～１５分、０．２５ｍＬ／分、２５～３５分、０．４０ｍＬ／分
グラジエント条件：図１

（ＨＰＬＣ条件（塩基性））
温度：４０℃
検出：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（株式会社島津製作所製、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣ／ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ超高速トリプル四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムＬＣＭＳ－８０６０）
移動相Ａ：５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液９５体積％－アセトニトリル５体積％（アンモニアでｐＨ９．８に調整）
移動相Ｂ：５ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液５体積％－アセトニトリル９５体積％
流量：０～１５分、０．２５ｍＬ／分、２５～３５分、０．４０ｍＬ／分
グラジエント条件：図１

（試料の調製）
下記メタボロームの１種と超純水とを混合して、１０μＭ（バリン、アデノシンは１μＭ）のメタボロームを含む試料を２８種類作製した。

１．アミノ酸
アラニン（Ａｌａ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）

２．核酸塩基
アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）

３．ヌクレオシド
アデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）

４．ヌクレオチド
アデノシン－１－リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン－１－リン酸（ＧＭＰ）、ウリジン－１－リン酸（ＵＭＰ）、シチジン－１－リン酸（ＣＭＰ）

５．有機酸
フマル酸（Ｆｕｍ）

なお、ヌクレオチド及び有機酸については、ＨＰＬＣ条件（塩基性）のみの検討を行った。

（評価基準）
以下の基準でメタボロームごとに得られたクロマトグラムをスコア化した。＋１点以上を結果が良好であると評価した。
（１）ボイドボリューム域（１．８８又は２．０６分）で保持される ＋１点
（２）５分以上保持される ＋１点
（３）ピーク幅が１分以下である ＋１点
（４）ピーク幅が３分以上５分未満である －１点
（５）ピーク幅が５分以上である －１点

図２は、実施例のカラム評価の結果を示すクロマトグラムのスコア表である。図２に示すとおり、実施例のカラムは、塩基性条件下で使用した場合においても、良好な結果を示した。

図３（ａ）は、実施例１のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデニンのクロマトグラムであり、図３（ｂ）は、実施例２のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデニンのクロマトグラムである。図４（ａ）は、実施例１のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデノシンのクロマトグラムであり、図４（ｂ）は、実施例２のカラムを用いたときの塩基性条件下のアデノシンのクロマトグラムである。図３及び図４に示すとおり、実施例１のカラムは、実施例２のカラムよりもシャープなピークを与えることが判明した。

これらの結果が示すように、本発明の分離方法が、ＬＣを用いてメタボロームを含む試料からメタボロームを分離することが可能であることが確認された。

Claims (4)

1. メタボロームを含む試料を分離材が充填されたカラムに通液し、前記試料からメタボロームを分離する工程を備え、
   前記分離材が、ポリマー粒子と、前記ポリマー粒子に結合した、第四級アンモニウム基及びイオン性基を含む有機基とを有し、
   前記イオン性基が、スルホン酸基又はリン酸基であり、
   前記分離材の平均粒子径が、２～５μｍである、メタボロームの分離方法。
2. 前記メタボロームが、アミノ酸、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び有機酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の分離方法。
3. 前記ポリマー粒子が、（メタ）アクリレートに由来する構造単位を有するポリマーを含む、請求項１又は２に記載の分離方法。
4. 前記分離材の第四級アンモニウム基量が、１０～５００μｅｑ／ｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の分離方法。

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