JP7340372B2 - 光活性化アデニル酸シクラーゼ - Google Patents
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Description
[1]光活性化アデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質であって、1~18のアミノ酸残基がC末端から欠失された配列番号1のアミノ酸配列、又はこれと90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、タンパク質。
[2]配列番号1のアミノ酸配列のC末端から欠失されたアミノ酸残基の数が5~7である、上記[1]に記載のタンパク質。
[3]上記[1]又は[2]に記載のタンパク質をコードする、核酸。
[4]上記[3]に記載の核酸を含む、ベクター。
[5]上記[4]に記載のベクターが導入された、形質転換体。
[6]上記[5]に記載の形質転換体を培養することを含む、上記[1]又は[2]に記載のタンパク質の製造方法。
[7]1~18のアミノ酸残基を光活性化アデニル酸シクラーゼのC末端から欠失させることを含み、上記光活性化アデニル酸シクラーゼはユレモ属に由来する、アデニル酸シクラーゼの光活性化効率を向上させる方法。
哺乳類に最適化されたコドンを有するOaPAC遺伝子(Oa-366遺伝子;配列番号8)を合成した。また、一般的な遺伝子組み換え技術を利用してOa-366の塩基配列から特定のヌクレオチドを欠失させ、変異型OaPAC遺伝子であるOa-363、Oa-360、Oa-357、Oa-354、Oa-351及びOa-348を得た。欠失させたヌクレオチドの位置を表2に示す。
GloSensor(商標)-22F cAMP遺伝子(プロメガ株式会社)を哺乳類発現ベクターpEBMulti-Neo(富士フイルム和光純薬株式会社)に組み込んだ。得られたpEBMulti-Neo-GloSensor-22F cAMPプラスミドを、FuGENE(登録商標) HD(プロメガ株式会社)を用いたリポフェクションによりヒト胎児腎臓細胞HEK293(株式会社ケー・エー・シー)に導入し、GloSensor-22F cAMPを安定的に発現する細胞株を樹立した。
OaPAC発現コンストラクトのそれぞれを、Ingenio(登録商標)Electroporation kit with 0.4cmcuvettes(マイラス・バイオ社)及びGene Pulserエレクトロポレーションシステム(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社、印加条件:260V,950μF)を用いた電気穿孔法によりGloSensor-22F cAMP発現HEK293に導入し、野生型又は変異型のOaPACタンパク質とGloSensor-22F cAMPタンパク質とを発現するHEK293を得た。なお、2A-ペプチドの働きによりOaPACタンパク質の発現の度合いはRFPタンパク質の発現の度合いと等しいため、OaPACタンパク質の発現の度合いは、RFPの蛍光強度により確認した。
OaPAC発現HEK293を、35mm培養皿(BioCoat(商標)コラーゲンI、コーニング社)に播種し、2mLの培地(DMEM high glucose with 10%FBS and 4mM L-glutamine、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社)で培養した。細胞に光を照射する数時間前に培地をCO2非依存性培地(サーモフィッシャー・サイエンティフィック社)に交換し、終濃度0.12mg/mLでGloSensor cAMP Reagent(プロメガ株式会社)を添加した。数時間後、EM-CCDカメラ(ImagEM C9100-23B、浜松ホトニクス株式会社)及び青色LED(LXML-PR01-0425、ルクシオン・レベル、フィリップス・ルミレッズ社)を取り付けた倒立蛍光顕微鏡(Eclipse TE-300、株式会社ニコン)を用いて、暗室にて以下の照射実験を行った。
Claims (5)
- 光活性化アデニル酸シクラーゼ活性を有するタンパク質であって、
(i)3~18のアミノ酸残基がC末端から欠失された配列番号1のアミノ酸配列、又は
(ii)前記(i)3~18のアミノ酸残基がC末端から欠失された配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1のアミノ酸配列の348番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基よりもC末端側のアミノ酸残基の数は、前記(i)3~18のアミノ酸残基がC末端から欠失された配列番号1のアミノ酸配列における348番目のアミノ酸残基よりもC末端側のアミノ酸残基の数と同じである、アミノ酸配列
からなる、タンパク質。 - 配列番号1のアミノ酸配列のC末端から欠失されたアミノ酸残基の数が5~7である、請求項1に記載のタンパク質。
- 請求項1又は2に記載のタンパク質をコードする、核酸。
- 請求項3に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項4に記載のベクターが導入された、形質転換体。
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