JP7317014B2 - Stingアゴニストとしての環状ジヌクレオチド - Google Patents
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Description
本出願は米国特許仮出願第62/599,111号(2017年12月15日出願)に対する優先権を主張するものであり、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、STING(Stimulator of Interferon Genes;インターフェロン遺伝子刺激因子)のアゴニストであり、STINGタンパク質の調節によって影響を受ける障害の治療に有用な、新規化合物に関する。本発明はまた、かかる化合物のうちの1つ以上を含む医薬組成物、かかる化合物及び組成物の調製プロセス、及び様々な疾患、症候群及び障害を治療するためのかかる化合物又は医薬組成物の使用に関する。本発明は、下流のシグナル伝達経路の活性化に関与していてもよく、更に第2のメッセンジャー及び増殖因子を活性化し、自然免疫及び適応免疫に関与するインターフェロンの産生に関与し得る。より具体的には、本発明は、限定されないが、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、線維肉腫及び抗ウイルス療法を含む種々の感染、疾患、症候群及び障害の治療のための、かかる化合物又は医薬組成物の使用に関する。
B1及びB2は、独立して、b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b11、b12、b13、b14、b15、b16、b17、b18、b19、b20、b21、b22、b23、b24、b25、b26、b27、b28、b29、b30、b31、b32、及びb33からなる群から選択され;
R1bは、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R1bがフルオロのとき、R1aは水素又はフルオロであり;
R1cは、独立して、水素又はメチルから選択され;
R2aは、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;1~7個のハロゲン置換基又はメトキシで任意選択で独立して置換されるC1~3アルコキシ;C3~6アルケニルオキシ;C2~6アルキニルオキシ;ヒドロキシ(C1~3)アルコキシ;又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、若しくはヒドロキシから選択される1~3個の置換基で任意選択で独立して置換されるC1~3アルキルから選択され;R3は、水素であり;
又は、R2aは-O-であり、R2cは-CH2-であり、これにより、R2aと、R2cと、これらが結合する原子とが、5員環を形成し;
R2bは、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R2bがフルオロのとき、R2aは水素又はフルオロであり;
R2cは、独立して、水素、フルオロ、CH3、又はCH2Fから選択され;
X1及びX2は、独立して、O、S、及びCH2からなる群から選択され;
Y及びY1は、各々独立して、存在しない、又はO若しくはNHからなる群から選択され;
Z及びZ1は、独立して、O及びNHからなる群から選択され;
M及びM1のうちの一方は、
R4は、独立して、ヒドロキシ、メチル、BH3、及び-SR5からなる群から選択され;R5は、独立して、水素、-CH2O(O)R6、-CH2OC(O)OR6、-CH2CH2SC(O)R6、及び-CH2CH2S-SCH2R6からなる群から選択され;
R6は、独立して、1~5個のフルオロ若しくはヒドロキシ置換基、C1~6アルキル、C6~10アリール、又はC3~12シクロアルキルで任意選択で独立して置換されるC6~10アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、C3~12シクロアルキル、及びC1~20アルキルからなる群から選択される)
若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態
(ただし、B1及びB2が各々b6であり、Z-M-YがOS(O2)NHであり、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oであるとき、R1aはOH以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B2がb6、X2がO、R2aがOCH3、R2bがH、R2cがH、Z-M-YがOS(O)2NH、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O、B1がb7、X1がO、R1aがOCH3、R1bがH、及びR1cがHである、化合物以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B2がb6、X2がO、R2aがF、R2bがH、R2cがH、Z-M-Yが(*R)OP(O)(SH)O、Y1-M1-Z1がNHS(O)2O、B1がb21、X1がO、R1aがOH、R1bがH、及びR1cがHである、化合物以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B2がb30、X2がO、R2aがH、R2bがH、R2cがH、Z-M-YがOS(O)2NH、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O、B1がb7、X1がO、R1aがOCH3、R1bがH、及びR1cがHである、化合物以外である)に関する。
R1aは、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;1~7個のハロゲン置換基又はメトキシで任意選択で独立して置換されるC1~3アルコキシ;C3~6アルケニルオキシ;C2~6アルキニルオキシ;ヒドロキシ(C1~3)アルコキシ;又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、若しくはヒドロキシから選択される1~3個の置換基で任意選択で独立して置換されるC1~3アルキルから選択され;
R1bは、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R1bがフルオロのとき、R1aは水素又はフルオロであり;
R1cは、独立して、水素又はメチルから選択され;
R2aは、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;1~7個のハロゲン置換基又はメトキシで任意選択で独立して置換されるC1~3アルコキシ、C3~6アルケニルオキシ;C2~6アルキニルオキシ;ヒドロキシ(C1~3)アルコキシ;又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、若しくはヒドロキシから選択される1~3個の置換基で任意選択で独立して置換されるC1~3アルキルから選択され;R3は、水素であり;
又は、R2aは-O-であり、R2cは-CH2-であり、これにより、R2aと、R2cと、これらが結合する原子とが、5員環を形成し;
R2bは、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R2bがフルオロのとき、R2aは水素又はフルオロであり;
R2cは、独立して、水素、フルオロ、CH3、又はCH2Fから選択され;
X1及びX2は、独立して、O、S、及びCH2からなる群から選択され;
Y及びY1は、各々独立して、存在しない、又はO若しくはNHからなる群から選択され;
Z及びZ1は、独立して、O及びNHからなる群から選択され;
M及びM1のうちの一方は、
R4は、独立して、ヒドロキシ、メチル、BH3、及び-SR5からなる群から選択され;R5は、独立して、水素、-CH2O(O)R6、-CH2OC(O)OR6、-CH2CH2SC(O)R6、及び-CH2CH2S-SCH2R6からなる群から選択され;
R6は、独立して、1~5個のフルオロ若しくはヒドロキシ置換基、C1~6アルキル、C6~10アリール、又はC3~12シクロアルキルで任意選択で独立して置換されるC6~10アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、C3~12シクロアルキル、及びC1~20アルキルからなる群から選択される)
若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又はこれらの医薬的に許容される塩形態
(ただし、B1及びB2が各々b6であり、Z-M-YがOS(O2)NHであり、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oであるとき、R1aはOH以外である)に関する。
医療において使用する場合、式(I)の化合物の塩とは、非毒性の「医薬的に許容される塩」を指す。しかし、他の塩が式(I)の化合物又はそれらの医薬的に許容される塩形態の調製にて有用である場合もある。式(I)の化合物の適切な医薬的に許容される塩としては、例えば、化合物の溶液を、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸などの医薬的に許容される酸の溶液と混合することにより形成され得る酸付加塩が挙げられる。更に、式(I)の化合物が酸性部分を有する場合、その適切な医薬的に許容される塩としては例えば、アルカリ金属塩(ナトリウム塩又はカリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩)、及び適切な有機リガンドと形成される塩(例えば、第四級アンモニウム塩)を挙げることができる。すなわち、代表的な医薬的に許容される塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、カルシウムエデト酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシラート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ハイドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、N-メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、パモン酸塩(エンボナート)、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、及び吉草酸塩が挙げられる。
HBV逆転写酵素阻害剤、並びにDNA及びRNAポリメラーゼ阻害剤、以下を含むが限定されない:ラミブジン(3TC、Zeffix、Heptovir、Epivir、及びEpivir-HBV)、エンテカビル(Baraclude、Entavir)、アデフォビルジピボキシル(Hepsara、Preveon、bis-POM PMEA)、テノホビルジソプロキシルフマレート(Viread、TDF、又はPMPA);
インターフェロンアルファ(IFN-α)、インターフェロンベータ(IFN-β)、インターフェロンラムダ(IFN-λ)、及びインターフェロンガンマ(IFN-γ)を含むがこれらに限定されないインターフェロン;
ウイルス侵入阻害剤;
ウイルス成熟阻害剤;
カプシドアセンブリ調節因子、例えば、限定されないが、BAY41-4109;
逆転写酵素阻害剤;
TLR-アゴニストなどの免疫調節剤;及び
異なる又は未知の機序を伴う薬剤、例えば、限定されないが、AT-61((E)-N-(1-クロロ-3-オキソ-1-フェニル-3-(ピペリジン-1-イル)プロパ-1-エン-2-イル)ベンズアミド)、AT-130((E)-N-(1-ブロモ-1-(2-メトキシフェニル)-3-オキソ-3-(ピペリジン-1-イル)プロパ-1-エン-2-イル)-4-ニトロベンズアミド)及びこれらの類似体。
(実施例1)
化合物1a(5.48g、14.7mmol)を無水トルエンと共蒸発(2回)させ、無水DMF(87mL)に溶解した。トリフェニルホスフィン(5.77g、22.0mmol)、アジ化ナトリウム(3.06g、47.1mmol)、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(1.08g、2.94mmol)、及び四臭化炭素(7.30g、22.0mmol)を添加した。この反応混合物を室温で終夜撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。得られた残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、白色固体粉末として化合物1bを得た(5.09g、収率:87%)。ESI-MS:m/z 399.0[M+H]+。
イミダゾール(0.51g、7.5mmol)及びTBSCl(0.76g、5.0mmol)をDMF(15mL)中の化合物1b(1.0g、2.5mmol)の溶液に添加し、反応混合物を室温で終夜撹拌した。混合物を水に注ぎ、EtOAcで抽出し、合わせた有機層を水及び食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~50%のEtOAc)により精製し、白色固体として化合物1cを得た(1.2g、収率:93%)。1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δppm0.18(s、6H)、0.95(s、9H)、3.52(dd、J=13.6。4.3Hz、1H)、3.78(dd、J=13.6、3.0Hz、1H)、4.25(m、J=7.2、3.5、3.5Hz、1H)、4.85(ddd、J=18.8、7.5、4.5Hz、1H)、5.53(ddd、J=53.0、4.5、1.8Hz、1H)、6.24(dd、J=18.2、1.9Hz、1H)、7.50~7.58(m、2H)、7.59~7.67(m、1H)、7.99~8.08(m、2H)、8.23(s、1H)、8.80(s、1H)、9.04(br s、1H);ESI-MS:m/z 513.1[M+H]+。
EtOAc(50mL)中の化合物1c(1.15g、2.24mmol)の溶液を、Pd/C(炭素上20%、132mg、0.224mmol)を触媒として、大気圧下、室温で水素添加した。水素取り込み後、触媒を濾過により除去し、濾液を蒸発させ、白色固体として化合物1dを得た(1.1g)。粗生成物を次ステップにてそのまますぐに使用した。ESI-MS:m/z 509.1[M+Na]+。
化合物1d(710mg、1.16mmol)、4-ニトロフェノール(485mg、3.49mmol)、及びEt3N(965μL、6.98mmol)を、DCM(30mL)に溶解し、続いて4Åモレキュラーシーブ(500mg)を添加した。得られた混合物を-78℃まで冷却し、続いてDCM(4mL)の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(830mg、3.49mmol)を添加した。反応混合物を、-78℃で2.5時間撹拌した。NaHCO3水溶液を添加し、水層を分離し、DCMで抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~50%のEtOAc)により精製し、白色固体として化合物1eを得た(546mg、純度89%、化合物(1d)から出発しての収率56%)。1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δppm0.17(s、3H)、0.18(s、3H)、0.96(s、9H)、3.64~3.75(m、2 H)、4.43(br s、1H)、4.67~4.74(m、1H)、5.51(dt、J=51.8、5.4Hz、1H)、6.14(dd、J=13.1、5、5Hz、1H)、7.41(m、J=9.0Hz、2H)、7.56(t、J=7.8Hz、2H)、7.65(t、J=7.5Hz、1H)、8.05(d、J=7.3Hz、2H)、8.09(s、1H)、8.15(m、J=9.0Hz、2H)、8.54(s、1H)、8.99(br s、1H)、9.40(br dd、J=6.5、2.5Hz、1H);19F NMR(376MHz、クロロホルム-d)δppm-207.51(br s、1F);ESI-MS:m/z 688.1[M+H]+。
DCM(8mL)中の化合物1e(546mg(純度92%)、0.73mmol)、5’-O-(4’,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチル-D-グアノシン([103285-33-2]、753mg(純度97%)、1.09mmol)及び4Åモレキュラーシーブ(500mg)の混合物を、窒素雰囲気下、室温で1時間撹拌した。Et3N(503μL、3.64mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~90%のEtOAc)により精製し、化合物1fを得て、これを次ステップにてそのまま使用した。1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δppm0.14(s、3H)、0.15(s、3H)、0.75(d、J=7.0Hz、3H)、0.89(d、J=6.8Hz、3H)、0.93(s、9H)、1.94(spt、J=6.8Hz、1H)、3.15(dd、J=10.9。3.4Hz、1H)、3.45(s、3H)、3.48-3.63(m、3H)、3.75(s、3H)、3.76(s、3H)、4.12-4.21(m、1H)、4.28(t、J=5.3Hz、1H)、4.36(br s、1H)、4.63-4.72(m、1H)、5.49(dt、J=52.0、5.1Hz、1H)、5.75(t、J=4.8Hz、1H)、6.07(d、J=4.5Hz、1H)、6.12(dd、J=13.4、5.1Hz、1H)、6.79(m、J=8.4、8.4Hz、4H)、7.15-7.22(m、1H)、7.25(t、J=7.5Hz、2H)、7.34(m、J=8.3Hz、4H)、7.43-7.55(m、4H)、7.61(t、J=7.3Hz、1H)、7.72(s、1H)、8.08(d、J=8.3Hz、2H)、8.09(s、1H)、8.83(s、1H)、9.14(m、J=8.3Hz、2H)、9.54(br s、1H)、12.06(br s、1H);19F NMR(376MHz、クロロホルム-d)δppm-207.07(br s、1F);ESI-MS:m/z 1240.6[M+Na]+。
MeCN(20mL)中の粗化合物1fの溶液に、酢酸80%(20mL、279.5mmol)及びトリエチルシラン(2mL、12.5mmol)を添加し、反応混合物を室温で終夜撹拌した。EtOAc及びNa2CO3水溶液を添加し、有機層を分離し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られた残分をピリジン(10mL)に溶解し、これにトリエチルアミン(1.0g、10.0mmol)及びEt3N.3HF(807mg、5.0mmol)を添加した。反応混合物を室温で12時間撹拌した。続いての減圧下での濃縮により、粗生成物が得られ、これを分取逆相HPLC(固定相:Phenomenex Gemini C18、10μm、250×50mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出:A中、22~52%のB、11.2分間;流速:22mL/分)により精製し、化合物1gを得た(化合物1fから出発しての収率27%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.11(d、J=6.5Hz、6H)、2.75(spt、J=6.8Hz、1H)、3.11~3.24(m、2H)、3.39(s、3H)、3.51~3.59(m、1H)、3.59~3.69(m、1H)、3.95(m、J=3.7Hz、1H)、4.09(d、J=3.3Hz、1H)、4.17(dd、J=4.9、3.3Hz、1H)、4.57(ddd、J=19.5、7.3、4.5Hz、1H)、5.22(br s、1H)、5.37(t、J=5.5Hz、1H)、5.57(ddd、J=52.5、4.5、2.4Hz、1H)、6.07(d、J=6.5Hz、1H)、6.33(dd、J=19.3、2.2Hz、1H)、7.50~7.60(m、2H)、7.61~7.70(m、1H)、7.99-8.10(m、2H)、8.22(s、1H)、8.62(s、1H)、8.73(s、1H)(ただしNH及びOHはD2Oで交換);19F NMR(376MHz、メタノール-d4)δppm-205.32(br s、1F);ESI-MS:m/z 802.2[M+H]+。
1:1MeCN/THF(14mL)中の化合物1g(100mg、0.12mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45Mの2.2mL、0.93mmol)の溶液を4Åモレキュラーシーブで30分処理した後、MeCN(6mL)中の2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(70mg、0.23mmol)を添加した。得られた反応混合物を2時間撹拌した後、追加量のテトラゾール(MeCN中0.45Mの0.55mL、0.25mmol)を添加し、続いて更に30分撹拌した。I2(THF/ピリジン/水8:1:1の混合物中0.5M、695μL、0.357mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。飽和Na2S2O3水溶液の添加により反応混合物をクエンチし、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残分を分取逆相HPLC(固定相:Phenomenex Gemini C18、10μm、250×50mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出:A中、20~50%のB、11.2分間;流速:22mL/分)により精製し、化合物1hを得て、これをその後の脱保護ステップにてそのまま使用した。ESI-MS:m/z 917.4[M+H]+。
アンモニア水溶液(25%、9mL)及びEtOH(3mL)の混合物中の化合物1hの溶液を、50℃で終夜撹拌した。減圧下での濃縮後に得られた粗生成物を、分取逆相HPLC(固定相:Syneri Polar-RP、5μm、100×30mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出:A中、0~25%のB、12分間;流速25mL/分)により精製し、アンモニウム塩として化合物1を得た。化合物1を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液から溶出することにより、ナトリウム塩に変換し、凍結乾燥後に白色固体として12.9mgの化合物1、ナトリウム塩を得た(化合物1gから出発しての収率:13%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6、80℃でスペクトル記録)δppm3.31(dd、J=13.2。2.2Hz、1H)、3.50(s、3H)、3.60(dd、J=13.5、3.6Hz、1H)、3.91~3.98(m、1H)、4.20(d、J=4.2Hz、1H)、4.23~4.28(m、1H)、4.28~4.31(m、1H)、4.31~4.37(m、1H)、5.22~5.34(m、1H)、5.43(dd、J=51.7、4.4Hz、1 H)、5.99(d、J=8.3Hz、1H)、6.19(br s、1H)、6.33(d、J=19.5Hz、1H)、6.58(br s、2H)、7.08(s、2H)、7.69(s、1H)、7.87(s、1H)、8.34(br s、1H)、9.70(br s、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm56.05(s、1P)、94.05(s、1P);ESI-MS:m/z 690.2[M+H]+。
1:1MeCN/THF(12mL)中の化合物1g(230mg、0.28mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中3~4%の1.67mL)の溶液を4Åのモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(78mg、0.26mmol)を添加した。得られた反応混合物を30分撹拌した後、追加量の2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(8.6mg、0.03mmol)を添加し、続いて更に15分撹拌した。ピリジン(15mL)及びフェニルアセチルジスルフィド(PADS、217mg、0.72mmol)を添加し、撹拌を40分間継続した。濾過によりモレキュラーシーブを除去してから、EtOAcを反応混合物に添加し、続いて食塩水及び飽和NaHCO3水溶液で十分に洗浄した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物を後続の脱保護ステップにてそのまま使用した。ESI-MS:m/z 933.2[M+H]+。
粗化合物2aを、エタノール中33%のメチルアミンの溶液(20mL)中で、50℃で4時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物を水に溶解し、EtOAcで洗浄し、凍結乾燥し、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出:A中、0~15%のB、29分間;流速30mL/分)により精製し、単一のジアステレオマーとして化合物(*R)2Aを得た。ナトリウム塩への変換を、実施例1、ステップ8に記載のように行った(23mg、化合物1gから出発しての収率10%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6、80℃でスペクトル記録)δppm3.31~3.43(m、1H)、3.49(s、3H)、3.62~3.75(m、1H)、3.92~4.00(m、1H)、4.00~4.09(m、1H)、4.20(br s、1H)、4.31(br s、2H)、5.33~5.50(m、2H)、5.64(br d、J=52.0Hz、1H)、5.68(dd、J=8.7。4.1Hz、1H)、6.03(d、J=8.6Hz、1H)、6.26(s、2H)、6.33(d、J=18.4Hz、1H)、7.07(s、2H)、7.88(br s、1H)、8.29(br s、2H)、8.66(br s、1H)、10.30(br s、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm52.18(s、1P);ESI-MS:m/z 706.0[M+H]+。
ピリジン(8mL)中の化合物3b(2.0g、4.99mmol、CAS番号153186-10-8)の溶液に、MsCl(1.14g、9.99mmol)を、N2下、0℃でゆっくりと添加し;室温で1時間撹拌した後、反応混合物をEtOAc(20mL)で希釈し、水(3×20mL)で洗浄した。水相を分離し、EtOAcで抽出した(3×15mL)。
合わせた有機層を引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、黄色の油として化合物3cを得た(3.1g)。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm7.38~7.31(m、7H)、7.21~7.14(m、3H)、5.79(d、J=3.8Hz、1H)、4.87(d、J=11.8Hz、1H)、4.74(d、J=12.0Hz、1H)、4.67~4.62(m、1H)、4.57~4.38(m、4H)、4.30(d、J=5.3Hz、1H)、3.63~3.58(m、1H)、3.53~3.48(m、1H)、3.63~3.47(m、1H)、3.07(s、3H)、2.36(s、3H)、1.71~1.67(m、3H)、1.35(s、3H);ESI-MS:m/z=501.2[M+Na]+。
80%トリフルオロ酢酸水溶液(10mL)中の3c(1.0g、2.1mmol)の溶液を室温で1時間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残分をDCM(20mL)に溶解し、飽和NaHCO3水溶液(2×20mL)で洗浄した。有機層を引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、無色の油を得た(876mg)。油を無水ピリジン(2×15mL)と共蒸発させ、無水ピリジン(15mL)に溶解し、Ac2O(815.8mg、7.99mmol)で処理した。50℃で終夜撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(25mL)でクエンチし、EtOAcで分液した(2×20mL)。有機層を合わせ、引き続いて食塩水(15mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~30%のEtOAc)により精製し、無色のシロップ状物として3dを得た(786mg)。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm7.42~7.18(m、12H)、6.38(d、J=4.5Hz、1H)、6.15(s、1H)、5.36(d、J=5.0Hz、1H)、5.30(s、1H)、5.17(dd、J=4.8。6.3Hz、1H)、2.99(s、3H)、2.96(s、1H)、2.19~2.10(m、4H)、2.06(d、J=7.8Hz、1H)、1.90(s、3H)。ESI-MS:m/z=545[M+Na]+。
無水1,2-ジクロロエタン(5mL)中の化合物3d(200mg、0.38mmol)及び6-N-ベンゾイルアデニン(3e、109.8mg、0.46mmol)の懸濁液に、ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA、202.4mg、0.99mmol)を添加した。混合物を1時間還流させ、室温まで冷却した。TMSOTf(170mg、0.76mmol)を添加し、溶液を110℃で16時間加熱した。反応混合物をDCM(15mL)で希釈し、次いで氷冷した飽和NaHCO3水溶液(20mL)に注ぎ、0.5時間撹拌し、濾過した。2つの層の分離後、有機層を引き続いて飽和NaHCO3水溶液(3×15mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH/CH2Cl2、1~1.5体積/体積%)により精製し、淡黄色の固体として化合物3f得た(208mg)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm8.80(s、1H)、8.59(s、1H)、8.04(s、1H)、7.87(br d、J=7.3Hz、2H)、7.54~7.44(m、1H)、7.44~7.34(m、2H)、7.29~7.03(m、10H)、6.18(br d、J=4.4Hz、1H)、5.96~5.84(m、1H)、4.70(br d、J=5.6Hz、1H)、4.56~4.29(m、1H)、4.55~4.22(m、4H)、4.21(s、1H)、3.63~3.53(m、1H)、3.46(br d、J10.0Hz、1H)、2.84~2.75(m、1H)、2.86~2.75(m、1H)、2.87~2.71(m、1H)、1.99~1.92(m、1H)、1.91(br s、1H);ESI-MS:m/z=702[M+H]+。
THF(50mL)及び水(35mL)の混合物中の化合物3f(5.86g、8.35mmol)の溶液に、LiOH.H2O(1.75g、41.8mmol)を0℃で添加した。混合物を室温で5時間撹拌した後、反応混合物をEtOAc(30mL)で希釈した。有機相を食塩水で洗浄し(30mL×2)、水層をEtOAc(50mL×3)により抽出した。合わせた有機層を引き続いて飽和NaHCO3水溶液(3×15mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc:PE=0~70%)により精製し、黄色の固体として化合物3gを得た(4.25g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm9.00(br s、2H)、8.74(s、2H)、8.23(s、2H)。8.02(br d、J=7.3Hz、3H)、7.60(br d、J=7.3Hz、2H)、7.52(br t、J=7.5Hz、3H)、7.38~7.16(m、15H)、6.09(s、2H)、4.79(s、2H)、4.66~4.49(m、6H)、4.24(s、2H)、4.18~4.05(m、3H)、3.99(br d、J=7.8Hz、2H)、3.90~3.70(m、3H)、2.03(s、2H)、1.75(br s、3H)、1.24(br t、J=7.1Hz、2H);ESI-MS:m/z=564.1[M+H]+。
DCM(50mL)中の化合物3g(3.3g、5.85mmol)の撹拌溶液に、メタンスルホン酸(28.9g、0.3mol)を0℃で添加した。0℃で2.5時間撹拌した後、反応物を前のバッチと合わせ、DCM(180mL)中のNaHCO3(75g、0.90mol)の懸濁液を、均圧滴下漏斗を用いて添加した。反応混合物を1.5時間撹拌した後、MeOH(10mL)を添加し、混合物を更に0.5時間撹拌した(pH約7~8)。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、淡黄色固体を得て、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~10%のMeOH、25mL/分)により精製し、灰白色固体として化合物3hを得た(3.75g)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δppm8.73(s、1H)、8.56(s、1H)、8.13~8.06(m、2H)、7.71~7.62(m、1H)、7.61-7.53(m、2H)、6.14(s、1H)、4.63(s、1H)、4.38(s、1H)、4.09(d、J=7.8Hz、1H)、3.97(s、2H)、3.92(d、J=7.8Hz、1H)。
ピリジン(50mL)中の化合物3h(4.3g、11.2mmol)の混合物に、ピリジン(20mL)中のDMTrCl(4.56g、13.4mmol)の溶液を0℃で滴下した。室温で2時間撹拌した後、反応混合物を酢酸エチル(100mL)で希釈し、次いで引き続いてNaHCO3飽和水溶液(80mL×3)及び食塩水(80mL×2)で洗浄した。有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製し、白色固体として化合物3iを得た(7.8g)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δppm8.74(s、1H)、8.50(s、1H)、8.09(d、J=7.3Hz、2H)、7.70~7.62(m、1H)、7.60~7.53(m、2H)、7.48(d、J=7.5Hz、2H)、7.36(dd、J=3.0、9.0Hz、4H)、7.33~7.27(m、1H)、7.26~7.18(m、1H)、6.87(d、J=8.8Hz、4H)、6.17(s、1H)、4.65(s、1H)、4.49(s、1H)、4.10(q、J=7.3Hz、1H)、4.05~3.98(m、2H)、3.77(s、6H)、3.65~3.58(m、1H)、3.54~3.48(m、1H);ESI-MS:m/z=686[M+H]+。
DMF(60mL)中の、化合物3j(5.0g、13.61mmol、CAS番号160107-07-3)、トリフェニルホスフィン(4.28g、16.33mmol)、TBAI(502mg、1.36mmol)及びNaN3(3.3g、50.76mmol)の撹拌懸濁液に、CBr4(5.41g、16.33mmol)を一度に添加した。20℃で12時間撹拌した後、反応混合物を80mLの飽和NaHCO3水溶液及びDCM(100mL×3)で分液した。有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%のEtOAcでPh3POを流し、次いでDCM中の0~10%のMeOHに切り替え)により精製し、白色固体として3kを得た(4.26g)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δppm8.16(s、1H)、5.96(d、J=4.9Hz、1H)、4.82(t、J=5.3Hz、1H)、4.27~4.21(m、1H)、3.97(t、J=4.9Hz、1H)、3.66(d、J=4.4Hz、2H)、3.52(s、3H)、2.78~2.69(m、1H)、1.24(d、J=6.8Hz、6H)、ESI-MS:m/z=393.1[M+H]+。
DCM(40mL)中の3k(4.07g、10.37mmol)、2m4,6-トリメチルピリジン(1.63g、13.48mmol)及びAgNO3(2.29g、13.48mmol)の溶液に、DMTrCl(4.57g、13.48mmol)を0℃で添加した。25℃で3時間撹拌した後、赤色の懸濁液をDCM(50mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過した。濾液をDCM/水(50/30mL)で分液し、食塩水(30mL)で洗浄した。有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色固体として3lを得た(7.0g)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ7.94(s、1H)、7.35~7.28(m、1H)、7.22(d、J=8.8Hz、1H)、7.18~7.12(m、2H).7.09(d.J=8.811z、1H)、6.72(d、J=8.8Hz、1H)、6.61(d、J=8.8Hz、1H)、6.03(d、J=7.7Hz、1H)、4.94(brdd、J=5.2.7.2Hz、1H)、4.87(s、7H)、4.16(t、J=5.7Hz、1H)、4.07(q、J=7.1Hz、1H)、3.71(d、J=13.7Hz、4H)、3.61(dd、J=6.6。12.8Hz。1H)、3.29(s、3H)、3.21(s、2H)、2.75(quin、J=6.8Hz、1H)、2.68(d、J=4.6Hz、1H)、1.99(s、2H)、1.28~1.17(m、6H);ESI-MS:m/z=695.3[M+H]+。
酢酸エチル(100mL)中の3l(1.2g、1.72mmol)及び10%の湿潤させたPd/C(1.0g、0.49mmol)の懸濁液を、15psiにて20℃で4時間水素添加した。反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~10%のMeOH)により精製された残分を得て、白色固体として3mを得た(682mg)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ7.89(s、1H)、7.33(dd、J=1.5、7.8Hz、1H)、7.30~7.29(m、1H)、7.36~7.29(m、1H)、7.21(d、J=8.8Hz、2H)、7.18~7.10(m、3H)、7.08(d、J=8.8Hz、2H)、6.71(d、J=8.8Hz、2H)、6.59(d、J=8.8Hz、2H)、5.98(d、J=7.5Hz、1H)、5.03(dd、J=4.8、7.5Hz、1H)、4.21(dd、J=3.4、9.9Hz、1H)、3.69(d、J=16.3Hz、6H)、3.26(s、3H)、3.16(dd、J=10.0、13.1Hz、1H)、2.88~2.75(m、3H)、1.31~1.21(m、8H);ESI-MS:m/z=669.3[M+H]+。
乾燥DCM(5mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート3n(2.45g、10.31mmol、J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,2002,485-495)の溶液を、N2下、乾燥DCM(50mL)中の3m(2.3g、3.44mmol)、4-ニトロフェノール(1.43g、10.31mmol)、Et3N(2.09g、20.63mmol)及び活性化した4Åモレキュラーシーブ(≒4g)の混合物に、-78℃で速やかに添加した。室温(12℃)まで加温し2時間撹拌した後、反応混合物をDCM(20mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過した。濾液を前の2つの他のバッチと合わせ、DCM/飽和NaHCO3水溶液(100、3×70mL)に分液した。有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%の酢酸エチル)により精製し、黄色固体として3oを得た(4.8g)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ12.18(br s、1H)、9.18(s、1H)、8.32~8.26(m、3H)、7.74(s、1H)、7.37~7.28(m、4H)、7.25~7.11(m、6H)、7.08(d、J=8.8Hz、1H)、6.73(d、J=9.0Hz、2H)、6.63(d、J=8.8Hz、2H)、5.89(d、J=8.8Hz、1H)、4.99(dd、J=5.0、8.5Hz、1H)、4.29(s、1H)、3.80~3.74(m、4H)、3.72(s、1H)、3.50~3.44(m、1H)、3.38~3.29(m、1H)、3.20(s、3H)、2.77(d、J=5.0Hz、1H)、2.55~2.43(m、1H)、1.31~1.27(m、4H)、1.15(d、J=6.8Hz、3H)。
ESI-MS:m/z=870[M+H]+。
3o及び3iの混合物を、使用前にTHF(30mL×3)と共蒸発させた。乾燥THF(50mL)中の3o(4.12g、4.74mmol)、3i(2.5g、3.64mmol)及び活性化4Åモレキュラーシーブ(約2g)の混合物を、N2下、室温で1時間撹拌した。DMAP(2.22g、18.22mmol)を一度に添加し、反応混合物を40℃で12時間撹拌した。混合物をDCM(40mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、淡黄色固体として3pを得た(4.6g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ12.31(s、1H)、9.25(s、1H)、9.11(br s、1H)、8.78(s、1H)、8.52~8.29(m、2H)、8.16~8.01(m、5H)、7.77(s、1H)、6.69(d、J=8.8Hz、2H)、6.60(d、J=9.0Hz、2H)、6.21(s、1H)、5.84(d、J=8.8Hz、1H)、5.36(s、1H)、5.06(s、1H)、4.86(dd、J=4.9、8.7Hz、1H)、4.06~3.93(m、2H)、3.73(d、J=2.8Hz、9H)、3.70(s、3H)、3.67~3.58(m、1H)、3.34(d、J=11.0Hz、1H)、3.15(s、3H)、3.06(dd、J=2.3、12.5Hz、1H)、2.96~2.84(m、1H)、2.62~2.49(m、2H)、1.28~1.24(m、5H)、1.18(d、J=6.8Hz、3H)。ESI-MS:m/z=1417[M+H]+。
DCM(84mL)中の3p(4.6g、3.25mmol)の撹拌溶液に、N2下、DCM(44mL、32.3mmol、10.0当量)中の6%のDCAを室温で添加した。室温で30分撹拌した後、反応混合物をピリジン(2.8g、11当量)でクエンチし、得られた無色の溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~7%のMeOH)により精製された無色の残分を得て、白色固体として3qを得た(1.9g)。上記の固体を逆相分取HPLC(カラム:Phenomenex Synergi Max-RP、250×50mm×10μm;移動相:水(10mMのNH4HCO3)-MeCN、B15で開始、B45で終了;流速:90ml/分、勾配時間:18分、続いて3分間B100)により更に精製し、凍結乾燥後に白色固体として3qの2画分を得た。画分1:876mg及び画分2:743mg。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ8.52(s、1H)、8.36(s、1H)、8.01(d、J=7.1Hz、2H)、7.86(s、1H)、7.65(d、J=7.3Hz、1H)、7.60~7.54(m、2H)、6.20(s、1H)、5.71(d、J=4.9Hz、1H)、5.22(d、J=14.4Hz、2H)、4.67~4.59(m、1H)、4.06(d、J=3.7Hz、2H)、4.02(br d、J=4.6Hz、3H)、4.10~3.99(m、1H)、3.99~3.93(m、1H)、3.51~3.44(m、4H)、3.40(d、J=4.6Hz、1H)、2.73~2.65(m、1H)、1.21(dd、J=5.4、6.6Hz、6H):ESI-MS:m/z 812.2[M+H]+。
THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNをCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
真空乾燥したジオール3q(300mg、0.37mmol)を、CH3CN/THF(10/6mL×3)の混合物と共蒸発させ、CH3CN/THF(10/6mL)の混合物に溶解した。これに、800mgの活性化4Åモレキュラーシーブ及びCH3CN中の1H-テトラゾールの溶液(6.56mL、0.45M、30mLの乾燥CH3CN中に945mgのテトラゾールを溶解し、続いて800mgの4Åモレキュラーシーブを添加し、次いで使用前にアルゴン下、1時間撹拌することにより調製)を添加し、混合物をアルゴン下、15分間バブリングした。白色の懸濁液をアルゴン下、8℃で1時間撹拌した後、CH3CN中の2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイトの溶液(5.62mL、0.59mmol、CH3CN中0.105M、759mgのホスホロジアミダイト試薬を24mLのCH3CNに溶解し、続いて800mgの4Åモレキュラーシーブを添加し、次いで使用前にアルゴン下、1時間撹拌することにより調製)を、60分かけて滴下した。得られた白色の懸濁液を、アルゴン下8℃で1時間撹拌した。更なるCH3CN(6mL)を添加し、30℃で1時間撹拌した後、追加のテトラゾール(1.64mL、0.74mmol、CH3CN中0.45M)を添加した。更に2時間撹拌した後、ピリジン(10mL)中のDDTTの溶液(380mg、1.84mmol)を速やかに添加した。30分撹拌した後、混合物を、珪藻土のパッドを通して濾過し;濾液を別のバッチと合わせ、減圧下で濃縮し、DCM(8mL)に溶解した残分を得て、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(12g、DCM中の0~6%のMeOH、25mL/分)により精製し、淡黄色固体として3r(275mg)を得て、これを更に精製することなく次ステップに直接使用した。ESI-MS:m/z=943.5[M+H]+。
MeNH2(EtOH中27~30%、5mL)中の化合物3r(275mg、0.292mmol)の溶液を、80℃で4時間撹拌した。反応混合物を別のバッチと合わせ、減圧下で濃縮し、残分を得て;残分をCH3CN/H2O(1/8mL)の混合物に溶解し、DCM(8mL×3)で洗浄した。水層を凍結乾燥し、黄色のガム(382mg)を得て、次いで更にCH3CN/H2O(4/1mL)の混合物に溶解した。逆相分取HPLC(カラム:Agela Durashell C18 150x25×5μm;移動相:水(0.04%のNH3水+10mMのNH4HCO3)-CH3CN;B12で開始、B25で終了;流速:25ml/分、勾配時間:12分、続いて3分のB100)により精製し;所望の画分を回収し、凍結乾燥し、白色固体として化合物(*R)4A、アンモニウム塩(39.8mg、最初の溶出異性体)、及び白色固体として化合物(*S)4B、アンモニウム塩(65.9mg、2番目の溶出異性体)を得た。
DMF(80mL)中の化合物3j(9.6g、26.13mmol、CAS番号160107-07-3)の溶液に、イミダゾール(3.56g、52.26mmol)及びTBSCL(4.73g、31.36mmol)を0℃で添加した。混合物を25℃で2時間撹拌した後、反応物をEtOAc(200mL)及びH2O(100mL)で希釈し;有機層を引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物4aを得た(9.7g、76%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm=12.12(br s、1H)、9.48(br s、1H)、8.05(s、1H)、5.89(d、J=4.8Hz、1H)、4.56(t、J=4.9Hz、1H)、4.21(q、J=3.4Hz、1H)、3.98(t、J=4.6Hz、1H)、3.93(dd、J=3.5、11.5Hz、1H)、3.79(dd、J=2.8、11.5Hz、1H)、3.47(s、3H)、2.75(td、J=6.9、13.6Hz、1H)、1.27(s、3H)、1.25(s、3H)、0.91(s、9H)、0.10(s、6H);ESI-MS:m/z 482.3[M+H]+。
DCM(200mL)中の化合物4a(10g、20.76mmol)の溶液に、Dess-Martinペルヨージナン(14.97g、35.29mmol)を0℃で添加した。混合物を30℃で12時間撹拌後。反応混合物をDCM(300mL)で希釈し;有機層を、飽和Na2S2O3水溶液(100mL)及び飽和NaHCO3水溶液(50mL)で洗浄した。有機層を圧力下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの、15g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製し、白色固体として化合物4bを得た(9.0g、80%)。ESI-MS:m/z 498.3[M+H7]+。
EtOH(200mL)中の化合物4b(9g、18.77mmol)の溶液に、NaBH4(1.06g、28.15mmol)を0℃で添加した。溶液を0℃で0.5時間撹拌した後、混合物を、EtOAc(500mL)及びNH4Cl飽和水溶液(100mL)で希釈した。有機層を減圧下で濃縮し、残分を得た(9.0g)。残分(シリカゲルと合わせたもの、15g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH、体積/体積)により精製し、白色固体として化合物4c(4.8g、53%)、及び白色固体として化合物4a(1.5g、17%)を得た。化合物4d:1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ=12.06(s、1H)、11.70(s、1H)。8.00(s、1H)、6.05(d、J=4.6Hz、1H)、5.85(d、J=5.5Hz、1H)、4.31~4.26(m、1H)、3.91~3.77(m、4H)、3.39(s、3H)、2.80~2.70(m、1H)、1.11(d、J=6.8Hz、6H)、0.89(s、9H)、0.07(s、6H)。
ESI-MS:m/z=482.3[M+H]+。
ピリジン(20mL)中の化合物4c(1.8g、3.74mmol)の溶液に、DIEA(1.45g、11.21)及びジフェニルカルバミッククロリド(1.12g、4.86mmol)を25℃で添加した。混合物を25℃3時間撹拌した。反応混合物を他の2つのバッチと合わせ、ワークアップした。混合物を、酢酸エチル(150mL)及びH2O(100mL)で分液した。有機層を食塩水(100mL)で洗浄し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(0~100%のEA/PE、体積/体積)により精製し、黄色固体として化合物4dを得た(6g、4.8gの化合物4cからで70%)。1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δ=8.34(s、1H)、8.00(s、1H)、7.44(br d、J=7.3Hz、4H)、7.37(t、J=7.8Hz、4H)、7.25(br s、2H)、6.22(d、J=3.0Hz、1H)、4.38(br s、1H)、4.16~4.12(m、1H)、4.00~3.93(m、2H)、3.83(dd、J=2.5、11.0Hz、1H)、3.51(s、3H)、2.94(br s、1H)、1.27(dd、J=1.0、6、8Hz、6H)、0.94(s、9H)、0.14(s、6H);ESI-MS:m/z=677.4[M+H]+。
ピリジン(100mL)中の化合物4d(5g、7.39mmol)の溶液に、Tf2O(16.67g、59.1mmol)を0℃で添加した。混合物を0℃で1.5時間撹拌した後、反応物を、DCM(200mL)及びH2O(100mL)で分液した。有機層を分離し、水相をDCM(100mL)で抽出した。次いで有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分を別のバッチと合わせ、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:0%~30%のEtOAc/石油エーテル、体積/体積)により精製し、白色固体として化合物4eを得た(4.0g)。ESI-MS:m/z=809.5[M+H]+。
DMF(40mL)中の化合物4e(4.0g、4.94mmol)の溶液に、NaN3(3.5g、54.15mmol)を25℃で添加した。反応物を25℃で12時間撹拌した後、混合物を飽和NaHCO3水溶液(30mL)で希釈し、pH>9に調整し、酢酸エチル(100mL×3)で抽出した。有機層を合わせ、引き続いて食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、黄色固体を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの、10g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%の酢酸エチル)により精製し、黄色固体として化合物4fを得た(1.8g、67%)。
1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δ=11.99(br s、1H)、8.20(br s、1H)、8.05(s、1H)、5.96(br d、J=4.4Hz、1H)、4.25~4.11(m、3H)、3.99(br d、J=11.7Hz、1H)、3.82(br d、J=11.7Hz、1H)、3.53(d、J=2.4Hz、3H)、2.70~2.58(m、1H)、1.30(br d、J=6.8Hz、6H)、0.94(s、9H)、0.13(s、6H);ESI-MS:m/z= 507.3[M+H]+。
THF(20mL)中の化合物4f(1.8g、3.55mmol)の溶液に、トリフェニルホスフィン(1.3g、4.97mmol)を25℃で添加した。反応物を40℃で2時間撹拌した後、水(10mL)を、溶液に40℃で添加し、混合物を12時間撹拌した。次いで、混合物をDCM(50mL)で希釈し、食塩水(2×50mL)で洗浄した。有機層を合わせ、適正圧力下で濃縮し、黄色固体を得た(2.0g)。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物4gを得た(1.5g、81%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ=8.15(s、1H)、5.57(d、J=8.0Hz、1H)、4.07~4.00(m、1H)、3.91(dd、J=5.3、8.0Hz、1H)、3.75~3.63(m、3H)、3.37(s、3H)、2.77~2.69(m、1H)、1.10(d、J=6.8Hz、6H)、0.86(s、9H)、0.04(s、6H);ESI-MS:m/z 481.3[M+H]+。
DCM(100mL)中の化合物4g(1.5g、2.81mmol)の溶液に、4-ニトロフェノール(3.12g、22.47mmol)、トリエチルアミン(1.7g、16.8mmol)及び4Åモレキュラーシーブ(2.0g)を添加した。混合物を-78℃で0.5時間撹拌した後、DCM(20mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート3n(2g、8.42mmol)を、溶液に-78℃で添加した。-78℃で15分撹拌し、0℃で1時間撹拌した後、混合物を濾過し、DCM(100mL)で希釈した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(3×50mL)で洗浄し、適正圧力下で濃縮し、黄色固体を得た(2.5g)。残分を別のバッチと合わせ(シリカゲルと合わせたもの、6g)、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~100%の酢酸エチル)により精製し、黄色固体として化合物4hを得た(1.68g、2.4gの化合物74からで75%)。1H NMR(400MHz、CD3CN)δ11.89(br s、1H)。9.27(br s、1H)。8.15(br d、J=9.3Hz、2H)、7.94~7.90(m、1H)、7.23(br d、J=9.0Hz、2H)、5.80(br d、J=8.3Hz、1H)、4.81(br d、J=7.3Hz、1H)、4.24(br s、1H)、3.97(br d、J=4.5Hz、1H)、3.83(br s、2H)、3.48~3.39(m、3H)、2.73~2.58(m、1H)、1.19(br dd、J=3.3、6.0Hz、6H)、0.94(s、9H)、0.12(s、6H);ESI-MS:m/z 682.3[M+H]+。
DCE(135mL)中の化合物4h(1.68g、2.47mmol)、化合物4i(731mg、1.9mmol)の溶液及び4Åモレキュラーシーブ(2.0g)を、N2下、25℃で30分撹拌し、続いてDMAP(1.16g、9.49mmol)を添加した。55℃(油温度)で12時間撹拌した後、混合物を濾過し、溶液をDCM(100mL)及び食塩水(50mL)で分液した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(3×100mL)で洗浄し;有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を得た(2.5g)。粗生成物(2.5g、粗)(シリカゲルと合わせたもの、5g)を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、淡黄色固体として化合物4jを得た(1.2g、52%)。ESI-MS:m/z 927.4[M+H]+。
ピリジン(24mL)中の化合物4j(1.2g、1.29mmol)の溶液に、TEA(1.31g、12.94mmol)及びEt3N-3HF(1.0、6.47mmol)を15℃で添加した。溶液を35℃で12時間撹拌した後、THF(20mL)及びトリメチル(プロポキシ)シラン(3.4g、25.89mmol)を25℃で添加し、反応混合物を更に3時間撹拌した。反応混合物を適正圧力下で濃縮し、残分を得た(2g)。残分(シリカゲルと合わせたもの、4g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、粗化合物4kを得た(900mg)。粗生成物を逆相分取HPLC(方法:カラム:Waters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30。条件:水(10mMのNH4HCO3)-ACN、B5、B35で終了、勾配時間(分):7、100%Bの保持時間(分):1、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として純粋な化合物4kを得た(0.57g、70%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ=8.17(d、J=4.4Hz、2H)、8.08(s、1H)、6.21(d、J=19.6Hz、1H)、5.84(d、J=8.6Hz、1H)、5.51~5.26(m、1H)、5.13(br s、1H)、4.72(dd、J=5.4、8.8Hz、1H)、4.53~4.38(m、1H)、4.22~4.16(m、1H)、4.14~4.10(m、1H)、4.09~4.00(m、2H)、3.86(d、J=5.4Hz、1H)、3.63~3.46(m、2H)、3.25(s、3H)、2.75(td、J=6.8、13.6Hz、1H)、1.11(dd、J=2.1、6.7Hz、6H)。
19F NMR(376MHz、DMSO-d6)-201.424(s、1F);ESI-MS:m/z=699.3[M+H]+。
CH3CNを、使用前にCaH2でフレッシュとして蒸留した。化合物4l(152mg、0.218mmol)を、DMF(2mL)及びCH3CN(6mL)中に溶解し、これに、0.3gの4ÅMS(粉末)及び1H-テトラゾール(3.87mg、0.45M、472.5mgのテトラゾールを15mLの乾燥CH3CNに溶解し、続いて1gの4ÅMSを添加し、次いで使用前にN2下、0.5時間撹拌することにより調製した)の溶液を添加した。CH3CN(0.8mL)中の2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(131.15mg、0.43mmol)の溶液を、シリンジを通して20分かけて滴下した。得られた白色の懸濁液を、N2下、25℃で2時間更に撹拌した。次いで、TBHP(0.218mL、1.09mmol、デカン中5M)を、上記の溶液に25℃で添加した。反応物を25℃で1時間撹拌した後、混合物を、DCM(20mL)及びCH3OH(3mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、真空下で濃縮し、無色の油を得て;油をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(4g、DCM中の0~11.5%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物4lを得た(151mg、68%)。ESI-MS:m/z=814.3[M+H]+。
EtOH(2mL)中の化合物4l(150mg、0.18mmol)の溶液を、MeNH2(5mL、EtOH中30%)で処理した。反応物を25℃で2時間、及び35℃で1時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮し、無色の油を得た。残分をH2O(20mL)及びCH3CN(5mL)に溶解し、次いでDCM(20mL×2)で洗浄した。次いで、水相を凍結乾燥し、淡黄色固体として粗生成物を得た(80mg、粗)。粗生成物(80mg、粗)を逆相分取HPLC(方法:カラム:Waters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30:条件:水(10mMのNH4HCO3)(A)-ACN(B)、B0で開始、B25で終了;勾配時間(分):7;100%Bの保持時間(分):1、流速(mL/分):25、インジェクション12)により精製し、白色固体として化合物52、アンモニウム塩を得た(35mg、26%)。1H NMR(400MHz、D2O)δ=8.29(s、1H)、8.19(br d、J=9.5Hz、2H)、6.61(br d、J=18.6Hz、1H)、6.08(br d、J=8.8Hz、1H)、5.90~5.72(m、1H)、5.39(br d、J=19.6Hz、1H)、5.20(br s、1H)、4.76(br s、1H)、4.72(br s、1H)、4.49(br d、J=10.3Hz、3H)、4.35(br d、J4.3Hz、1H)、4.17(q、J=6.2Hz、1H)、3.67(s、3H);19F NMR(376.5MHz、D2O)-199.859;31P NMR(162MHz、D2O)-1.639;ESI-MS:m/z 691.1[M+H]+。
Dowex 50W×8、200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオンH2O(20mL)で洗浄した。次いで樹脂に、15%H2SO4脱イオンH2O溶液(20mL)を添加し、混合物を15分穏やかに撹拌し、デカントした(15mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオンH2O溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで中性になるまで脱イオンH2Oで洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオンH2O溶液(20mL)を添加し、混合物を15分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%のNaOHのH2O溶液(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで中性になるまで、脱イオンH2Oで洗浄した。CDN(化合物52、35mg、0.049mmol)を脱イオンH2O(8mL)に溶解し、カラムの上部に添加し、脱イオンH2Oで溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体としてナトリウム塩の形態を得た(30mg、純度91%)。塩の形態(30mg)を逆相分取HPLC(方法:カラム:Waters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30;条件:水(10mMのNH4HCO3)(A)-ACN(B)、B0で開始、B30で終了;勾配時間(分):7;100%Bの保持時間(分):1、流速(mL/分):25)より精製し、白色固体として生成物を得た(25mg)。生成物(25mg、純度97.07%)を、2回目の逆相分取HPLC(方法:カラム:Waters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30:条件:水(10mMのNH4HCO3)(A)-ACN(B)、B0で開始、B30で終了;勾配時間(分):7;100%Bの保持時間(分):1、流速(mL/分):25)より精製し、化合物52、アンモニウム塩を得て、これをイオン交換樹脂DOWEX 50W×8 200-400で処理し、白色固体として化合物52、ナトリウム塩を得た(16.1mg、65%)。1H NMR(400MHz、D2O)δ=8.01(s、1H)、7.93(s、1H)、7.85(s、1H)、6.37(br d、J=17.3Hz、1H)、5.83(d、J=9.0Hz、1H)、5.59(br d、J=3.5Hz、0.5H)、5.46(br d、J=3.5Hz、0.5H)、5.15~5.02(m、1H)、4.97(br d、J=4.5Hz、1H)、4.62~4.52(m、2H)、4.49(br s、1H)、4.29~4.19(m、3H)、4.10(br d、J=4.5Hz、1H)、3.43(s、3H);19F NMR(376.5MHz、D2O)-200.863;31P NMR(162MHz、D2O)-1.676;
ESI-MS:m/z=691.2[M+H]+。
DMF(50mL)中の5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチル-D-グアノシン[CAS番号103285-33-2](5.2g、7.76mmol)の溶液に、イミダゾール(2.38g、34.94mmol)及びTBSCl(3.51g、23.29mmol)を添加し、35℃で6時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液でクエンチし、DCMで抽出した。
合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~15%のMeOH)により精製し、化合物5aを得て、次ステップにてそのまま使用した。ESI-MS:m/z 784.4[M+H]+。
TFA(2mL、26.12mmol)及びEt3SiH(8mL、50.03mmol)を、DCM(160mL)中の上記の化合物5aの溶液に0℃で添加した。得られた混合物を0℃で30分撹拌した後、撹拌を室温で4時間継続した。反応溶液をNaHCO3水溶液でクエンチし、DCMで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物5bを得た(2.9g)。1H NMR。(400MHz、クロロホルム-d)δppm12.12(br s、1H)、8.36(br s、1H)、7.71(s、1H)、5.72(d、J=7.5Hz、1H)、5.41(br s、1H)、4.78(dd、J=7.5、5.1Hz、1H)、4.30(br s、1H)、3.98(dd、J=12.6、2.2Hz、1H)、3.84(d、J=5.1Hz、1H)、3.71(br s、1H)、3.54(s、3H)、2.68(spt、J=6.9Hz、1H)、1.28(d、J=6.8Hz、3H)、1.29(d、J=6.8Hz、3H)、0.81(s、9H)、~0、07(s、3H)、-0.29(s、3H);ESI-MS:m/z 482.1[M+H]+。
DMF(10mL)中の5c[CAS番号2241580-02-7](2g、5.02mmol)の溶液に、イミダゾール(1.02g、15.06mmol)及びTBSCl(1.51g、10.04mmol)を添加し、室温で2時間撹拌した。反応混合物をEtOACで希釈し、水で洗浄した。水層を、EtOACで抽出した。合わせた有機層を飽和NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~15%のMeOH)により精製し、黄色固体として化合物5dを得た(2.57g、収率100%)。ESI-MS:m/z 513.2[M+H]+。
EtOAc(150mL)中の化合物5d(1.285g、2.51mmol)の溶液を、10%Pd/C(2.95g)を触媒として使用し、大気圧下、室温で2時間水素添加した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。反応を同じ規模で繰り返し、両方の反応の粗生成物を合わせ、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物5eを得た)(1.69、収率69%)。ESI-MS:m/z 487.1[M+H]+。
DCM(40mL)中の化合物5e(1.05g、2.16mmol)の溶液に、4-ニトロフェノール(900mg、6.47mmol)、Et3N(1.79mL、12.95mmol)及び活性化モレキュラーシーブを添加し、室温で30分撹拌した。混合物を-78℃まで冷却した後、DCM(10mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(1.54g、6.47mmol)を添加し、撹拌を-78℃で2.5時間継続した。反応混合物を濾過し、NaHCO3水溶液で洗浄し、水性洗浄層をDCMで抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製し、白色固体として化合物5fを得た(1.24g、収率:83.5%)。ESI-MS:m/z 688.2[M+H]+。
活性化モレキュラーシーブを、乾燥THF(2mL)中の化合物5b(105mg、0.218mmol)及びスルファミン酸塩5f(180mg、0.262mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を、N2下、室温で1時間撹拌した。次に、DMAP(133mg、1.09mmol)を添加し、反応を開始し、反応混合物を室温で18時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、黄色固体として化合物5gを得た(157mg、収率:70%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm12.18(s、1H)、9.07(s、1H)、8.78(s、1H)、8.39(s、1H)、8.05(d、J=7.3Hz、2H)、7.66~7.59(m、1H)、7.58~7.49(m、3H)、7.19(br s.1H)、6.32(d、J=17.8Hz、1H)、5.60~5.42(m、2H)、5.60~5.42(m、1H)、4.80~4.63(m、2H)、4.49(dd、J=3.8、11.0Hz、1H)、4.36~4.27(m、2H)、4.17~4.02(m、2H)、3.80(dd、J=2.3、4.8Hz、1H)、3.51(s、3H)、2.75~2.63(m、1H)、1.33(d、J=6.8Hz、3H)、1.27(d、J=6.8Hz、3H)、0.91(s、9H)、0.77(s、9H)、0.89(s、3H)、0.91(s、3H)、~0.08(s、3H)、~0.28(s、3H)。ESI-MS:m/z 1030.5[M+H]+。
Et3N(2.62g、25.92mmol)及びトリエチルアミン三フッ化水素酸塩(6.28g、51.83mmol)を、ピリジン(10mL)中の化合物5g(890mg、0.864mmol)の溶液に添加し、得られた反応混合物を、N2下、室温で18時間撹拌した。混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、続いて分取逆相HPLC(固定相:Phenomenex Synergi Max-RP 10μm、250×50mm;移動相:水(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、白色固体として化合物5hを得た(397mg、収率:57%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.07(s、1H)、11.60(s、1H)、11.20(s、1H)、8.89(br d、J=9.0Hz、1H)、8.71(d、J=22.8Hz、2H)、8.14(s、1H)、8.05(d、J=7.3Hz、2H)、7.60~7.72(m、1H)、7.47~7.60(m、2H)、6.46(d、J=19.9Hz、1H)、5.84(d、J=5.7Hz、1H)、0.00(d、J=6.1Hz、1H)、5.66(dd、J=52.1、4.5Hz、1H)、5.22(br t、J=5.1Hz、1H)、4.50~4.69(m、2H)、4.22~4.42(m、3H)、4.05~4.16(m、1H)、3.93(t、J=4.1Hz、1H)、3.82(br dd、J=12.2、4.4Hz、1H)、3.54~3.68(m、1H)、3.42(s、3H)、2.75(spt、J=6.9Hz、1H)、1.12(d、J=6.9Hz、6H)、ESI-MS:m/z 802.3[M+H]+。
乾燥THF/MeCN(1:1、12mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物5h(200mg、0.25mmol)及び1H-テトラゾ-ル(1.82mL、MeCN中3~4%、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(75mg、0.25mmol)を一度に添加した。反応混合物を終夜振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(22.5+15mg、0.075+0.05mmol)を、2時間の時間間隔内で2つに分けて添加した後、振盪を90分間継続した。tBuOOH(68μL、デカン中5.5Mの溶液、0.37mmol)を添加し、反応混合物を30分間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。濾液を食塩水で洗浄し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物5iを得た(30mg、収率:13%)。ESI-MS:m/z 917.5[M+H]+。
上記の化合物5i(30mg、0.033mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(1mL)中で、変換完了まで室温で撹拌した(約2時間)。粗生成物を、減圧下での濃縮後に得て、MeCN中ですりつぶした。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、ふわふわした白色固体として化合物6、ナトリウム塩を得た(14mg、収率:60%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6、61℃)δppm10.39(br s、1H)、8.32(s、1H)、8.19(s、1H)、7.97(s、1H)、7.07(br s、2H)、6.31(br s、2H)、6.24(dd、J=15.7、2.7Hz、1H)、5.78(d、J=9.0Hz、1H)、5.44(br d、J=53.9Hz、1H)、5.11(td、J=9.3。4.0Hz、1H)、4.42~4.57(m、1H)、4.13~4.25(m、4H)、4.11(d、J=3.9Hz、1H)、3.90~4.03(m、1H)、3.79~3.88(m、1H)、3.53(s、3H);
31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm-1.45(s、1P);ESI-MS:m/z 690.3[M+H]+。
化合物3h(1.0g、2.61mmol)を、無水トルエン:CH3CN(体積:体積=1:1、6mL×2)と共蒸発させ、次に無水DMF(18.8mL)に溶解した。次いでこれに、トリフェニルホスフィン(1.02g、3.91mmol)、NaN3(0.63g、9.73mmol)、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(192.7mg、0.52mmol)及びCBr4(1.3g、3.91mmol)を室温で添加した。反応物を室温で12時間撹拌した後、反応物を食塩水(10mL)でクエンチし、EtOAc(20mL)で分液した。飽和NaHCO3水溶液(20mL)を混合物に添加し、続いてEtOAcで抽出した(20mL×3)。次いで有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc:石油エーテル=0~100%、続いてMeOH:DCM=0~5%)により精製し、黄色粉末として化合物6aを得た。ESI-MS:m/z 408.9[M+H]+。
DCM(16mL)中の6a(1.24g、3.04mmol)の溶液に、2,4,6-コリジン(1.4g、11.56mmol)、AgNO3(1.96g、11.56mmol)、及びDMTrCl(1.54g、4.56mmol)を15℃で添加した。15℃で5時間撹拌した後、反応混合物をMeOH(20mL)でクエンチし、DCM(40mL)で希釈した。有機層を引き続いて食塩水(20mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc:石油エーテル=0~100%)により精製し、白色固体として6bを得た(1.99g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ7.17~7.00(m、6H)、6.93(s、4H)、6.73~6.49(m、4H)、5.28(s、2H)、4.10(d、J=7.3Hz、3H)、3.79~3.56(m、5H)、3.47(br d、J=4.6Hz、1H)、3.37~3.11(m、2H)、2.94(s、1H)、2.87(s、1H)、2.61(s、6H)、2.31(s、3H)、2.03(s、1H)、1.72~1.56(m、5H)、1.53~1.35(m、2H)、1.24(t、J=7.2Hz、1H)、0.99(t、J=7.3Hz、3H)、ESI-MS:m/z 711.2[M+H]+。
EtOAc(100mL)中の6b(1.99mg、2.8mmol)の触媒としての10%Pd/C湿潤物(3.3g、2.8mmol)との懸濁液を、(15psiで)、室温(約15℃)で5時間水素添加した。触媒を濾別し、濾液を減圧下で蒸発させ、白色固体として粗6c(1.31g)を得て、これを更に精製することなく次ステップに直接使用した。
ESI-MS:m/z 685.2[M+H]+。
化合物6c(213mg、0.31mmol)を、無水トルエン:CH3CN(体積:体積=1:1、3×2mL)と共蒸発させ、無水DCM(8mL)に溶解した。次いでこれに、N2下、4-ニトロフェノール(129.8mg、0.93mmol)、Et3N(188.8mg、1.86mmol)及び活性化4Åモレキュラーシーブ(約3g)を室温(約10℃)で添加し;混合物を-78℃まで冷却し、続いてN2下、4-ニトロフェニルクロロサルフェート3n(221.74mg、0.93mmol)を-78℃で速やかに添加した。-78℃で3時間撹拌した後、反応混合物をDCM(30mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過した。濾液を、DCM/飽和NaHCO3水溶液(30/45mL)で分液し、水層をDCMで抽出した(15mL×3)。有機層を合わせ、引き続いて食塩水(20mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EtOAc:石油エーテル=0~90%)により精製し、黄色固体として6dを得た(142mg)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ9.25~9.05(m、2H)、8.35~8.26(m、1H)、8.05~7.94(m、4H)、7.76~7.64(m、1H)、7.58(br t、J6.7Hz、1H)、7.50(t、J=7.5Hz、2H)、7.38~7.27(m、4H)、7.24(s、1H)、7.20~7.10(m、7H)、6.65(br d、J=8.8Hz、2H)、6.62(br d、J=7.9Hz、2H)、5.86(s、1H)、4.53(s、1H)、4.41(d.J=7.6Hz、1H)、4.09(q、J=7.3Hz、2H)。4.02~3.93(m、2H)、3.79(br d、J=12.5Hz、1H)、3.71(s、3H)、3.70(s、3H)、2.88(s、1H)、2.01(s、3H)、1.22(t、J=7.2Hz、3H)。ESI-MS:m/z 886.2[M+H]+。
化合物6dを、使用前に無水トルエン:CH3CN(1:1、6mL×2)と共蒸発させた。乾燥THF(20mL)中の6d(699mg、0.79mmol)、6e(739.81mg、1.1mmol、CAS番号103285-33-2)及び活性化4Åモレキュラーシーブ(約5g)の混合物を、N2下、室温で1時間撹拌した。DMAP(481.97mg、3.94mmol)を一度に添加し、反応混合物をN2下、40℃(油温度)で5時間撹拌した。反応混合物をDCM(15mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、黄色の残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH:DCM=0~10%)により精製し、淡い黄色固体として6fを得た(969mg)。ESI-MS:m/z 1416.2[M+H]+。
DCA(DCM中6%、10.8mL)をN2下、DCM(22mL)中の化合物6f(1.1g、0.78mmol)の溶液に添加し、得られた赤色の溶液を室温で30分撹拌し、次いで、ピリジン(12mL)でクエンチした。透明な反応混合物を減圧下で濃縮し、無色の残分を得て、これをシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH:DCM=0~10%)により精製し、白色固体として化合物6gを得た(740mg)。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ8.67(s、1H)、8.40(s、1H)、8.14~8.09(m、3H)、7.71~7.65(m、1H)、7.62~7.56(m、2H)、6.19(d、J=5.3Hz、1H)、6.03(s、1H)、5.53(t、J=5.4Hz、1H)、4.84(br s、1H)、4.48(s、1H)、4.43(s、1H)、4.32(t、J=4.8Hz、1H)、4.14(br d、J=3.8Hz、1H)、3.99(d、J=8.0Hz、1H)、3.83~3.77(m、1H)、3.73~3.66(m、2H)、3.60(s、3H)、3.54(d、J=13.3Hz、1H)、3.30~3.23(m、2H)、2.67(td、J=6.7、13.7Hz、1H)、1.17(dd、J=2.4、6.9Hz、6H)。ESI-MS:m/z 812.2[M+H]+。
化合物6g(105mg、0.129mmol)を、無水トルエン:アセトニトリル(1:1、体積/体積、3×30mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(12mL)に溶解し、4Åモレキュラーシーブ粉末(0.3g)及びCH3CN中0.45Mのテトラゾール(2.3mL、1.03mmol)を添加し、得られた不均一混合物をアルゴンで4分間バブリングした。この混合物を室温で10分撹拌した後、CH3CN中の2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイトの溶液(59mg、0.19mmol、3.0mLのCH3CN)を、室温で30分かけて添加した。反応物を1.5時間撹拌した後、混合物を濾別し、次いで、THF(15mL)で洗浄した。(化合物6h。MS:m/z 911[M+H]+)。得られた混合物を、次ステップにて直接使用した。0.5Mのヨウ素溶液(THF:水:Py、8:1:1、体積/体積/体積中)を、色が持続するまで添加した。反応混合物を室温で30分撹拌した後、混合物をEtOAc(30mL)で希釈し、過剰なヨウ素を飽和Na2S2O3水溶液で(変色するまで)クエンチした。層を分離し;有機層を飽和NaHCO3水溶液(1×20mL)及び食塩水(1×20mL)で洗浄した。水層をEtOAcで逆抽出した(1×20mL)。合わせた有機層を蒸発乾固させ、得られた粗物質をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中のMeOH:0~15%、体積/体積)により精製し、化合物6iを得た(75mg)。ESI-MS:m/z 927[M+H]+。
MeNH2(EtOH中33%、6mL)中の化合物6i(75mg、0.08mmol)の溶液を、40℃で2時間30分撹拌し、減圧下で濃縮した。
得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾別し、逆相分取HPLC(カラム:Synergi 4μ、Hydro RP、250mm×30mm×10μM、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;勾配:30分間の0~40%のB、流速:24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物9を得た(18.2mg)。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、化合物9、ナトリウム塩を得た(17.3mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δ7.96(s、1H)、7.72(s、1H)、7.12(s、1H)、5.90~6.12(m、3H)、4.97(s、1H)、4.79(s、1H)、4.60(m、1H)、4.41(t、J=5.6Hz、1H)、4.25(d、J=4.0Hz、1H)、4.05(d、J=8.0Hz、1H)、3.90~4.01(m、1H)、3.85(d、J=8.0Hz、1H)、3.55(d、J=12.8Hz、1H)、3.41(s、3H)、3.31(d.J=12.8Hz)。31P NMR(162MHz、D2O)、δ-1.46(s、1P)。ESI-MS:m/z 698[M+1]+。
化合物1g(80mg、0.099mmol)を、無水トルエン:アセトニトリル(1:1、体積/体積、3×15mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(10mL)に溶解した。4Åモレキュラーシーブ粉末(0.3g)及びCH3CN中0.45Mのテトラゾール(1.3mL、0.598mmol)を添加し、得られた不均一混合物をアルゴンで4分間バブリングした。この混合物を室温で10分撹拌した後、CH3CN中の2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイトの溶液(48mg、0.16mmol、3.0mLのCH3CN)を、室温で30分かけて添加した。反応物を1.5時間撹拌した後、混合物を濾別し、THF(15mL)で洗浄した。(化合物7a。MS:m/z 901[M+H]+)。得られた混合物を、次ステップに直接使用した。
ボランジメチルスルフィド複合体溶液(THF中2.0M、BH3-DMS、180μL、0.35mmol)を。0℃で5分かけて非常にゆっくり添加した。反応物を室温で20分撹拌した後、反応混合物を素早く濾別し、EtOAc(50mL)で希釈し、水(20mL)でクエンチした。層を分離し;有機層を水(1×20mL)及び食塩水(1×20mL)で洗浄し;水層をEtOAcで逆抽出した(1×20mL)。次いで有機層を合わせ、蒸発乾固させた。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~15%のMeOH、体積/体積)により精製し、7bを得た(48mg)。ESI-MS:m/z 915[M+H]+。
MeNH2(EtOH中33%、6mL)中の化合物7b(48mg)の溶液を、40℃で2時間撹拌し、減圧下で濃縮した。得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾別し、逆相分取HOPC(カラム:Synergi 4μm、Hydro RP、250mm×4.6mm、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート、緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート、勾配:30分間の0~40%のB、流速24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物14を得た(20.2mg)。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、化合物(*R)14A、ナトリウム塩を得た(18.8mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δ7.92(s、1H)、7.81(s、1H)、7.08(s、1H)、6.17~6.24(d、J=20.8Hz、1H)、5.95(d、J=7.2Hz、1H)、5.45(s、1H)、5.29(s、0.5H)、5.16(s、0.5H)、4.70~4.85(m、1H)、4.49(s、1H)、4.33(d、J=8Hz、1H)、4.27(s、1H)、4.05~4.15(m、1H)、3.96(d、J=10.8Hz、1H)、3.64(d、J=12.4Hz、1H)、3.44(s、1H)、3.30~3.44(m、2H)、0.3(br.s、3H);31P NMR(162MHz、D2O)δ95.57ppm(s、1P)、19F NMR(379MHz、D2O)δブロードピーク-196.84ppm(s、1F);ES-MS:m/z 686.8[M+H]+。
NaH(鉱油中60%、4.864g、121.61mmol)を、DMF(800mL)中のアデノシン8a(25g、93.549mmol)の溶液に、-5℃で添加した。混合物を-5℃で1.5時間撹拌した後、DMF(50mL)中の4-メトキシベンジルクロリド(15.15g、112.26mmol)の溶液を2時間かけて滴下した。添加が完了した後、反応物を室温まで加温し、18時間撹拌した。水(15mL)を反応物に添加し、混合物を15℃で10分撹拌した。得られた混合物を他の反応物と合わせ、DMFを高真空下で蒸発させた。懸濁液をMeOHで希釈し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=100:0~20:1)により精製し、8b及び8cを得て、混合物を逆相分取HPLC(カラム:Phenomenex Synergi Max-RP、250×50mm×10μm;条件:水-MeCN、B2%で開始、B36%で終了;勾配時間:18分;100%Bの保持時間:14分;流速:100mL/分)により分離し、両方とも白色固体として8b(75g)及び8c(15.5g)を得た(全体収率66%)。
化合物8b。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.31(s、1H)、8.09(s、1H)、7.36(s、2H)、7.06(d、J=8.4Hz、2H)、6.72(d、J=8.8Hz、2H)、6.03(d、J=6.4Hz、1H)、5.51(dd.J=4.4、7.2Hz、1H)、5.32(d、J=4.8Hz、1H)、4.71~4.46(m、2H)、4.43~4.30(m、2H)、4.03(br d、J=2.8Hz、1H)、3.74~3.61(m、4H)、3.61~3.49(m、1H)、ESI-MS:m/z=388.1[M+H]+。
化合物8c:1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.35(s、1H)、8.13(s、1H)、7.49~7.30(m、4H)、6.93(d.J=8.4Hz、2H)、5.92(d.J=6.4Hz、1H)、5.57(d、J=6.4Hz、1H)、5.51(dd、J=4.4、7.3Hz、1H)、5.64~5.40(m、1H)、5.56~5.37(m、1H)、4.89~4.73(m、1H)、4.72~4.62(m、1H)、4.62~4.49(m、1H)、4.60~4.48(m、1H)、4.15~.3.98(m、2H)、3.75(s、3H)、3.70~3.60(m、1H)、3.53(ddd、J=3.6、7.6、11、8Hz、1H);ESI-MS:m/z 388.1[M+H]+。
ピリジン(200mL)中の化合物8e(10g、25.81mmol)の溶液に、クロロトリメチルシラン(14.74mL、116.162mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を2時間撹拌した後、0℃まで冷却し、ベンゾイルクロリド(6mL)を0℃で30分かけて滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、水(30mL)で、0℃で注意深くクエンチし、次いで、アンモニア水溶液(60mL)を0℃で滴下した。混合物を1.5時間撹拌した後、反応物をDCM(800mL)で希釈した。有機層を引き続いて食塩水(200mL×3)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をEtOAc(100mL)からすりつぶし、白色固体として化合物8dを得た(9.8g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.21(s、1H)、8.72(d、J=13.2Hz、2H)、8.06~7.89(m、2H)、7.71~7.58(m、1H)、7.57~7.46(m、2H)、7.31(d、J=8.8Hz、2H)、6.90(d、J=8.8Hz、2H)、6.05(d、J=6.0Hz、1H)、5.67(d、J=6.4Hz、1H)、5.18(t、J=5.6Hz、1H)、4.91~4.76(m、1H)、4.73~4.59(m、1H)、4.53(d、J=11.6Hz、1H)、4.17~4.04(m、2H)、3.72(s、3H)、3.66(td、J=4.4、12.0Hz、1H)、3.53(ddd、J=3.6、6.0、12.0Hz、1H);ESI-MS:m/z 388.1[M+H]+。
DMF(90mL)中の化合物8d(7g、14.24mmol)、トリフェニルホスフィン(5.6g、21.36mmol)、TBAI(1.05g、2.85mmol)及びNaN3(6.67g、102.54mmol)の撹拌懸濁液に、CBR4(7.085g、21.363mmol)を0℃で小分けして添加し、黄色の懸濁液を得た。35℃で撹拌した後、混合物を撹拌条件下で、飽和NaHCO3水溶液(500mL)に注いだ。混合物をDCMで抽出した(200mL×3)。次いで有機層を合わせ、引き続いて無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、白色固体として8eを得た(6.4g)。ESI-MS:m/z=517.2[M+H]+。
ピリジン(100mL)中の8e(6.0g、11.61mmol、使用前にピリジンと2回共蒸発させた)の溶液に、DMTrCl(7.87g、23.23mmol)を添加した。反応混合物を80℃で終夜撹拌した後、これをEA(800mL)で希釈し、飽和NaHCO3水溶液(200mL×2)及び食塩水(200mL×2)で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル/EtOAc)により精製し、黄色固体として8fを得た(6.8g)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.21(s、1H)、8.64(s、1H)、8.55(s、1H)、8.58~8.45(m、1H)、8.04(d、J=7.2Hz、2H)、7.74~7.59(m、1H)、7.58~7.47(m、2H)、7.28(d、J=8.8Hz、2H)、7.22(dd、J=2.8、6.8Hz、2H)、7.15~7.07(m、5H)、6.98(d、J=8.8Hz、2H)、6.91(d、J=8.8Hz、2H)、6.72(d、J=8.8Hz、2H)、6.60(d、J=8.8Hz、2H)、6.27(d、J=7.6Hz、1H)、5.24(dd、J=4.4、7.6Hz、1H)、4.30(d、J=10.4Hz、1H)、4.22(dd、J=4.8、7.8Hz、1H)、4.05~3.99(m、1H)、3.80~3.58(m、10H)、3.21(dd、J=4.8、12.8Hz、1H)、2.56(d、J=4.4Hz、1H);ESI-MS:m/z=819.4[M+H]+。
THF(80mL)中の8f(6.8g、8.3mmol)の混合物に、PPh3(3.27g、12.46mmol)を一度に添加し;混合物を、N2下、40℃で2時間撹拌し、続いて水(30mL)を添加し、次いで更に12時間、更に撹拌し、無色の溶液を得た。混合物を別のスケールアップ物と合わせた。揮発性物質の大部分を減圧下で除去し、残りの水層をDCM/水に分液した。層を回収し、DCMで抽出した(200mL×3)。次いで有機層を合わせ、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色固体として8gを得た(6.4g、全体収率89%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm8.74~8.65(m、1H)、8.54(s、1H)、8.13~8.01(m、2H)、7.74~7.63(m、1H)、7.62~7.51(m、2H)、7.31(d、J=8.8Hz、2H)、7.24(dd、J=3.2、6.4Hz、2H)、7.19~7.07(m、5H)、6.97(dd、J=8.8、18.0Hz、4H)、6.73(d、J=8.8Hz、2H)、6.62(d、J=9.2Hz、2H)、6.25(d、J=7.6Hz、1H)、5.16(dd、J=4.4、7.6Hz、1H)、4.30(d、J=10.8Hz、1H)、4.16~4.04(m、2H)、4.01~3.95(m、1H)、3.84~3.59(m、9H)、2.72(d、J=4.8Hz、1H)、2.67~2.58(m、1H)、2.67~2.58(m、1H);ESI-MS:m/z=794.4[M+H]+。
乾燥DCM(5mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(5.57g、23.46mmol)の溶液を、N2下、乾燥DCM(20mL)中の8g(6.2g、7.82mmol)、4-ニトロフェノール(3.26g、23.46mmol)、Et3N(4.75g、46.92mmol)の混合物に、-78℃で速やかに添加し、次いで、室温まで1.5時間かけて加温した。混合物を分液漏斗に移し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(200mL×4)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製し、白色固体として8hを得た(6.2g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.32(br s、1H)、9.29(br t、J=5.6Hz、1H)、8.72(s、1H)、8.33~8.24(m、2H)、8.13(s、1H)、8.07(d、J=7.2Hz、2H)、7.72~7.63(m、1H)、7.60~7.46(m、4H)、7.31(d、J=8.4Hz、2H)、7.27~7.19(m、2H)、7.18~7.06(m、5H)、6.95(d、J=8.0Hz、4H)、6.73(d、J=9.2Hz、2H)、6.60(d、J=9.2Hz、2H)、6.30(d、J=7.8Hz、1H)、5.11(dd、J=4.8、7.8Hz、1H)、4.39~4.22(m、2H)、4.10~3.93(m、2H)、3.83~3.59(m、10H)、2.84(d、J=4.8Hz、1H)。ESI-MS:m/z=994.2[M+H]+。
乾燥THF(20mL)中の39h(1.3g、1.92mmol)、8h(2.48g、2.5mmol)及びモレキュラーシーブ(1.5g)の懸濁液を、N2下、室温で30分撹拌し、続いてDMAP(0.94g、7.7mmol)を添加した。N2下、45℃で終夜撹拌した後、反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、黄色の残分を得て;これをDCM(300mL)に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(100mL×3)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:PE中の0~70%のEtOAc)により精製し、白色固体として8jを得た(2.7g)、ESI-MS:m/z=766.2[M+H]+。
DCM(80mL)中の8j(2.7g、1.76mmol)の混合物に、水(318mg、17.64mmol)及びDCA(335mg、4.06mmol)を添加し、黄色の溶液を得た。混合物を室温で1.5時間撹拌した後、これにMEOH(2mL)を添加し、続いてピリジン(558.1mg)を添加し、無色の溶液を得て、これを15分間更に撹拌した。溶媒を減圧下で濃縮し、残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物8kを得た(1.28g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.26(br d、J=10.8Hz、2H)、9.02~8.50(m、5H)、8.05(d、J=7.6Hz、4H)、7.79~7.62(m、2H)、7.61~7.48(m、4H)、7.36(d、J=8.4Hz、2H)、6.93(d、J=8.4Hz、2H)、6.50(dd、J=2.4、16.8Hz、1H)、6.09(d、J=5.6Hz、1H)、5.99~5.83(m、1H)、5.79(br d、J=6.4Hz、1H)、5.53~5.27(m、2H)、5.11~4.93(m、1H)、4.79~4.53(m、2H)、4.42~4.29(m、1H)、4.27~4.03(m、2H)、3.89~3.71(m、4H)、3.68~3.56(m、1H)、3.55~3.38(m、2H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δ202.67(s、1F);ESI-MS:m/z=926.3[M+H]+。
THFをナトリウム/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
THF(6mL)中の8k(200mg、0.21mmol)の溶液に、4Åモレキュラーシーブ(800mg、粉末)を添加し、1H-テトラゾールの溶液(乾燥CH3CN 30mL中の4.8mL、0.45M、945mgのテトラゾール(凍結乾燥により乾燥)、続いて4ÅMS(1g、粉末)を添加し、N2下、使用前に1時間撹拌したもの)を添加した。フラスコをN2でパージした後。THF(0.8mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(117mg、0.39mmol)の溶液を、シリンジを通して25分かけて滴下して;反応混合物を室温で1.5時間撹拌した後、TBHP(0.34mL、1.73mmol、5M)の溶液を添加し、反応混合物を更に30分間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:MeOH中の0~5%のDCM)により精製し、白色固体として8lを得た(153mg、0.14mmol)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ9.85(br s、1H)、9.79~9.72(m、1H).8.89(s、1H)、8.87~8.84(m、1H)、8.64~8.59(m、1H)、8.20~8.14(m、1H)、8.10~8.04(m、4H)、8.02~7.95(m、3H)、7.65~7.56(m、3H)、7.55~7.45(m、6H)、6.05~5.94(m、1H)、4.81~4.71(m、2H)、4.66(br d、J=11.6Hz、1H)、4.52~4.47(m、1H)、4.36~4.21(m、4H)、4.01(br dd、J=4.4、8.8Hz、1H)、3.92~3.80(m、6H)、2.67(t、J=6.0Hz、1H)、2.43~2.28(m、2H);19F NMR(376MHz、CDCl3)δ-196.54~-197.10(m、1F);31P NMR(162MHz、CDCl3)δ-2.49(s、1P)、-4.38(s、1P);ESI-MS:m/z=780.2[M/2+H]+。
MeNH2/EtOH(5mL)中の8l(153mg、0.14mmol)の溶液を、室温で2時間撹拌した。揮発性物質を減圧下で蒸発させ、白色固体を水(20mL)に溶解し;水層を、DCMで洗浄した(10mL×3)。水層を凍結乾燥し、白色固体として114mgの8mを得た。
TFA(1.57mL、20.47mmol)中のアニソール(158mg、1.46mmol)の溶液を0℃まで冷却し、8m(114mg)に添加した。反応混合物を0℃で2.5時間撹拌した後、窒素ガス流を0℃で吹き込むことにより、TFAを除去した。反応混合物の残りをMeNH2(EtOH中33%の溶液、1.6mL)で、で、0℃でクエンチし、減圧下で蒸発乾固させた。残分を、DCM/水(15mL×3/15mL)に分液した。水層を凍結乾燥し、白色の残分を逆相分取HPLC(カラム:XBridge 150×30mm×10μm、条件:A:水(10mMのNH4HCO3)-ACN:MeCN、B5%で開始、B35%で終了;流速(mL/分):25)により更に精製し、白色固体として化合物41、アンモニウム塩を得た(45mg)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm10.63(br s、1H)、8.44~8.37(m、1H)、8.25(br s、1H)、8.04(br s、2H)、7.38~6.89(m、2H)、6.41(br d、J=19.6Hz、1H)、6.13(d、J=8.4Hz、1H)、6.01~5.83(m、1H)、5.60(br s.1H)、5.31(br s、1H)、4.45(br d.J=5.2Hz、1H)、4.28(br s、2H)、4.12~4.04(m、1H)、3.99(br d、J=11.2Hz、1H)、19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δ-198.36~-200.33(m、1F);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm-3.40(br s、1P);ESI-MS:m/z=659.9[M+H]+。
Dowex 50W×8,200-400(9mL、H形態)をビーカー(45mgの化合物41アンモニウム塩用)に添加し、脱イオン水(50mL)で洗浄した。次いで、樹脂に、15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(50mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%のH2SO4(少なくとも4CV[カラム体積])で洗浄し、次いで中性になるまで、脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液(20mL)を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで脱イオン水で中性になるまで洗浄し、化合物41アンモニウム塩(45mg)を最小量の脱イオン水に溶解し、カラムの上部に添加し、脱イオン水で溶出した。所望の画分を一緒に貯めて凍結乾燥し、白色固体として化合物41、ナトリウム塩を得た(31.4mg)。1H NMR(D2O、400MHz)δ8.06(s、1H)、8.00(s、1H)、7.62~7.87(m、1H)、7.28(br s、1H)、6.24(br d、J=12.8Hz、1H)、6.03(br d、J=8.0Hz、1H)、5.49~5.74(m、1H)、5.22~5.31(m、1H)、5.11(br d、J=16.4Hz、1H)、4.53(br s、1H)、4.44(br d、J=4.4Hz、1H)、4.39(br s、1H)、4.34(br d、J=10.4Hz、1H)、3.98(br δ、J=8.8Hz、1H)、3.71~3.79(m、1H)、3.60~3.70(m、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δ-201.23(br s、1F)、31P NMR(162MHz、D2O)δ-2.76(br s、1P);ESI-MS:m/z=660.1[M+H]+。
乾燥ピリジン(160mL)中の化合物9a(8.3g、27.27mmol、CAS番号2086765-82-2)の0℃の溶液に、クロロトリメチルシラン(14.8g、136.36mmol)を0℃で1.5時間かけて滴下した。ベンゾイルクロリド(19.2g、136.36mmol)を滴下し、撹拌を室温で3時間継続した。反応溶液を氷浴にて冷却し、水(50mL)の添加によりクエンチし、室温で終夜撹拌した。アンモニア水溶液(70mL、25%溶液)を添加し、撹拌を更に1時間継続した。反応溶液をEtOAcで抽出し、合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~90%のEtOAc)により行い、黄色固体として化合物9bを得た(9.1g、収率:80%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.11(s、1H)、8.60(s、1H)、8.07(d、J=7.3Hz、2H)、7.69(d、J=3.8Hz、1H)、7.66~7.61(m、1H)、7.57~7.51(m、2H)、6.68(d、J=3.5Hz、1H)、5.13(td、J=6.3、12.0Hz、1H)、4.92(t、J=6.8Hz、1H)、4.80(t、J=5.3Hz、1H)、4.55(dd、J=4.4、7.2Hz、1H)、3.59~3.46(m、2H)、2.32~2.20(m、2H)、2.16~2.03(m、1H)、1.49(s、3H)、1.23(s、3H);
ESI-MS:m/z 409.1[M+H]+。
DMAP(448mg、3.76mmol)及びトシルクロリド(2.80g、14.69mmol)を、DCM(60mL)中の化合物9b(3.0g、7.35mmol)及びEt3N(2.33mg、22.04mmol)の溶液に氷冷下で添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、DCMで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、トシル化化合物を得た。粗生成物をDMF(30mL)に溶解し、アジ化ナトリウム(2.34g、36.00mmol)を添加し、得られた反応混合物を30℃で終夜撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、飽和Na2CO3水溶液で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層を分離し、食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中に0~40%のEtOAc)により精製し、化合物9cを得た(2.1g、収率:62%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.13(s、1H)、8.60(s、1H)、8.10~8.03(m、2H)、7.69(d、J=3.8Hz、1H)、7.67~7.61(m、1H)、7.57~7.51(m、2H)、6.69(d、J=3.8Hz、1H)、5.16(td、J=6.3.12.0Hz、1H)、4.99~4.89(m、1H)、4.55(dd、J=5.1、7.2Hz、1H)、3.63~3.46(m、2H)、2.41~2.27(m、2H)、2.20~2.07(m、1H)、1.50(s、3H)、1.24(s、3H);ESI-MS:m/z 434.1[M+H]+。
TFA(40mL)を、DCM(100mL)中の化合物9c(5.4g、12.46mmol)の溶液に添加した。反応混合物を、室温で終夜撹拌した。減圧下での濃縮後に得られた残分を、MeOH(20mL)に再溶解し、続いて飽和K2CO3水溶液(40mL)を添加した。得られた混合物を20分間撹拌した後、DCMで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、化合物9dを得て、これを次ステップにてそのまま使用した。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.08(s、1H)、8.57(s、1H)、8.07(br d、J=7.5Hz、2H)、7.67~7.61(m、2H)、7.57~7.51(m、2H)、6.66(d、J=3.5Hz、1H)、5.10~5.01(m、1H)、4.97(d、J=6.5Hz、1H)、4.89(d、J=4.8Hz、1H)、4.27(td、J=6.1、8.1Hz、1H)、3.84~3.80(m、1H)、3.60~3.48(m、2H)、2.34~2.25(m、1H)、2.23~2.12(m、1H)、1.67~1.55(m、1H);ESI-MS:m/z 394.0[M+H]+。
上記の化合物9dをDCM(90mL)に溶解し、続いてイミダゾール(2.42g、35.52mmol)及びTBSCl(2.68g、17.76mmol)を添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、水に注ぎ、DCMで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、9e及びその3’-位置異性体を得た。分離を、分取逆相HPLC(固定相:Phenomenex Synergi 10μm Max-RP、250×50mm;移動相:水(A)-MeCN(B);勾配溶出)により行い、最初の溶出異性体として化合物9eを得た(2.3g、収率:9cからで50%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.05(br s、1H)、8.56(s、1H)、8.07(d、J=7.8Hz、2H)、7.60~7.68(m、2H)、7.47~7.59(m、2H)、6.68(d、J=3.5Hz、1H)、5.10~5.23(m、1H)、4.63(d、J=5.5Hz、1H)、4.37(dd、J=8.0、5.8Hz、1H)、3.74~3.84(m、1H)、3.48~3.62(m、2H)、2.10~2.30(m、2H)、1.66~1.85(m、1H)、0.64(s、9H)、~0.16(s、3H)、~0.37(s、3H);ESI-MS:m/z 508.1[M+H]+。
DMTrCl(3.87g、11.43mmol)、AgNO3(4.85g、28.56mmol)及び2,4,6-コリジン(3.46g、28.56mmol)を、DCM(50mL)中の化合物9e(2.9g、5.71mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を35℃で終夜撹拌した。反応溶液を濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中0~20%のEtOAc)により精製し、続いて分取逆相HPLC(固定相:Phenomenex Synergi Max-RP、10μm、250×50mm、移動相:0.1%TEA水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物9fを得た(3.6g、収率78%)。
1H NMR。(400MHz、DMSO-d6)δppm11.04(s、1H)、8.59(s、1H)、8.08(d、J=7.4Hz、2H)、7.66(d、J=3.5Hz、1H)、7.61~7.65(m、1H)、7.55(q、J=7.3Hz、4H)、7.40(t、J=8.6Hz、4H)、7.27~7.35(m、2H)、7.18~7.26(m、1H)、6.85~6.96(m、4H)、6.68(d、J=3.5Hz、1H)、5.50(q、J=9.1Hz、1H)、4.42(dd、J=9.1、4.1Hz、1H)、3.74(s、3H)、3.73(s、3H)、3.64(br d、J=3.9Hz、1H)、3.27~3.37(m、1H)、3.20(dd、J=12.3、5.5Hz、1H)、2.26~2.37(m、1H)、1.71~1.84(m、1H)、1.59~1.71(m、1H)、0.60~0.78(m、9H)、~0.27~-0.18(m、3H)、~0.59~-0.51(m、3H);ESI-MS:m/z 810.1[M+H]+。
EtOAc(80mL)中の化合物9f(2.3g、2.84mmol)の溶液を、H2下(50psi)、Pd/C(炭素上10%、2.0g)の存在下、35℃で終夜撹拌した。触媒を、珪藻土で濾過することにより除去し、濾過ケークをEtOAcで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、化合物アミンを得て、これを次ステップにてそのまますぐ使用した。粗生成物をDCM(90mL)に溶解し、続いて4-ニトロフェノール(2.81g、20.21mmol)、Et3N(1.23g、12.12mmol)及び活性化モレキュラーシーブを添加した。得られた混合物を、N2下、-78℃まで冷却した後、DCM(10mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(2.88g、12.12mmol)を滴下し、反応溶液を室温まで温め、終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去した。濾液を、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~20%のEtOAc)により精製し、化合物9gを得た(1.4g、収率:80%(LCUV、純度:76%))。
ESI-MS:m/z 986.6[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(0.55g、4.47mmol)、乾燥THF(6mL)及び活性化3Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を、不活性雰囲気下、室温で2時間振盪した。同時に、各々乾燥THF(2×6mL)中の5’-O-(4’,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチル-D-グアノシン[103285-33-2]、(0.33g、0.46mmol)の溶液、及び化合物9g(1.16g、0.89mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約2時間)。両方の溶液5’-O-(4’,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-2’-O-メチル-D-グアノシン及び化合物9gのそれぞれ)を、引き続いて反応フラスコに移した。反応混合物を50℃で18時間撹拌した後、室温まで冷却し、DCMで希釈した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで徹底的にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物9hを得た(1.17g、収率:86%)。ESI-MS:m/z 1515.9[M+H]+。
DCM(20mL)中の化合物9h(1.13g、0.75mmol)の溶液を、水(67μL、3.73mmol)の存在下、DCA(250μL、2.98mmol)で2.5時間処理した。反応混合物をピリジン(360μL、4.47mmol)の添加によりクエンチした。得られた溶液の残分をそのまま、精製用のシリカでのカラム(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)にかけ、白色固体として化合物9iを得た(595mg、収率:87%)。
1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δppm12.01(br s、1H)、9.70(br s、1H)、8.71(br s、1H)、8.53(s、1H)、8.02~8.07(m、2H)、7.87(s、1H)、7.57~7.63(m、1H)、7.49~7.57(m、2H)、7.13(d、J=3.7Hz、1H)、7.00(d、J=3.6Hz、1H)、6.12(d、J=4.0Hz、1H)、5.49(t、J=4.5Hz、1H)、4.74~4.83(m、2H)、4.39(br t、J=5.3Hz、1H)、4.12~4.27(m、1H)、4.04~4.10(m、1H)、3.97~4.04(m、1H)、3.74~3.82(m、1H)、3.57(s、3H)、3.37~3.46(m、1H)、3.17~3.26(m、1H)、2.65(spt、J=7.0Hz、1H)、2.45~2.54(m、1H)、2.39~2.49(m、1H)、1.96~2.03(m、1H)、1.17(d、J=6.6Hz、3H)、1.18(d、J=6.6Hz、3H)、0.75(s、9H)、-0.23(s、3H)、-0.44(s、3H);ESI-MS:m/z 911.6[M+H]+。
乾燥THF/MeCN(1:1、108mL、使用前に活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物9i(530mg、0.58mmol)の溶液を、不活性雰囲気下、活性化3Åモレキュラーシーブで処理(約2時間振盪)し、1H-テトラゾール(5.0mL、MeCN中3~4%、1.73mmol、使用前に活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥)を添加し、混合物を室温で1時間振盪した。次に、2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(180μL、0.58mmol)を一度に添加し、振盪を18時間継続した。最後に、2つの等しく分けたtBuOOH(2×120μL、デカン中5.5Mの溶液、2×0.63mmol)を、30分の時間間隔で添加した後、反応混合物を更に2時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMですすいだ。濾液を、飽和Na2S2O3水溶液、飽和NaHCO3水溶液及び食塩水の混合物で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物9jを得た(130mg、収率:21%)。1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δppm-0.04ppm(br s、3H)0.11(s、3H)0.85(s、9H)0.93(br d、J=6.9Hz、3H)1.10(d、J=6.9Hz、3H)2.42~2.52(m、1H)2.52~2、69(m、2H)2.89(td、J=5.9、2.8Hz、2H)2.93(br d、J=5.7Hz、1H)3.37~3.50(m、1H)3.56~3.67(m、4H)4.35(d、J=2.8Hz、1H)4.37~4.48(m、4H)4.53(dt、J=5.3、3.7Hz、1H)4.80(br s、1H)4.99(ddd、J=11.0、5.3、3.7Hz、1H)5.27~5.32(m、1H)5.95~6.02(m、2H)7.03(d、J=3.7Hz、1H)7.12(d、J=3.7Hz、1H)7.52~7.58(m、2H)7.58~7.65(m、1H)7.59~7.67(m、1H)8.04(s、1H)8.12(d、J=7.3Hz、2H)8.93(br s、1H)9.10(br s、1H)10.66(br s、1H)12.10(br s、1H);31P NMR(162MHz、クロロホルム-d)δppm-3.52(s、1P);ESI-MS:m/z 1026.6[M+H]+。
化合物9j(118mg、0.11mmol)を、エタノール(5.9mL)中33%のメチルアミン溶液中で、変換完了まで40℃で撹拌(約3時間)した後、反応溶液を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。残分をピリジン(6mL)に溶解し、続いてEt3N(460μL、3.31mmol)及びトリエチルアミン三フッ化水素酸塩(280μL、1.66mmol)を添加した。反応混合物を45℃で18時間撹拌し、イソプロポキシトリメチルシラン(1.17mL、6.62mmol)を添加し、撹拌を室温で2時間継続した。減圧下での濃縮後に得られた残分を、無水アセトニトリル中ですりつぶし、得られた沈殿物を、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、10μm、150×50mm、移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により更に精製し、化合物8を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、ふわふわした白色固体として化合物8、ナトリウム塩を得た(32mg、収率:41%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm10.31(br s、1H)、8.04(s、1H)、7.94(s、1H)、7.76(br s、1H)、7.21(d、J=3.3Hz、1H)、6.74(d、J=3.1Hz、1H)、6.48~6.60(m、5H)、6.02(d、J=8.4Hz、1H)、5.92(dd、J=8.4、4.3Hz、1H)、4.80~4.93(m、1H)、4.63(br s、1H)、4.34~4.43(m、1H)、4.30(d、J=3.8Hz、2H)、4.18(dd、J=12.2、3.6Hz、1H)、4.08(dd、J=12.5、2.8Hz、1H)、3.50(s、3H)、3.16(br d、J=6.1Hz、2H)、2.25~2.37(m、2H)、1.45~1.57(m、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm 1.42(s、1P);ESI-MS:m/z 685.3[M+H]+。
DMF(6mL)中の化合物10a(0.8g、2.15mmol)の溶液に、イミダゾール(439.98mg、6.46mmol)及びTBSCl(616.94mg、4.09mmol)を添加した。室温で1.5時間撹拌した後、混合物を別のバッチとともにし、EA(800mL)で希釈した。有機層を引き続いて、飽和NaHCO3水溶液(200mL×2)及び食塩水(200mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE中の0~70%のEAで溶出)により精製し、白色固体として化合物10bを得た(5.5g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.44(br s、1H)、8.66(br s、1H)、8.17~7.92(m、2H)、7.85(br s、1H)、7.69~7.59(m、1H)7.57~7.33(m、2H)、5.44~5.09(m、2H)、5.02(br d、J=5.4Hz、1H)、4.30(br s、1H)4.01(br d、J=4.0Hz、1H)、3.87(br d、J=3.6Hz、1H)、3.80~3.61(m、2H)、0.84(s、9H)、0.01(d、J=4.4Hz、6H)、ESI-MS:m/z=486.2[M+H]+。
化合物10bを、使用前にピリジン(10mL)と2回共蒸発させた。ピリジン(15mL)中の化合物10b(1.7g、0.88mmol)の溶液に、DMTrCl(41.78g、5.25mmol)を添加した。室温で2時間撹拌した後、混合物を別のバッチと合わせ、EtOAc(500mL)で希釈した。有機層を引き続いて、飽和NaHCO3水溶液(150mL×2)及び食塩水(150mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE中の0~70%のEtOAcで溶出)により精製し、化合物10c1及び10c2の混合物を得た(3.9g)。ESI-MS:m/z=788.4[M+H]+。
DMF(25mL)中の化合物10c1及び10c2(2.5g、3.17mmol)の溶液に、NaH(鉱油中60%、482.3mg、12.05mmol)を0℃で添加した。混合物を0℃で1時間撹拌し、DMF(5mL)中の4-メトキシベンジルクロリド(745.31mg、4.76mmol)の溶液を10分かけて滴下した。室温で2時間撹拌した後、混合物を水(5mL)の滴下でクエンチし、EAで希釈した(500mLの有機層を引き続いて、飽和NaHCO3水溶液(150mL×2)、食塩水(150mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE中の0~40%のEAで溶出)により精製し、化合物10d1及び10d2の混合物を得た(1.9g)。ESI-MS:m/z=908.4[M+H]+。
DCM(30mL)中の10c1及び10c2(1.9g、2.09mmol)の溶液を、水(0.38mL、20.92mmol)及びDCA(0.69mL、8.37mmol)で処理した。得られた黄色の溶液を室温で2時間撹拌した。次いでこれを、MeOH(0.15mL)に添加し、続いてピリジン(662mg)を添加し、無色の溶液を得て、これを15分間更に撹拌した。混合物を減圧下で蒸発させ、残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し、黄色固体として化合物10e1及び10e2の混合物を得た(1.05g)。ESI-MS:m/z=606.1[M+H]+。
THF(12mL)中の化合物10e1及び10e2(1.2g、1.98mmol)の混合物を、TBAF(3mL、1M)で一度に処理した。混合物を室温で3時間撹拌し、飽和NaHCO3水溶液(150mL)でクエンチした。有機層を乾燥させ(無水Na2SO4)、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得て、これをシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中5%のMeOH)により精製し、化合物10f1及び10f2の混合物を得た。10f1及び10f2の混合物を別のバッチと合わせ、MeOHですりつぶし;MeOHから形成された沈殿物を;濾過及び少量の冷MeOHで洗浄した後、主純異性体化合物10f2(659mg)として同定し;母液を濃縮し、逆相分取逆相分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD 10μm C18 150×30:条件:水(10mMのNH4CO3)-ACN:MeCN、B25%で開始、B45%で終了;流速(mL/分)25)により精製し、各々白色固体として更なる化合物10f2(97mg)及び副生異性体化合物10f1(200mg)を得た。
化合物10f1:1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.51(s、1H)、8.03(br d、J=8.0Hz、2H)、7.81(s、1H)、7.67~7.63(m、1H)、7.57~7.53(m、2.H)、7.17(d、J=8.0Hz、2H)、6.80(d、J=8.0Hz、2.H)、5.28(d、J=8.0Hz、1H)、5.09(br d、J=4.0Hz、1H)、4.83(br t、J=4.0Hz、1H)、4.64(d、J=12Hz、1H)、4.47(d、J=12Hz、1H)、4.28(t、J=4.0Hz、1H)、4.20(q、J=4.0Hz、1H)、3.91(q、J=4.0Hz、1H)、3.70(s、3H)、3.61~3.58(m、1H)、3.51~3.47(m、1H)、ESI-MS:m/z=492.2[M+H]+。
化合物10f2:1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ8.61(br s、1H)、8.03(br d、J=8.0Hz、2H)、7.92(br s、H)、7.69~7.65(m、1H)、7.58~7.54(m、2H)、7.33(d、J=8.0Hz、2H)、6.92(d、J=8.0Hz、2H)、5.33(d、J=8.0Hz、1H)、5.21(br d、J=8.0Hz、1H)、4.87(t、J=8.0Hz、1H)、4.66(d、J=8.0Hz、1H)、4.57~4.49(m、2H)、4.01(q、J=4.0Hz、1H)、3.95(t、J=4.0Hz、1H)、3.75(s、3H)、3.60~3.55(m、1H)、3.50~3.45(m、1H);ESI-MS:m/z=492.3[M+H]+。
ピリジン(6mL)中のN-(7-((2S,3S,4S,5R)-3-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-4-((4-メトキシベンジル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)イミダゾ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-4-イル)ベンズアミド、化合物10f2(400mg、0.81mmol)の溶液に、DMTrCl(496mg、1.46mmol)を室温で添加した。室温で終夜撹拌した後、混合物を別の粗バッチと合わせ、DCM(50mL)で希釈した。有機層を引き続いて飽和NaHCO3水溶液(50mL×3)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%のEtOAc及びDCM中の0~10%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物10gを得た(450mg)。未反応化合物10f2(160mg)を白色固体として回収した。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.50(br s、1H)、8.67(br s、1H)、7.99(br d、J=6.0Hz、1H)、7.86(br s、1H)、7.65(br d、J=6.4Hz、1H)、7.54(br t、J=7.6Hz、2H)、7.29~7.35(m、2H)、7.23~7.29(m、2H)、7.17~7.23(m、7H)、6.83(td、J=6.0、3.2Hz、6H)、5.45(br d、J=4.8Hz、1H)、5.30(br s、1H)、4.63(br d、J=11.6Hz、1H)、4.43(br d、J=12.0Hz、1H)、4.12(br s、1H)、4.07(br s、1H)、3.72(s、9H)、3.20(br d、J=7.6Hz、1H)、3.01(br d、J=5.6Hz、1H);ESI-MS:m/z=794.2[M+H]+。
乾燥THF(6mL)中の化合物10g(450mg、0.56mmol)、スルファミン酸塩17a(744.735mg、0.850mmol)及び4ÅMS(1g)の撹拌懸濁液を、DMAP(277mg、2.27mmol)で、25℃で処理した。黄色の懸濁液を、N2下、45℃で18時間撹拌した後、反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、黄色の残分を得て;残分をDCM(100mL)に溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(100mL×4)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:PE中の0~100%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物10hを得た(604mg)。ESI-MS:m/z=766.8[M+H]+。
水(0.08mL)中の化合物10h(704mg、0.46mmol)の溶液及びDCM(15mL)を、DCA(118.6mg、0.92mmol)で、室温で4時間処理し、次いでピリジン(0.5mL)でクエンチした。室温で10分撹拌した後、混合物を真空下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:PE中の0~100%のEtOAc)により精製し、固体として化合物10iを得た(370mg)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ11.46(hrs、1H)、11.24(s、1H)、8.70(s、1H)、8.62(s、1H)、8.45(br t、J=4.0Hz、1H)、8.03(br t、J=8.0Hz、6H)、7.67~7.63(m、2H)、7.57~7.53(m、4H)、7.30(br d、J=8.0Hz、2H)、6.91(br d、J=8.0Hz、2H)、6.38~6.33(m、1H)、5.89(br d、J=8.0Hz、1H)、5.65(br s、1H)、5.51(br s、1H)、5.38(br s、1H)、4.95(br s、1H)、4.63~4.50(m、4H)、4.32(br t、J=4.0Hz、1H)、4.04~3.99(m、3H)、3.74(s、3H)、3.59(br d、J=12.0Hz、2H)、3.29~3、22(m、1H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6);δ-202.69(td、J=18.8、52.6Hz、1F);ESI-MS:m/z=926.5[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。THF(4mL)に溶解した化合物10i(220mg、0.24mmol、凍結簡素により乾燥)の溶液に、4ÅMS(粉末、800mg)及び1H-テトラゾールの溶液(5.28mL、0.45M、945mgのテトラゾール(凍結乾燥により乾燥)を乾燥CH3CN30mLに溶解し、続いて1gの4ÅMSを添加し、次いでN2下、使用前に1時間撹拌することにより調製)を添加した。容器のフラスコをN2で数回パージした。THF(2mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(129mg、0.43mmol)の溶液を、シリンジを通して20分かけて滴下した。室温で1.5時間撹拌した後、TBHP(0.38mL、1.9mmol、5M)の溶液を添加し、混合物を更に30分撹拌し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:MeOH中の0~10%のDCM、Rf==0.6)により精製し、白色固体として化合物10jを得た(308mg)。ESI-MS:m/z 1041.4[M+H]+。
化合物10j(308mg)をMeNH2/EtOH(2mL)で処理し、室温で2.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を逆相分取逆相分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30:条件:A:水(10mMのNH4CO3)-ACN:MeCN、B5%で開始、B35%で終了;流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物10kを得た(32mg)。
ESI-MS:m/z=780.3[M+H]+。
TEA(0.31mL、4.02mmol)中のアニソール(43.43mg、0.4mmol)の溶液を0℃まで冷却した。溶液を、化合物10k(32mg、0.04mmol)に添加した。混合物を0℃で2.5時間撹拌した後、窒素ガス流を0℃で吹き込むことにより、TFAの大部分を除去した。残りの反応混合物を、EtOH中33%のMeNH2の溶液(0.31mL)で、0℃でクエンチした。反応混合物を減圧下で蒸発させ、残分をDCM/水(30mL×3/15mL)に分液し、水層をDCMで洗浄した(30mL×2)。水層を凍結乾燥し、残分を得た。残分を、逆相分取逆相分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 5μm C18 150×30:条件:水(10mMのNH4HCO3)-ACN:MeCN、B5%で開始、B35%で終了;流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物48、アンモニウム塩を得た(19.2mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δ8.32(s、1H)、8.00(d、J=3.2Hz、2H)、7.49(s、1H)、6.57~6.50(m、1H)、5.81~5.75(m、1H)、5.73~5.65(m、2H)、5.54(br d、J=4.4Hz、1H)、5.39~5.27(m、1H)、4.80(d、J=4.2Hz、1H)、4.46(br s、1H)、4.42~4.34(m、1H)、4.24~4.17(m、1H)、3.82(br dd、J=3.2、13.4Hz、1H)、3.61(br d、J=13.2Hz、1H);19F NMR(376MHz、D2O)-197.15~197.29(m、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δ-1.83(s、1P);ESI-MS:m/z=660.1[M+H]+。
Dowex 50WX8 200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(25mL)で洗浄した。次いで樹脂に、15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(25mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物48、(アンモニウム塩)(19.2mg)を脱イオン水(2mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物48、ナトリウム塩を得た(16mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δ8.04(br s、1H)、7.73(s、1H)、7.56(s、1H)、6.83(br s、1H)、6.33~6.25(m、1H)、5.68~5.60(m、1H)、5.46(br d、J=9.6Hz、1H)、5.32(br d、J=4.0Hz、1H)、5.20(br d、J=4.4Hz、1H)、5.06~4.90(m、1B)、4.38(br d、J=9、2Hz、1H)、4.30(br s、1H)、4.17(br dd、J=6.0、10.4Hz、1H)、4.02(br d、J=11.6Hz、1H)、3.67(br d、J=12.8Hz、1H)、3.41(br d、J=13.2Hz、1H);31P NMR(162MHz、D2O)δ-2.02(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δ-196.74(br s、1F);ESI-MS:m/z=660.1[M+H]+。
TIPDSCl2(6.70g、21.23mmol)を、ピリジン(50mL)中のSM11、N-イソブチリルグアシン(5.0g、14.15mmol)の溶液に添加した。反応混合物を室温で12時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残分の生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、白色の泡状物として化合物11aを得た(5.5g、収率:65%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.12(s、1H)、11.76(s、1H)、8.05(s、1H)、5.79(s、1H)、5.71(d、J=4.9Hz、1H)、4.28~4.39(m、2H)、4.13(br dd、J=12.9、2.6Hz、1H)、4.00~4.07(m、1H)、3.94(br dd、J=12.9、2.7Hz、1H)、2.78(spt、J=6.8Hz、1H)、1.11(d、J=6.6Hz、6H)、0.93~1.08(m、28H);ESI-MS:m/z 596.2[M+H]+。
活性化モレキュラーシーブを、乾燥THF(60mL)中の化合物11a(1.28g、1.92mmol)及び化合物1e(1.0g、1.28mmol)の溶液に添加し;得られた混合物を、N2下、1時間撹拌した。次に、DMAP(783mL、6.41mmol)を添加し、反応を開始した。反応混合物を、50℃で終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMですすぎ、濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。水相をDCMで抽出した。合わせた有機層をNa2SCNで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。化合物11bを、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%のEtOAc、続いてDCM中の0~2%のMeOH)により精製した後、黄色固体として得た(520mg、収率:36%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.08(br s、1H)、11.56(br s、1H)、11.28(br s、1H)、8.70(s、1H)、8.61(s、1H)、8.54(br s、1H)、8.09(s、1H)、8.04(s、2H)、7.61~7.73(m、1H)、7.49~7.59(m、2H)、6.31~6.44(m、1H)、6.06(d、J=1.5Hz、1H)、5.73(br d、J=53.5Hz、1H)、5.31(br d、J=5.8Hz、1H)、4.79~4.95(m、1H)、4.64(t、J=6.9Hz、1H)、3.84~4.10(m、4H)、3.41(m、J=13.3Hz、1H)、3.11~3.25(m、1H)、2.75(spt、J=6.5Hz、1H)、0.85~1.15(m、43H)、0.15(s、3H)、0.14(s、3H);ESI-MS:m/z 1144.4[M+H]+。
乾燥MeOH(55mL、モレキュラーシーブで乾燥)中の化合物11b(1.3g、0.98mmol)の溶液を、HCl(Et2O中2Mの0.19mL、13.7mmol)で4時間処理した。反応混合物を、飽和NaHCO3水溶液を添加することによりクエンチし、続いてDCMで抽出した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、化合物11cを得た(670mg、収率:65%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.01~1.08(m、28H)、1.12(d、J=6.8Hz、3H)、1.67~1.75(m、1H)、2.20~2.32(m、1H)、2.43~2.54(m、1H)、2.62(br d、J=14.3Hz、1H)、2.79(spt、J=6.9Hz、1H)、2.85~2.96(m、1H)、3.51(s、3H)、3.52~3.57(m、2H)、3.75~3.83(m、1H)、4.39~4.48(m、1H)、4.50(d、J=4.2Hz、1H)、5.02(q、J=9.6Hz、1H)、5.09(t、J=4.5Hz、1H)、5.25(dd、J=9.8、4.1Hz、1H)、5.52(ddd、J=52.4、4.4、2.6Hz、1H)、5.68(br d、J=5.9Hz、1H)、6.30(dd、J=18.5、2.6Hz、1H)、7.56(t、J=7.7Hz、2H)、7.61~7.69(m、1H)、8.02~8.07(m、2H)、8.11(br s、1H)、8.14(s、1H)、8.57(s、1H)、8.71(s、1H)、11.22(br s、1H)、11.33(br s、1H)、12.09(br s、1H);ESI-MS:m/z 1060.7[M+H]+。
乾燥THF/MeCN(1:1、11mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物11c(340mg、0.32mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の4.48mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(96mg、0.32mmol)を一度に添加した。反応混合物を2時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(19mg、0.064mmol)を添加し、振盪を2時間継続した。tBuOOHの溶液(93μL、デカン中5.5Mの溶液、0.51mmol)を添加し、反応混合物を30分振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。濾液を食塩水で洗浄し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、化合物11dを得た(100mg、収率:26.5%)。ESI-MS:m/z 1177.6[M+H]+。
上記の化合物11d(100mg、0.085mmol)を、エタノール(2mL)中33%のメチルアミン溶液中で、変換完了まで室温で撹拌(約3時間)した後、反応溶液を減圧下で濃縮し、MeCN中ですりつぶした。沈殿物を、ピリジン(684μL)及びEt3N(590μL)の混合物に溶解した。トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(57mg、0.34mmol)を添加し、得られた反応混合物を変換完了まで室温で撹拌した(注記:所望の生成物の沈殿が観察された。残分を、減圧下での濃縮後に得て、MeCN中ですりつぶし、得られた沈殿物を、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm、移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により更に精製し、化合物11を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、ふわふわした白色固体として化合物11、ナトリウム塩を得た(24.5mg、収率:41%)。1H NMR(600MHz、DMSO-d6)δppm10.03(br s、1H)、9.49(br s、1H)、8.27(br s、1H)、7.85(s、1B)、7.60(br s、1H)、7.25(br s、2H)、6.41~6.79(m、2B)、6.36(br d、J=200Hz、1H)、6.08~6.22(m、1H)、6.04(br d、J=7.9Hz、1B)、5.72(br s、1H)、5.43(br dd、J=51.7.4.3Hz、1H)、5.25~5.34(m、1H)、4.54(br t、J=4.0Hz、1H)、4.33~4.43(m、1H)、4.29~4.33(m、1B)、4.11(br t、J=3.9Hz、1H)、3.85~3.94(m、1H)、3.56(br dd、J=13.0.2.6Hz、1H)、3.34(br d、J=12.6Hz、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δ-2.34(s、1P);ESI-MS:m/z 675.1[M+H]+。
化合物12a(300mg、0.38mmol)を、無水ACN(33mL)及び無水THF(33mL)の混合物に溶解した。1H-テトラゾール(3.3mL、1.13mmol)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で2時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.16mL、0.49mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で4時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.078mL、0.25mmol)を添加した。反応混合物を室温で1時間振盪し、次いでデカン中5.5Mのtert-ブチルヒドロペルオキシドの溶液(0.075mL、0.41mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分振盪し、次いで濾過した。モレキュラーシーブをジクロロメタンで3回洗浄した。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分を、SiO2カラムで、100%のDCMからDCM中10%のMeOHまでの勾配を用いて精製した。生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、12bを得た(47mg、収率12%)、ESI-MS:m/z 905.4[M+H]+。
エタノール中33%のメチルアミンの溶液(2.5mL、20.2mmol)中の化合物12b(47mg、0.045mmol)を、40℃で3時間撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残分を、10mLの無水アセトニトリル中ですりつぶした。沈殿物を濾過により回収し、無水アセトニトリルで洗浄した。残分を、逆相分取HPLC(固定相:RP XBrige Prep C18 OBD-10μm 50×150mm、移動相:0.25%NH4HCO3水溶液、MeOH)により精製した。純粋な画分の溶媒を凍結乾燥により除去した。残分を水に溶解し、イオン交換樹脂レジンで充填した予め洗浄した(水)カラムで精製した。得られた溶液の溶媒を凍結乾燥により除去し、白色固体として化合物29、ナトリウム塩を得た(27mg、収率87%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm3.18~3.28(m、1H)3.29~3.40(m、1H)4.02~4.10(m、2H)4.17~4.25(m、1H)4.29~4.48(m、1H)4.36(br s、1H)5.09(br dd、J=13.6、7.1Hz、1H)5.23~5.49(m、2H)5.86~6.00(m、2H)6.34~6.42(m、1H)6.61(br s、2H)6.96(br s、2H)7.92(s、1H)8.11(d、J=2.4Hz、1H)8.15(s、1H)、ESI-MS:m/z 678.2[M+H]+。
化合物13a(355mg、0.46mmol)を、無水ACN(40mL)及び無水THF(40mL)の混合物に溶解した。1H-テトラゾール(4.1mL、1.4mmol)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で2時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.19mL、0.61mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で4時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.18mL、0.57mmol)を添加した。反応混合物を室温で1時間振盪し、次いでデカン中5.5Mのtert-ブチルヒドロペルオキシドの溶液(0.093mL、0.51mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分振盪した。反応混合物を濾過した。モレキュラーシーブをジクロロメタンで3回洗浄した。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3水溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分を、SiO2カラムで、100%のDCMからDCM中10%のMeOHまでの勾配を用いて精製した。生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、13bを得た(34mg、収率5%)。ESI-MS:m/z 888.4[M+H]+。
エタノール中33%のメチルアミンの溶液(2mL、16mmol)中の化合物13b(34mg、0.023mmol)を、40℃で3時間撹拌した。反応混合物を、減圧下で蒸発乾固させた。残分を、10mLの無水アセトニトリル中ですりつぶした。沈殿物を濾別し、無水アセトニトリルで洗浄した。精製を、逆相分取HPLC(固定相:RP XBrige Prep C18 OBD-10μm 50×150mm、移動相:0.25%NH4HCO3水溶液、MeOH)により行った。純粋な画分の溶媒を凍結乾燥により除去した。残分を水に溶解し、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填した予め洗浄した(水)カラムで濾過した。得られた溶液の溶媒を凍結乾燥により除去し、白色固体として化合物15、ナトリウム塩を得た(23mg、収率100%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm2.00~2.13(m、1H)2.49(m、J=3.9、1.7、1.7Hz、1H)3.29~3.37(m、1H)3.57(dd、J=13.6、2.6Hz、1H)3.85~3.97(m、1H)4.03~4.17(m、1H)4.27(br d、J=9.0Hz、1H)4.45~4.55(m、1H)4.73~4.88(m、1H)5.10(br d、J=22.4Hz、1H)5.42(dd、J=51.1、4.1Hz、1H)6.11(br d、J=4.1Hz、1H)6.32(d、J=18.7Hz、1H)6.86~7.03(m、2H)7.07(br s、2H)7.85(br s、1H)8.15(s、1H)8.35(s、1H)8.40~8.87(m、1H);ESI-MS:m/z 661.3[M+H]+。
化合物14a(275mg、0.26mmol)を、無水ACN(40mL)に溶解した。1H-テトラゾール(2.3mL、1.8mmol)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で1時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.084mL、0.26mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で4時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.084mL、0.26mmol)を添加した。反応混合物を室温で1時間振盪し、次いでデカン中5.5Mのtert-ブチルヒドロペルオキシドの溶液(0.062mL、0.34mmol)を添加した。反応混合物を室温で18時間振盪した。反応混合物を濾過した。モレキュラーシーブをジクロロメタンで3回洗浄した。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3水溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分を、SiO2カラムで、100%のDCMからDCM中10%のMeOHまでの勾配を用いて精製した。生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を蒸発させ、14bを得た(30mg、収率5%)。ESI-MS:m/z 1159.6[M+H]+。
エタノール中33%のメチルアミンの溶液(3mL、24.3mmol)中の化合物14b(30mg、0.014mmol)を、45℃で1時間撹拌した。反応混合物を、減圧下で蒸発乾固させた。残分を、10mLの無水アセトニトリル中ですりつぶした。沈殿物を濾別し、無水ACNで洗浄し、白色固体として化合物14c、メチルアンモニウム塩を得た(11mg、収率71%)。ESI-MS:m/z 898.5[M+H]+。
TFA(0.076mL、1mmol)中のアニソール(0.011mL、0.1mmol)の溶液を0℃まで冷却した。冷溶液を、化合物14c(11mg、0.01mmol)に添加した。反応混合物を0℃で75分撹拌した。窒素ガス流を0℃で吹き込むことにより、TFAの大部分を除去した。残りの反応混合物を、エタノール中33%のメチルアミンの溶液(0.12mL、1mmol)を0℃で添加することによりクエンチした。反応混合物を蒸発乾固させた。残分を、逆相分取HPLC(固定相:RP XBrige Prep C18 OBD-10μm 50×250mm、移動相:0.25%NH4HCO3水溶液、CH3CN)により精製した。純粋な画分の溶媒を凍結乾燥により除去した。残分を水に溶解し、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填した予め洗浄した(水)カラムで濾過した。生成物を含有する画分を、合わせた。得られた溶液の溶媒を凍結乾燥により除去し、白色固体として化合物30、ナトリウム塩を得た(3mg、収率45%)。31P NMR(162MHz、D2O)δppm-1.27(s、1P);ESI-MS:m/z 658.3[M+H]+。
ジオール15a(210mg、0.272mmol)を、無水トルエン:アセトニトリル(1:1、体積/体積、3×30mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(20mL)に溶解し、4Åモレキュラーシーブ粉末(0.8g)及びMeCN中0.45Mのテトラゾール(4.8mL、2.17mmol)を添加した。得られた不均一混合物をアルゴンで4分間バブリングした。この混合物を室温で10分撹拌した後、これに、MeCN(3mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(131mg、0.43mmol)の溶液を、室温で30分かけて添加した。90分撹拌した後、反応物を濾過し、次いでTHF(15mL)で洗浄した。0.5Mのヨウ素(THF:水:Py、8:1:1、体積/体積/体積中)を、色が持続するまで添加した。反応物を室温で30分撹拌した後、反応混合物をEtOAc(30mL)で希釈し、過剰なヨウ素を飽和Na2S2O3水溶液で(変色するまで)クエンチした。相を分離し;有機相を飽和NaHCO3水溶液(1×20mL)、飽和NaCl水溶液(1×20mL)で洗浄した。水相をEtOAcで逆抽出した(1×20mL)。合わせた有機相を蒸発乾固させ、得られた粗物質をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(ジクロロメタン中0~15%のMeOH)により精製し、15bを得た(120mg)。ESI-MS:m/z 873[M+H]+。
化合物15b(120mg)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(15mL)に室温で供した。反応物を40℃で2時間撹拌した後、混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾過により回収し、逆相分取HPLC(カラム:Synergi 4μm、Hydro RP、250mm×30mm、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート[TEAA]、勾配:30分間の0~40%のB、流速24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物38を得た(7.1mg)。ESI-MS:m/z 658[M-1]+。
塩変換:Dowex 50W×8,200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物38TEAA塩(24.2mg)を最小量の脱イオン水及びCH3CN(1:1、体積/体積)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物38ナトリウム塩を得た(6.3mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δ7.98(s、1H)、7.82(s、1H)、7.49(s、1H)、6.37(dd、J=5.2Hz、11.6Hz、1H)、5.75~5.90(m、2H)、5.49(t、J=4.8Hz、0.5H)、5.37(t、J=4.8Hz、0.5H)、5.01~5.15(m.1H)、4.51(s、1H)、4.26(d、J=3.6Hz、1H)、4.00~4.10(m、2H)、3.35~3.50(m、2H)、2.45~2.70(m、2H).31P NMR(162MHz、D2O)δ-1.416ppm(s、1P);19F NMR(379MHz、D2O)δ-196ppm(ブロードピーク、1F);ESI-MS:m/z:658.4[M-1]-。
化合物16a(140mg、0.174mmol)を、無水トルエン:アセトニトリル(1:1、体積/体積、3×30mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(15mL)に溶解した。4Åモレキュラーシーブ粉末(0.5g)及びアセトニトリル中0.45Mのテトラゾール(2.32mL、1.04mmol)を添加した。得られた不均一混合物をアルゴンで4分間バブリングした。混合物を室温で10分撹拌した後、これに、CH3CN(3.0mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(84mg、0.28mmol、1.6当量)の溶液を、室温で30分かけて添加した。
反応物を90分撹拌した後、混合物を濾過し、次いで、THF(15mL)で洗浄した。得られた化合物ホスファイト(MS:m/z:901[M+H]+)を次ステップにて直接使用した。これに、0.5Mのヨウ素(THF:水:Py、8:1:1、体積/体積/体積中)を、色が持続するまで添加した。混合物を30分撹拌した後、反応物をEtOAc(30mL)で希釈し;過剰なヨウ素を、飽和Na2S2O3水溶液でクエンチした(変色まで)。相を分離し;有機相を飽和NaHCO3水溶液(1×20mL)及び食塩水(1×20mL)で洗浄した。水層をEtOAcで逆抽出した(1×20mL)。合わせた有機層を蒸発乾固し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(ジクロロメタン中の0~15%のMeOH、体積/体積)により精製し、化合物16bを得た(80mg)。ESI-MS:m/z 917[M+H]+。
化合物16b(80mg)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(6mL)に室温で供した。混合物を40℃で2時間撹拌した後、反応物を減圧下で濃縮し、固体を得た。得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾過により回収し、逆相分取HPLC(カラム:Synergi 4μ、Hydro RP、250mm×30mm、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート、勾配:30分間の0~40%のB、流速24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物28を得た(22.4mg)。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物28、ナトリウム塩を得た(21.9mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm7.87(s、1H)、7.80(s、1H)、7.19(s、1H)、6.32(t、J=5.6Hz、1H)、5.97(d.J=8.0Hz、1H)、5.91(s、1H)、5.50(s、0.5H)、5.37(s、0.5H)、4.98~5.10(m、1H)、4.49(s、1H)、4.10~4.30(m、4H)、3.52(d、J=11.6Hz、1H)、3.44(s、3H)、3.34(d、J=12.4Hz);19F NMR(379MHz、D2O)δブロードピーク-196.61ppm;31P NMR(162MHz、D2O)δ-1.38ppm;ESI-MS:m/z:688.8[M-1]-。
注記:化合物1bを、使用前にピリジン(60mL)と2回共蒸発させた。ピリジン(60mL)中の化合物1b(6g、15.06mmol)の溶液に、DMTrCl(10.2g、30.12mmol)及びDMAP(920mg、7.53mmol)を5℃で添加した。反応混合物を80℃で18時間撹拌し、黄色の溶液を得た。反応混合物を別のバッチと合わせ、ワークアップした。揮発性物質を真空下で除去し、残分をDCM(150mL)に溶解し、次いで激しく撹拌しながら飽和NaHCO3水溶液(100mL)にゆっくり注いだ。水層をDCMで抽出した(100mL×2)。有機層を合わせ、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、黄色の残分を得た。残分を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物17-1を得た(12.6g、7.9gの化合物1bからで88%)。ESI-MS:m/z=701.1[M+H]+。
PPh3(6.6g、25.1mmol)を、THF(100mL)中の化合物17-1(12.6g、17.98mmol)の溶液に一度に添加し;混合物をN2下、40℃で2時間撹拌し、続いてH2O(50mL)を添加し;混合物を12時間撹拌し、無色の溶液を得た。溶媒を減圧下で濃縮し、残りの水層をDCM/H2O(80/30mL)に分液した。水層をDCMで抽出した(40mL×2)。次いで有機層を合わせ、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、白色固体をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~5%のMeOH)により精製し。白色固体として、化合物17-2を得た(11.6g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ8.93(br s、1H)、8.71(s、1H)、8.31(s.1H)、8.01(br d、J=7.3Hz、2H)、7.33~7.19(m、4H)、6.82(dd、J=6.9、8.9Hz、4H)、6.17(dd、J=1.5、17.6Hz、1H)、4.64(ddd.J=4.4、7.6、19.4Hz、1H)、4.57~4.36(m、1H)、4.18~4.08(m、1H)、3.77(d、J=5.3Hz、6H)、2.94(dd、J=2.4、14.2Hz、1H)、2.64(dd、J=4.3、14.3Hz、1H);19F NMR(376MHz、CDCl3)δ-197.03(br s、1F);ESI-MS:m/z=675.1[M+H]+。
乾燥CH2Cl2(5mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(768mg、3.23mmol)の溶液を、乾燥CH2Cl2(15mL)中の化合物17-2(727mg、1.07mmol)、4-ニトロフェノール(449mg、3.23mmol)、Et3N(654mg、6.46mmol)及び活性化4Åモレキュラーシーブ(約1g)の混合物に、N2下、-78℃で速やかに添加した。混合物を1.5時間かけて徐々に室温まで加温した。反応混合物を他のバッチと合わせ、珪藻土パッドを通して濾過した。濾液を分液漏斗に移し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(200mL×4)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製しされた黄色の残分を得て、淡黄色固体として化合物17aを得た(16g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ8.93~8.81(m、2H)、8.41(s、1H)、8.11~7.92(m、5H)、7.67~7.58(m、1H)、6.86(br t、J=7.7Hz、4H)、6.20(br dd、J=5.1、13.7Hz、1H)、5.34~5.23(m、2H)、5.16(br t、J=5.1Hz、1H)、4.73(br s、1H)、3.90(br s、1H)、3.79(d、J=6.4Hz、6H)、3.23(br d、J=13.2Hz、1H)、2.89(br dd、J=8.7、12.6Hz、1H);19F NMR(376MHz、CDCl3)δ-199.28~-205.90(m、1F);ESI-MS:m/z=876.1[M+H]+。
THF(30mL)中の化合物17a(2053g、2.34mmol)、化合物17b(1000mg、1.56mol)の溶液及びモレキュラーシーブ(6g)を、N2下、室温で30分撹拌し;DMAP(954.8mg、7.81mmol)を添加し、混合物を45℃(油温度)で12時間撹拌した。反応混合物を濾過し、これにDCM(50mL)及び食塩水(20mL)を添加した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(3×50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分をシリカゲル(6g)と合わせ、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE/EAが10~100%、及びDCM/MeOHが0~5%)により精製し、淡黄色固体として17cを得た(1.8g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.10(s、1H)、11.46(s、1H)、11.23(s、1H)、11.05(s、1H)、8.65(s、1H)、8.47(s、1H)、8.13~8.10(m、1H).8.02(d、J=73Hz、2H)、7.68~7.63(m、1H)、7.58~7.46(m、4H)、7.41~7.31(m、6H)、7.29~7.23(m、3H)、7.20~7.11(m、7H)、6、91(dd、J=6.4、8.3Hz、4H)、6.75(dd、J=8.9、12.3Hz、4H)、6.39~6.30(m、1H)、6.16(s、1H)、5、34(br、d、J=5.9Hz、1H)、4.91(br、s、1H)、4.86~4.73(m、2H)、4.45(br、d、J=5.4Hz、1H)、3.69(s、12H)、3.21~3.08(m、2H)、2.96~2.88(m、1H)、2.73(m、2H)、2.07(m、1H)、1.02(m、6H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δ-197.64(s、1F);ESI-MS:m/z 689.1[M/2+H]+。
DCM(30mL)中の17c(1.8g、1.31mmol)の溶液に、水(235.5mg、13.08mmol)及びDCA(337.233mg、2.615mmol)を添加し、赤色の溶液を得た。溶液を25℃で、室温で12時間撹拌した。次いでこれに、溶液が透明になるまでMeOH(5mL)を添加し、続いてピリジン(1034.4mg、13.08mmol)を添加した。混合物を25℃で2時間撹拌した後、溶液を適切な圧力下で濃縮し、残分を得た(3.0g)。残分をシリカゲル(6.0g)と合わせ、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH中の0~8%のDCM)により精製し、白色固体として17dを得た(0.9g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.12(s、1H)、11.57(s、1H)、11.26(s、1H)、8.75(s、1H)、8.60(s、1H)、8.47(t、J=5.9Hz、1H)、8.21(s、1H)、8.07~8.02(m、2H)、7.69~7.63(m、1H)、7.60~7.52(m、2H)、6.33(dd、J=2.0、19.3Hz、1H)、6.08(d、J=1.7Hz、1H)、5.92(d.J=6.4Hz、1H)、5.70~5.50(m、1H)、5.30(br.d、J=6.1Hz、1H)、5.02(t、J=5.4Hz、1H)、4.67~4.53(m、1H)、4.27(br、d、J=3.9Hz、1H)、4.11(q、J=5.1Hz、1H)、4.05~3.99(m、1H)、3.66~3.55(m、1H)、3.46(td、J4.9、12.2Hz、1H)、2.78(td、1H)、2.24(td、1H)、1.12(d、6H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δ-202.156(s、1F);ESI-MS:m/z=772.1[M+H]+。
THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
テトラヒドロフラン(3mL)中の17e(100mg、0.130mmol)の溶液に4ÅMS(粉末、1g)を添加し、混合物を20分撹拌した。20分後、1H-テトラゾール(アセトニトリル中0.45M、2.3mL)の溶液を25℃で添加し、続いて、2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(78.1mg、0.26mmol、1mLのTHFに希釈)の溶液を25℃で添加した。室温で1.5時間撹拌した後、tert-ブチルヒドロペルオキシド(0.12mL、0.65mmol)を25℃で添加し、溶液を1.5時間撹拌した。反応混合物を適切な圧力下で濃縮し、黄色の残分を得た。残分をシリカゲル(2g)と合わせ、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~15%のMeOH)により精製し、淡黄色固体として17eを得た(80mg)。
ESI-MS:m/z 887.5[M+H]+。
化合物17e(80mg、0.090mmol)を、MeNH2(EtOH中50%、5.0mL)で処理した。25℃で4時間撹拌した後、溶液を圧力下で濃縮し、残分を得た。残分を、逆相分取HPLC(カラム:Ageka Durashell 5μm C18 150×25、条件:水(10mMのNH4HCO3)-CH3CN、B5で開始、B35で終了、勾配時間(分):9、100%Bの保持時間(分):0、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物33、アンモニウム塩を得た(15mg)。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物33、ナトリウム塩を得た(25.5mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.16(br、s、1H)、7.88(s、1H)、7.15(br、s、1H)、6.45(br、d、J=19.8Hz、1H)、6.19(br、d、J=7.3Hz、1H)、6.00(br、d、J=7.1Hz、1H)、5.43~5.29(m、1H)、5.28~5.18(m、1H)、4.63~4.51(m、2H)、4.31~4.22(m、1H)、4.16~4.04(m、1H)、3.78(br d、J=13.2Hz、1H)、3.45(br、d、J=13.2Hz、1H)、2.80~2.60(m、2H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-196.95(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-1.422(s、1P);ESI-MS:m/z=660.2[M+H]+。
THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
THF(2mL)中の18a(100mg、0.127mmol)の溶液に、4ÅMS(粉末、0.5g)及び1H-テトラゾールの溶液(2.25mL、0.45M、945mgのテトラゾールを乾燥CH3CN30mLに溶解し、続いて1gの4ÅMSを添加し、次いでN2下、使用前に1時間撹拌することにより調製)を添加し;次いで、N2で数回パージした。THF(0.6mL)中の2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(61mg、0.203mmol)の溶液を、5分かけて滴下した。室温で4時間撹拌した後、TBHPの溶液(124μL、0.62mmol、デカン中5M)を、N2下で添加した。30分撹拌した後、反応混合物を前のバッチと合わせ、珪藻土パッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、無色の油を得た。油をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(12g、35mL/分、最初に石油エーテル中の50~80のTHFで溶出、次いでDCM中の0~2%のMeOHに切り替え)により精製し、白色固体として18bを得た(89mg)。1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)δ8.82(s、2H)、8.60(s、1H)、8.08(s、1H)、7.95(br d、J=7.5Hz、2H)、7.81(br s、2H)、7.60~7.50(m、1H)、7.47~7.37(m、3H)、7.37~7.28(m、2H)、6.95(s、1H)、6.36(br d、J=17.6Hz、2H)、6.23~5.80(m、2H)、5.67~5.39(m、1H)、4.87~4.56(m、3H)、4.53~4.37(m、3H)、3.84~3.67(m、2H)、3.48~3、32(m、1H)、2.87(br t、J=5.9Hz、4H):31PNMR(162MHz、クロロホルム-d)δ~5.30(s、1p);ESI-MS:m/z=923.4[M+H]+。
化合物18b(98mg、0.096mmol)を、Et中のメチルアミンの溶液(EtOH中30%、5mL)で処理した。40℃で1時間撹拌した後、揮発性溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた白色固体を、水/CH3CNの混合物(15/4mL)に溶解し、次いでDCMで洗浄した(10mL×3)。水層を凍結乾燥し、白色固体として化合物34を得た(61mg)。ESI-MS:m/z=662.2[M+H]+。
固体を、逆相分取HPLC(カラム:XBridge 10μm 150×30mm、条件:水(10mMのNH4HCO3)-CH3CN、B8で開始、B38で終了、勾配時間(分):7、100%Bの保持時間(分):0、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物34、アンモニウム塩を得た。ESI-MS:m/z=662.3[M+H]+。1H NMR(400MHz、D2O)δ8.50~8.11(m、1H)、8.08~7.86(m、1H)、7.81~7.56(m、1H)、6.95~6.58(m、1H)、6.41~6.01(m、2H)、5.76~5.05(m、4H)、5.01~4.76(m、1H)、4.45~3.93(m、3H)、3.81~3.23(m、2H);19F NMR(376MHz、D2O)δ-196.50、-197.49、-197.63、-198.85;31P NMR(162MHz、D2O)δ-2.25(1s、1P);
塩変換:Dowex 50W×8,200-400(6mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物34TEAA塩(44mg)を、脱イオン水:CH3CN(4:1)の混合物に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物34、ナトリウム塩を得た(43.5mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.29(s、1H)、7.98(s、1H)、7.68(s、1H)、6.75(br s、1H)、6.31~6.17(m、2H)、5.73~5.58(m、1H)、5.57~5.39(m、1H)、5.31~5.12(m、1H)、4.96~4.82(m、1H)、4.68(br d、J=2.4Hz、1H)、4.33(br d、J=9.0Hz、1H)、4.25~4.06(m、2H)、3.62(dd、J=2.4、13.4Hz、1H)、3.43(br d、J=13.0Hz、1H);31P NMR(162MHz、D2O):δppm-2.15(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δ-196.86(s、1F)、-198.50(s、1F);ESI-MS:m/z=662.2[M+H]+。
イミダゾール(31g、456.1mmol)及びTBSCl(45.8g、304.0mmol)を、引き続いて乾燥DMF(750mL)中のN6-ベンゾイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)2’-デオキシアデノシン(19a[64325-78-6]、50.0g、76.0mmol)の溶液に添加した。混合物を変換完了まで室温で撹拌(約3時間)した後、反応溶液をEtOAcで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗残分を、DCM及びヘキサンで再沈殿させ、白色の泡状物として化合物19bを得た(68g、粗)。ESI-MS:m/z 771.0[M+H]+。
化合物19b(68.0g、88.3mmol)をCHCl3(1564mL)に溶解し、0℃まで冷却した。メタノール中のpTSA一水和物(20.1g、105.9mmol)の溶液を添加した。反応混合物を30分撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液をクエンチ用に添加した。水層をDCMで抽出した。合わせた有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により行い、灰白色の泡状物として化合物19cを得た(27g)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.20(s、1H)、8.75(s、1H)、8.69(s、1H)、8.05(d、J=7.6Hz、2H)、7.65(t、J=7.6Hz、1H)、7.55(t、J=7.6Hz、2H)、6.47(t、J=6.9Hz、1H)、5.06(t、J=5.5Hz、1H)、4.65(m、1H)、3.90(q、J=4.1Hz、1H)、3.63(m、1H)、3.53(m、1H)、2.92(m、1H)、2.36(qd、J=6.4、2.8Hz、1H)、0.92(s、9H)、0.13(s、6H);ESI-MS:m/z 470.0[M+H]+。
メシルクロリド(5.1mL、66.7mmol)を、乾燥ピリジン(135mL)中の化合物19c(27.0g、57.5mmol)の溶液に0℃で滴下した。反応混合物を、変換完了まで0℃で撹拌(約3時間)した後、メタノールでクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、メシル化生成物を得た。粗生成物を乾燥DMF(256mL)に溶解し、続いてアジ化ナトリウム(30.5g、468.0mmol)を添加した。反応混合物を60℃で5時間撹拌した後、室温まで冷却し、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液及び水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により行い、泡状物として化合物19dを得た(24g、収率:84%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.19(s、1H)、8.77(s、1H)、8.70(s、1H)、8.05(d、J=6.9Hz、2H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、7.55(t、J=7.6Hz、2H)、6.51(t、J=6.9Hz、1H)、4.71(m、1H)、4.01(m、1H)、3.65(q、J=6.4Hz、1H)、3.57(dd、J=13.1、4.8Hz、1H)、3.06(m、1H)、2.41(qd、J=6.7、4.0Hz、1H)、0.92(s、9H)、0.14(s、6H);ESI-MS:m/z 495.0[M+H]+。
MeOH(100mL)中の化合物19d(10.0g、20.2mmol)溶液を、大気圧下、Pd/C(炭素上20%、1g)にて室温で水素添加した。反応混合物を珪藻土で濾過し、珪藻土をMeOHですすいだ。濾液を減圧下で濃縮し、白色の泡状物として化合物アミン得た(9.4g、粗)。粗生成物(9.4g)をDCM(395mL)に溶解し、続いて4-ニトロフェノール(8.38g、60.2mmol)、Et3N(16.9mL、120.4mmol)及び活性化モレキュラーシーブを添加した。得られた混合物をN2下、-78℃まで冷却した後、DCM(45mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(14.28g、60.2mmol)の溶液を滴下し、変換完了まで撹拌を続けた(約2時間)。反応混合物を室温まで加温し、飽和NaHCO3水溶液及び水で洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘキサン中の0~50%のEtOAc)により精製し、泡状物として化合物19eを得た(6.4g、収率:47%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.20(s、1H)、9.09(t、J=5.9Hz、1H)、8.70(d、J=2.1Hz、2H)、8.29(td、J=6.2、3.9Hz、2H)、8.05(d、J=7.6Hz、2H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、7.54(m、4H)、6.50(t、J=6.9Hz、1H)、4.66(m、1H)、4.01(m、1H)、3.51(dt、J=14.2、5.7Hz、1H)、3.39(m、1H)、3.05(m、1H)、2.38(qd、J=6.7、2.8Hz、1H)、0.91(s、9H)、0.13(s、6H);ESI-MS:m/z 670.0[M+H]+。
5’-O-(4’,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチル-D-グアノシン([103285-33-2]、2.5g、3.73mmol)、化合物19e(2.9g、4.48mmol)及びDMAP(2.27g、18.6mmol)を、各々別個に乾燥DCM(3×10.0mL)に溶解し、不活性雰囲気下、活性化3Åモレキュラーシーブで少なくとも2時間乾燥させた。次に、5’-O-(4’,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチル-D-グアノシン及び化合物22cの溶液を、引き続いてDMAP溶液の入っている反応フラスコに移した。反応混合物を22時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的に洗浄した。濾液を飽和NaHCO3水溶液、食塩水及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により精製し、化合物19fを得た(2.04g、収率:45.5%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.10(s、1H)、11.54(s、1H)、11.20(s、1H)、8.70(s、1H)、8.65(s、1H)、8.18(s、1H)、8.05(d、J=6.9Hz、2H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、7.56(t、J=7.6Hz、2H)、7.29(d、J=7.6Hz、2H)、7.24(t、J=7.6Hz、2H)、7.18(t、J=9.6Hz、5H)、6.81(dd、J=8.3、6.2Hz、4H)、6.46(t、J=6.9Hz、1H)、6.16(d、J=4.1Hz、1H)、5.55(t、J=4.8Hz、1H)、4.63(m、1H)、4.38(t、J=5.2Hz、1H)、4.12(q、J=4.6Hz、1H)、3.86(dd、J=9.0、6.2Hz、1H)、3.71(s、6H)、3.37(s、3H)、3.23(m、5H)、2.97(m、1H)、2.74(m、1H)、1.09(m、6H)、0.88(s、9H)、0.11(s、6H);ESI-MS:m/z 1201.0[M+H]+。
Et3N(11.61mL、83.3mmol)及びEt3N.3HF(1.35mL、8.33mmol)を、ピリジン(16.5mL)中の化合物19f(2.5g、2.08mmol)の溶液に添加した。反応混合物を変換完了まで45℃で撹拌(約5時間)し、次いで室温まで冷却した。イソプロポキシトリメチルシラン(5.9mL、33.28mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。減圧下で濃縮し、粗5’脱保護化合物を得て、これをDCM(59.0mL)に再溶解した。水(0.17mL、9.65mmol)及びジクロロ酢酸(DCM中10%の6.3mL、7.72mmol)を添加し、得られた反応混合物を1時間撹拌した(完全変換)後、これを、ピリジン(0.77mL、9.65mmol)及び数滴のメタノールの添加によりクエンチした。減圧下での濃縮後に得られた残分を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~9%のMeOH)により精製し、化合物19gを得た(1.4g、収率:86%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.08(s、1H)、11.62(s、1H)、11.19(s、1H)、8.70(s、1H)、8.60(s、1H)、8.25(s、1H)、8.05(d、J=7.6Hz、2H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、7.56(t、J=7.6Hz、2H)、6.42(t、J=6.9Hz、1H)、6.08(d、J=6.2Hz、1H)、5.45(d、J=4.1Hz、1H)、5.38(dd、J=6、5、5.2Hz、1H)、5.26(t、J=5.2Hz、1H)、4.36(d、J=2.1Hz、1H)、4.18(q、J=2.5Hz、1H)、4.10(m、1H)、3.79(td、J=5.9、3.2Hz、1H)、3.61(dtd、J=37.3、8.3、3.8Hz、2H)、3.41(s、3H)、3.09(d、J=15.1Hz、3H)、2.83(m、1H)、2.74(td、J=13.4、6.7Hz、1H)、2、33(qd、J=6.7、3、6Hz、1H)、1H(q、J=3.4Hz、6H);ESI-MS:m/z 784.0[M+H]+。
乾燥THF(26mL)中の化合物19g(500mg、0.638mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中3~4%の5.59mL)の溶液を、不活性雰囲気下、3Åモレキュラーシーブで2時間処理した。2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(250mg、0.829mmol)を一度に添加し、反応混合物を終夜振盪した。t-BuOOH(デカン中5.5Mの174μLの溶液、0.96mmol)を添加し、振盪を1時間継続した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで十分にすすいだ。濾液を減圧下で濃縮し、粗化合物19hを得て、これを次ステップにて直接使用した。ESI-MS:m/z 899.5[M+H]+。
粗化合物19hを、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、室温で2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により精製し、化合物12、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への変換を、IR Naイオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物12、ナトリウム塩を得た(43mg、収率:10%)。
1H NMR(600MHz、DMSO-d6、60℃)δppm10.36(br s、1H)、8.54(br s、1H)、8.33(s、1H)、7.99(s、1H)、7.98(s、1H)、7.11(s、2H)、6.76(br s、2H)、6.35(t、J=6.9Hz、1H)、5.98(br s、2H)、5.14(br s、1H)、4.28(br s、2H)、4.19(s、1H)、4.09(s、1H)、3.86~3.95(m、1H)、3.48(s、3H)、3.34~3.46(m、1H)、3.09~3.26(m、1H)、2.87~2.99(m、1H)、2.56~2.65(m、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm-1.88(s、1P);
ESI-MS:m/z 670.2[M+H]+。
乾燥ピリジン(138mL)中のN-ベンゾイル-3’-デオキシ-3’-フルオロ-アデノシン20a[CAS番号129054-67-7](7.4g、18.5mmol)の溶液に、DMAP(1.13g、9.2mmol)及びDMTrCl(10g、29.7mmol)を(小分けして)添加し、変換完了まで室温で撹拌(約5時間)した。反応混合物をメタノール(15mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により行い、白色の泡状物として化合物20bを得た(9.8g、収率:78%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm3.31(q、J=5.0Hz、1H)、3.36(t、J=5.2Hz、1H)、3.73(s、6H)、4.41(dt、J=26.4、4.6Hz、1H)、5.19(m、1H)、5.28(dd、J=11.7、7.6Hz、1H)、6.09(dd、J=6.9、4.8Hz、2H)、6.87(m、4H)、7.24(m、7H)、7.39(d、J=6.9Hz、2H)、7.56(t、J=7.6Hz、2H)、7.65(m、1H)、8.06(d、J=6.9Hz、2H)、8.62(d、J=3.4Hz、2H)、11.27(s、1H);ESI-MS:m/z 676.1[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(2.62g、21.4mmol)、乾燥DCM(50mL)及び活性化3Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で少なくとも2時間撹拌した。同時に、各々乾燥DCM(2×50mL)中の、化合物20b(2.9g、4.29mmol)の溶液及び化合物19e(3.4g、5.15mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約2時間)。両方の溶液(それぞれ化合物20b及び化合物19c)を、引き続いて反応フラスコに移した。得られた反応混合物を24時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液、食塩水、及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により精製し、化合物20cを得た(4.2g、収率:81%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.23(d、J=36.5Hz、2H)、8.70(s、1H)、8.63(d、J=20.0Hz、2H)、8.53(s、1H)、8.04(q、J=3.4Hz、4H)、7.65(m、2H)、7.55(td、J=7.6、4.8Hz、4H)、7.35(d、J=7.6Hz、2H)、7.22(m、7H)、6.83(m、4H)、6.43(q、J=7.1Hz、2H)、6.05(td、J=11.0、6.2Hz、1H)、5.64(d、J=54.4Hz、1H)、4.53(m、2H)、3.88(t、J=3.1Hz、1H)、3.70(s、6H)、3.37(m、2H)、3.20(m、2H)、2.97(m、1H)、0.88(s、9H)、0.09(d、J=2.1Hz、6H);ESI-MS:m/z 1206[M+H]+。
Et3N(19.4mL、139.4mmol)及びEt3N.3HF(2.2mL、13.9mmol)を、ピリジン(70mL)中の化合物20d(4.2g、3.4mmol)の溶液に添加した。反応混合物を変換完了まで45℃で撹拌(約5時間)し、次いで室温まで冷却した。イソプロポキシトリメチルシラン(9.9mL、55.7mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。最後に、反応混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~4%のMeOH)により精製し、泡状物として化合物20dを得た(3.0g、収率:78%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.21(s、1H)、8.70(s、1H)、8.62(d、J=9.6Hz、2H)、8.53(s、1H)、8.04(m、4H)、7.65(m、2H)、7.55(td、J=7.7、3.7Hz、4H)、7.36(d、J=7.6Hz、2H)、7.21(m、7H)、6.83(m、4H)、6.43(dd、J=16.2、6.5Hz、2H)、6.04(td、J=11.0、6.2Hz、1H)、5.66(dt、J=53.5、3.4Hz、1H)、5.46(s、1H)、4.49(dd、J=24.1、2.8Hz、1H)、4.39(s、1H)、3.88(m、1H)、3.71(s、6H)、3.40(q、J=5.3Hz、2H)、3.20(m、2H)、2.85(q、J=6.9Hz、1H)、ESI-MS:m/z 1090[M+H]+。
化合物20d(3.0g、2.7mmol)をDCM(84mL)に溶解し、水(250μL、13.7mmol)及びジクロロ酢酸(DCM中10%の9.1mL、10.9mmol)を添加した。得られた反応混合物を1時間撹拌した(変換完了)後、これを、ピリジン(1.1mL、13.7mmol)及び数滴のメタノールの添加によりクエンチした。減圧下での濃縮後に得られた残分を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~6%のMeOH)により精製し、化合物20eを得た(1.9g、収率:87%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.28(s、1H)、11.21(s、1H)、8.72(d、J=4.1Hz、3H)、8.62(S、1h)、8.04(d、J=8.3Hz、4H)、7.64(m、2H)、7.55(q、J=6.9Hz、4H)、6.40(m、2H)、5.53(t、J=5.9Hz、1H)、5.42(t、J=5.2Hz、1H)、4.45(dt、.J=26.9、3.4Hz、1H)、4.35(s、1H)、3.79(t、J=7.2Hz、1H)、3.68(d、J=20.0Hz、2H)、3.10(m、3H)、2.84(m、1H)、2.32(q、J=3.4Hz、1H);ESI-MS:m/z 790[M+H]+。
乾燥THF(31mL)中の化合物20e(500mg、0.63mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の5.54mL)の溶液を、不活性雰囲気下、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(210mg、0.70mmol)を一度に添加した。反応混合物を後で2時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(95mg、0.32mmol)を添加し、振盪を終夜継続した。tBuOOH(デカン中5.5M溶液の196μL、1.08mmol)を添加し、反応混合物を更に1時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで十分にすすいだ。濾液を、食塩水及び飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物20fを得た(56mg、収率:10%)。ESI-MS:m/z 905.5[M+H]+。
化合物20f(56mg、0.062mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、室温で2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物36、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への変換を、IR Naイオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物36、ナトリウム塩を得た(17.5mg、収率:42%)。1H NMR(600MHz、DMSO-d6、81℃)δppm8.71(br s、1H)、8.34(br s、1H)、8.14(s、1H)、8.07(s、1H)、6.94(br s、2H)、6.90(br s、2H)、6.32(t、J=7.1Hz、1H)、6.22(br s、1H)、5.68(br d、J=26.8Hz、1H)、5.42(br d、J=51.9Hz、1H)、5.10(br s、1H)、4.46(br d、J=25.5Hz、1H)、4.10~4.19(m、1H)、4.04(br s、1H)、3.79(br s、1H)、3.18(m、J=11.4Hz、1H)、2.92(s、1H)、2.53(br s、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm-1.74(s、1P);ESI-MS:m/z 644.4[M+H]+。
乾燥ピリジン(33mL)中の3’-デオキシ-3’-フルオロイノシン21a[CAS番号117517-20-1](2.2g、8.14mmol)の溶液に、DMAP(0.49g、4.0mmol)及びDMTrCl(4.4g、13mmol)を(小分けして)添加し、変換完了まで室温で撹拌(約2.5時間)した。反応混合物をメタノール(10mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により行い、灰白色の泡状物として化合物21bを得た(3.3g、収率:71%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.22(d、J=2.1Hz、1H)、7.93(d、J=1.4Hz、1H)、7.36(d、J=8.3Hz、2H)、7.28(t、J=7.6Hz、2H)、7.23(m、5H)、6.86(dd、J=8.3、6.2Hz、4H)、5.92(d、J=7.6Hz、1H)、5.14(dd、J=54.1、4.5Hz、1H)、5.02(dq、J=23.2、3.9Hz、1H)、4.35(dt、J=25.9、4.3Hz、1H)、3.74(s、6H)、3.29(dq、J=37.5、5.2Hz、2H)、ESI-MS:m/z 572.0[M+H]+。
化合物21b(0.66g、1.15mmol)、スルファミン酸塩17a(1.21g、1.38mmol)及びDMAP(0.704g、5.76mmol)を、各々別個に乾燥DCM(3×20.0mL)に溶解し、不活性雰囲気下、活性化3Åモレキュラーシーブで少なくとも2時間乾燥させた。次に、化合物21b及びスルファミン酸塩17aの溶液を、引き続いてDMAP溶液の入っている反応フラスコに移した。得られた反応混合物を24時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、引き続いて飽和NaHCO3水溶液及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、灰白色の泡状物として化合物21cを得た(0.475g、収率:31%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.47(s、1H)、11.23(s、1H)、8.66(s、1H)、8.56(s、1H)、8.48(s、1H)、8.19(s、1H)、8.03(d.J=7.6Hz、2H)、7.84(s、1H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、7.55(t、J=7.6Hz、2H)、7.48(d、J=7.6Hz、2H)、7.36(q、J=4.8Hz、4H)、7.32(m、4H)、7.23(t、J=7.6Hz、4H)、7.19(t、J=7.9Hz、5H)、6.90(dd、J=9.0、6.9Hz、4H)、6.81(dd、J=9.0、6.2Hz、4H)、6.34(m、1H)、6.23(d、J=6.2Hz、1H)、5.78(m、2H)、5.50(d、J=53.7Hz、1H)、4.72(m、2H)、4.43(d、J=24.1Hz、1H)、4.01(t、J=7.9Hz、1H)、3.74(s、1H)、3.70(t、J=2.4Hz、12H)、3.25(dd、J=10.7、3.8Hz、1H)、2.99(d、J=13.1Hz、1H)、2.70(dd、J=14.5、9.0Hz、1H);ESI-MS:m/z 1310.0[M+H]+。
DCM(12.6mL)中の化合物21c(0.453g、0.34mmol)の溶液に、DCA(DCM中10%の1.14mL、1.38mmol)及び水(31μL、1.72mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した(約2時間)。反応混合物を、ピリジン(0.14mL、1.72mmol)及び数滴のメタノールを添加することによりクエンチした。得られた懸濁液を20分撹拌し、濾過し、乾燥させ、化合物21dを得た(0.21g、収率:86%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.5(d、J=3.4Hz、1H)、11.25(s、1H)、8.75(s、1H)、8.69(t、j=6.0Hz、1H)、8.61(s、1H)、8.35(s、1H)、8.09(d、J=3.4Hz、1H)、8.05(d、7.6Hz、2H)、7.66(t、J=7.2Hz、1H)、7.56(tJ=7.6Hz、2H)、6.32(dd、J=20.0、2.1Hz、1H)、6.21(d、J=7.6Hz、1H)、5.85(d、J=6.2Hz、1H)、5.60(m、1H)、5.49(m、3H)、5.34(d、J=4.8Hz、1H)、4.57(m、1H)、4.40(dt、J=26.9、3.4Hz、1H)、3.92(q、J=6.0Hz、1H)、3.65(t、J=4.1Hz、2H)、3.17(t、J=6.2Hz、2H);ESI-MS:m/z 706.0[M+H]+。
DMF/THF(1:2、30mL、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物21d(260mg、0.37mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の2.15mL、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、不活性雰囲気下、3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(129μL、0.41mmol)を一度に添加した。得られた反応混合物を室温で終夜振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(23μL、0.074mmol)を添加し、振盪を更に1日継続し、完全な変換とした。tBuOOH(デカン中5.5M溶液の134μL、0.74mmol)を添加し、反応混合物を更に1時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。濾液を水で徹底的に洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、化合物21eを得た(20mg、収率:7%)。ESI-MS:m/z 820.4[M+H]+。
化合物21e(20mg、0.024mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、変換完了まで室温で撹拌した(約1時間)。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物29、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物29、ナトリウム塩を得た(13.5mg、収率:80%)。31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm-2.06(s、1P);ESI-MS:m/z 663.3[M+H]+。
THF(200mL)中の6-クロロプリンリボシド22a(10.0g、34.88mmol、CAS番号5399-87-1)の溶液を、K2CO3(9.64g、69.77mmol)の存在下、Pd/C(炭素上10%、8g)にて、室温、大気圧で水素添加した。反応混合物を珪藻土で濾過し、珪藻土を引き続いてTHF及び5:1THF/MeOHですすいだ。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、粗化合物22b(6.3g)を得て、これを次ステップにてそのまま使用した。ESI-MS:m/z 253.1[M+H]+。
乾燥ピリジン(300mL)中の粗化合物22b(6.1g)及びDMTrCl(11.93g、35.20mmol)の溶液を、変換完了まで室温で撹拌した(約2時間)。反応混合物をDCMで希釈し、食塩水で洗浄した。水層をDCMで再抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の1~5%のMeOH)により行い、白色固体として化合物22cを得た(11.7g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm9.21(s、1H)、8.89(s、1H)、8.74(s、1H)、7.33(d、J=6.8Hz、2H)、7.15~7.26(m、7H)、6.80(t、J=9.3Hz、4H)、6.07(d、J=4.5Hz、1H)、5.62(d、J=5.6Hz、1H)、5.29(d、J=5.8Hz、1H)、4.78(q、J=5.1Hz、1H)、4.34(q、J=5.3Hz、1H)、4.11(q、J=4.8Hz、1H)、3.72(s、3H)、3.71(s、3H)、3.21~3.25(m、2H);ESI-MS:m/z 555.1[M+H]+。
DMF(70mL)中の化合物22c(6.7g、12.1mmol)の溶液に、イミダゾール(2.47g、14.5mmol)及びTBSCl(2.19g、2.39mmol)を添加し、室温で終夜撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、食塩水で洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の10~33%のEtOAc)により精製し、最初の溶出異性体として化合物22d(3.3g、収率:40%)及び2番目の溶出異性体として化合物22e(3.5g、収率:43%)を得た。化合物22d:1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm9.22(s、1H)、8.87(s、1H)、8.74(s、1H)、7.38(d、J=7.5Hz、2H)、7.16~7.29(m、7H)、6.83(dd、J=8.5、4.9Hz、4H)、6.09(d、J=4.8Hz、1H)、5.23(d、J=6.0Hz、1H)、4.89(t、J=4.9Hz、1H)、4.27(q、J=5.2Hz、1H)、4.14(q、J=4.5Hz、1H)、3.72(s、6H)、3.29(br d、J=4.6Hz、2H)、0.72(s、10H)、-0.05(s、3H)、-0.17(s、3H);ESI-MS:m/z 669.2[M+H]+。
化合物22e:1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm9.20(s、1H)、8.87(s、1H)、8.80(s、1H)、7.29~7.40(m、2H)、7.12~7.27(m、7H)、6.82(m、J=8.8、6.8Hz、4H)、6.04(d、J=5.0Hz、1H)、5.48(d、J=6.0Hz、1H)、4.92(q、J=5.2Hz、1H)、4.52(t、J=4.6Hz、1H)、4.05~4.13(m、1H)、3.72(s、6H)、3.36(dd、J=10.5、4.5Hz、1H)、3.15(dd、J=10.5、5.0Hz、1H)、0.84(s、9H)、0.09(s、3H)、0.05(s、3H);ESI-MS:m/z 669.2[M+H]+。
活性化3Åモレキュラーシーブを、乾燥THF(85mL)中の化合物22e(1.31g、1.96mmol)及びスルファミン酸塩17a(1.88g、2.14mmol)の入っている反応フラスコに添加した。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で少なくとも2時間撹拌した。同時に、乾燥THF(15mL)中のDMAP(1.2g、9.82mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた後、反応フラスコに移した。得られた反応混合物を、50℃で終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、水及び飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、化合物22fを得た。
DCM(80mL)中の化合物22f(2.4g、1.71mmol)の溶液に、DCA(0.563mL、6.83mmol)及び水(154μL、8.54mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した(約1時間)。反応混合物を、ピリジン(688μL、8.54mmol)及びメタノール(1mL)を添加することによりクエンチし、水で洗浄した。有機層を、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物22gを得た。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.26(s、1H)、9.17(s、1H)、8.89(s、1H)、8.83(s、1H)、8.71(s、1H)、8.57(s、1 H)、8.44(t、J=5.8Hz、1H)、8.00~8.08(m、2H)、7.61~7.75(m、1H)、7.49~7.59(m、2H)、6.34(d、J=6.0Hz、1H)、6.28(dd、J=19.2、2.1Hz、1H)、5.79(d、J=6.1Hz、1H)、5.39~5.61(m、2H)、5.21~5.32(m、1H)、4.69(dd、J=4.8、2.8Hz、1H)、4.39~4.55(m、1H)、4.02(q、J=3.5Hz、1H)、3.78~3.87(m、1H)、3.66~3.76(m、1H)、3.54~3.62(m、1H)、2.95~3.14(m、2H)、0.91(s、9H)、0.13(s、3H)、0.13(s、3H);ESI-MS:m/z 801.3[M+H]+。
乾燥THF(3mL)中の化合物22g(100mg、0.129mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45Mの溶液の2.22mL、0.99mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで5分処理した後、乾燥THF(1mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(75mg、0.25mmol)を、シリンジを通して10分かけて滴下した(注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。tBuOOHの溶液(デカン中5~6Mの溶液の114μL、0.624mmol)を、シリンジを通して添加し、撹拌を更に30分継続した。混合物をDCM(20mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~6%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物22hを得た(66mg、収率57%)。ESI-MS:m/z 916.3[M+H]+。
化合物22h(66mg、0.072mmol)を、エタノール中30%のメチルアミン溶液(5mL)中で、室温で4時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を水に溶解し、DCMで洗浄し、凍結乾燥した。粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:Agela Durashell C18、5μm、150×25mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物22iを得た(11.6mg、収率:14.5%)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm9.57(d、J=1.5Hz、1H)、9.35(dd、J=1.5、9.5Hz、2H)、8.71(d、J=1.3Hz、1H)、8.09(d、J=1.8Hz、1H)、7.04(d、J=8.3Hz、1H)、6.86(br、d、J=19.6Hz、1H)、6.18~5.91(m、2H)、5.84~5.65(m、1H)、5.24(br、s、1H)、4.88~4.80(m、3H)、4.74~4.59(m、1H)、4.05(br、dd、J=5.4、14.4Hz、1H)、3.96~3.81(m、1H)、1.44(d、J=1.3Hz、9H)、0.73~0.60(m、6H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-198.496(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-198.496(s、1F);ESI-MS:m/z 759.2[M+H]+。
ピリジン(3mL)中の化合物22i(40mg、0.053mmol)の溶液に、Et3N(320mg、3.16mmol)及びトリエチルアミン三フッ化水素酸塩(254mg、1.58mmol)を添加し、50℃で4時間撹拌した。反応混合物を適切な温度まで冷却し、THF(2mL)で希釈した。イソプロポキシトリエチルシラン(697mg、5.27mmol)を添加し、撹拌を室温で1.5間撹拌を継続した。残分を、減圧下での濃縮後に得て、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD 5μm 150×25mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物49、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、白色固体として化合物49、ナトリウム塩を得た(22.5mg、収率:58%)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.95(s、1H)、8.76(s、1H)、8.53(s、1H)、8.13(s、1H)、6.73~6.58(m、1H)、6.53(d、J=8.0Hz、1H)、6.42~6.33(m、1H)、5.93(br、dd、J=4.3、7.8Hz、1H)、5.50~5.30(m、1H)、5.19~5.04(m、1H)、4.88~4.81(m、1B)、4.55~4.44(m、2H)、4.39~4.32(m、1H)、4.25(ddd、J=2.3、4.9、12.2Hz、1H)、3.71(br、d、J=13.1Hz、1H)、3.46(br、d、J=12.8Hz、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-197.119(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-1.984(s、1P);ESI-MS:m/z 645.2[M+H]+。
化合物13a(900mg、1.16mmol)を、無水ACN(103mL)及び無水THF(103mL)の混合物に溶解した。1H-テトラゾール(10.2mL、MeCN中の3~4%、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥l)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で2時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.48mL、1.51mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で4時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.48mL、1.51mmol)を添加した。反応混合物を室温で1時間振盪し、次いでフェニルアセチルジスルフィド(0.7g、2.33mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分振盪した。反応混合物を濾過した。モレキュラーシーブをジクロロメタンで3回洗浄した。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~100%のMeOH)により精製し、化合物23aを得た(152mg、収率:11%)。ESI-MS:m/z 904.3[M+H]+。
エタノール中33%のメチルアミンの溶液(7mL、56mmol)中の化合物23a(152mg、0.12mmol)を、40℃で3時間撹拌した。反応混合物を、減圧下で蒸発乾固させた。残分を、10mLの無水アセトニトリル中ですりつぶした。沈殿物を濾過により回収し、無水アセトニトリルで洗浄した。精製/2つのエピマーの分離を、逆相分取HPLC(固定相:RP XBrige Prep C18 OBD-10μm 50×150mm、移動相:0.25%NH4HCO3水溶液、MeOH)により行った。2つの純粋な画分の溶媒を凍結乾燥により除去した。残分を水に溶解し、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填した予め洗浄した(水)カラムで濾過し、白色固体として化合物(*R)16A、ナトリウム塩(37mg、収率29%)及び化合物(*S)16B、ナトリウム塩(5mg、収率6%)を得た。
化合物19g(0.6g、0.77mmol)を、無水ACN(55mL)及び無水THF(55mL)の混合物に溶解した。1H-テトラゾール(8.94mL、MeCN中の3~4%、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥l)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で1時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.24mL、0.77mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で2.5時間振盪し、次いでフェニルアセチルジスルフィド(PADS、0.46g、1.53mmol)を添加した。反応混合物を室温で18時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~100%のMeOH)により精製し、化合物24aを得た(184mg、収率:26%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.13(dd、J=6.7、1.4Hz、6H)2.69~2.87(m、2H)3.07(t、J=5.9Hz、2H)3.25~3.30(m、1H)3.35~3.47(m、2H)3.53(s、3H)3.55~3.65(m、1H)4.31~4.48(m、4H)4.51~4.61(m、2H)5.14(dd、J=8.5、4.1Hz、1H)5.38~5.52(m、1H)6.20(d、J=8.5Hz、1H)6.60(dd、J=8.5、6.1Hz、1H)7.56(t、J=7.4Hz、2H)7.65(t、J=7.0Hz、1H)8.05(d、J=7.5Hz、2H)8.35(s、1H)8.44(br s、1H)8.73(s、1H)8.76(s、1H)11.22(br s、1H)11.73(s、1H)12.11(br s、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm65.02(s、1P);ESI-MS:m/z 915.5[M+H]+。
エタノール中33%のメチルアミンの溶液(10mL、81mmol)中の化合物24a(184mg、0.2mmol)を、45℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残分を、3mLの無水アセトニトリル中ですりつぶした。沈殿物を濾過により回収し、無水アセトニトリルで洗浄した。精製を、逆相分取HPLC(固定相:RP XBrige Prep C18 OBD-10μm 50×150mm、移動相:0.25%NH4HCO3水溶液、MeOH)により行った。純粋な画分の溶媒を凍結乾燥により除去した。残分を水に溶解し、イオン交換樹脂IR120のNa+形態で充填した予め洗浄した(水)カラムで濾過した。得られた溶液の溶媒を凍結乾燥により除去し、ふわふわした白色固体として化合物(*R)13A、ナトリウム塩を得た(93mg、収率66%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm10.59(br s、1H)、8.42(s、1H)、8.37(s、1H)、8.05(s、1H)、7.23~7.33(m、2H)、7.28(br s、2H)、6.52(br s、2H)、6.35(dd、J=8.4、6.0Hz、1H)、6.02(d、J=8.5Hz、1H)、5.48(br dd、J=8.6、4.0Hz、1H)、5.17(br s、1H)、4.36(br s、1H)、4.12(s、2H)、3.95~4.04(m、1H)、3.88~3.95(m、1H)、3.48~3.59(m、1H)、3.47(s、3H)、3.18(dd、J=14.0、4.3Hz、1H)、3.06(ddd、J=13.9、8.2、5.9Hz、1H)、2.53~2.68(m、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm52.21(s、1P);ESI-MS:m/z 688.3[M+H]+。
化合物12a(300mg、0.38mmol)を、無水ACN(33mL)及び無水THF(33mL)の混合物に溶解した。1H-テトラゾール(4.4mL、MeCN中の3~4%、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥l)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で1時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.12mL、0.38mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で4.5時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.06mL、0.19mmol)を添加した。反応混合物を室温で18時間振盪し、次いでフェニルアセチルジスルフィド(0.23g、0.75mmol)を添加した。反応混合物を室温で2時間振盪した。反応混合物を濾過した。モレキュラーシーブをジクロロメタンで3回洗浄した。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物25aを得た(103mg、収率27%)。ESI-MS:m/z 921.4[M+H]+。
化合物25a(103mg、0.1mmol)を、エタノール中33%のメチルアミンの溶液(6mL、58.4mmol)中に入れ、45℃で1時間撹拌した。反応混合物を、減圧下で蒸発乾固させた。残分を、10mLの無水アセトニトリル中ですりつぶした。沈殿物を濾過により回収し、無水アセトニトリルで洗浄した。精製/2つのエピマーの分離を、逆相分取HPLC(固定相:RP XBrige Prep C18 OBD-10μm 50×150mm、移動相:0.25%NH4HCO3水溶液、MeOH)により行った。2つの純粋な画分の溶媒を凍結乾燥により除去した。残分を水に溶解し、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填した予め洗浄した(水)カラムで濾過した。得られた溶液の溶媒を凍結乾燥し、各々白色固体として化合物31A及び31Bを得た。
クロロトリメチルシラン(5.53mL、43.7mmol)を、乾燥ピリジン(26mL)中の26a[CAS番号847648-20-8](2.6g、8.74mmol)の溶液に0℃で滴下した。反応溶液を室温で30分撹拌した後、0℃まで再度冷却した。イソブチリルクロリド(4.58mL、43.7mmol)を15分かけて滴下し、撹拌を変換完了まで室温で継続した。反応物を0℃まで冷却し、水を添加し、続いて20分後にアンモニア水溶液((26%、18mL)を添加し、撹拌を室温で2時間継続した。反応溶液を酢酸で中和し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7%のMeOH)により行い、灰白色固体として化合物26bを得た(1.3g、収率:40%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.10(s、1H)、11.71(s、1H)、7.96(s、1H)、5.93(d、J=4.1Hz、1H)、4.80(t、J=5.5Hz、1H)、4.50(t、J=2.1Hz、1H)、4.23(q、J=5.0Hz、1H)、3.78(q、J=2.1Hz、1H)、3.71(m、1H)、3.63(m、1H)、3.37(s、3H)、2.78(m、1H)、1.23(d、J=4.8Hz、1H)、1.12(d、J=6.9Hz、6H);ESI-MS:m/z 367.9[M+H]+。
乾燥ピリジン(35mL)中の化合物26b(1.75g、4.76mmol)の溶液に、DMAP(0.29mL、2.38mmol)及びDMTrCl(2.41g、7.14mmol)を(小分けして)添加し、変換完了まで室温で撹拌した(約1.5時間)。反応混合物をメタノール(15mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2.5%のMeOH)により行い、淡い褐色の泡状物として化合物26cを得た(3.1g、収率:96%)、1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.89(d、J=177.0Hz、2H)、7.75(s、1H)、7.39(d、J=7.6Hz、2H)、7.25(m、7H)、6.86(m、4H)、5.98(d、J=4.1Hz、1H)、5.83(d、J=2.1Hz、1H)、4.49(m、2H)、3.82(q、J=2.1Hz、1H)、3.73(d、J=2.8Hz、6H)、3.27(s、3H)、3.22(m、1H)、2.78(m、1H)、1.12(dd、J=6.9、2.1Hz、6H);ESI-MS:m/z 669[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(0.35g、2.9mmol)、乾燥DCM(10mL)及び活性化3Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で少なくとも2時間撹拌した。同時に、各々乾燥DCM(2×10mL)中の、化合物26c(0.38g、0.57mmol)の溶液及びスルファミン酸塩17a(0.6g、0.69mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約2時間)。両方の溶液(それぞれ化合物26c及びスルファミン酸塩17a)を、引き続いて反応フラスコに移した。得られた反応混合物を24時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液、食塩水、及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により精製し、泡状物として化合物26dを得た(0.44g、収率:55%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.12(s、1H)、11.69(s、1H)、11.22(s、1H)、8.63(s、1H)、8.45(s、1H)、8.02(d、J=6.9Hz、2H)、7.64(q、J=7.3Hz、2H)、7.55(t、J=7.6Hz、2H)、7.49(d、J=7.6Hz、2H)、7.36(m、8H)、7.23(m、8H)、6.92(t、J=9.6Hz、4H)、6.84(dd、J=13.8、9.0Hz、4H)、6.28(d、J=19.3Hz、1H)、6.05(d、J=1.0Hz、1H)、5.15(s、1H)、4.97(m、1H)、4.85(d、J=22.0Hz、1H)、4.40(q、J=5.0Hz、1H)、3.98(m、2H)、3.70(t、J=3.1Hz、12H)、3.23(d、J=6.9Hz、2H)、3.13(s、3H)、2.79(m、2H)、2.65(m、2H)、1.10(d、J=5.5Hz、6H);ESI-MS:m/z 1406[M+H]+。
DCM(12mL)中の化合物26d(430mg、0.3mmol)の溶液に、DCA(DCM中10%の1.0mL、1.2mmol)及び水(27μL、1.5mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した(約1時間)。反応混合物を、ピリジン(120μL、1.5mmol)及び数滴のメタノールを添加することによりクエンチした。減圧下での濃縮後に得られた残分を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~8%のMeOH)により精製し、白色粉末として化合物26eを得た(225mg、収率:92%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.11(s、1H)、11.67(s、1H)、11.25(s、1H)、8.73(s、1H)、8.57(s、1H)、8.04(d、J=6.9Hz、2H)、7.87(s、1H)、7.65(t、J=7.6Hz、1H)、7.55(t、J=7.9Hz、2H)、6.29(dd、J=19.6、1.7Hz、1H)、6.04(s、1H)、5.92(s、1H)、5.58(m、1H)、5.22(s、1H)、4.92(d、J=10.3Hz、1H)、4.62(m、1H)、4.17(q、J=5.0Hz、1H)、4.10(t、J=2.1Hz、1H)、4.02(td、J=7.2、2.5Hz、1H)、3.70(m、1H)、3.61(m、1H)、3.45(m、1H)、3.37(s、3H)、3.06(q、J=7.3Hz、1H)、2.77(m、1H)、1.12(dd、J=6.9、2.1Hz、6H)、ESI-MS:m/z 801.0[M+H]+。
1:1MeCN/THF(CN/48mL、3Åモレキュラーシーブで乾燥、3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物26e(220mg、0.27mmol)及び1H-テトラゾ-ル(3.2mL、MeCN中3~4%、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで1時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(87μg、0.27mmol)を一度に添加した。得られた反応混合物を室温で22時間振盪した。フェニルアセチルジスルフィド(PADS、0.45g、1.5mmol)を添加し、振盪を更に1時間継続した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。合わせた濾液を、引き続いて飽和Na2S2O3水溶液及び飽和NaHCO3水溶液の1:1混合物並びに食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物26fを得た(55mg、収率:21%)。ESI-MS:m/z 933.5[M+H]+。
化合物26e(55mg、0.059mmol)を、エタノール(4mL)中33%のメチルアミン中で、変換完了まで45℃で撹拌(約1時間)した後、反応溶液を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。粗生成物をMeCN中ですりつぶし、得られた沈殿物を、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により更に精製し、両方のP-エピマー、すなわち最初の溶出異性体として化合物(*R)7A、アンモニウム塩及び2番目の溶出異性体として化合物(*S)7B、アンモニウム塩を分離した。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、白色固体として化合物(*R)7A、ナトリウム塩(収率:7mg、16%)及び白色固体として化合物(*S)7B、ナトリウム塩(収率:4mg、9%)を得た。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
テトラヒドロフラン(14mL)中の17d(400mg、0.518mmol)の溶液に4Åモレキュラーシーブ(粉末、2g)を添加し、混合物を20分撹拌した。20分後、1H-テトラゾール(アセトニトリル中0.45M、9.2mL)の溶液を25℃で添加し、続いて、2-シアノエチル-N,N,N”,N”-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(0.31g、1.037mmol、2mLのTHFに希釈)の溶液を25℃で添加した。室温で1.5時間撹拌した後、(E)-N,N-ジメチル-N’-(3-チオキソ-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-イル)ホルムイミダミド(DDTT、0.453g、2.205mmol、10mLのPyに希釈)を25℃で添加し、溶液を1.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~15%のMeOH)により精製し、淡黄色固体として27aを得た(80mg)。ESI-MS:m/z=902.9[M+H]+。
メチルアミン(EtOH中50%、5.0mL)中の化合物27a(80mg、0.09mmol)の溶液を、25℃で4時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。逆相分取HPLC(カラム:XBridge 150×30mm 10μm、条件:水(10mMのNH4HCO3)-CH3CN、B5で開始、B20で終了、勾配時間(分):7、100%Bの保持時間(分):0、流速(mL/分):25)により精製し、両方とも白色固体として化合物(*R)44A、アンモニウム塩(19mg)及び化合物(*S)44B、アンモニウム塩(1.5mg)を得た。両方の化合物のそれらの相当するナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行った。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.22(br、s、1H)、8.09(s、1H)、7.29(br、s、1H)、6.57~6.50(m、1H)、6.05~5.98(m、2H)、5.94~5.78(m、1H)、5.31~5.13(m、1H)、4.70(br、d、J=7.5Hz、1H)、4.60(br、d、J=8.8Hz、1H)、4.26(br、dd、J=4.3、11.5Hz、1H)、4.19~4.11(m、1H)、3.85(br、d、J=13.3Hz、1H)、3.56(br、d、J=13.3Hz、1H)、2.81~2.63(m、2H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-195.872(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm52.528(s、1P);ESI-MS:m/z 676.0[M+H]+。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.20(s、1H)、7.87(s、1H)、7.28(s、1H)、6.59~6.46(m、1H)、6.22~6.14(m、1H)、5.97(d、J=7.5Hz、1H)、5.53~5.34(m、2H)、4.66~4.54(m、2H)、4.34(br、t、J=11.5Hz、1H)、4.11(br、dd、J=4.6、11.9Hz、1H)、3.77(br、d、J=13.3Hz、1H)、3.45(br、d、J=13.3Hz、1H)、3.02(q、J=7.3Hz、1H)、2.76~2.66(m、1H)、2.78~2.65(m、1H)、2.58(br、dd、J=7.8、12.5Hz、1H)、1.26~1.18(m、1H)、1.27~1.17(m、1H)、1.22(br t.J=7.3Hz、1H)、1.32~1.10(m、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-195.902(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm56.151(s、1P);ESI-MS:m/z=677.0[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
テトラヒドロフラン(9mL)中の18a(430mg、0.532mmol、凍結乾燥により乾燥)の溶液に、4Åモレキュラーシーブ(粉末、2g)を添加し、混合物を20分撹拌した。20分後、1H-テトラゾールの溶液(アセトニトリル中0.45M、9.46mL、945mgのテトラゾール(凍結乾燥により乾燥)を乾燥CH3CN30mLに溶解し、続いて1.5gの、4ÅMSを添加し、次いでN2下で使用前に1時間撹拌することにより調製)を、25℃で添加し、N2で数回パージし、続いて3-((ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)オキシ)プロパンニトリル(0.288mg、0.958mmol、2mLのTHFに希釈したもの)の溶液を25℃で30分かけて滴下し、白色の懸濁液を得た。室温で1.5時間撹拌した後、ピリジン(10mL)中のDDTT(655mg、3.19mmol)の溶液を25℃で添加し、溶液を30分撹拌した。反応混合物を別のバッチと合わせ、珪藻土パッドを通して濾過し、減圧下で濃縮し、黄色の残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、白色固体として28aを得た(260mg)。ESI-MS:m/z 939.1[M+H]+。
メチルアミン(EtOH中27~32%、5.0mL)中の化合物28a(130mg、0.138mmol)の溶液を、室温で2時間撹拌した。反応混合物を別のバッチと合わせ、混合物を減圧下で蒸発させ、白色固体を得て;固体を水(30mL)で溶解し、DCM(20mL×4)で洗浄した。水層を凍結乾燥し、白色固体を得た(190mg)。白色固体を、逆相分取HPLC(カラム:XBridge 150×30mm×5μm、条件:水(10mMのNH4CO3)-CH3CN、B5で開始、B35で終了、勾配時間(分):7、100%Bの保持時間(分):0、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物(*R)42A、アンモニウム塩(70mg)及び白色固体として化合物(*S)42B、アンモニウム塩(12mg)を得た。
Dowex 50W×8,200-400(12mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4(少なくとも4CV)で洗浄し、次いでpHが中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、pHが中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物(*R)42A、アンモニウム塩塩(92mg、20mL/9mL中)を最小量の脱イオン水及びCH3CN(1:1、体積/体積)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯めて凍結乾燥し、白色固体として化合物(*R)42A、ナトリウム塩を得た(72.4mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.96(br s、1H)、8.24(br d、J=13.2Hz、2H)、7.13(s、1H)、6.62~6.41(m、2H)、5.95~5.64(m、3H)、5.27~5.06(m、1H)、5.02~4.89(m、1H)、4.63(br d、J=8.3Hz、1H)、4.39(br s、2H)、3.92(br d、J=11.5Hz、1H)、3.72(br d、J=13.2Hz、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-196.32(s、1F)、-198.94(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O):δppm54.05(s、1P);
ESI-MS:m/z=678.1[M+H]+。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.63(s、1H)、8.23(s、1H)、8.08(s、1H)、7.29(s、1H)、6.56~6.39(m、2H)、5.95~5.77(m、1H)、5.73~5.58(m、1H)、5.58~5.45(m、1H)、5.58~5.44(m.1H)、5.36~5.22(m、1H)、4.91~4.78(m、1H)、4.53(br dd、J=6.1、11.0Hz、1H)、4.19(br d、J=11.7Hz、1H)、4.25~4.13(m、1H)、3.79(dd、J=4.0、13、6Hz、1H)、3.71~3.70(m、1H)、3.66~3.66(m、1H)、3.68~3.59(m、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-195.10~-196.43(m、1F)、-198.17(td、J=25.9、52.5Hz、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δ55.26(1s、1P);ESI-MS:m/z=678.1[M+H]+。
ピリジン(10.06mL、124.86mmol)及びジクロロメタン(300mL)中の化合物29a(13g、49.94mmol)の溶液に、無水トリフルオロメタンスルホン酸(10.92mL、64.93mmol)を0℃で滴下した。反応物を0℃で約1時間撹拌した後、混合物をDCM(100mL)で希釈し、水(200mL)、食塩水(200mL)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させ、黄色の油として29b(20.4g)得て、これを更に精製することなく次ステップに使用した。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ6.07(d、J=3.6Hz、1H)、5.35(d、J=1.6Hz、1H)、4.85(d.J=3.8Hz、1H)、4.32~4.19(m、3H)、4.06(dd、J=3.90、8.8Hz、1H)、1.61(s、3H)、1.51(s、3H)、1.42(d、J=2.6Hz、6H).
トルエン(500mL)中の化合物29b(20.4g、51.99mmol)の溶液に、n-Bu4NBH4(40.13g、155.98mmol)を25℃で滴下した。80℃で6時間撹拌した後、反応混合物を水(200mL)、食塩水(200mL)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させ、黄色の油を得た。得られた油をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE中の0~20%のEA)により精製し、無色の油として化合物29cを得た(6.4g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ5.83(d、J=3.8Hz、1H)、4.77(t、J=4.1Hz、1H)、4.23~4.08(m、3H)、3.89~3.76(m、1H)、2.19(dd、J=3.9、13.4Hz、1H)、1.82~1.73(m、1H)、1.52(s、3H)、1.43(s、3H)、1.35(d、J=15.3Hz、6H).
AcOH/水(体積/体積で1:1、200mL)中の化合物29c(13.4g、54.85mmol)の溶液を、25℃で12時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、トルエン(2×40mL)と共蒸発させ、無色の油として化合物29d(11.4g)を得て、これを更に精製することなく次ステップ用に直接使用した。
MeOH(200mL)及び水(100mL)中の化合物29d(11.4g、8.81mmol)の溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム(17.91g、83.73mmol)を添加した。25℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、濾液を飽和Na2S2O3水溶液(50mL)で希釈し;次いで混合物を濃縮し、MeOHを除去した。残分を、2-Me-THF(200mL)で分液し、水層を2-Me-THF(5×100mL)で抽出した。次いで有機層を合わせ、食塩水で洗浄し、乾燥(無水Na2SO4)させ、濾過し、減圧下で濃縮し、黄色の油として化合物29e(11g)を得て、これを更に精製することなく次ステップ用に直接使用した。
MeOH(200mL)中の化合物29e(11g、9.29mmol)の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム(2.9mg、76.66mmol)を添加した。0℃で1時間撹拌した後、反応混合物を飽和NH4Cl水溶液(60mL)でクエンチし、混合物を濃縮し、MeOHを除去した。残分を凍結乾燥し、粗29fを得た。粗生成物をMeOH/DCM(体積/体積で10:1、200mL)と混合し、次いで濾過し、減圧下で濃縮し、残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA中の0~60%のPE)により精製し、黄色固体として化合物29fを得た(5.3g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ5.83(d、J=3.7Hz、1H)、4.77(t、J=4.2Hz、1H)、4.41~4.30(m、1H)、3.90(br d、J=12.0Hz、1H)、3.57(br d、J=12.0Hz、1H)、2.01(dd、J=4.5、13.3Hz、1H)、1.89~1.81(m、2H)、1.33(s、3H).
無水酢酸(6.51mL、68.9mmol)及び濃硫酸(36.91μL、0.69mmol)を、酢酸(39.4mL、688.89mmol)中の化合物29f(1.2g、6.89mmol)の撹拌溶液に0℃で添加した。室温で1時間撹拌した後、反応混合物を冷水(100mL)でクエンチし、室温で30分撹拌し、酢酸エチルで抽出した(3×60mL)。有機層を引き続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(3×90mL)、食塩水(2×90mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:4g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE中の0~40%のEA、体積/体積)により精製し、無色の油として化合物29gを得た(870mg)。1H NMR(400MHz、CD3CN)δ6.03(s、1H)、5.11(d、J=4、6Hz、1H)、4.49(dtd、J=3.3、6.5、9.6Hz、1H)、4.19(dd、J=3.3、11.9Hz、1H)、4.00(dd、J=6.6、12.0Hz、1H)、2.03~1.99(m、11H).
同じ反応を数回繰り返し、全てのバッチを合わせた。
無水CH3CN(12mL)中の化合物29h(0.672g、4.42mmol)及びBSA(3.13g、15.37mmol)の溶液を85℃で1時間撹拌し、次いで0℃まで冷却した。次いでこれに、化合物29g(1g、3.84mmol)及びSnCl4(3.003g、11.53mmol)を0℃で撹拌下滴下し;混合物を26℃で24時間撹拌した後、粗混合物を別のバッチと合わせ、冷却し、EA(300mL)で希釈した。有機層を引き続いて飽和NaHCO3水溶液(4×200mL)、食塩水(2×150mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:10g)をシリカ(20g)でのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~10%のMeOH、体積/体積)により精製し、白色の泡状物として化合物29iを得た(3.52g)。1H NMR(400MHz、CD3OD-d4)δ6.22(s、1H)、5.75(br、d、J=5.5Hz、1H)、4.65(br dd、J=3.6、9.7Hz、1H)、4.31(dd、J=3.3、12.0Hz、1H)、4.12(dd、J=5.6、11.9Hz、1H)、3.35(s、3H)、2.80(ddd、J=5.8、10.0、14.1Hz、1H)、2.33(br、dd、J=6.0、13.8Hz、1H)、2.12(s、3H)、1.97~1.93(m、3H);ESI-MS:m/z 352.9[M+H]+。
DCM(20mL)中の化合物29i(2g、5.677mmol)の溶液に、Et3N(1.72g、17.03mmol)及びイソブチリルクロリド(1.12g、11.35mmol)を室温で滴下した。25℃で2時間撹拌した後、反応物を水(50mL)でクエンチし、食塩水(2×50mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、化合物29j(2.39g)を得て、これを更に精製することなく次ステップ用に直接使用した。
THF(25mL)中の化合物29j(2.39mg、5.67mmol)の溶液に、ナトリウムメタノレート(1.23g、22.71mmol)を0℃で滴下した。25℃で2時間撹拌した後、更なるナトリウムメタノレートを滴下した(1.23g、22.71mmol)。25℃で0.5時間撹拌した後、混合物を飽和水/CH3COOH(1:1、4mL)で希釈し、pH7に調整し、次いで減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:10g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~10%のMeOH、体積/体積)により精製し、白色の泡状物として化合物29kを得た(770mg)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.09(br s、2H)、5.99(s、1H)、5.75(br d、J=2.9Hz、1H)、4.80~4.70(m、2H)、4.49~4.36(m、1H)、3.51~3.40(m、2H)、2.79(td、J=6.8、13.6Hz、1H)、2.43~2.30(m、1H)、2.07(dd、J=6.7、12.6Hz、1H)、1.13(d、J=6.6Hz、6H);ESI-MS:m/z 339.1[M+H]+。
DMTrCl(1.20g、3.54mmol)を、Py(10mL)中の化合物29k(1g、2.95mmol)の溶液に添加した。25℃で12時間撹拌した後、混合物を、EA(150mL)及び水(100mL)に分液した。混合物を濾過し、有機層を引き続いて食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、乾燥するまで濃縮し、粗残分(油)を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:5g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~10%のMeOH、体積/体積)により精製し、黄色の泡状物として化合物29lを得た(1.52g)。1H NMR(400MHz、CD3CN)δ7.32(dd、J=1.6、7.9Hz、2H)、7.22~7.10(m、7H)、6.73(dd、J=8.8、13、9Hz、4H)、6.13(s、1H)、4.93(br s、1H)、4.77~4.57(m、1H)、3.77(br s、1H)、3.73(d、J=3.9Hz、6H)、3.23~3.04(m、2H)、2.70(spt、J=6.9Hz、1H)、2.57(ddd、J=5.3、9.8、13.3Hz、1H)、2.08(dd、J=6.4、13.4Hz、1H)、1.19(d、J=6.8Hz、6H).
ESI-MS:m/z=663.3[M+Na]+。
ヨウ化テトラブチルアンモニウム(0.89g、2.41mmol)、トリフェニルホスフィン(4.74g、18.08mmol)、四臭化炭素(5.996g、18.080mmol)、NaN3(3.330g、51.223mmol)を、DMF(70mL)中の化合物29m(4.5g、12.05mmol、CAS番号144924-99-2cb)の溶液に30℃で添加した。30℃で24時間撹拌した後、更なるヨウ化テトラブチルアンモニウム(0.89g、2.41mmol)、トリフェニルホスフィン(4.74g、18.00mmol)及び四臭化炭素(5.99g、18.08mmol)を、溶液に添加した。更に24時間撹拌した後、混合物を飽和Na2CO3水溶液(150mL)で希釈し、混合物をpH9に調整し、混合物を酢酸エチルで抽出した(200mL×3)。次いで有機層を合わせ、引き続いて食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、黄色固体を得た。反応を数回繰り返し、全てのバッチを合わせた。残分(シリカゲルと合わせたもの、30g)をシリカゲル(シリカゲル:120g)でのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%の酢酸エチルから、酢酸エチル中の0~20%のメタノールまで)により精製し、黄色固体として化合物29nを得た(9.5g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.28(br、s、1H)、8.78(s、1H)、8.54(d、J=2.4Hz、1H)、8.08~8.02(m、2H)、7.68~7.62(m、1H)、7.58~7.52(m、2H)、6.66~6.58(m、1H)、6.18(br s、1H)、5.46~5.24(m、1H)、4.56(td、J=4.4、19.1Hz、1H)、4.08~4.04(m、1H)、3.72~3.68(m、1H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δppm-197.05(s、1H);ESI-MS:m/z 398.9[M+H]+。
ピリジン(90mL)中の化合物29n(8.5g、21.33mmol)及びDMAP(1.3g、10.67mmol)の溶液に、DMTrCl(14.46g、42.67mmol)を25℃で添加した。80℃で14時間撹拌した後、混合物を、DCM(200mL)及び水(50mL)に分液した。有機層を食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させ、粗29oを得た。これを別のバッチと合わせ、精製し;残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE/(EA/DCM=1:1)10%~100%)により精製し、淡黄色固体として化合物29oを得た(9.5g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ9.00(s、1H)、8.84(br、s、1H)、8.20(br、s、1H)、8.02(br.d、J=7.6Hz、2H)、7.64~7.58(m、1H)、7.54(br、t、J=7.5Hz、2H)、7.46(br、d、J=7.1Hz、2H)、7.40~7.34(m、5H)、7.30(br、d、J=7.3Hz、1H)、6.94~6.84(m、4H)、6.58~6.48(m、1H)、4.48~4.34(m、2H)、4.18~4.06(m、1H)、3.38(br d、J=13.0Hz、1H)、3.18(br、dd、J=5.9、13.9Hz、1H);19F NMR(376MHz、CDCl3)δ-196.176(s、1F);ESI-MS:m/z 701.2[M+H]+。
THF(100mL)中の化合物29o(10.0g、14.27mmol)の溶液に、トリフェニルホスフィン(5.24g、1.99mmol)を25℃で添加した。溶液を40℃で2時間撹拌した後、溶液に水(50mL)を40℃で添加し、混合物を12時間撹拌した。反応混合物をDCM(200mL)及び食塩水(2×50mL)に分液した。有機層を減圧下で濃縮し、黄色固体を得た(10.0g)。黄色固体(シリカゲルと合わせたもの:20g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM/MeOH=0%~20%)により精製し、白色固体として化合物29pを得た(6.6g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm8.74(s、1H)、8.46(d、J=2.7Hz、1H)、8.06~7.98(m、2H)、7.64(d、J=7.3Hz、1H)、7.58~7.50(m、2H)、7.48(d、J=7.6Hz、2H)、7.38~7.32(m、6H)、7.30~7.26(m、1H)、6、94(dd、J=3.4、8、8Hz、4H)、6.50~6.40(m、1H)、4.38~4.32(m、1H)、4.24~4.08(m、2H)、3.74(d、J=2.9Hz、6H)、2.68~2.54(m、2H):19FNMR(376MHz、DMSO~d6)δppm~195.79(s、1F);ESI-MS:m/z 675.3[M+H]+。
4-ニトロフェノール(0.92g、6.67mmol)及びトリエチルアミン(1.35、13.34mmol)を、DCM(40mL)中の化合物29p(1.5g、2.22mmol)の溶液に添加した。得られた溶液を-78℃で撹拌し、DCM(5mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(1.58g、6.67mmol)の溶液を-78℃で添加した。-78℃で1時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:4g)を、シリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA中の0%~100%のPE)により精製し、淡黄色固体として化合物29q(1.4g)を得て、-20℃で保存した。1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm8.94(br、s、1H)、8.64(s、1H)、8.48(br、s、1H)、8.18~8.08(m、2H)、8.00(br、d、J=7.8Hz、2H)、7.96(s、1H)、7.66~7.60(m、1H)、7.58~7.52(m、2H)、7.44(br、d、J=7.8Hz、2H)、7.38~7.28(m、7H)、6.92~6.84(m、4H)、6.40~6.26(m、1H)、4.48~4.42(m、2H)、4.28(br、s、1H)、3.86~3.76(m、6H)、3.56(br、d、J=13.2Hz、1H)、3.32(br、d、7=13.7Hz、1H);19F NMR(376MHz、CDCl3)δ-193.08(s、1F);ESI-MS:m/z 876.6[M+H]+。
THF(24mL)中の化合物29l(800mg、1.25mmol)、化合物29q(1.64g、1.87mmol)の溶液及び活性化4Åモレキュラーシーブ(3g)を、N2下、室温で0.5時間撹拌した。次いでDMAP(762.73mg、6.24mmol)を一度に添加した。N2下、室温で2時間、次いでN2下、45℃で12時間撹拌した後、反応混合物をEA(100mL)で希釈し、次いで珪藻土パッドを通して濾過した。濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(6×50mL)。有機層を引き続いて食塩水(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:5g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~10%のMeOH、体積/体積)により精製し、白色固体として化合物29rを得た(1.4g)。ESI-MS:m/z 1377.1[M+H]+。
DCM(24mL)中の化合物29r(1.4g、1.01mmol)の溶液に、ジクロロ酢酸(262mg、2.03mmol)及び水(0.183mL)を室温で滴下した。N2下、室温で3時間撹拌した後、溶液にピリジン(0.8g、10.16mmol)を添加した。2時間撹拌した後、混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:6g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH/DCM=0%~10%)により精製し、白色固体として化合物29sを得た(570mg)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.15~11.97(m、2H)、11.22(s、1H)、8.78(t、J=5.9Hz、1H)、8.67(s、1H)、8.41(d、J=1.5Hz、1H)、8.09~8.00(m、2H)、7.69~7.61(m、1H)、7.60~7.51(m、2H)、6.51(dd、J=3.8、17.6Hz、1H)、6.34(s、1H)、6.23(d、J=4.0Hz、1H)、5.95(s、1H)、5.33~5.13(m、1H)、4.76(t、J=5.5Hz、1H)、4.51~4.33(m、2H)、4.18~4.02(m、2H)、3.54~3.36(m、3H)、2.90~2.73(m、1H)、2.69~2.56(m、1H)、2.40(br、dd、J=6.0、14.3Hz、1H)、1.13(dd、J=6.9、10.2Hz、6H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δppm-197.57(s、1F);ESI-MS:m/z 773.3[M+H]+。
THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
真空乾燥した化合物29s(100mg、0.13mmol)を、CH3CN及びTHFの混合物と共蒸発(2/2mL×3)させ、次いでTHF(5mL)の混合物に溶解した。次いでこれに、4ÅMS(500mg)及び1H-テトラゾールの溶液(2.301mL、0.45M、315mgのテトラゾールを乾燥CH3CN10mLに溶解し、続いて500mgの4ÅMSを添加し、次いでN2下、使用前に1時間撹拌することにより調製)を添加した。得られた白色の懸濁液を、N2下、室温で5分撹拌した。次いで、THF(1mL)中の2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト(78.01mg、0.26mmol)の溶液を、シリンジを通して5分かけて滴下した。得られた白色の懸濁液を、N2下、35℃で1時間更に撹拌した。TBHPの溶液(0.118mL、0.65mmol、デカン中5~6M)を、シリンジを通して更に30分かけて添加した。混合物をDCM(20mL)で希釈し、次いで珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮し、無色の油として粗生成物を得た。粗生成物(シリカゲルと合わせたもの:2g)をシリカでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~6%のMeOH、体積/体積)により精製し、白色固体として化合物29tを得た(72mg)。ESI-MS:m/z=887.9[M+H]+。
化合物29t(72mg、0.082mmol)をメチルアミン(5.0mL)と合わせ;4時間室温で撹拌した後、反応混合物を圧力下で濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を、逆相分取HPLC(カラム:XBridge 10μm 150×30mm、条件:水(10mMのNH4CO3)-ACN、B0で開始、B25で終了、勾配時間(分):7、100%Bの保持時間(分):0、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物45、アンモニウム塩を得た(6.9mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.12(s、1H)、7.67(br、s、1H)、6.52(br、dd、J=4.9、11.7Hz、1H)、6.31(br、d、J=7.0Hz、1H)、6.18~6.04(m、1H)、5.64~5.43(m、1H)、5.32~5.20(m、1H)、4.37(br、d、J=3.5Hz、1H)、4.15~4.03(m、2H)、3.57~3.46(m、2H)、2.83~2.71(m、1H)、2.67~2.56(m、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-195.88(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-1.513(s、1P);ESI-MS:m/z=661.1101[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
化合物29s(200mg、0.26mmol)をTHF(6mL)及びCH3CN(10mL)に溶解し、これに、0.3gの4ÅMS(粉末)及び1H-テトラゾール(4.6mL、0.45M、使用前に活性化モレキュラーシーブで乾燥)の溶液を添加した。THF(0.9mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(156mg、0.52mmol)の溶液を、シリンジを通して10分かけて滴下した。得られた白色の懸濁液を、アルゴン下、35℃で2時間更に撹拌した。次いで、上記の溶液に、ピリジン(10mL)中のDDTT(264.9mg、1.29mmol)の溶液を35℃で添加した。反応物を35℃で1時間撹拌した後、混合物をEtOAc(20mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、パッドをEtOAcで洗浄し、濾液を減圧下で蒸発させ、粗生成物を得た。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(DCM中のMeOH=0%~7%)により精製し、白色固体として化合物30a(80mg)を得た。ESI-MS:m/z=904.2[M+H]+。
化合物30a(80mg)を、MeNH2(5mL、EtOH中30%)で、25℃で処理した。反応物を25℃で3時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分をH2O/CH3CN(30mL)の混合物に溶解し、DCM(3×15mL)で洗浄した。水相を凍結乾燥し、黄色固体として粗生成物を得た(71mg)。残分を逆相分取HPLC(方法:カラム:Waters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30;条件:水(10mMのNH4CO3)(A)-ACN(B)、B0で開始、B23で終了;勾配時間(分):7;100%Bの保持時間(分):0、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物(*R)50A、アンモニウム塩を得た(8mg、9%)。1H NMR(400MHz、D2O)δ8.63(br s、1H)、8.51(d、J=1.7Hz、1H)、6.94(br d、J=18.8Hz、1H)、6.65(br d、J=3.4Hz、1H)、6.39(br d、J=2.9Hz、1H)、6.20~6.00(m、1H)、5.71(br t、J=11.4Hz、1H)、5.06(br s、1H)、4.70~4.60(m、1H)、4.56~4.47(m、1H)、4.04~3.96(m、1H)、3.94~3.85(m、1H)、3.27~3.17(m、1H)、3.16~3.03(m、1H);19FNMR(376MHz、D2O)δppm-195.682;
31P NMR(162MHz、D2O):δppm54.318;ESI-MS:m/z 677.2[M+H]+。
Dowex 50W×8,200-400(2mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(10mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(15mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4(少なくとも4CV)で洗浄し、次いでpHが中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、pHが中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物(*R)50A、アンモニウム塩(4mg)を最小量の脱イオン水:CH3CN(3:1、体積/体積、8mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯めて凍結乾燥し、白色固体として化合物(*R)50A、ナトリウム塩を得た(2.4mg、58%)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.25(s、1H)、7.88(s、1H)、6.59(dd、J=4.3、15.5Hz、1H)、6.33(d、J=6.8Hz、1H)、6.15~6.01(m、1H)、5.86~5.66(m、1H)、5.54~5.41(m、1H)、4.47(br d、J=3.9Hz、1H)、4.29~4.12(m、2H)、3.65~3.54(m、2H)、2.88~2.79(m、1H)、2.76~2.69(m、1H);19FNMR(376MHz、D2O)δppm-194.41;
31P NMR(162MHz、D2O):δppm53.83;ESI-MS:m/z=677.1[M+H]+。
ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA、93.95g、461.9mmol)を、無水MeCN(340mL)中の8-アザグアニン(11.71g、77.0mmol)の懸濁液に25℃で滴下した。反応混合物を80℃で3時間撹拌し、次いで室温まで冷却した。無水MeCN(65mL)中の1,2-ジ-O-アセチル-5-ベンゾイル-3-O-メチル-D-リボフラノース31a[CAS番号10300-21-7](13.56g、38.5mmol)の溶液を添加し、続いてSnCl4(80.21g、307.9mmol)を滴下した。均一溶液を80℃で30分撹拌し、次いで室温まで冷却し、氷冷5%NaHCO3水溶液(800mL)に注いだ。EtOAc(800mL)を添加し、撹拌を10分継続した。反応混合物を濾過し、濾液を分液漏斗に移した。2つの層を分離し、水層をEtOAcで抽出した(200mL×2)。合わせた有機層を5%NaHCO3水溶液(600mL×2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空下で蒸発乾固させ、粗化合物31bを得た(11.50g)。粗生成物を、更に精製することなく次の反応にて直接使用した。1H NMR(600MHz、DMSO-d6)δppm11.09(br s、1H)、7.88(d、J=7.2Hz、2H)、7.61~7.68(m、1H)、7.44~7.52(m、2H)、7.04(br s、2H)、6.17(d、J=1.7Hz、1H)、5.90(dd、J=5.0、2.1Hz、1H)、4.66(dd、J=7.1、4.9Hz、1H)、4.53~4.58(m、1H)、4.35~4.42(m、2H)、3.41(s、3H)、2.14(s、3H);ESI-MS:m/z 445.5[M+H]+。
無水ジメチルアセトアミド(57.5mL)中の上記の粗化合物31b(11.50g)の溶液に、無水イソ酪酸(6.14g、38.8mmol)を滴下した。反応混合物を140℃で2時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、EtOAc(300mL)で希釈した。得られた溶液を、10%NH4Cl水溶液(300mL×3)及び食塩水(300mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、真空にて乾燥するまで濃縮し、粗化合物31cを得た(13.30g)。粗生成物を、更に精製することなく次の反応にて直接使用した。
THF(42mL)中の粗化合物31c(11.98g、ステップ2から)の溶液、MeOH(35mL)及びH2O(11mL)に、5NのNaOH(11mL、55mmol)を0℃で添加した。反応混合物を0℃で4時間撹拌した。反応混合物のpHをギ酸で6.5に調整した。得られた溶液を真空にて乾燥するまで濃縮し、残分をMeCN及びH2Oで数回すりつぶし、化合物31dを得た(1.55g、31bからで収率:14%)。1H NMR(600MHz、DMSO-d6)δppm12.07(br s、2H)、5.97(d、J=4.4Hz、1H)、5.68(br s、1H)、4.92(br s、1H)、4.84(br s、1H)、4.01~4.08(m、2H)、3.52~3.59(m、1H)、3.44~3.50(m、1H)、3.43(s、3H)、2.79(spt、J=6.8Hz、1H)、1.13(d、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 369.5[M+H]+。
無水ピリジン(20.0mL)中の化合物31d(1.10g、3.0mmol)の溶液に、ピリジン(3.0mL)中のDMTrClの溶液(1.32g、3.9mmol)を0℃で添加した。得られた混合物を室温で12時間撹拌した後、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、40℃で乾燥するまで濃縮した。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘプタン中の20~50%のEtOAc)により精製し、白色固体として化合物31eを得た(1.52g、収率:76%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.87(br s、1H)、7.24~7.28(m、2H)、7.10~7.24(m、7H)、6.76~6.82(m、4H)、6.06(d、J=2.7Hz、1H)、5.79(br d、J=4.6Hz、1H)、5.01(br s、1H)、4.18~4.24(m、2H)、3.71(s、6H)、3.36(s、3H)、3.15~3.20(m、1H)、3.05(br dd、J=10.0、3.9Hz、1H)、2.80(spt、J=6.8Hz、1H)、1.13(d、J=6.9Hz、6H);ESI-MS:m/z 671.4[M+H]+。
化合物31e(1.30g、1.94mmol)、DMAP(546mg、4.47mmol)及びスルファミン酸塩17a(1.18g、1.33mmol)を、別々に乾燥DCE(3×3mL)に溶解した。各溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブと終夜撹拌することにより乾燥させた。DCE中のスルファミン酸塩17aの溶液に、DCE中のDMAPの溶液及びDCE中の化合物31eの溶液をそれぞれ添加した(シリンジを通して添加)。反応混合物をN2下、60℃で4時間撹拌した。この混合物をDCMで希釈し、濾過し、濾液を2%酢酸水溶液、5%のNaHCO3水溶液及び食塩水溶液で連続的に洗浄し、次いで減圧下で蒸発乾固させた。残分をDCMに溶解し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0.6~1%のEtOH)により精製し、黄色固体として化合物31fを得た(0.53g、収率:28%)。ESI-MS:m/z 1407.6[M+H]+。
DCM(5mL)中の化合物31f(480mg、0.34mmol)の溶液に、水(30.8mg、1.71mmol)及びDCA(220mg、1.71mmol)を添加し、室温で4時間撹拌した。次に、反応混合物を、5%NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧下で乾燥するまで濃縮した。残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の1~5%のEtOH)により精製し、白色固体として化合物31gを得た(150mg、収率:55%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ11.90(br s、1H)、11.27(br s、1H)、8.74(s、1H)、8.62(s、1H)、8.04(d、J=7.6Hz、2H)、7.61~7.70(m、1H)、7.51~7.59(m、2H)、6.38(d、J=19.5Hz、1H)、6.29(d、J=2.3Hz、1H)、5.51~5.69(m、2H)、4.90(br s、1H)、4.63(ddd、J=20.4、7.6、4.6Hz、1H)、4.47(br t、J=5.5Hz、1H)、4.00~4.12(m、2H)、3.55~3.61(m、1H)、3.42~3.47(m、2H)、3.39(s、3H)、3.21~3.29(m、1H)、2.77(spt、J=6.7Hz、1H)、1.11(d、J=6.9Hz、6H);ESI-MS:m/z 803.7[M+H]+。
乾燥THF(2mL)中の化合物31g(100mg、0.125mmol)及び1H-テトラゾール(2.22mL、MeCN中0.45Mの溶液、0.998mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで1時間処理した後、乾燥MeCN(0.6mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(67.5mg、0.22mmol)を、15分かけて滴下した(注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で90分撹拌した。tBuOOHの溶液(199μL、0.99mmol)を添加し、撹拌を更に30分継続した。反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:0~10%のDCM中のMeOH)により精製し、白色固体として化合物31hを得た(32mg、収率:30%)。ESI-MS:m/z 918.4[M+H]+。
化合物31h(32mg、0.035mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(12mL)中で、40℃で2.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を水に溶解し、DCMで洗浄し、凍結乾燥した。粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:XBridge OBD C18 5μm、150×30mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製した。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物51、ナトリウム塩を得た(14mg、収率:55%)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.15(br s、1H)、7.10(br s、1H)、6.51~6.45(m、1H)、6.41(br s、1H)、6.16(br s、1H)、5.36~5.12(m、2H)、4.61(br d、J=2.4Hz、1H)、4.52(br d、J=8.8Hz、1H)、4.38(d、J=4.8Hz、1H)、4.23(dd、J=2.4、4.8Hz、2H)、3.77(br d.J=13.2Hz、1H)、3.57(s、3H)、3.42(br d、J=12.8Hz、1H);
31P NMR(162MHz、D2O)δppm-1.81(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δ-196.87~197.38(m、1F);ESI-MS:m/z 691.0[M+H]+。
THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNをCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
31P NMR(162MHz、CD3CN)δ3.07(s、1P)、3.15(s、1P);ESI-MS:m/z=927.3[M+H]+。
MeNH2(EtOH中27~30%、5mL)中の化合物32a(30.5mg、0.033mmol)の溶液を、5℃で4時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得て;残分を、DCM/水(10/15mL)に分液した。水層をDCM(8mL×3)で洗浄し、凍結乾燥した。粗化合物を、6mLの酢酸エチルに懸濁し、超音波処理し(3分)、遠心分離した(5分)。上記の上澄みを回収し、前の手順を2回繰り返した。沈殿物を、DCM/水(10/15mL)に分液した。水層をDCM(10mL×2)で抽出し、凍結乾燥し、固体を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物25、ナトリウム塩を得た(60.1mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δ8.15~7.90(m、1H)、7.83(br s、2H)、7.69(br s、1H)、6.90~6.72(m、1H)、6.08~5.82(m、1H)、4.45~4.15(m、3H)、4.16~3.88(m、1H)、3.28(t、J=6.8Hz、1H)、2.87(t、J=6.7Hz、1H)、2.68~2.59(m、1H)、2.46(s、4H);31P NMR(162MHz、D2O)δ-2.4(s、1P);ESI-MS:m/z=700[M+H]+。
1:1THF/MeCN(110mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物33a(600mg、0.75mmol)及び1H-テトラゾ-ル(8.97mL、MeCN中3~4%、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブで1時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(240μL、0.75mmol)を一度に添加した。反応混合物を室温で3.5時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(0.12mL、0.37mmol)を添加し、振盪を終夜継続した。次に、フェニルアセチルジスルフィド(PADS、0.45g、1.5mmpl)を添加し、反応混合物を更に18時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。合わせた濾液を、続いて飽和Na2S2O3水溶液及び飽和NaHCO3水溶液の1:1混合物並びに食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、最初の溶出異性体として化合物33b(122mg、収率:17%)及び2番目の溶出異性体として化合物33c(39mg、収率:5%)を得た。化合物33b ESI-MS:m/z 933.5[M+H]+。化合物33c ESI-MS:m/z 933.6[M+H]+。
化合物33b(122mg、0.13mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(7mL)中で、変換完了までで45℃で撹拌した(約1時間)。反応混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、150×50mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により精製し、化合物(*R)23Aを得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物(*R)23A、ナトリウム塩を得た(13mg、収率:14%)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.23(s、1H)、8.19(s、1H)、7.82(br、1H)、6.44(d、J=15.5Hz、1H)、5.92(d、J=8.5Hz、1H)、5.65(dd、J=50.6、3.4Hz、1H)、5.42(br s、1H)、5.17(ddd、J=21.8、9.2、3.4Hz、1H)、4.66~4.71(m、1H)、4.46~4.58(m、2H)、4.15(br s、1H)、4.00(br dd、J=12.2、4.1Hz、1H)、3.69~3.90(m、2H)、3.60(s、3H);31P NMR(162MHz、D2O)δppm52.18(s、1P);ESI-MS:m/z 706.4[M+H]+。
化合物34a(0.8g、0.99mmol)を、無水ACN(85mL)及び無水THF(85mL)の混合物に溶解した。1H-テトラゾール(11.5mL、3.96mmol)及び3Åモレキュラーシーブを添加した。混合物を室温で1時間振盪し、次いで2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.31mL、0.99mmol)を、シリンジを通して一度に添加した。反応混合物を室温で4.5時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(0.16mL、0.5mmol)を添加した。反応混合物を室温で2日間振盪し、次いでフェニルアセチルジスルフィド(PADS、0.6g、1.98mmol)を添加した。反応混合物を室温で18時間振盪した。反応混合物を濾過した。モレキュラーシーブをジクロロメタンで3回洗浄した。合わせた濾液を飽和Na2S2O3溶液及び飽和NaHCO3溶液の混合物で洗浄し、食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を蒸発させた。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、最初の溶出異性体として化合物34b(224mg、収率:16%)及び2番目の溶出異性体として化合物34c(265mg、収率:11%)を得た。
化合物34a ESI-MS:m/z 939.5[M+H]+。
化合物34b ESI-MS:m/z 939.5[M+H]+。
化合物35aを、使用前にピリジン(30mL)と2回共蒸発させた。ピリジン(50mL)中の化合物35a(3g、11.22mmol)の撹拌懸濁液に、TMSCl(7.2mL、56.73mmol)を、均圧滴下漏斗を通して0℃で30分かけて滴下し、白色の懸濁液を得て、次いで、室温で1時間更に撹拌した。次いでイソブチリルクロリド(2.4g、22.52mmol)を、N2下、反応混合物にシリンジを通して0℃で15分かけて添加した。得られた懸濁液を、N2雰囲気下、室温で終夜撹拌した。水(15mL)を反応混合物に0℃で添加し、次いで水酸化アンモニウム(17.3mL、25%)を、均圧滴下漏斗を通して0℃で10分かけて添加した。
得られた透明溶液を室温で1時間更に撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~20%のMeOH)により精製し、黄色固体として化合物35bを得た。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δppm12.12(s、1H)、11.71(s、1H)、8.30(s、1H)、5.79(d、J=1.6Hz、1H)、4.46~4.50(m、1H)、4.30~4.38(m、1H)、3.68(br dd、J=12.0、3.2Hz、3H)、3.52(br dd、J=12.0、3.6Hz、1H)、2.73~2.84(m、1H)、2.18~2.28(m、1H)、1.90(ddd、J=13.2、6.0、2.0Hz、1H)、1.11(d、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 338.1[M+H]+。
THF(35mL)中の化合物35b(3.4g、粗)、トリフェニルホスフィン(7.93g、30.23mmol)及びイミダゾール(2.75g、40.4mmol)の撹拌溶液に、THF(20mL)中のI2(7.68g、30.26mmol)の溶液を0℃で添加した。反応物を35℃で終夜撹拌した後、混合物を濾過し、濾液を濃縮し、次いでDCM(150mL)で希釈し、飽和Na2SO3水溶液で洗浄した(100mL×2)。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、黄色固体として化合物35cを得た(1.55g)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δppm12.11(s、1H)、11.66(s、1H)、8.17(s、1H)、5.82(d、J=2.4Hz、1H)、5.74~5.76(m、1H)、4.65~4.70(m、1H)、4.30~4.39(m、1H)、3.43~3.55(m、2H)、2.78(quin、J=6.8Hz、1H)、2.12~2.25(m、2H)、1.12(d、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 447.9[M+H]+。
NaN3(800mg、12.3mmol)を、N2下、DMF(25mL)中の化合物35c(1.73g、3.87mmol)の撹拌溶液に添加した。反応物を80℃で3時間撹拌した後、混合物をDCM(100mL)で希釈し、食塩水で洗浄した(50mL×2)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、黄色固体として化合物35dを得た(1.27g)。
ESI-MS:m/z 363.1[M+H]+。
化合物35dを、使用前にピリジン(20mL)と2回共蒸発させた。ピリジン(15mL)中の化合物35d(1.27g)の溶液に、DMAP(215mg、1.76mmol)及びDMTrCl(1.781g、5.257mmol)を0℃で添加した。反応物を室温で終夜撹拌した後、混合物をCH2Cl2(80mL)で希釈し、次いで、引き続いて飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(50mL×3)。有機層を回収し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中0~85%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物35eを得た(1.61g)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ12.05(s、1H)、11.59(s、1H)、7.96(s、1H)、7.36(d、J=7.2Hz、2H)、7.22~7.29(m、2H)、7.12~7.22(m、5H)、6.76(d、J=8.8Hz、2H)、6.69(d、J=8.8Hz、2H)、5.55(d、J=2.4Hz、1H)、4.72(br d、J=6.4Hz、1H)、4.42~4.51(m、1H)、3.64(d、J=12.4Hz、6H)、3.47~3.54(m、1H)、3.37(br d、J=6.4Hz、1H)、2.79(quin、J=6.8Hz、1H)、2.03~2.14(m、1H)、1.85~1.94(m、1H)、1.13(t、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 665.2[M+H]+。
THF(16mL)中の化合物35e(1.61g、2.42mmol)の溶液に、Ph3P(889mg、3.39mmol)を一度に添加し、次いで混合物をN2下、40℃で2時間撹拌し、水(8mL)を混合物に添加し、次いで、40℃で終夜更に撹拌した。混合物を別の粗バッチと合わせ、CH2Cl2(100mL)、水(80mL)で希釈し、CH2Cl2で抽出した(100mL×2)。有機層を合わせ、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~8%MeOH)により精製し、白色固体として化合物35fを得た(1.5g、2.34mmol)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ7.92(s、1H)、7.36(d、J=7.2Hz、2H)、7.13~7.28(m、7H)、6.76(d、J=8.8Hz、2H)、6.70(d、J=9.2Hz、2H)、5.59(d、J=1.6Hz、1H)、4.56~4.87(m、5H)、4.26(dq、J=10.0、5.2Hz、1H)、3.65(d、J=11.6Hz、6H)、2.78(spt、J=6.8Hz、1H)、2.58~2.72(m、2H)、1.99~2.11(m、1H)、1.73(br dd、J=13.2、5.6Hz、1H)、1.13(t、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 639.2[M+H]+。
乾燥CH2Cl2(3mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート3n(1.67g、7.04mmol)の溶液を、N2下、CH2Cl2(27mL)中の化合物35f(1.5g、2.35mmol)、4-ニトロフェノール(980.1mg、7.04mmol)、Et3N(1.96mL、14.14mmol)の混合物に-78℃で速やかに添加し、次いで2時間かけて室温まで自然に温めた。混合物を別の粗バッチと合わせ、CH2Cl2(100mL)で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(100mL×5)。有機層を回収し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中0~90%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物35gを得た(1.6g)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ12.05(s、1H)、11.55(s、1H)、8.91(t、J=5.6Hz、1H)、8.20~8.27(m、2H)、7.93(s、1H)、7.43~7.51(m、2H)、7.34(d、J=7.2Hz、2H)、7.21~7.28(m、2H)、7.11~7.21(m、5H)、7.11~7.21(m、1H)、6.75(d、J=8.8Hz、2H)、6.68(d、J=8.8Hz、2H)、5.55(d、J=2.0Hz、1H)、4.67(br d、J=6.4Hz、1H)、4.34~4.44(m、1H)、3.64(d、J=12.4Hz、6H)、3.30~3.37(m、1H)、3.18~3.27(m、1H)、2.78(spt、J=6.8Hz、1H)、1.99~2.10(m、1H)、1.89(br dd、J=12.4、5.6Hz、1H)、1.10~1.15(m、6H);ESI-MS:m/z 840.3[M+H]+。
THF(40mL)中の化合物35h(910mg、1.347mmol)、化合物35g(1.6g、1.905mmol)及びモレキュラーシーブ(3g)の懸濁液を、N2下、室温で30分撹拌し、続いてDMAP(659mg、5.39mmol)を添加し、次いでN2下、45℃で終夜撹拌した。反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、黄色の残分を得て、これをDCM(60mL)に溶解し、次いで飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(40mL×3)。有機層を回収し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、黄色の残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル:EtOAc=1:0~1:4)により精製し、白色固体として化合物35i(1.13g)を得て、これをLCMSにより確認した。ESI-MS:m/z 1377.3[M+H]+。
DCM(30mL)中の化合物35i(1.13g、0.77mmol)の撹拌溶液に、水(140mg、7.77mmol)及びDCA(220mg、1.7mmol)を添加した。黄色の混合物を室温で終夜撹拌した。次いでこれに、MeOH(5mL)を添加し、続いてピリジン(244.5mg、4当量)を添加し、黄色の溶液を得て、これを15分更に撹拌し;溶液を別の粗バッチとともにワークアップし、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、白色固体として化合物35jを得た(630mg)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ12.11(s、1H)、11.64(s、1H)、11.28(s、1H)、8.77(s、1H)、8.70(s、1H)、8.62(br t、J=6.0Hz、1H)、8.14(s、1H)、8.04(d、J=7.2Hz、2H)、7.62~7.69(m、1H)、7.52~7.59(m、2H)、6.48(dd、J=16.8、2.8Hz、1H)、5.76~5.96(m、2H)、5.72(d、J=4.0Hz、1H)、5.30~5.43(m、2H)、4.60(br s、1H)、4.36~4.45(m、1H)、4.28~4.34(m、1H)、3.74~3.84(m、1H)、3.58~3.68(m、1H)、3.23~3.35(m、2H)、2.71~2.83(m、1H)、2.17~2.28(m、1H)、2.00~2.09(m、1H)、1.11(dd、J=6.8、1.6Hz、6H);19F NMR(DMSO-d6、376MHz)δ-202.81(dt、J=52.1、16.5Hz、1F);ESI-MS:m/z 772.3[M+H]+。
THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。THF(3mL)中の化合物35i(120mg、0.15mmol)の溶液に、4ÅMS800mg(粉末)及び1H-テトラゾールの溶液(3.45mL、0.45M、945mgのテトラゾール(凍結乾燥により乾燥)を乾燥CH3CN30mLに溶解し、続いて1gの4ÅMSを添加し、次いでN2下、使用前に1時間撹拌することにより調製)を添加し;混合物をN2でパージした。THF(0.8mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(84.36mg、0.28mmol)の溶液を、シリンジを通して25分かけて滴下し、次いでで室温で1.5時間撹拌した。TBHP(0.25mL、1.24mmol、5M)の溶液を添加し、更に30分撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、白色固体として39kを得た(68mg)。ESI-MS:m/z 887.4[M+H]+。
MeNH2/EtOH(5mL)中の化合物35k(68mg、0.077mmol)の溶液を室温で2時間撹拌した。反応混合物を40℃で1時間撹拌した後、揮発性物質を蒸発させ、得られた白色固体を水(20mL)の混合物に溶解し、次いでDCM(10mL×4)で抽出した。水層を凍結乾燥し、逆相分取HPLC(カラム:XBridge 150×30mm×10μm、条件:A:水(10mMのNH4HCO3)-ACN:MeCN、B0%で開始、B30%で終了;流速25mL/分)により精製し、白色固体として化合物26、アンモニウム塩を得た(18.8mg)。
1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δppm10.78(br s、1H)、8.84(br d、J=6.8Hz、1H)、8.45(s、1H)、8.25(s、1H)、7.86(s、1H)、6.67(br s、1H)、6.44(br d、J=18.0Hz、1H)、5.91(s、1H)、5.62(br s、1H)、5.49(br d、J=3.2Hz、1H)、5.30~5.16(m、2H)、4.72(br s、1H)、4.44(br d、J9.4Hz、1H)、4.48~4.40(m、1H)、4.29(br d、J=12.4Hz、1H)、4.21(br t、J=10.8Hz、1H)、3.89(br d、J=12.0Hz、1H)、3.45~3.33(m、1H)、2.92(br d、J=11、2Hz、1H)、1.94(br t、J=10、8Hz、1H);19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δppm-198.95(s、1F);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm-4.86(br s,1P);ESI-MS:m/z 660.3[M+H]+。
Dowex 50W×8,200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物26、アンモニウム塩(10mg)を最小量の脱イオン水及びCH3CN(1:1、体積/体積、3mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物26、ナトリウム塩を得た(6.1mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.22(br s、1H)、8.11(br s、1H)、7.75(s、1H)、6.40(br d、J=16.8Hz、1H)、5.88(br s、1H)、5.73(br s、1H)、5.60(br s、1H)、5.24~5.04(m、1H)、4.59(br d、J=8.8Hz、1H)、4.49(br s、1H)、4.42(br d、J=12.0Hz、1H)、4.13(br d、J=11.8Hz、1H)、3.69(br d、J=13.6Hz、1H)、3.41(br d、J=8.0Hz、1H)、2.76(br s、1H)、2.26~2.19(m、1H)、2.22(br d、J=6.8Hz、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-200.45(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.84(s、1P);ESI-MS:m/z 660.0[M+H]+。
DCM(40mL)中の化合物36a(4.2g、24.11mmol)の溶液に、TEA(4.88g、48.22mmol)及びMsCl(4.97mg、43.4mmol)を、10分かけて滴下した。25℃で2時間撹拌した後、混合物を、DCM(100mL)及び水(50mL)に分液した。
有機層を食塩水(3×50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:10g)を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE/EAが10~100%、及びDCM/MeOHが0~5%)により精製し、淡黄色固体として化合物36bを得た(5.6g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm5.84(d、J=2.4Hz、1H)、4.78(t、J=3.4Hz、1H)、4.51~4.40(m、2H)、4.29~4.22(m、1H)、3.09~3.05(m、3H)、2.18~2.09(m、1H)、1.84~1.73(m、1H)、1.52(s、3H)、1.33(s、3H).
DMF(55mL)中の化合物36b(5.6g、22.19mmol)の溶液に、NaN3(4.25g、65.37mmol)を25℃で添加した。100℃で3時間撹拌した後、混合物を飽和NaHCO3水溶液(100mL)で希釈し、酢酸エチル(3×100mL)で抽出した。有機層を食塩水(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、黄色固体を得た。固体(シリカゲルと合わせたもの、10g)をシリカゲル(シリカゲル:20g)でのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%の酢酸エチル、次いで酢酸エチル中の0~20%のメタノール)により精製し、黄色固体として化合物36cを得た(3.8g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ5.85(d、J=3.4Hz、1H)、4.77(t、J=4.2Hz、1H)、4.45~4.35(m、1H)、3.59(dd、J=3.7、13.2Hz、1H)、3.28(dd、J=4.6、13.2Hz、1H)、2.09(dd、J=4.4、13.4Hz、1H)、1.79(ddd、J=4.8、10.7、13.4Hz、1H)、1.52(s、3H)、1.33(s、3H).
無水酢酸(18.03mL、190.75mmol)及び濃硫酸(0.104mL、1.91mmol)を、酢酸(109.1mL、1907.56mmol)中の化合物36c(3.8g、19.08mmol)の撹拌溶液に0℃で添加した。25℃で2時間撹拌した後、反応混合物を冷水(100mL)でクエンチし、25℃で30分撹拌した。混合物を酢酸エチルで抽出した(3×200mL)。有機層を合わせ、引き続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(3×300mL)、食塩水(2×200mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの、10g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中の0~100%のPE)により精製し、黄色の油として化合物36dを得た(3.2g)。1NMR(400MHz、CDCl3)δ6.21~6.14(m、1H)、5.22(d、J=5.0Hz、1H)、4.58~4.50(m、1H)、3.57(dd、J=4.0、13.1Hz、1H)、3.25(dd、J=4.6、13.2Hz、1H)、2.29~2.19(m、1H)、2.12~2.10(m、1H)、2.09(s、6H).
無水CH3CN(200mL)中の5-アミノ-3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-d]ピリミジン-7(6H)-オン(2.37g、15.6mmol)及びBSA(11.041g、54.273mmol)の溶液を、80℃で1時間撹拌し、次いで0℃まで冷却した。次いでこれに、無水CH3CN(80mL)中の化合物36d(3.3g、13.57mmol)の溶液を添加し、続いてSnCl4(10.6g、40.7mmol)を添加した。26℃で48時間撹拌した後、混合物を冷却し、EtOAc(100mL)で希釈し、次いで飽和NaHCO3水溶液(500mL)に0℃で滴下した。有機層を食塩水(2×100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、適切な圧力下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:10g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の2~10%のMeOH、体積/体積)により精製し、黄色の泡状物として化合物36eを得た(6.4g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.08(br、s、1H)、7.28(br、s、1H)、6.68(br、s、1H)、6.10(s、1H)、5.68(d、J=5.5Hz、1H)、4.61~4.50(m、1H)、3.58(dd、J=3.1、13.4Hz、1H)、3.34~3.29(m、1H)、2.71~2.59(m、1H)、2.33~2.24(m、1H)、2.09(s、3H);ESI-MS:m/z=336.1[M+H]+。
DCM(48mL)中の化合物36e(4.8g、14.32mmol)の溶液に、トリエチルアミン(4.34g、42.95mmol)及びDMAP(504.37mg、4.13mmol)を25℃で添加した。5分撹拌した後、混合物を0℃まで冷却し、イソブチリルクロリド(3.05g、28.63mmol)を10分にて溶液に添加した。25℃で2時間撹拌した後、混合物をEtOAc(100mL)で希釈し、食塩水(3×100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、圧力下で濃縮し、黄色固体として化合物36f(4.8g)を得て、これを更に精製することなく次ステップに直接使用した。
THF/MeOH/水(240/150/45mL)中の化合物36f(6.5g)の溶液に、NaOH(水中0.5M、64.14mL)を0℃で添加した。次いで、溶液を0℃で1時間撹拌した。溶液を酢酸(約2mL)でpH7まで酸性化した。溶液を圧力下で濃縮し、黄色固体を得た(6g)。残分(シリカゲルと合わせたもの:10g)を、シリカゲル(シリカゲル:40g)でのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM/MeOH=1/0~5/1)により精製し、淡黄色固体として化合物36gを得た(4.5g)。
1H NMR(400MHz、CD3OD)δppm6.20(s、1H)、4.94(d、J=5.0Hz、1H)、4.73~4.65(m、1H)、3.52~3.46(m、1H)、3.38~3.33(m、1H)、2.78~2.61(m、2H)、2.20(ddd、J=1.3、6.0、13.3Hz、1H)、1.23(d、J=7.0Hz、6H).ESI-MS:m/z=364.2[M+H]+。
Py(50mL)中の化合物36g(5g、13.76mmol)の溶液を、DMAP(841mg、6.88mmol)で、0℃で10分処理した。10分後、DMTrCl(9.3g、27.52mmol)を添加し、次いで溶液を80℃で12時間撹拌した。反応混合物をEA(50mL)で希釈し、食塩水(3×80mL)で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、圧力下で濃縮し、黄色固体を得た(10g)。黄色固体(シリカゲルと合わせたもの、15g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA中の0~100%のPE)により精製し、淡黄色固体として化合物36hを得た(8.0g)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δppm12.01(br、s、1H)、8.35(br、s、1H)、7.45~7.42(m、2H)、7.28~7.24(m、7H)、6.73~6.66(m、4H)、5.10(d、J=5.8Hz、1H)、4.84~4.74(m、1H)、3.83~3.77(m、1H)、3.71(d、J=6.3Hz、6H)、3.43~3.35(m、1H)、3.29~3.23(m、1H)、2.68~2.56(m、2H)、2.40(dd、J=5.9、13.2Hz、1H)、1.31(dd、J=6.9、11.7Hz、6H).
ESI-MS:m/z 688.1[M+Na]+。
EA/EtOH(1/1、350mL)中の化合物36h(8.0g、12.02mmol)の溶液を、Pd/C(4.5g)で処理し;混合物をH2雰囲気(15psi)下、2時間撹拌した後、溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:10g)を、シリカゲル(シリカゲル:40g)でのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM-MeOH=1/0~5/1)により精製し、淡黄色固体として化合物36iを得た(6.0g)。ESI-MS:m/z=640.4[M+H]+。
DCM(130mL)中の化合物36i(6.0g、8.44mmol)の溶液を、4-ニトロフェノール(3.52g、25.32mmol)及びトリエチルアミン(5.12g、50.65mmol)で処理した。-78℃まで冷却した後、DCM(20mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(6.02g、25.32mmol)の溶液を-78℃で添加した。-78℃で1時間撹拌した後、混合物を濾過し、濾液をDCM(300mL)で希釈した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(3×150mL)で洗浄し、減圧下で濃縮し、残分を得た(10g)。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%の酢酸エチル)により精製し、黄色固体として化合物36jを得た(5.9g)。1H NMR(400MHz、CD3CN)δppm12.07(br、s、1H)、9.39(br、s、1H)、8.22~8.17(m、2H)、7.40~7.36(m、4H)、7.24~7.14(m、7H)、6.76~6.66(m、4H)、5.76(d、J=3.8Hz、1H)、4.97~4.90(m、1H)、4.68~4.60(m、1H)、3.68(d、J=8.3Hz、6H)、3.46~3.39(m、1H)、3.32~3.25(m、1H)、2.65(td、J=7.0、13.7Hz、1H)、2.40~2.32(m、1H)、2.22~2.19(m、1H)、1.22(d、J=7.0Hz、3H)、1.21~1.18(m、3H).
ESI-MS:m/z 863.2[M+Na]+。
DCE(21mL)中の化合物36j(1.18g、1.40mmol)、化合物35h(0.73g、1.08mmol)の溶液及び4ÅMS(1g)を、N2下、室温で30分撹拌し、続いてDMAP(660.41mg、5.41mmol)を添加した。反応物を45℃(油温度)で12時間撹拌した後、混合物を濾過し、濾液をDCM(100mL)及び食塩水(100mL)に分液した。有機層を引き続いて飽和NaHCO3水溶液(3×100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た(4g)。残分(シリカゲルと合わせたもの:6g)を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE/EAが10~100%、及びDCM/MeOHが0~5%)により精製し、淡黄色固体として化合物36kを得た(1.2g)。
1H NMR(400MHz、CD3CN)δ11.88(br、s、1H)、9.42(br、s、1H)、9.09(br、s、1H)、8.38(s、1H)、8.05(s、1H)、7.98~7.85(m、1H)、7.76(br、d、J=7.6Hz、1H)、7.47~7.39(m、1H)、7.35~7.27(m、2H)、7.12(br、d、J=7.3Hz、2H)、7.07(br、d、J=6.4Hz、2H)、7.02~6.86(m、11H)、6.72(br、d、J=8.6Hz、1H)、6.59~6.40(m、8H)、6.13~6.03(m、1H)、5.83(br、s、0.5H)、5.73~5.62(m、1H)、5.46(br、s、1H)、4.67(br、s、1H)、4.33(br、s、1H)、3.99(br、s、1H)、3.67~3.38(m、11H)、3.25(br、d、J=11.2Hz、1H)、3.10(br、d、J=14.4Hz、1H)、3.00(br、d、J=8.1Hz、1H)、2.89(br、d、J=6.1Hz、1H)、2.51~2.41(m、1H)、2.14~2.05(m、1H)、1.75~1.72(m、6H);19F NMR(376MHz、CD3CN)δppm-200.072(s、1F);ESI-MS:m/z 1377.8[M+H]+。
DCM(30mL)中の化合物36k(1.2g、0.78mmol)の溶液を、水(141.25mg、7.84mmol)及びDCA(202.19mg、1.57mmol)で処理し、赤色の溶液を得た。25℃で12時間撹拌した後、混合物にMeOH(5mL)を透明になるまで添加し、続いてピリジン(620.19mg、7.84mmol)を添加した。混合物を室温で2時間撹拌し、次いで圧力下で濃縮し、残分を得た。残分(シリカゲルと合わせたもの:2g)を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH中の0~8%のDCM)により精製し、白色固体として化合物36iを得た(0.54g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.26(s、1H)、11.92(s、1H)、11.27(s、1H)、8.77(s、1H)、8.69(s、1H)、8.53(br、t、J=5.8Hz、1H)、8.05(br、d、J=7.5Hz、2H)、7.69~7.63(m、1H)、7.60~7.53(m、2H)、6.46(dd、J=2.6、16.7Hz、1H)、6.04(s、1H)、5.92(br、s、0.5H)、5.86(br、d、J=3.8Hz、1H)、5.79(br、d、J=3.3Hz、0.5H)、5.37~5.26(m、2H)、4.75(br、s、1H)、4.60~4.49(m、1H)、4.27(br、s、1H)、4.10(br、s、1H)、3.77(br、d、J=12.5Hz、1H)、3.60(br、dd、J=4.8、8.0Hz、1H)、2.79(td、J=6.7、13.7Hz、1H)、2.19(br、dd、J=6.3、12.5Hz、1H)、1.13(d、J=6.8Hz、6H).
19F NMR(376MHz、DMSO-d6)δppm-202.787(s、1F);ESI-MS:m/z 773.3[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
THF(2mL)中の化合物36l(100mg、0.13mmol)の溶液を、4ÅMS(粉末)(1g)で処理し、20分撹拌した後、CH3CN(2.3mL)中の1H-テトラゾールの溶液(0.45M)を25℃で添加した。次いでこれに、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(0.078g、0.26mmol、2mLのTHFに希釈)を25℃で添加し、混合物を1.5時間撹拌し、続いてtert-ブチルヒドロペルオキシド(0.12mL、0.65mmol)の溶液を25℃で添加した。1.5時間撹拌した後、混合物をDCM(20mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮し、黄色固体として粗生成物を得た(1.0g)。粗物質(シリカゲルと合わせたもの、2g)をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(CH2Cl2中の0~15%のMeOH)により精製し、淡黄色固体として化合物36mを得た(50mg)。ESI-MS:m/z=888.3[M+H]+。
EtOH(2.5mL)中の化合物36m(50mg、0.056mmol)の溶液を、メチルアミン(2.5mL、EtOH中33%)で処理した。25℃で3時間撹拌した後、溶液を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分を、逆相分取HPLC(カラム:Waters XBridge Prep OBD C18 5μm 150×30、条件:水(10mMのNH4CO3)-ACN、B:0、B30で終了、勾配時間(分):7、100%Bの保持時間(分):1、流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物37、アンモニウム塩を得た(12.2mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.58(s、1H)、8.45(s、1H)、6.66(d、J=18.1Hz、1H)、6.46(s、1H)、5.94~5.75(m、1H)、5.51~5.41(m、1H)、5.37(br、s、1H)、4.63(br、d、J=12.5Hz、1H)、4.35(br、d、J=13.4Hz、1H)、3.92(br、dd、J=3.7、14.4Hz、1H)、3.50~3.36(m、1H)、3.16(br、d、J=12.0Hz、1H)、2.65~2.55(m、1H)、19F NMR(376MHz、D2O)δppm-199.359(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-3.307(s、1P);ESI-MS:m/z 661.3[M+H]+。
Dowex 50W×8,200-400(10mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液の入ったカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物37、アンモニウム塩(28mg)を脱イオン水/MeCN(20mL/5mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物37、ナトリウム塩を得た(24.5mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δ8.63(br、s、1H)、8.48(br、s、1H)、6.71(br、d、J=17.6Hz、1H)、6.51(br、s、1H)、5.97~5.79(m、1H)、5.54~5.40(m、2H)、4.69(br、d、J=13.3Hz、1H)、4.41(br、d、J=13.1Hz、1H)、3.97(br、d、J=13.8Hz、1H)、3.54~3.41(m、1H)、3.22(br、d、J=12.5Hz、1H)、2.66(br、s、1H);19F NMR(376MHz、D2O)ppm-199.443(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)-3.283(s、1P);ESI-MS:m/z 661.2[M+H]+。
THF(100mL)中の化合物37a(10g、28.3mmol)、トリフェニルホスフィン(22.27g、84.91mmol)、イミダゾール(7.71g、113.25mmol)の撹拌溶液に、THF(100mL)中のヨウ素(21.55g、84.91mmol)の溶液を0℃で添加した。35℃で終夜撹拌した後、反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、DCM(400mL)で希釈した。有機層を、飽和Na2SO3水溶液(200mL×2)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、白色固体として化合物37bを得た(6g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.10(s、1H)、11.65(s、1H)、8.26(s、1H)、5.83(d、J=6.0Hz、1H)、5.66(br d、J=5.6Hz、1H)、5.45(br d、J=4.4Hz、1H)、4.68(q、J=5.6Hz、1H)、4.11(br d、J=3.2Hz、1H)、3.92~4.02(m、1H)、3.58(br dd、J=10.4、6.0Hz、1H)、3.43(br dd、J=10.4、6.8Hz、1H)、2.76(dt、J=13.6、6.8Hz、1H)、1.12(br d、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 463.9[M+H]+。
DMF(100mL)中の化合物37b(6g、12.95mmol)の溶液を、N2下、NaN3(2.47g、37.99mmol)で処理した。80℃で3時間撹拌した後、混合物をDCM(400mL)で希釈し、食塩水で洗浄した(300mL×2)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、白色固体として化合物37cを得た(4g)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δ12.10(s、1H)、11.64(s、1H)、8.26(s、1H)、5.84(d、J=6.0Hz、1H)、5.65(d、J=6.0Hz、1H)、5.38(d、J=4.8Hz、1H)、4.60(q、J=5.6Hz、1H)、4.09~4.11(m、1H)、4.02(dt、J=7.2、3.6Hz、1H)、3.62~3.72(m、1H)、3.52~3.60(m、1H)、2.77(sept、J=6.8Hz、1H)、1.12(d、J=6.8Hz、6H);ESI-MS:m/z 379.0[M+H]+。
化合物37cを、使用前にピリジン(80mL)と2回共蒸発させた。ピリジン(40mL)中の化合物37c(4g、10.57mmol)の溶液に、DMAP(646mg、5.29mmol)及びDMTrCl(5.38g、15.88mmol)を0℃で添加した。室温で終夜撹拌した後、反応混合物をCH2Cl2(200mL)で希釈した。有機層を引き続いて飽和NaHCO3水溶液(150mL×3)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(石油エーテル中0~90%のEtOAc)により精製し、黄色のものとして粗生成物を得た。粗生成物を逆相分取HPLC(Phenomenex Synergi Max-RP、10μm 250×50mm;移動相:水-ACN、30%~70%;流速:100mL/分)により精製し、白色固体として化合物37dを得た(4.15g)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ12.02(s、1H)、11.43(br s、1H)、7.97(s、1H)、7.42(d、J=6.8Hz、2H)、7.28(d、J=8.8Hz、2H)、7.11~7.22(m、5H)、6.71(d、J=9.2Hz、2H)、6.63(d、J=9.2Hz、2H)、5.66(d、J=5.2Hz、1H)、5.48(d、J=5.6Hz、1H)、4.80(br t、J=4.8Hz、1H)、4.05(dt、J=7.2、4.0Hz、1H)、3.65(d、J=11.6Hz、6H)、3.56(br dd、J=13.2、7.2Hz、1H)、3.44~3.51(m、1H)、3.39(dd、J=13.2、4.0Hz、1H)、2.79(quin、J=6.8Hz、1H)、1.14(dd、J=6.8、2.3Hz、6H);ESI-MS:m/z 681.4[M+H]+。
NaH(鉱油中60%、189.5mg、4.74mmol)を、DMF(20mL)中の化合物37d(2.15g、3.16mmol)の懸濁液に、0℃で添加した。0℃で0.5時間撹拌した後、DMF(10mL)中の4-メトキシベンジルクロリド(0.512mL、3.8mmol)の溶液を滴下した。添加完了後、反応混合物を0℃で1時間撹拌し、水(80mL)でクエンチし、EtOAc(100mL×2)で抽出した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分を別のバッチと合わせ、逆相分取HPLC(YMC Triart C18 7μm 250×50mm;移動相:水(10mMのNH4HCO3)-ACN、55%~90%;流速:90mL/分)により精製し、白色固体として化合物37e(1.5g、1.83mmol)及び黄色固体として化合物37d(2.16g、3.09mmol)を得た。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ12.04(s、1H)、11.42(br s、1H)、8.11(s、1H)、7.32(d、J=8.4Hz、2H)、7.22~7.28(m、2H)、7.14~7.20(m、5H)、7.05(d.J=9.2Hz、2H)、6.96(d、J=8.8Hz、2H)、6.74(d、J=8.8Hz、2H)、6.66(d、J=8.8Hz、2H)、6.02(d、J=7.6Hz、1H)、4.87(br s、1H)、4.34(d、J=10.4Hz、1H)、4.22(dd、J=7.2、5.2Hz、1H)、4.00(br d、J=10.4Hz、1H)、3.78(s、3H)、3.69(d、J=9.6Hz、7H)、3.27(dd、J=12.8、4.8Hz、1H)、2.76(spt、J=6.8Hz、1H)、2.61(br d、J=3.6Hz、1H)、1.09~1.17(m、6H)、ESI-MS:m/z 801.4[M+H]+。
Ph3P(673mg、2.566mmol)を、THF(15mL)中の化合物37e(1.5g、1.83mmol)の溶液に一度に添加した。混合物をN2下、40℃で2時間撹拌し、続いて水(7.5mL)を添加した。40℃で撹拌した後、混合物をDCM(50mL)、水(40mL)で希釈し、DCMで抽出した(50mL×2)。次いで有機層を合わせ、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中の0~8%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物37fを得た(1.27g)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ8.06(s、1H)、7.31(d、J=8.4Hz、2H)、7.22~7.27(m、2H)、7.13~7.22(m、5H)、7.04(d、J=8.8Hz、2H)、6.96(d、J=8.4Hz、2H)、6.74(d、J=9.2Hz、2H)、6.66(d、J=8.8Hz、2H)、5.99(d、J=7.6Hz、1H)、4.78(br s、1H)、4.30(d、J=10.4Hz、1H)、4.04(t、J=5.6Hz、1H)、3.96(d、J=10.4Hz、1H)、3.75~3.80(m、3H)、3.69(d、J=8.4Hz、6H)、2.73~2.85(m、1H)、2.66(br d、J=4.4Hz、1H)、2.62(br d、J=6.0Hz、2H)、1.12(t、J=6.4Hz、6H);ESI-MS:m/z 775.3[M+H]+。
乾燥DCM(3mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(1.17g、4.92mmol)の溶液を、N2下、乾燥DCM(27mL)中の化合物37f(1.27g、1.64mmol)、4-ニトロフェノール(685mg、4.92mmol)、Et3N(1.37mL、9.88mmol)の混合物に、-78℃で添加し、次いで、2時間かけて室温まで自然に温めた。反応混合物を別のバッチとともにワークアップし、DCM(100mL)で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(100mL×5)。有機層を回収し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE中0~90%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物37gを得た(1.55g、1.59mmol)。1H NMR(DMSO-d6、400MHz)δ12.05(s、1H)、11.49(br s、1H)、8.88(t、J=6.0Hz、1H)、8.26~8.31(m、2H)、8.13(s、1H)、7.47~7.53(m、2H)、7.29(d、J=8.8Hz、2H)、7.20~7.25(m、2H)、7.14~7.20(m、5H)、7.03(d、J=8.8Hz、2H)、6.95(d、J=8.8Hz、2H)、6.74(d、J=8.8Hz、2H)、6.67(d、J=8.8Hz、2H)、5.95(d、J=7.2Hz、1H)、4.72(br s、1H)、4.25(d、J=10.4Hz、1H)、4.18(br t、J=5.6Hz、1H)、3.96(br d、J=10.4Hz、1H)、3.77(s、3H)、3.69(d、J=6.8Hz、6H)、3.24~3.44(m、2H)、2.91(br d、J=3.6Hz、1H)、2.69~2.79(m、1H)、1.12(t、J=6.4Hz、6H);ESI-MS:m/z=976.3[M+H]+。
THF(40mL)中の化合物37g(766mg、1.13mmol)、化合物35h(1.55g、1.59mmol)の懸濁液及びMS(3g)を、N2下、室温で30分撹拌し、続いてDMAP(554mg、4.53mmol)を添加し、次いでN2下、45℃で撹拌した。反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、黄色の残分を得て;残分をDCM60mLに溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した(40mL×3)。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(PE:EtOAc=1:0~0:1)により精製し、黄色固体として化合物37hを得た(360mg)。ESI-MS:m/z 757.4[M/2+H]+。
DCM(10mL)中の化合物37h(360mg、0.24mmol)の溶液を、水(43mg、2.39mmol)及びDCA(67.5mg、0.52mmol)で処理し、黄色の溶液を得た。室温で6時間撹拌した後、混合物にMeOH(2mL)を添加し、続いてピリジン(75.5mg、4当量)を添加し;得られた溶液を15分撹拌し、濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、白色固体として化合物37iを得た(130mg)。ESI-MS:m/z=908.4[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。THF(3mL)中の化合物37i(130mg、0.14mmol、凍結乾燥により乾燥)の溶液に、4ÅMS(粉末、800mg)を添加し、続いて1H-テトラゾールの溶液(3.18mL、0.45M、945mgのテトラゾール(凍結乾燥により乾燥)を乾燥CH3CN30mLに溶解し、続いて1gの4ÅMSを添加し、次いでN2下、使用前に1時間撹拌することにより調製)を添加し;容器をN2で数回パージした後、THF(0.8mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(77.69mg、0.26mmol)の溶液を、シリンジを通して25分かけて滴下し、次いで、室温で1.5時間撹拌し、続いてtert-ブチルヒドロペルオキシド(0.23mL、1.13mmol、5M)を添加した。更に30分撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1、Rf=0.4)により精製し、白色固体として化合物37jを得た(46mg)。ESI-MS:m/z=1023.5及び1023.4[M+H]+。
化合物37j(46mg、0.045mmol)の溶液をMeNH2/EtOH(5mL)で、40℃で2.5時間処理した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分を、逆相分取逆相分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 5μm 150×30:条件:水(10mMのNH4CO3)-ACN:MeCN、B5%で開始、B25%で終了;流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物37kを得た(12mg)。
ESI-MS:m/z=796.3[M+H]+。
TFA(0.113mL、57.3mmol)中のアニソール(15.9mg、0.14mmol)の溶液を0℃まで冷却し、化合物37k(12mg、0.015mmol)に添加した。0℃で2.5時間撹拌した後、窒素ガス流を0℃で吹き込むことにより、TFAを除去した。残りの反応混合物を、EtOH中33%のメチルアミンの溶液(0.113mL)で、0℃でクエンチした。反応混合物を蒸発乾固し、DCM及び水(20mL×3/10mL)に分液した。水層を凍結乾燥し、白色の残分を逆相分取HPLC(カラム:WATERS XBridge Prep OBD 5μm C18 150×30、条件:A:水(10mMのNH4HCO3)-ACN:MeCN、B5%で開始、b35%で終了;流速(mL/分):25)により精製し、白色固体として化合物47、アンモニウム塩を得た(7.1mg、0.010mmol)。1H NMR(400MHz、D2O)δ8.59(s、1H)、8.47(s、1H)、8.16(s、1H)、6.76(d、J=16.8Hz、1H)、6.28(d、J=8.4Hz、1H)、6.07(br d、J=3.6Hz、1H)、5.94(br d、J=4.4Hz、1H)、5.63(br dd、J=3.2、8.8Hz、1H)、5.58(br dd、J=4.4、8.8Hz、1H)、5.49(br d、J=5.6Hz、1H)、4.93(br d、J=8.8Hz、1H)、4.67(br s、1H)、4.39(br d、J=15.6Hz、1H)、4.13~4.07(m、1H)、3.96(br d.J=14.4Hz、1H);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.21(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δ200.3~200.4(m、1F);ESI-MS:m/z=676.0[M+H]+。
Dowex 50W×8,200-400(3mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物47、アンモニウム塩(7.1mg)を脱イオン水/MeCN(3mL/3mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物47、ナトリウム塩を得た(3.4mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.57(s、1H)、8.44(s、1H)、8.13(s、1H)、6.73(d、J=16.6Hz、1H)、6.25(d、J=8.8Hz、1H)、6.04(br d、J=3.6Hz、1H)、5.91(br d、J=4.0Hz、1H)、5.60(br dd、J=3.6、9.2Hz、1H)、5.55(br dd、J=4.0、9.2Hz、1H)、5.49~5.42(m、1H)、4.90(br d、J=9.2Hz、1H)、4.67~4.64(m、1H)、4.39~4.33(m、1H)、4.08(br d、J=14.4Hz、1H)、3.93(br d、J=14.8Hz、1H);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.26(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-200.34~200.47(m、1F);ESI-MS:m/z=676.1[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、CH3CNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。THF(6mL)中の化合物35j(300mg、0.39mmol、凍結乾燥により乾燥)の溶液に、4ÅMS(粉末、800mg)及び1H-テトラゾールの溶液(8.64mL、0.45M、945mgのテトラゾール(凍結乾燥により乾燥)を乾燥CH3CN30mLに溶解し、続いて1gの4ÅMSを添加し、次いでN2下、使用前に1時間撹拌することにより調製)を添加し;反応フラスコをN2でパージした後、THF(2mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(210.9mg、0.7mmol)の溶液を、シリンジを通して20分かけて滴下し、次いで、室温で1.5時間撹拌した。次いでこれに、DDTT(638.53mg、3.11mmol)を添加し、混合物を更に30分撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分を得た。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM:MeOH=1:0~10:1)により精製し、白色固体として化合物38aを得た(372mg)。ESI-MS:m/z 903.2及び903.4[M+H]+。
化合物38a(372g)を、MeNH2/EtOH(15mL)で、40℃で2.5時間処理した。40℃で1時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、別のバッチと合わせて白色固体を得た。固体を水(40mL)に溶解し、DCM(20mL×4)で洗浄した。水層を凍結乾燥し、逆相分取HPLC(カラム:Xtimate C18 5μm 150×25mm:条件:水(10mMのNH4CO3)-ACN:MeCN、B12%で開始、B42%で終了;流速(ml/分)25)により精製し、白色固体、すなわち白色固体として化合物(*R)46A、アンモニウム塩(18.5mg)及び白色固体として化合物(*S)46B、アンモニウム塩(35.2mg)を得た。
Dowex 50W×8,200-400(4mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(15mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物(*R)46A、アンモニウム塩(18.5mg)を脱イオン水/MeCN(8mL/2mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯めて凍結乾燥し、白色固体として化合物(*R)46A、ナトリウム塩を得た(13.7mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.27(br s、1H)、7.97(br s、1H)、7.72(br s、1H)、6.35(br d、J=16.4Hz、1H)、5.77(br s、1H)、5.70~5.49(m、1H)、5.26(br s、2H)、4.59~4.44(m、2H)、4.36(br d、J=11.2Hz、1H)、4.05(br s、1H)、3.60~3.38(m、2H)、2.71(br s、1H)、2.28(br s、1H);31P NMR(162MHz、D2O)δ54.42(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δ-200.41(br s、1F);ESI-MS:m/z 676.0[M+H]+。
Dowex 50W×8,200-400(10mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(25mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物(*S)46B、アンモニウム塩(35.2mg)を脱イオン水/MeCN(10mL/8mL)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。
適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、白色固体として化合物(*S)46B、ナトリウム塩を得た(33.1mg)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.72(br s、1H)、8.73~8.68(m、1H)、8.58(br s、1H)、8.14(br s、1H)、6.81(br d、J=17.6Hz、1H)、6.26(br s、1H)、6.07~5.89(m、1H)、5.67~5.53(m、2H)、4.94(br d、J=6.8Hz、2H)、4.82(br s、1H)、4.42(br d、J=12.4Hz、1H)、4.09(br d、J=14.4Hz、1H)、4.14~4.04(m、1H)3.82~3.69(m、1H)、3.23(br s、1H)、2.58(br s、1H)、2.37(br s、1H);31P NMR(162MHz、D2O)δppm53.58(s、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-199.69(br s、1F);ESI-MS:m/z=676.0[M+H]+。
イミダゾール(2.36g、34.6mmol)及びTBSCl(3.48g、23.1mmol)を、引き続いて乾燥DCM(101mL)中の化合物20b[CAS番号170871-87-1](7.8g、11.5mmol)の溶液に添加した。反応混合物を変換完了まで室温で撹拌(約3時間)した後、反応溶液をDCMで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、白色の泡状物として粗化合物39bを得た(9.2g、粗)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm0.20(s、3H)、0.24(s、3H)、0.96(s、9H)、3.60(d、J=5.5Hz、2H)、3.97(d、J=2.1Hz、6H)、4.69(m、1H)、5.4(dd、J=54.4、4.1Hz、1H)、5.63(dq、J=21.3、3.9Hz、1H)、6.35(d、J=7.6Hz、1H)、7.10(m、4H)、7.47(q、J=7.3Hz、1H)、7.52(m、6H)、7.66(d、J=7.6Hz、2H)、7.80(t、J=7.6Hz、2H)、7.89(t、J=7.6Hz、1H)、8.29(d、J=6.9Hz、2H)、8.83(s、1H)、8.89(s、1H)、11.49(s、1H);ESI-MS:m/z 790.4[M+H]+。
DCM(250mL)中の粗化合物39b(9.2g)の溶液に、水(1mL、57.6mmol)及びDCA(DCM中10%の溶液の38mL、46.1mmol)を添加し、変換完了まで室温で撹拌した(約1時間)。反応混合物をピリジン(4.6mL、57.6mmol)及びメタノール(5mL)でクエンチし、引き続いて、減圧下で濃縮した。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色の泡状物として化合物39cを得た(4.4g)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-0.26(s、3H)、-0.06(s、3H)、0.72(s、9H)、3.72(m、2H)、4.36(dt、J=26.6、4.0Hz、1H)、5.10(m、2H)、5.22(d、J=4.1Hz、1H)、5.39(s、1H)、6.13(d、J=7.6Hz、1H)、7.55(t、J=7.6Hz、2H)、7.65(t、J=7.6Hz、1H)、8.05(d、J=6.9Hz、2H)、8、77(d、J=9.6Hz、2H)、11.24(s、1H);ESI-MS:m/z 488.2[M+H]+。
メシルクロリド(1.04mL、13.55mmol)を、乾燥ピリジン(44mL)中の化合物39c(4.4g、9.03mmol)の溶液に0℃で滴下した。反応混合物を、変換完了まで0℃で撹拌(約3時間)した後、メタノールでクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、メシル化生成物を得た。粗生成物を乾燥DMF(50mL)に溶解し、続いてアジ化ナトリウム(4.51g、69.38mmol)を添加した。反応混合物を60℃で5時間撹拌した後、室温まで冷却し、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液及び水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により行い、白色の泡状物として化合物39dを得た(4g、収率:86.5%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-0.25(s、3H)、-0.02(s、3H)、0.72(s、9H)、3.65(dd、J=13.1、4.1Hz、1H)、3.92(q、J=6.9Hz、1H)、4.50(dq、J=25.3、3.7Hz、1H)、5.20(dd、J=53.7、4.8Hz、1H)、5.35(dq、J=22.0、3.9Hz、1H)、6.15(d、J=7.6Hz、1H)、7.56(t、J=7.9Hz、2H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、8.05(d、J=6.9Hz、2H)、8.80(d、J=2.4Hz、2H)、11.24(s、1H);ESI-MS:m/z 513.2[M+H]+。
MeOH(40mL)中の化合物39d(4g、7.8mmol)の溶液を、大気圧下、Pd/C(炭素上20%、0.4g)にて、室温で水素添加した。反応混合物を珪藻土で濾過し、珪藻土をMeOHですすいだ。濾液を減圧下で蒸発させ、白色の泡状物として化合物アミンを得た。粗生成物(無水トルエンと共蒸発させることにより乾燥)をDCM(59mL)に溶解し、続いて4-ニトロフェノール(3.2g、24mmol)、Et3N(6.5mL、46.8mmol)及び活性化モレキュラーシーブを添加した。得られた混合物をN2下、-78℃まで冷却した後、DCM(20mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(5.5g、23.4mmol)の溶液を滴下し、撹拌を変換完了まで継続した(約3時間)。反応混合物を室温まで加温し、飽和NaHCO3水溶液及び水で洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘキサン中の0~50%のEtOAc)により精製し、黄色の泡状物として化合物39eを得た(3.5g、収率:65%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-0.28(d、J=15.8Hz、3H)、-0.05(d、J=6.2Hz、3H)、0.71(s、9H)、3.66(t、J=5.9Hz、2H)、4.42(d、J=26.2Hz、1H)、5.29(m、2H)、6.14(t、J=7.2Hz、1H)、7.55(m、4H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、8.05(d、J=7.6Hz、2H)、8.30(m、2H)、8.69(s、1H)、8.76(d、J=7.6Hz、1H)、9.22(t、J=5.9Hz、1H)、11.27(s、1H);ESI-MS:m/z 688.29[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(2.59g、21.2mmol)、乾燥DCM(60mL)及び活性化3Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で少なくとも2時間撹拌した。同時に、各々乾燥DCM(2×60mL)中の、化合物39f(2.05g、4.2mmol)の溶液及びスルファミン酸塩39e(3.5g、5.1mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約2時間)。両方の溶液(それぞれ化合物39f及びスルファミン酸塩39e)を、引き続いて反応フラスコに移した。得られた反応混合物を24時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を飽和NaHCO3水溶液、食塩水及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、灰白色の泡状物として化合物39gを得た(2.9g、収率:66%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-0.26(s、3H)、-0.05(t、J=11.0Hz、9H)、0.71(s、9H)、0.77(s、9H)、3.56(m、2H)、3.85(dd、J=12.4、3.4Hz、1H)、3.98(d、J=9.6Hz、1H)、4.33(t、J=3.4Hz、1H)、4.46(dt、J=25.2、6.0Hz、1H)、5.18(d、J=4.1Hz、1H)、5.31(m、2H)、5.55(dq、J=17.9、4.1Hz、1H)、5.98(dd、J=51.0、2.8Hz、1H)、6.15(d、J=7.6Hz、1H)、6.51(dd、J=18.9、1.7Hz、1H)、7.55(t、J=7.6Hz、4H)、7.65(t、J=7.6Hz、2H)、8.04(dd、J=7.9、1.7Hz、4H)、8.59(s、1H)、8.75(d、J=8.3Hz、3H)、8.86(t、J=6.2Hz、1H)、11.26(d、J=4.1Hz、2H);ESI-MS:m/z 1036.5[M+H]+。
ピリジン(55mL)中の化合物39g(2.9g、2.8mmol)の溶液に、Et3N(19.5mL、140mmol)及びEt3N.3HF(4.5g、28mmol)を添加し、変換完了まで45℃で撹拌した(約5時間)。反応混合物を室温まで冷却し、イソプロポキシトリメチルシラン(19.8mL、112mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。減圧下での濃縮後に得られた残分を、DCMに懸濁し、数滴のメタノールを添加した。懸濁液を20分撹拌した後、沈殿物を濾過により回収し、高真空下で乾燥させ、灰白色粉末として化合物34aを得た(1.8g、収率:79%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm3.51(dd、J=46.1、13.8Hz、2H)、3.65(td、J=9.0、3.4Hz、1H)、3.81(q、J=4.1Hz、1H)、4.34(t、J=3.12Hz、1H)、4.41(dt、J=25.9、6.0Hz、1H)、5.21(m、2H)、5.40(m、2H)、5.92(dt、J=51.2、3.8Hz、1H)、6.11(d、J=8.3Hz、1H)、6.15(d、J=6.2Hz、1H)、6.50(dd、J=17.2、2.8Hz、1H)、7.55(t、J=7.6Hz、4H)、7.65(t、J=7.6Hz、2H)、8.04(dd、J=7.6、2.1Hz、4H)、8.70(s、1H)、8.76(d、J=7.6Hz、3H)、8.85(s、1H)、11.27(s、2H);ESI-MS:m/z 808.3[M+H]+。
乾燥THF(50mL)中の化合物34a(890mg、1.10mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中3~4%の12.86mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間、前処理した。2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(365mg、1.21mmol)を一度に添加した。反応混合物を1時間振盪した後、追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(166mg、0.55mmol)を添加した。振盪を終夜継続した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(33mg、0.11mmol)を添加し、続いて更に1日の振盪が完全な変換とするのに必要であった。t-BuOOH(デカン中5.5M溶液の341μL、1.87mmol)を添加し、振盪を1時間継続した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで十分にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液及び食塩水でそれぞれ洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、化合物39hを得た(168mg、収率:16.5%)。ESI-MS:m/z 923.4[M+H]+。
化合物39h(168mg、0.182mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、室温で2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B):勾配溶出)により精製し、化合物35、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物35、ナトリウム塩を得た(25mg、収率:20%)。1H NMR(600MHz、DMSO-d6、67℃)δppm10.60(br s、1H)、8.32(br s、1H)、8.27(s、1H)、8.14(s、1H)、8.13(s、1H)、7.32(br s、2H)、7.14(br s、2H)、6.29(dd、J=15.4、4.4Hz、1H)、6.05(d、J=8.8Hz、1H)、6.00~6.14(m、1H)、5.48~5.59(m、2H)、5.27(dd、J=53.0、3.6Hz、1H)、4.46~4.53(m、1H)、4.42~4.46(m、1H)、4.08(dt、J=11.7、7.5Hz、1H)、3.73(ddd、J=11.7、6.0、3.3Hz、1H)、3.69(br d.J=14.7Hz、1H)、3.49(br d、J=14.4Hz、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm-1.33(s、1P);ESI-MS:m/z 660.3[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(1.43g、11.7mmol)、乾燥DCM(9mL)及び活性化4Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で3時間撹拌した。同時に、各々乾燥DCM(2×9mL)中の、5’-O-DMTr-2’-F-デオキシノイシン(CAS番号51424-83-1](1.47g、2.57mmol)の溶液及びスルファミン酸塩40a(2.0g、2.34mmol)の溶液を、活性化4Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約3時間)。両方の溶液を引き続いて反応フラスコに移した。得られた反応混合物を、40℃で終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで徹底的にすすいだ。濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、次いで水相をDCMで抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の1~3%のMeOH)により精製し、純粋な化合物40bを得た(2.01g、収率:65.9%)。ESI-MS:m/z 1303.8[M+H]+。
化合物40b(2.0g、1.53mmol)を、DCM(77mL)に溶解し、これに水(140μL、7.65mmol)及びDCA(490μL、5.98mmol)を添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した後、ピリジン(620μL、7.65mmol)及びいくらかのMeOHを添加した。得られた混合物を減圧下で部分的に濃縮し、精製用のシリカでのカラム(勾配溶出:DCM中の0~18%のMeOH)に移し、化合物40cを得た(0.92g、86%)。
1H NMR(300MHz、DMSO-d6)δppm12.48(br s、1H)、12.08(br s、1H)、11.60(br s、1H)、8.63(br t.J=5.6Hz、1H)、8.34(s、1H)、8.23(s、1H)、8.09(d、J=3.2Hz、1H)、6.31(dd、J=16.4、2.9Hz、1H)、5.58~5.88(m、3H)、5.37(br t、J=5.0Hz、1H)、5.18~5.30(m、1H)、4.65(q、J=5.9Hz、1H)、4.23~4.33(m、1H)、4.05(q、J=5.0Hz、1H)、3.84(t、J=4.1Hz、1H)、3.70~3.81(m、1H)、3.54~3.68(m、1H)、3.42(s、3H)、3.20~3.40(m、2H)、2.75(spt、J=6.9Hz、1H)、1.12(br d、J=7.0Hz、3H)、1.11(br d、J=7.0Hz、3H);ESI-MS:m/z 699.4[M+H]+。
乾燥MeCN(8mL)中の化合物40c(200mg、0.286mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45Mの溶液の5.09mL、2.29mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで1時間処理した後、乾燥MeCN(1.0mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(173mg、0.57mmol)を、10分かけて滴下した(注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で2時間撹拌した。tBuOOHの溶液(300μL、1.5mmol)を添加し、撹拌を更に30分継続した。反応混合物を、珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:0~10%のDCM中のMeOH)により精製し、白色固体として化合物40dを得た(206mg、71%)。ESI-MS:m/z 814.4[M+H]+。
化合物40d(206mg、0.253mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、40℃で3時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を水に溶解し、DCMで洗浄し、凍結乾燥した。粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:XBridge OBD C18 5μm、150×30mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製した。ナトリウム塩への最終的な変換を、Dowex 50WX8 Naイオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物53、ナトリウム塩を得た(13mg、8%)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.39(s、1H)、8.18(s、1H)、8.06(s、1H)、6.63(d、J=19.1Hz、1H)、6.12(d、J=8.5Hz、1H)、6.01~5.84(m、1H)、5.66(ddd、J=4.1、8.7、19.1Hz、1H)、5.54~5.44(m、1H)、4.75~4.69(m、1H)、4.66(s、1H)、4.51(br d、J=11.5Hz、1H)、4.26(d、J=4.8Hz、1H)、4.24~4.17(m、1H)、4.03~3.94(m、1H)、3.91~3.81(m、1H)、3.77(s、3H);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.020(s、1P);
19F NMR(376.5MHz、D2O)δppm-198.634(s、1F);ESI-MS:m/z=691.2[M+H]+。
Selectfluor(34.6g、97.7mmol)及びAcOH(100mL)を、乾燥MeCN(500mL)中の4-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン[CAS番号3680-69-1](41a、10.0g、65.1mmol)の溶液に添加し、混合物を変換完了まで70℃で撹拌した(約16時間)。室温まで冷却した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、無水トルエンと共蒸発させた。得られた固体をDCM/EtOAc(1:1)溶媒混合物に溶解し、得られた溶液を、珪藻土パッドを通して濾過し、徹底的に洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により行い、灰白色固体として化合物41bを得た(5.2g、収率:47%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.49(s、1H)、8.63(s、1H)、7.73(t、J=2.8Hz、1H);ESI-MS:m/z 169.8[M+H]+。
ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA、3.15mL、12.8mmol)を、乾燥MeCN(80mL)中の化合物41b(2.0g、11.6mmol)の懸濁液に添加した。10分撹拌した後、引き続いて1,2-ジ-O-アセチル-3-O-メチル-5-O-ベンゾイル-D-リボフラノース([10300-21-7]、4.53g、12.8mmol)及びトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(TMSOTf、2.34mL、12.8mmol)を添加した。反応混合物を室温で15分撹拌し、次いで、80℃の前加熱した油浴に移し、撹拌を90分継続した。室温まで冷却した後、反応混合物をEtOAcで希釈し、引き続いて飽和NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。
精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘキサン中の0~10%のEtOAc)により行い、灰白色粉末として化合物41cを得た(1.6g、収率:30%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.66(s、1H)、7.99(d、J=1.4Hz、1H)、7.95(d、J=7.6Hz、2H)、7.65~7.71(m、1H)、7.47~7.56(m、2H)、6.42(d、J=4.1Hz、1H)、5.78(t、J=4.8Hz、1H)、4.65(dd、J=12.2、3.5Hz、1H)、4.51(dd、J=12.2、5.1Hz、1H)、4.41~4.45(m、1H)、4.35~4.40(m、1H)、3.41(s、3H)、2.09(s、3H);ESI-MS:m/z 464.0[M+H]+。
2MのNaOH水溶液(16mL)を、ジオキサン(16mL)中の化合物41c(1.6g、3.4mmol)の溶液に添加した。反応混合物を変換完了まで110℃で撹拌(約3時間)した後、室温まで冷却し、1MのHCl水溶液で中和した。減圧下での濃縮後に得られた残分を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7%のMeOH)により精製し、灰白色粉末として化合物41dを得た(0.32g、収率:45%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.11(br s、1H)、7.92(s、1H)、7.34(d、J=2.1Hz、1H)、6.04(dd、J=6.2.1.4Hz、1H)、5.42(d、J=6.2Hz、1H)、5.08(br t、J=5.2Hz、1H)、4.33~4.43(m、1H)、3.96(q、J=3.8Hz、1H)、3.77(dd、J=5.0、3.4Hz、1H)、3.56~3.65(m、1H)、3.49~3.55(m、1H)、3.39(s、3H);ESI-MS:m/z 299.9[M+H]+。
乾燥ピリジン(8mL)中の化合物41d(0.51g、1.7mmol)の溶液に、DMAP(0.1g、0.8mmol)及びDMTrCl(0.92g、2.7mmol)を(小分けして)添加し、室温で16時間撹拌した。反応混合物をメタノール(5mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分をEtOAcに溶解し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により行い、灰白色の泡状物として化合物41eを得た(0.75g、収率:74%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.13(br s、1H)、7.93(s、1H)、7.35~7.41(m、2H)、7.26~7.32(m、2H)、7.22~7.26(m、5H)、7.18(d、J=2.1Hz、1H)、6.83~6.90(m、4H)、6.06(dd、J=4.8、1.4Hz、1H)、5.54(d、J=6.2Hz、1H)、4.47(q、J=5.4Hz、1H)、4.05(q、J=4.4Hz、1H)、3.87(t、J=5.2Hz、1H)、3.74(s、6H)、3.33(s、3H)、3.20(d、J=4.1Hz、2H);ESI-MS:m/z 602.3[M+H]+。
化合物41e(1.2g、2.03mmol)、スルファミン酸塩17a(2.1g、2.43mmol)及びDMAP(1.2g、10.14mmol)を、各々別々に乾燥DCM(3×30.0mL)に溶解した。各溶液を、N2下、3Å活性化モレキュラーシーブとともに少なくとも2時間撹拌することにより乾燥させた。DMAP溶液に、DCM中の化合物41eの溶液及びDCM中のスルファミン酸塩17aの溶液をそれぞれ添加した。得られた反応混合物を36時間撹拌した。
モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を飽和NaHCO3水溶液、食塩水及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により精製し、化合物41fを得た(1.3g、収率:49%)。ESI-MS:m/z 1338.77[M+H]+。
DCM(36.5mL)中の化合物41f(1.3g、0.9mmol)の溶液に、DCA(DCM中10%の3.2mL、3.8mmol)及び水(90μL、4.8mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した。反応混合物を、ピリジン(0.4mL、4.8mmol)及び数滴のメタノールを添加することによりクエンチした。減圧下での濃縮後に得られた残分をジクロロメタン中に懸濁し、濾過し、乾燥させ、灰白色粉末として化合物41g(0.56g、収率:78%)を得た。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.18(br s、1H)、11.26(br s、1H)、8.75(s、1H)、8.62(s、1H)、8.49(br t、J=5.9Hz、1H)、8.06(d、J=7.6Hz、2H)、7.93(br d、J=2.1Hz、1H)、7.63~7.70(m、1H)、7.53~7.60(m、2H)、7.34(s、1H)、6.37(br d、J=19.3Hz、1H)、6.31(br d、J=5.5Hz、1H)、5.86(br s、1H)、5.59(br d、J=53.7Hz、1H)、5.25(br s、1H)、5.20(br t、J=5.5Hz、1H)、4.59(br d、J=18.6Hz、1H)、4.03~4.15(m、2H)、3.98(m、J=2.1Hz、1H)、3.60~3.67(m、1H)、3.53~3.59(m、1H)、3.38(s、3H)、3.11~3.27(m、2H);ESI-MS:m/z 734.2[M+H]+。
乾燥MeCN/DMF(4mL、1:3)中の化合物41g(100mg、0.136mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで20分処理した後、乾燥MeCN(1.0mL)中の1H-テトラゾール(MeCN中0.45M溶液の2.42mL、1.09mmol)及び2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(82mg、0.27mmol)を添加した(注記:MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。tBuOOHの溶液(126μL、0.69mmol)を添加し、撹拌を更に30分継続した。反応混合物をDCMで希釈し、次いで珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮した。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、化合物41hを得た(50mg、純度:77%)。
ESI-MS:m/z 849.3[M+H]+。
上記の化合物41hを、エタノール中30%のメチルアミン溶液(5mL)中で、室温で3時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を水に溶解し、DCMで洗浄し、凍結乾燥した。粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:XBridge OBD C18 5μm、150×30mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製した。ナトリウム塩への最終的な変換を、Dowex 50WX8 Naイオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物54、ナトリウム塩を得た(24mg、収率:41gからで25%)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.22(br s、1H)、7.94(s、1H)、7.40(s、1H)、7.30(br s、1H)、6.46~6.34(m、2H)、5.39(br dd、J=4.6、8.1Hz、2H)、5.23(br s、1H)、5.08~4.93(m、1H)、4.63(br s、1H)、4.48(br d、J=86Hz、1H)、4.41(br d、J=3.9Hz、1H)、4.32~4.25(m、1H)、4.25~4.18(m、1H)、3.77(br d、J=11.7Hz、1H)、3.59(s、3H)、3.54(br d、J=13.0Hz、1H);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-164.506(s、1F)、-197.262(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O):δppm-1.850(s、1P);ESI-MS:m/z 692.1[M+H]+。
THF(20mL)中の化合物4h(520mg、0.76mmol)、化合物42a(372mg、0.76mmol)及び活性化4ÅMS(1g)の混合物を、N2下、20℃で1時間撹拌した。次いで、DMAP(466mg、3.81mmol)を添加した。得られた黄色の懸濁液をN2下、20℃で17時間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下、(<40℃で)濃縮し、残分をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル/酢酸エチル100/0~0/100、次いでジクロロメタン/メタノール100/0~100/10)により精製し、淡い黄色固体として化合物42bを得た(460mg)。
1H NMR(400MHz、CD3OD)δppm8.69(s、1H)、8.40(s、1H)、8.08~8.13(m、3H)、7.64~7.71(m、1H)、7.54~7.62(m、2H)、6.28(dd、J=19.07、1.47Hz、1H)、5.94(d、J=8.07Hz、1H)、5.57(d、J=4.40Hz、1H)、5.44(d、J=2.93Hz、1H)、4.92~5.00(m、1H)、4.61(dd、J=8.07、5.38Hz、1H)、4.22(br dd、J=8.19、2.81Hz、2H)、4.13~4.17(m、1H)、4.06(br dd、J=7.09、3.18Hz、1H)、3、84~3.91(m、2H)、3、77~3.82(m、1H)、3.37(s、3H)、2.69(dt、J=13.69、6.85Hz、1H)、1.20(t、J=6.60Hz、6H)、0.87~0.96(m、17H)、0.17~0.21(m、6H)、0.08(d、J=11.00Hz、6H);ESI-MS:m/z=1031.2[M+H]+。
ピリジン(20mL)中の化合物42b(660mg、0.64mmol)、トリエチルアミン(648.2mg、6.4mmol)及びトリチルアミン三フッ化水素酸塩(516.3mg、3.20mmol)の溶液を、10℃で17時間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下、30℃で濃縮し、粗油を得て、逆相分取HPLC(カラム:Agela Durashell 5μm 150mm×25mm;移動相:水(10mMのNH4HCO3)-B:MeCN;勾配溶出:A(93%):B(7%)~A(63%):B(37%)、9分;流速25mL/分)により精製した。純粋な画分を回収し、乾燥するまで凍結乾燥し、白色固体として化合物42cを得た(230mg)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.08(s、1H)、11.63(s、1H)、11.26(s、1H)、8.69~8.81(m、2H)、8.56(s、1H)、8.18(s、1H)、8.05(d、J=7.28Hz、2H)、7.62~7.71(m、1H)、7.50、~7.61(m、2H)、6.38(d、J19.83Hz、1H)、5.99(d、J=6.53Hz、1H)、5.84(d、J=8.78Hz、1H)、5.46~5.68(m、1H)、5.15(t、J=5.27Hz、1H)、4.59~4.79(m、2H)、4.21~4.32(m、1H)、4.13~4.19(m、1H)、4.03~4.11(m、2H)、3.85(d、J=5.52Hz、1H)、3.55~3.63(m、1H)、3.45~3.53(m、1H)、3.19(s、3H)、2.75(quin、J=6.71Hz、1H)、1.11(dd、J=6.78、2.76Hz、5H)、1.08~1.14(m、1H);ESI-MS:m/z=801.9[M+H]+。
CH3CN/THF(1:1、体積/体積、18mL)中の化合物42c(310mg、0.38mmol)の溶液に、4Åモレキュラーシーブ(1g)及びCH3CN中の1H-テトラゾール(7mL、3.15mmol、CH3CN中0.45M)を添加した。混合物を25℃で0.5時間撹拌した後、混合物に、CH3CN中の2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(190mg、0.63mmol)を添加した。混合物を30℃で2時間撹拌した後、混合物に、CH3CN中の1H-テトラゾール(1.8mL、0.81mmol、CH3CN中0.45M)を添加した。混合物を30℃で0.5時間撹拌した後、反応物に、TBHP(0.4mL、2mmol、デカン中5M)を添加した。混合物を30℃で2時間撹拌した後、反応物を濾過し、減圧下で濃縮し、粗化合物42dを得た(850mg)。ESI-MS:m/z=917.1[M+H]+。
化合物42d(1000mg、粗)を、EtOH中のメタンアミン(33%)(10mL)で、室温で処理した。反応混合物を20℃で2時間撹拌した後、混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。残分を水(30mL)に溶解し、酢酸エチル(10mL×2)で抽出した。水相を乾燥するまで凍結乾燥し、残分を逆相分取HPLC(カラム:Agela Durashell 5μm 150mm×25mm;移動相:A:水(0.04%のNH3-H2O+10mMのNH4HCO3)-B:MeCN;勾配溶出:A(100%):B(0%)~A(90%):B(10%)、10分;流速25mL/分)により精製した。純粋な画分を回収し、乾燥するまで凍結乾燥し、化合物5、アンモニウム塩を得た(111mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm7.98(s、1H)、7.56~7.70(m、2H)、6.20(br d、J=14.92Hz、1H)、5.71(br d、J=9.05Hz、1H)、5.18~5.40(m、2H)、4.98(br s、1H)、4.85(br d、J=4.89Hz、1H)、4.55(br d、J=10.27Hz、1H)、4.44~4.52(m、1H)、4.39(br s、1H)、4.19(br d、J=11.25Hz、1H)、4.05~4.16(m、2H)、4.01(br d、J=4.40Hz、1H)、3.34~3.43(m、1H)、3.35(s、3H);31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.37~-0.06(m、1P);19F NMR(376MHz、D2O)δppm-202.54(br s、1F);ESI-MS:m/z=689.9[M+H]+。
5-[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]テトラゾール(MeCN中0.25M溶液の9.65mL、2.41mmol、溶液を使用前にモレキュラーシーブで乾燥)を、MeCN(8mL)中のN-ベンゾイル-2’,3’-ジデオキシ-3’-[(トリフェニルメチル)アミノ]-アデノシン43a[CAS番号195375-63-4](720mg、1.21mmol)の溶液に添加した。活性化モレキュラーシーブを添加し、得られた混合物をN2下、1時間撹拌した。次に上記の混合物に、活性化モレキュラーシーブで乾燥させた、MeCN(25mL)中の5’-O-(4,4-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチルグアノシン-2’-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト)43b[CAS番号179479-04-0](2201mg、2.53mmol)の溶液を、移した。得られた反応溶液を室温で1時間撹拌した後、tBuOOH(デカン中5.5M溶液の1.10mL、6.03mmol)を添加し、撹拌を更に1時間継続した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。水及び酢酸エチルを添加し、水相を分離し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中0~100%のEtOAc、続いてEtOAc中の0~10%のMeOH)により行い、化合物43cを得た(2.3g)。
ESI-MS:m/z 1381.4[M+H]+。
MeCN(15mL)中の上記の化合物43e(1.3g、不純)の溶液に、AcOH(水中80%、15mL)及びトリエチルシラン(4.8mL、30.22mmol)を添加し、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を分取逆相HPLC(固定相:Xtimate C18、5μm、150×25mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物43d及びそのシアノエチル脱保護化類似体の生成物混合物を得た(260mg)。ESI-MS:m/z 838.2[M+H]+及び784.2[M+H]+(シアノエチル脱保護化化合物)。
化合物43d及びそのシアノエチル脱保護化類似体の混合物(400mg、約0.49mmol)を、ピリジン/DCM(1:1、mL)に溶解し、続いてEt3N(403mg、3.98mmol)、4-ニトロフェノール(346mg、2.49mmol)及び活性化4Åモレキュラーシーブを添加した。得られた溶液を-78℃まで冷却し、不活性雰囲気下、1時間撹拌した。これに、使用前に活性化4Åモレキュラーシーブで乾燥(1時間)させたDCM(5mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(592mg、2.49mmol)の溶液を、添加した。反応混合物を-78℃で2時間撹拌した後、室温まで加温し、更に1.5時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。水及び酢酸エチルを添加し、水相を分離し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中0~100%のEtOAc、続いてEtOAc中の0~10%のMeOH)により行い、不純な化合物43eを得て、更に精製することなくそのまま使用した。ESI-MS:m/z 899.3[M+H]+。
tert-ブチルアミン(200μL、1.88mmol)を、エタノール(1mL)中の化合物43e(100mg、不純)の溶液に添加した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:Agela Durashell C18 5μm、150×25mm、移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、純粋な化合物43fを得た(7mg)。
ESI-MS:m/z 846.2[M+H]+。
化合物43f(6mg、7.09μmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(1mL)中で、室温で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残分をMeCNですりつぶし、化合物20を得た(2mg、収率:33%)。1H NMR(600MHz、DMSO-d6)δppm8.37(s、1H)、8.17(s、1H)、7.89(s、1H)、7.29(br s、2H)、6.53(br s、2H)、6.36(dd、J=9.7、5.4Hz、1H)、5.76(d、J=9.1Hz、1H)、5.08(td、J=9.7、4.3Hz、1H)、4.73(br d、J=5.1Hz、1H)、4.37(d、J=11.2Hz、1H)、4.29(s、1H)、4.16~4.22(m、2H)、4.15(br dd、J=11、8、2.1Hz、1H)、3.94(d、J=4.1Hz、1H)、3.52~3、57(m、1H)、3.50(s、3H)、3.12~3.19(m、1H)、2.44~2.49(m、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm0.97(s、1P);ESI-MS:m/z 672.3[M+H]+。
化合物6g(95mg、0.117mmol)を、無水トルエン:アセトニトリル(1:1、体積/体積、3×30mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(10mL)に溶解した。4Åモレキュラーシーブ粉末(0.3g)及びCH3CN中0.45Mのテトラゾール(2.0mL、0.936mmol)を添加し、得られた不均一混合物をアルゴンで4分間バブリングした。この混合物を室温で10分撹拌した後、CH3CN中の2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル-クロロホスホルアミダイト(57mg、0.18mmol、CH3CN中3.0mL)の溶液を、室温で30分かけて添加した。反応物を1.5時間撹拌した後、モレキュラーシーブを濾過により除去し、THF(15mL)で洗浄した。濾液を、次ステップにて直接使用した。DDTT(119mg、0.585mmol、5mLのピリジンに溶解)の溶液を添加した。反応混合物を室温で30分撹拌した後、混合物をEtOAc(30mL)で希釈し、飽和NaHCO3水溶液(1×20mL)及び食塩水(1×20mL)で洗浄した。水層をEtOAcで逆抽出した(1×40mL)。合わせた有機層を蒸発乾固させ、得られた粗物質をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中のMeOH:0~15%、体積/体積)により精製し、化合物44aを得た(58mg)。ESI-MS:m/z 943[M+H]+。
MeNH2(EtOH中33%、10mL)中の化合物44a(58mg、0.06mmol)の溶液を、40℃で2時間30分撹拌し、減圧下で濃縮した。
得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾別し、逆相分取HPLC(カラム:カラム:Synergi 4μm、Hydro RP、250mm×4.6mm、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;勾配:30分の0~40%のB、流速:24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物(*R)10Aを得た(15.9mg)。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、もたらした。
Dowex 50WX8 200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄し、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し;混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%のH2SO4(少なくとも4CV[カラム体積])で洗浄し、次いでpHが中性(試験紙のpH)になるまで、脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、pHが中性になるまで脱イオン水で洗浄した。化合物16(15.9mg)を最小量の脱イオン水に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に(UV)貯めて凍結乾燥し、化合物(*R)10A、ナトリウム塩を得た(15.1mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δ8.33(s、1H)、7.99(s、1H)、7.71(s、1H)、6.30~6.42(m、2H)、6.22(d、J=8.0Hz、1H)、5.43(s、1H)、5.27(s、1H)、4.84~4.98(m、1H)、4.60~4.70(m、1H)、4.56(d、J=3.6Hz、1H)、4.32(d、J=8.4Hz、1H)、4.12(d、J=8.0Hz、1H)、4.01~4.11(m、1H)、3.81(d、J=11.6Hz、1H)、3.69(s、3H)、3.55(d、J=11.6Hz、1H);31P NMR(162MHz、D2O)δ54.07(s、1P);ESI-MS:m/z:714.7[M-1]-。
化合物45a(200mg、0.216mmol)を、無水トルエン:MeCN(1:1、体積/体積、3×30mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(20mL)に溶解した。4Åモレキュラーシーブ粉末(0.8g)及びMeCN中の0.45Mのテトラゾール(3.8mL、1.72mmol)を添加した。得られた不均一混合物をアルゴンで4分バブリングした。この混合物を室温で10分撹拌した後、これに、MeCN(3mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(105mg、0.345mmol)の溶液を、室温で30分かけて添加した。反応物を90分撹拌した後、濾別し、次いで、THF(15mL)で洗浄した。得られた混合物(MS:m/z:1007[M+H]+)を次ステップにて直接使用した。これに、0.5Mのヨウ素(THF:水:Py、8:1:1、体積/体積/体積中)を、色が持続するまで添加した。室温で30分撹拌した後に次いで、反応混合物をEtOAc(30mL)で希釈し、過剰なヨウ素を飽和Na2S2O3水溶液で(変色するまで)クエンチした。相を分離し;有機相を飽和NaHCO3水溶液(1×20mL)、飽和NaCl水溶液(1×20mL)で洗浄した。水相をEtOAcで逆抽出した(1×20mL)。合わせた有機相を蒸発乾固させ、得られた粗物質をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(DCM中0~15%のMeOH、体積/体積)により精製し、45bを得た(135mg)。ESI-MS:m/z 1023[M+H]+。
化合物45b(135mg)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)に室温で供した。40℃で2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾別し、固体として45cを得た(98mg)。ESI-MS:m/z 796[M+H]+。
化合物45c(98mg)を、80%TEA水溶液(4mL)に0℃で供した。0℃で1時間撹拌した後、反応混合物を真空下で濃縮し、無色の油として粗生成物を得た。粗物質を逆相分取HPLC(カラム:Synergi 4μm、Hydro RP、250mm×30mm、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート、勾配:30分の0~40%のB、流速24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物17を得た(24.2mg)。ESI-MS:m/z:674[M-1]-。
Dowex 50W×8,200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。
化合物17TEAA塩(1:1、体積/体積)を最小量の脱イオン水及びMeCN(1:1、体積/体積)に溶解し、カラム上部に添加し、脱イオン水で溶出した。
適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、化合物17、ナトリウム塩を得た(22.9mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.31(s、1H)、7.95(s、1H)、7.76(s、1H)、6.74(s、1H)、6.15~6.25(m、2H)、5.45~5.55(m、1H)、5.25(d、J=4.8Hz、0.5H)、5.13(d、J=4.8Hz、0.5H)、4.75~4.90(m、1H)4.65(s、1H)、4.35~4.45(m、1H)、4.33(d.J=9.6Hz、1H)4.10~4.25(m、2H)、3.55~3.70(dd、J=3.2、13.2Hz、1H)、3.38(d、J=12Hz、1H).31P NMR(162MHz、D2O)δ-1.895ppm(s、1P);19F NMR(379MHz、D2O)δ-196.91ppm(ブロードピーク、1F);ESI-MS:m/z:658.5[M-1]-。
化合物46a(110mg、0.123mmol)を、無水トルエン:アセトニトリル(1:1、体積/体積、3×30mL)の混合物と共蒸発させ、次いで無水THF(14mL)に溶解し、これに、4Åモレキュラーシーブ粉末(0.5g)及びMeCN中0.45Mのテトラゾール(2.1mL、0.989mmol)を添加した。得られた不均一混合物をアルゴンで4分バブリングした。この混合物を室温で10分撹拌した後、MeCN(3.0mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(60mg、0.197mmol)の溶液を、室温で30分かけて添加した。室温で90分撹拌した後、反応混合物を濾別し、次いでTHF(15mL)で洗浄した。得られた混合物(MS:m/z:989[M+H]+)を次ステップに直接使用した。これに、0.5Mのヨウ素(THF:水:Py、8:1:1、体積/体積/体積中)を、色が持続するまで添加した。室温で30分撹拌した後、反応混合物をEtOAc(30mL)で希釈し、過剰なヨウ素を飽和Na2S2O3水溶液で(変色するまで)クエンチした。相を分離し;有機相を飽和Na2S2O3水溶液で(変色するまで)洗浄した。相を分離し;有機相を飽和NaHCO3水溶液(1×20mL)、飽和NaCl水溶液(1×20mL)で洗浄した。水相をEtOAcで逆抽出した(1×20mL)。合わせた有機相を蒸発乾固させ、得られた粗物質をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(ジクロロメタン中0~15%のMeOH、体積/体積)により精製し、化合物46bを得た(77mg)。ESI-MS:m/z 1005.8[M+H]+。
化合物46b(77mg)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(6mL)に室温で供した。40℃で2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗固体をDCM(15mL)で洗浄し、沈殿物を濾別し、化合物46cを得た(43mg)。ESI-MS:m/z 778[M+H]+。
化合物46c(43mg)を、80%TEA水溶液(2mL)に供した。室温で1時間撹拌した後、反応混合物を真空下で濃縮し、無色の油として残分を得た。残分を逆相分取HPLC(カラム:Synergi 4μm、Hydro RP、250mm×30mm、移動相:緩衝液A:水中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート;緩衝液B:CH3CN中50mMのトリエチルアンモニウムアセテート、勾配:30分の0~40%のB、流速24mL/分)により精製し、TEAA塩として化合物18を得た(6.4mg)。
Dowex 50W×8,200-400(5mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオン水(30mL)で洗浄した。次いで、樹脂に15%H2SO4脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオン水溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4で洗浄し(少なくとも4CV)、次いで、中性になるまで脱イオン水で洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオン水溶液を添加し、混合物を5分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%NaOH水溶液(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで脱イオン水で中性になるまで洗浄し、化合物18(6.4mg)TEAA塩を最小量の脱イオン水及びMeCN(1:1、体積/体積)に溶解し、カラムの上部に添加し、脱イオン水で溶出した。適切な画分を一緒に貯め、凍結乾燥し、化合物18、ナトリウム塩を得た(5.9mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm7.93(s、1H)、7.84(s、1H)、7.21(s、1H)、6.32(dd、J=2.8、4.8Hz、1H)、6.05(d、J=8.4Hz、1H)、5.92~6.01(m、1H)、5.15~5.25(m、1H)、4.61(d、J=12Hz、1H)、4.30~4.36(m、1H)、3.90~4.20(m、3H)、3.50~3.58(dd、J=3.2、13.2Hz、1H)、3.20~3、33(dd、J=2、13.2Hz、1H)、2.60~2.75(m、2H).31P NMR(162MHz、D2O)δppm-0.838(s、1P);ESI-MS:m/z:656.8[M-1]-。
クロロトリメチルシラン(2.08mL、16.38mmol)を、乾燥ピリジン(60mL)中の化合物47a[CAS番号174171-97-2](1g、3.28mmol)の溶液に0℃で滴下した。反応混合物を0℃で2時間撹拌した後、ベンゾイルクロリド(1.89mL、16.38mmol)を滴下した。撹拌を室温で3時間継続した。反応溶液を0℃まで冷却し、水(30mL)を添加し、続いてアンモニア水溶液(30mL、25%溶液)を添加し、撹拌を0℃で90分継続した。反応溶液をEtOAcで抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の50~100%のEtOAc)により行い、白色固体として化合物47bを得た(1.1g、収率:82%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.17(s、1H)、8.75(s、1H)、8.64(s、1H)、8.05(d、J=7.3Hz、2H)、7.61~7.68(m、1H)、7.46~7.59(m、2H)、5、02~5.09(m、1H)、4.90~5.01(m、1H)、4.83(t、J=5.3Hz、1H)、4.59(dd、J=7.2、3.9Hz、1H)、3.53(br t、J=5.0Hz、2H)、2.17~2.41(m、3H)、1.50(s、3H)、1.25(s、3H);ESI-MS:m/z 410.2[M+H]+。
DMAP(448mg、3.66mmol)及びトシルクロリド(2.79g、14.65mmol)を、DCM(6mL)中の化合物47b(3g、7.32mmol)及びEt3N(3.07mL、21.98mmol)の溶液に氷冷下で添加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。混合物を水でクエンチし、DCMで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、トシル化生成物を得た。粗生成物をDMF(15mL)に溶解し、続いてアジ化ナトリウム(1.88g、28.91mmol)を添加し、得られた反応混合物を35℃で16時間撹拌した。次に反応混合物を室温まで冷却し、飽和Na2CO3水溶液で希釈し、EtOAcで抽出した。有機層を分離し、食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~25%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物47cを得た(2.1g、収率:61%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.25(s、3H)、1.51(s、3H)、2.24~2.48(m、3H)、3.53(dd、J=12.3、6.3Hz、1H)、3.60(dd、J=12.3、5.3Hz、1H)、4.02(q、J=7.2Hz、1H)、4.58(dd、J=7.2、4.6Hz、1H)、4.93~5.03(m、1H)、5.03~5.11(m、1H)、7.51~7.59(rn、2H)、7.60~7.71(m、1H)、8.04(d、J=7.5Hz、2H)、8、64(s、1H)、8.75(s、1H)、11.19(br s、1H);
ESI-MS:m/z 435.1[M+H]+。
TFA(100mL、水中75%)を、DCM(20mL)中の化合物47c(3.47g、7.99mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を室温で1時間撹拌した。反応物を減圧下で濃縮し、得られた残分をEtOAcに溶解し、飽和K2CO3水溶液で洗浄し、水層を分離し、EtOAcで抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、真空下で蒸発させ、白色固体として化合物47d(3.25g、粗)を得て、これを次ステップにてそのまま使用した。
ESI-MS:m/z 395.0[M+H]+。
化合物47d(3.25g)をDMF(22mL)に溶解し、続いてイミダゾール(1.57g、23.0mmol)及びTBSCl(1.39g、9.20mmol)を添加した。第2の反応を同じ規模で並行して行った。両方の反応混合物を室温で終夜撹拌した後、EtOAc及び食塩水を添加した。有機相を分離し、水層をEtOAcで抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗位置異性体混合物を得た。分離を、分取逆相HPLC(固定相:Phenomenex Synergi 10μm Max-RP、250×50mm;移動相:水(A)-MeCN(B);勾配溶出)により行い、最初の溶出異性体として化合物47e(2.0g、収率:24%)及び2番目の溶出異性体として3’-TBS保護化位置異性体(47ea、構造を示さず、2.5g、収率:31%)を得た。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.13(s、1H)、8.72(s、1H)、8.61(s、1H)、8.04(br d、J=7.5Hz、2H)、7.61~7.68(m、1H)、7.51~7.58(m、2H)、4.91~5.01(m、1H)、4.78(d、J=5.3Hz、1H)、4.52(dd、J=8.5、5.5Hz、1H)、3.79~3.86(m、1H)、3.54~3.64(m、2H)、2.34(dt、J=12.6、8.5Hz、1H)、2.16~2.28(m、1H)、1.94~2.04(m、1H)、0.64(s、9H)、-0.16(s、3H)、-0.38(s、3H);
ESI-MS:m/z 509.2[M+H]+。
DMTrCl(394mg、1.16mmol)、AgNO3(492mg、2.90mmol)及び2,4,6-コリジン(351mg、2.90mmol)を、DCM(6mL)中の化合物47e(300mg、0.59mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。反応物を食塩水でクエンチし、水層を分離し、DCMで抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗生成物を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%のEtOAc)により精製し、黄色固体として化合物47fを得た(430mg、収率:90%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm-0.68(s、3H)、-0.22(s、3H)、0.67~0.75(m、9H)、0.80~0.89(m、1H)、1.54~1.66(m、1H)、2.00~2.08(m、1H)、2.29~2.39(m、1H)、3.21(dd、J=12.0、5.9Hz、1H)、0.00(br dd、J=3.9、1.0Hz、1H)、3.74(s、3H)、3.75(s、3H)、4.58(dd、J=9.3、3.9Hz、1H)、5.37(q、J=9.3Hz、1H)、6.83~6.96(m、4H)、7.20~7.27(m、1H)、7.28~7.35(m、2H)、7.36~7.44(m、4H)、7.50~7.60(m、4H)、7.61~7.67(m、1H)、8.05(br d、J=7.6Hz、2H)、8.62~8.69(m、1H)、8.71(s、1H)、11.12(br s、1H);
ESI-MS:m/z 811.3[M+H]+。
EtOAc(150mL)中の化合物47f(3.23g、3.98mmol)の懸濁液を、H2下(15psi)、Pd/C(炭素上10%、3.0g)の存在にて、30℃で終夜撹拌した。触媒を、珪藻土で濾過することにより除去し、濾液を減圧下で濃縮し、化合物アミンを得て、これを次ステップにてそのまますぐ使用した。粗生成物をDCM(110mL)に溶解し、続いて4-ニトロフェノール(3.53g、25.38mmol)、Et3N(2.12mL、15.23mmol)及び活性化モレキュラーシーブを添加した。得られた混合物を、N2雰囲気下、-78℃まで冷却した後、DCM(20mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(3.62g、15.23mmol)を滴下し、反応溶液を室温まで温め、終夜撹拌した。混合物をDCMで希釈し、珪藻土パッドを通して濾過した。濾液を、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~50%のEtOAc)により精製し、化合物47gを得た(2.6g、収率:67%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm-0.62(s、3H)、-0.30(s、3H)、0.65(s、9H)、1.92~2.11=1(m、2H)、2.44(br dd、J=9.9、3.5Hz、1H)、2.85~3.01(m、1H)、3.04~3.15(m、1H)、3.45(br d、J=3.9Hz、1H)、3.72(s、3H)、3.72(s、3H)、4.68(br dd、J=9.5、3.9Hz、1H)、5.47(q、J=9.5Hz、1H)、6.87(s、3H)、7.19~7.25(m、1H)、7.26~7.34(m、2H)、7.35~7.48(m、5H)、7.51~7.60(m、3H)、7.62~7.70(m、1H)、8.05(br d、J=7.3Hz、2H)、8.33(d、J=9.0Hz、2H)、8.67(d、J=7.1Hz、1H)、8.80(br t、J=5.7Hz、1H)、11.15(s、1H);ESI-MS:m/z 986.6[M+H]+。
活性化モレキュラーシーブを、乾燥THF(25mL)中の化合物47g(1g、1.07mmol)及び5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-3’-O-メチル-D-グアノシン[CAS番号103285-33-2](717mg、1.01mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を、窒素下、室温で2時間撹拌した。次に、THF(10mL)中のDMAP(619mg、5.07mmol)の溶液を、活性化モレキュラーシーブの存在下で2時間撹拌することにより前乾燥させ、添加し、反応を開始した。得られた反応混合物を、50℃で終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。水相をDCMで抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、化合物47hを得た(875mg、収率:54%)。ESI-MS:m/z 759.2[M+2H]/2+。
DCM(40mL)中の化合物47h(875mg、0.56mmol)の溶液を、水(0.05mL、2.81mmol)の存在下、DCA(0.19mL、2.25mmol)で1時間処理した。反応混合物をメタノール(2mL)中のピリジン(0.23mL、2.81mmol)の添加によりクエンチし、続いて減圧下で濃縮した。得られた残分をDCMに溶解し、得られた溶液を水及び食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物47iを得た(465mg、収率:91%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.11(br s、1H)、11.58(br s、1H)、11.09(br s、1H)、8.70(s、1H)、8.57(s、1H)、8.44(br s、1H)、8.29(s、1H)、8.05(d、J=7.3Hz、2H)、7.59~7.70(m、1H)、7.47~7.58(m、2H)、6.10(d、J=6.5Hz、1H)、5.41(dd、J=6.5、5.3Hz、1H)、5.29(t、J=5.3Hz、1H)、4.91(q、J=9.3Hz、1H)、4.54(br d、J=3.7Hz、1H)、4.48(dd、J=8.7、5.5Hz、1H)、4.22(dd、J=4.9、2.4Hz、1H)、4.15(q、J=3.3Hz、1H)、3.76(br s、1H)、3.54~3.73(m、2H)、3.49(s、3H)、2.97(dd、J=13.4、7.7Hz、1H)、2.81~2.90(m、1H)、2.75(spt、J=6.8Hz、1H)、2.18~2.29(m、1H)、2.02~2.15(m、1H)、1.74~1.87(m、1H)、1.11(d、J=6.5Hz、3H)、1.08(d、J=6.9Hz、3H)、0.63(s、9H)、-0.17(s、3H)、-0.41(s、3H);ESI-MS:m/z 912.7[M+H]+。
MeCN/THF(1:1、44mL、使用前に活性化3Åモレキュラーシーブで前乾燥)中の化合物47i(280mg、0.31mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の3.58mL、使用前に起動3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(97μL、0.31mmol)を一度に添加した。得られた反応混合物を室温で3時間振盪した。PADS(0.19g、0.61mmol)を添加し、振盪を更に1時間継続した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。合わせた濾液を、飽和NaHCO3水溶液及び食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製し、単一のジアステレオマーとして化合物47jを得た(91mg、収率:26%)。
31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm66.65(s、1P);
ESI-MS:m/z 1043.7[M+H]+。
化合物47j(86mg、0.077mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(4mL)中で、変換完了まで45℃で撹拌(約1時間)した後、反応溶液を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。残分をピリジン(4mL)に溶解し、続いてEt3N(320μL、2.32mmol)及びトリエチルアミン三フッ化水素酸塩(200μL、1.16mmol)を添加した。反応混合物を45℃で18時間撹拌した。イソプロポキシトリメチルシラン(0.82mL、4.65mmol)を添加し、撹拌を室温で18時間継続した。減圧下での濃縮後に得られた残分を、無水アセトニトリル中ですりつぶし、得られた沈殿物を、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD 10μm、150×50mm、移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により更に精製し、単一のジアステレオマーとして化合物(*R)21Aを得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、ふわふわした白色固体として化合物(*R)21A、ナトリウム塩を得た(27mg、収率:46%)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.36(s、1H)、8、18(s、1H)、7.87(s、1H)、6.10(d、J=8.1Hz、1H)、5.68(dd、J=8.3、4.3Hz、1H)、4.83~4.95(m、2H)、4.67~4.72(m、1H)、4.61(m、J=2.0Hz、1H)、4.39(d、J=4.5Hz、1H)、4.27(ddd、J=11.8、6.5、2.4Hz、1H)、4.18(ddd、J=12.2、4.5、1.6Hz、1H)、3.55(s、3H)、3.36(br d、J=4.8Hz、2H)、2.55~2.65(m、2H)、1.92~2.03(m、1H);
31P NMR(162MHz、D2O)δppm54.55(s、1P);
ESI-MS:m/z 702.4[M+H]+。
TIPDSCl2(765μL、2.39mmol)を、ピリジン(25mL)中の化合物48a[CAS番号1834500-50-3](0.6g、1.71mmol)の溶液に添加した。反応混合物を2時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液に注いで、EtOAcで抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残りの生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:石油エーテル中の0~100%のEtOAc、続いてEtOAc中の0~10%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物48bを得た(550mg、収率:54%)。1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.06(br s、1H)、11.56(br s、1H)、8.05(s、1H)、4.85(d、J=7.3Hz、1H)、4.51~4.64(m、1H)、4.29(q、J=7.2Hz、1H)、4.14~4.23(m、1H)、3.90(dd、J=11.5、3.0Hz、1H)、3.76(dd、J=11.6、8.1Hz、1H)、2.78(spt、J=6.7Hz、1H)、2.10~2.29(m、2H)、1.42~1.58(m、1H)、1.13(d、J=7.0Hz、6H)、0.99~1.10(m、28H);ESI-MS:m/z 594.4[M+H]+。
活性化モレキュラーシーブを、乾燥THF(20mL)中の化合物48b(350mg、0.59mmol)及びスルファミン酸塩17a(745mg、0.85mmol)の溶液に添加し、得られた混合物を、窒素下、室温で2時間撹拌した。次に、THF(5mL)中のDMAP(347mg、2.84mmol)の溶液を、活性化モレキュラーシーブの存在下で撹拌することにより前乾燥させ、添加し、反応を開始した。反応混合物を、50℃で終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。水相をDCMで抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。化合物48cを、シリカでのカラムクロマトグラフィ(1順目:勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH、2順目:石油エーテル中の0~100%のEtOAc、続いてEtOAc中の0~10%のMeOH)の2順により精製した後、黄色固体として得た(401mg、収率:51%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.00(s、1H)、11.44(s、1H)、11.25(s、1H)、8.59(s、1H)、8.51(s、1H)、8.20(br t、J=5.4Hz、1H)、8.03(d、J=7.3Hz、2H)、8.00(s、1H)、7.62~7.70(m、1H)、7.55(t、J=7.5Hz、2H)、7.46(d、J=7.5Hz、2H)、7.28~7.39(m、6H)、7.18~7.26(m、1H)、6.84~6.92(m、4H)、6.30(dd、J=17.9、3.0Hz、1H)、4.98~5.04(m、1H)、4.84~4.95(m、1H)、4.56~4.72(m、1H)、4.55(br s、1H)、4.39(t、J=5.5Hz、1H)、3.73~3.93(m、3H)、3.71(s、3H)、3.70(s、3H)、2.88~3.00(m、1H)、2.73(spt、J=6.8Hz、1H)、2.57~2.68(m、1H)、2.20~2.34(m、2H)、1.54~1.66(m、1H)、1.09(d、J=6.8Hz、6H)、0.86~1.07(m、28H);ESI-MS:m/z 1329.8[M+2H]/2+。
乾燥MeOH(55mL、モレキュラーシーブで乾燥)中の化合物48c(1.3g、0.98mmol)の溶液を、HCl(Et2O中2Mの0.19mL、13.7mmol)で4時間処理した。反応混合物を、飽和NaHCO3水溶液を添加することによりクエンチし、続いてDCMで抽出した。有機相を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、化合物48dを得た(670mg、収率:65%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm1.01~1.08(m、28H)、1.12(d、J=6.8Hz、3H)、1.67~1.75(m、1H)、2.20~2.32(m、1H)、2.43~2.54(m、1H)、2.62(br d、J=14.3Hz、1H)、2.79(spt、J=6.9Hz、1H)、2.85~2.96(m、1H)、3.51(s、3H)、3.52~3.57(m、2H)、3.75~3.83(m、1H)、4.39~4.48(m、1H)、4.50(d、J=4.2Hz、1H)、5.02(q、J=9.6Hz、1H)、5.09(t、J=4.5Hz、1H)、5.25(dd、J=9.8、4.1Hz、1H)、5.52(ddd、J=52.4、4.4、2.6Hz、1H)、5.68(br d、J=5.9Hz、1H)、6.30(dd、J=18.5、2.6Hz、1H)、7.56(t、J=7.7Hz、2H)、7.61~7.69(m、1H)、8.02~8.07(m、2H)、8.11(br s、1H)、8.14(s、1H)、8.57(s、1H)、8.71(s、1H)、11.22(br s、1H)、11.33(br s、1H)、12.09(br s、1H);ESI-MS:m/z 1060.7[M+H]+。
乾燥THF(47.5mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物48d(640mg、0.60mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の7.05mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(200mg、0.66mmol)を一度に添加した。反応混合物を3時間振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(73mg、0.24mmol)を添加し、振盪を終夜継続した。ピリジン(19.5mL)及びPADS(456mg、1.53mmpl)を添加し、反応混合物を更に1時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。濾液を食塩水で洗浄し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~15%のMeOH)により精製し、化合物48eを得た(250mg、収率:35%)。ESI-MS:m/z 1138.7[M+H]+。
化合物48e(250mg、0.21mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、変換完了まで室温で撹拌(約4時間)した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、MeCN中ですりつぶした。沈殿物を、ピリジン(1.7mL)及びEt3N(1.5mL)の混合物に溶解した。
トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(141μL、0.84mmol)を添加し、得られた反応混合物を変換完了まで室温で撹拌した(注記:所望の生成物の沈殿が観察された。イソプロポキシトリメチルシラン(596μL、3.36mmol)を添加し、撹拌を終夜とした。残分を、減圧下での濃縮後に得て、MeCN中ですりつぶし、得られた沈殿物を、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、10μm、150×50mm、移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により更に精製し、単一のP-エピマーとして化合物(*R)43A、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、ふわふわした白色固体として化合物(*R)43A、ナトリウム塩を得た(56mg、収率:37.5%)。1H NMR(600MHz、DMSO-d6、61℃)δppm10.24(br s、1H)、8.34(br s、1H)、8.07(s、1H)、7.87(s、1H)、7.26(s、3H)、6.34(dd、J=18.6、2.2Hz、1H)、6.23(br s、2H)、5.69(d、J=51.8Hz、1H)、5.44~5.54(m、1H)、5.39(dddd、J=17.3、9.8、7.2、4.7Hz、1H)、5.18(br s、1H)、5.06(q、J=9.8Hz、1H)、4.30~4.38(m、1H)、4.29(br s、1H)、3.99~4.10(m、1H)、3.86(dt、J=11.0、4.0Hz、1H)、3.63(dd、J=13.2、4.5Hz、1H)、3.36(dd、J=13.6、3.7Hz、1H)、2.45(dt、J=13.5、10.2Hz、1H)、2.20(m、J=9.1、4.5Hz、1H)、1.80~1.91(m、1H);
31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm51.63(s、1P);ESI-MS:m/z 690.1[M+H]+。
無水ピリジン(500mL)中のN2-イソブチリル-3’-O-メチル-グアノシン3j(50g、136mmol)の溶液に、イミダゾール(18.52g、272mmol)、トリフェニルホスフィン(53.51g、204mmol)及びヨウ素(51.78g、204mmol)を添加した。反応混合物をN2下、0~5℃で3時間撹拌した。次いで、溶液を蒸発乾固させ、残分をDCM(500mL)に溶解した。飽和NaHCO3水溶液を添加し、混合物を30分撹拌した。沈殿物を濾過し、真空下で乾燥させ、白色粉末として化合物49aを得た(56g、収率:86%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm11.94(br s、2H)、8.24(s、1H)、5.82(d、J=6.5Hz、1H)、5.69(br s、1H)、4.84(dd、J=5.0、6.5Hz、1H)、4.10(m、1H)、3.83(dd、J=3.0、4.5Hz、1H)、3.58(dd.J=7.0、10.5Hz、1H)、3.47(dd、J=7.0、10.5Hz、1H)、3.46(s、3H)、2.74(spt、J=6.5Hz、1H)、1.12(d、J=6.5Hz、6H):ESI-MS:m/z 477.8[M+H]+。
アジ化ナトリウム(22.48g、345.8mmol)を、無水DMF(100mL)中の化合物49a(55g、115.2mmol)の溶液に添加し、N2下、85℃で4時間撹拌した。次いで、反応溶液を25℃まで冷却し、水(2L)に注ぎ、30分撹拌した。沈殿物を濾過により回収し、乾燥させ、化合物3Kを得た(41g、収率:91%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.09(br s、1H)、11.63(br s、1H)、8.26(s、1H)、5.84(d、J=6.0Hz、1H)、5.68(d、J=5.0Hz、1H)、4.76(m、1H)、4.14(m、1H)、3.84(t、J=4.5Hz、1H)、3.69(dd、J=8.0、13.0Hz、1H)、3.57(dd、J=4.0、13.0Hz、1H)、3.43(s、3H)、2.77(spt、J=7.0Hz、1H)、1.13(d、J=7.0Hz、6H);ESI-MS:m/z 393.0[M+H]+。
無水DMF(100mL)中の化合物3k(40.00g、101.94mmol)、イミダゾール(10.41g、152.9mmol)及びTBSCl(18.44g、122.4mmol)の混合物を、N2下、25℃で17時間撹拌した。反応溶液を、減圧下、55℃で蒸発乾固させた。残分をEtOAcに溶解し、水で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させた。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘプタン中の20~40%のEtOAc)により精製し、化合物49bを得た(45g、収率:87%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.08(br s、1H)、11.59(br s、1H)、8.29(s、1H)、5.87(d、J=7.5Hz、1H)、4.86(dd、J=4.5、7.5Hz、1H)、4.17(m、1H)、3.84~3.79(m、2H)、3.56(dd、J=4.5、13.0Hz、1H)、3.45(s、3H)、2.77(spt、J=7.0Hz1H)、1.12(d、J=6.5Hz、6H)、0.74(s、9H)、-0.02(s、3H)、-0.23(s、3H);ESI-MS:m/z 507.6[M+H]+。
トリフェニルホスフィン(31.06g、118.4mmol)を、THF(400mL)中の化合物49b(40g、78.95mmol)の溶液に添加した。反応混合物を25℃で10分撹拌した後、水(5.68g、315.2mmol)を30分かけて滴下した。TsOH(27.19g、157.9mmol)を添加し、撹拌を10分継続した。反応溶液を減圧下で蒸発させた。残分をDCM(400mL)に溶解し、水(3×400mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。粗物質をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の1~5%のMeOH)により精製し、トシレート塩として化合物49cを得た(35g、収率:68%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm9.38(br s、5H)、8.33(s、1H)、7.49(d、J=8.5Hz、2H)、7.12(d、J=8.5Hz、2H)、5.88(d、J=7.0Hz、1H)、4.85(dd、J=5.0及び7.0Hz、1H)、4.20(m、1H)、3.92(dd、J=2.0及び4.5Hz、1H)、3.46(s、3H)、3.31~3.17(m、2H)、2.77(spt、J=7.0Hz、1H)、2.29(s、3H)、1.12(d、J=7.0Hz、6H)、0.74(s、9H)、-0.01(s、3H)、-0.25(s、3H);ESI-MS:m/z 481.6[M+H]+。
化合物49c(TsOH塩、34g、52.1mmol)、4-ニトロフェノール(72.48g、521mmol)及びEt3N(63.21g、625mmol)を、DCM(800mL)に溶解し、-78℃まで冷却した。DCM(50mL)中の4-ニトロフェニルクロロサルフェート(24.76g、104.2mmol)の溶液を30分かけて滴下した。反応混合物を0℃まで加温し、DCM(800mL)で希釈し、1MのNaH2PO4水溶液(3×800mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:MTBE中の1~5%のDCM)により精製し、化合物49dを得た(19g、収率:53.5%)。
1H NMR(500MHz、CDCl3)δppm9.49(br s、1H)、8.32(d、J=9.0Hz、2H)、7.63(s、1H)、7.47(d、J=9.0Hz、2H)、5.64(d、J=8.0Hz、1H)、4.95(dd、J=5.5、8.0Hz、1H)、4.38(s、1H)、3.84(d、J=5.5Hz、1H)、3.64(s、2H)、3.55(s、3H)、2.51(spt、J=7.0Hz、1H)、1.18(d、J=7.0Hz、3H)、1.12(d、J=7.0Hz、1H)、0.77(s、9H)、-0.10(s、3H)、-0.31(s、3H);ESI-MS:m/z 682.7[M+H]+。
化合物49d(18g、26.4mmol)、N6-ベンゾイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-デオキシアデノシン(34.56g、52.55mmol)及びEt3N(13.32g、131.6mmol)を、別々に乾燥DCM(3×72mL)に溶解した。各溶液を、N2下、4時間撹拌することにより3Å活性化モレキュラーシーブで乾燥させた。次にEt3N溶液を、N6-ベンゾイル-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-アデノシン(49d1)溶液に添加し、続いてスルファミン酸塩49d溶液を添加した(シリンジを通して移した)。得られた反応混合物を25℃で17時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。粗生成物49eを次ステップにてそのまま使用した。
上記の粗生成物49eをTHF(190mL)に溶解し、TBAF(14.57g、55.73mmol)で、25℃で16時間処理した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させた。残分をDCMに溶解し、2%酢酸水溶液(3×190mL)で洗浄し、蒸発させた。粗生成物をDCM(190mL)に溶解し、DCA(17.97g、139.4mmol)及び水(2.5mL、138.7mmol)で処理した。反応混合物を脱保護完了まで25℃で撹拌し、次いで5%のNaHCO3水溶液で洗浄した。減圧下で蒸発させた後に得られた残分を、溶出液としてMeOH及び水を使用する逆相クロマトグラフィにより精製し、灰白色固体として化合物49fを得た(4g)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δ(ppm)12.07(s、1H)、11.59(s、1H)、11.19(s、1H)、8.75(s、1H)、8.68(s、1H)、8.47(t、J=5.5Hz、1H)、8.26(s、1H)、8.05(d、J=7.5Hz、2H)、7.65(t、J=7.0Hz、1H)、7.55(t、J=7.5Hz、2H)、6.51(t、J=6.5Hz、1H)、5.83(d、J=6.0Hz、1H)、5.64(d、J=6.0Hz、1H)、5.27~5.23(m、2H)、4.67(q、J=5.5Hz、1H)、4.24(m、1H)、4.08(m、1H)、3.87(m、1H)、3.60(m、2H)、3.44(s、3H)、3.44~3.28(m、2H)、3.10(m、1H)、2.76(m、2H)、1.12(d、J=3.0Hz、6H);ESI-MS:m/z 784.1[M+H]+)。
乾燥MeCN/THF(1:1、24mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物49f(387mg、0.49mmol)の溶液を3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、反応フラスコに移した。1H-テトラゾール(MeCN中3~4%溶液の4.32mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)を添加し、続いて2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(172μL、0.54mmol)を添加した。得られた反応混合物を2時間振盪した後、追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(78μL、0.25mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。tBuOOH(デカン中5.5M溶液の161μL、0.89mmol)を添加し、反応溶液を更に90分撹拌した後、濾過し、減圧下で濃縮した。精製をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7.5%のMeOH)により行い、化合物49gを得た(158mg、収率:31%)。ESI-MS:m/z 899.5[M+H]+。
化合物49g(158mg、0.155mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(2mL)中で、変換完了まで室温で撹拌した(約2時間)。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、10μm、150×50mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により精製した。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物24、ナトリウム塩を得た。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6、81℃)δppm10.19(br s、1H)、8.24(s、1H)、8.17(s、1H)、8.19(br s、1H)、6.92(s、1H)、6.33(dd、J=9.4、5.6Hz、1H)、6.19(br s、2H)、5.74(d、J=8.8Hz、1H)、5.36~5.60(m、2H)、4.05~4.24(m、3H)、3.82(d、J=4.4Hz、1H)、3.53~3.63(m、1H)、3.50(s、3H)、3、26(br s、2H)、3.01~3.11(m、1H、水ピーク下のシグナル)、2.87(dd、J=14.1、5.5Hz、1H);
31P NMR(126MHz、DMSO-d6)δppm0.84(s、1P);ESI-MS:m/z 672.3[M+H]+。
乾燥DCM(40mL)中の49f(1g、1.3mmol)及び1H-テトラゾール(0.2g、3.1mmol)の溶液を、3Åモレキュラーシーブで3時間前処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(0.4g、1.3mmol)を一度に添加した。得られた反応混合物を35℃で1時間撹拌した。キサンタンヒドリド(0.22g、1.43mmol)を添加し、撹拌を30分継続した。反応溶液をDCMで希釈し、食塩水、5%のNaHCO3水溶液、及び水で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過した。濾液を、減圧下で蒸発乾固させた。粗物質をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の5~10%のMeOH)により精製し、化合物50a及びそのシアノエチル脱保護生成物の600mgの混合物を得た。ESI-MS:m/z 916.0[M+H]+。
上記の生成物50aを、エタノール中33%のメチルアミン溶液(13mL)中で、変換完了まで室温で撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物を、MeOH及び水を移動相として使用する逆相C18カラムにより精製し、P-エピマー混合物を得た(60mg、収率:化合物50aからで7%)。両方の異性体を分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18、OBD 10μm、250×50mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeOH(B);勾配溶出)により精製し、最初の溶出異性体として化合物(*R)19A、アンモニウム塩及び2番目の溶出異性体として化合物(*S)19B、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行った。
1H NMR(600MHz、DMSO-d6、81℃)δppm9.17(br s、1H)、8.24(s、1H)、8.16(s、1H)、7.96(br s、1H)、6.97(s、2H)、6.38(dd、J=9.1、5.4Hz、1H)、6.20(br s、2H)、5.77(d、J=8.9Hz、2H)、5.51(br s、1H)、4.44~4.51(m、1H)、4.26(br s、1H)、4.18(br s、1H)、3.78(d、J=4.6Hz、1H)、3.56~3.62(m、1H)、3.53(s、3H)、3.20~3.50(m、3H)、2.90(dd、J=14.5、5.4Hz、1H);ESI-MS:m/z 687.1[M+H]+。
1H NMR(600MHz、DMSO-d6、81℃)δppm10.03(br s、1H)、8.29(s、1H)、8.18(s、1H)、8.00(br s、1H)、6.97(br s、2H)、6.38(dd、J=9.4、5.4Hz、1H)、6.26(br s、2H)、5.78(d、J=8.9Hz、1H)、5.50(br s、1H)、5.48(br s、1H)、4.22~4.34(m、1H)、4.15(br s、1H)、4.09(q、J=11.2Hz、1H)、3.85(d、J=4.5Hz、1H)、3.60~3.71(m、1H)、3.55(s、3H)、3.41~3.48(m、1H)、3.34~3.40(m、1H)、3.23~3、34(m、1H)、2.87(dd、J=14.5、5.4Hz、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm55.50(s、1P);ESI-MS:m/z 678.1.1[M+H]+。
イミダゾール(3.94g、57mmol)及びTBSCl(7.18g、470mmol)を、DMF(105mL)中のN6-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロアデノシン1a[CAS番号136834-20-3](12.7g、34.0mmol)の溶液に0℃で添加した。反応混合物を変換完了まで室温で撹拌した(2時間)。反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和水NH4Cl溶液及び水で洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により行い、白色固体として化合物51aを得た(12g、収率:71%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-0.04(s、3H)、-0.02(s、3H)、0.82(s、9H)、3.81(dd、J=11.7、4.1Hz、1H)、3.99(m、2H)、4.62(ddd、J=21.7、11.7、6.9Hz、1H)、5.54(dq、J=52.8、2.0Hz、1H)、5.77(m、1H)、6.38(dd、J=18.6、1.4Hz、1H)、7.55(t、J=7.9Hz、2H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、8.04(d、J=6.9Hz、2H)、8.57(s、1H)、8.75(s1H);ESI-MS:m/z 488.0[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(2.03g、16.6mmol)、乾燥DCM(40mL)及び活性化3Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で少なくとも2時間撹拌した。同時に、各々乾燥DCM(2×40mL)中の、化合物51a(1.6g、3.3mmol)の溶液及びサルファメート51b(2.5g、3.66mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約2時間)。両方の溶液(それぞれ化合物51a及びサルファメート51b)を、引き続いて反応フラスコに移した。得られた反応混合物を36時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液、食塩水、及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~1%のMeOH)により精製し、灰白色の泡状物として化合物51cを得た(1.8g、収率:53%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-0.25(s、3H)、-0.050(s、3H)、-0.015(d、J=2.8Hz、6H)、0.73(s、9H)、0.79(s、9H)、1.11(dd、J=6.9、1.4Hz、6H)、2.75(m、1H)、3.40(q、J=6.9Hz、1H)、3.45(s、3H)、3.48(q、J=6.9Hz、1H)、3.85(dd、J=11.7、3.4Hz、2H)、3.98(dd、J=12.4、2.1Hz、1H)、4.13(m、1H)、4.33(t、J=3.4Hz、1H)、4.71(dd、J=6.9、4.8Hz、1H)、5.49(dq、J=17.6、3.9Hz、1H)、5.86(d、J=6.9Hz、1H)、6.51(dd、J=18.6、2.1Hz、1H)、7.56(t、J=7.6Hz、2H)、7.66(t、J=7.2Hz、1H)、8.05(d、J=7.6Hz、2H)、8.30(s、1H)、8.59(s、1H)、8.71(t、J=6.2Hz、1H)、8.75(s、1H)、11.26(s、1H)、11.65(s、1H)、12.08(s、1H);ESI-MS:m/z 1030.4[M+H]+。
Et3N(12.1mL、87.37mmol)及びEt3N.3HF(2.84mL、17.4mmol)を、ピリジン(34mL)中の化合物51c(1.8g、1.74mmol)の溶液に添加した。反応混合物を変換完了まで45℃で撹拌(約5時間)し、次いで室温まで冷却した。イソプロポキシトリメチルシラン(12.4mL、69.9mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。減圧下での濃縮後に得られた粗生成物を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7%のMeOH)により精製し、灰白色の泡状物として化合物33aを得た(1.2g、収率:86%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm1.11(q、J=3.2Hz、6H)、2.75(m、1H)、3.40(s、1H)、3.43(s、3H)、3.64(d、J=12.4Hz、1H)、3.80(d、J=12.4Hz、1H)、3.86(t、J=4.5Hz、1H)、4.07(m、1H)、4.32(t、J=3.1Hz、1H)、4.67(q、J=5.7Hz、1H)、5.36(td、J=10.7、4.6Hz、2H)、5.66(d、J=6.2Hz、1H)、5.88(m、2H)、6.49(dd、J=16.5、2.8Hz、1H)、7.56(t、J=7.9Hz、2H)、7.66(t、J=7.6Hz、1H)、8.05(d、J=7.6Hz、2H)、8.25(s、1H)、8.66(s.1H)、8.74(d.J=32.4Hz、2H)、11.27(s、1H)、11.62(s、1H)、12.08(s、1H);ESI-MS:m/z 802.1[M+H]+。
乾燥THF(25mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物33a(500mg、0.624mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の5.46mL、使用前に3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(206mg、0.686mmol)を一度に添加した。得られた反応混合物を終夜振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(94mg+38mg、0.312mmol+0.125mmol)を2つに分けて5時間の間隔で添加し、振盪を更に1日継続し、完全な変換とした。tBuOOH(デカン中5.5M溶液の227μL、1.25mmol)を添加し、反応混合物を更に1時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで十分にすすいだ。濾液を濃縮し、得られた残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7.5%のMeOH)により精製し、化合物51dを得た(110mg、収率:19%)。ESI-MS:m/z 917.5[M+H]+。
化合物51d(110mg、0.12mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、変換完了まで室温で撹拌した(約2時間)。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物22、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物22、ナトリウム塩を得た(52mg、収率:60%)。
1H NMR(600MHz、DMSO-d6、60℃)δppm10.67(brs、1H)、9.13(brs、1H)、8.37(s、1H)、8.18(s、1H)、7.99(brs、1H)、7.24(brs、2H)、6.33(dd、J=15.9、3.3Hz、1H)、6.29(brs、2H)、5.95(brd、J=50.9Hz、1H)、5.76(d、J=8.9Hz、1H)、5.59(brs、1H)、5.18~5.25(m、1H)、4.47(brs、1H)、4.20(dt、J=11.9、6.1Hz、1H)、4.14(brs、1H)、3.94(brd、J=4.4Hz、1H)、3.75~3.81(m、1H)、3.52(s、3H)、3.47~3.55(m、1H)、3.42(s、1H);31P NMR(162MHz、DMSO-d6):δppm-1.28(s、1P);
ESI-MS:m/z 690.3[M+H]+。
炭酸カリウム(0.32g、2.3mmol)を、乾燥DMF(6mL)中の化合物41d(0.55g、1.8mmol)の溶液に添加した。得られた懸濁液を0℃まで冷却した後、ヨードメタン(0.15mL、2.3mmol)を添加した。反応混合物を室温まで加温し、変換完了まで撹拌した(約2.5時間)。減圧下での濃縮後に得られた残分を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~4%のMeOH)により精製し、白色粉末として化合物52aを得た(0.45g、収率:79%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.25(s、1H)、7.36(s、1H)、6.02(d、J=5.5Hz、1H)、5.43(d、J=6.9Hz、1H)、5.09(t、J=5.5Hz、1H)、4.39(q、J=6.0Hz、1H)、3.97(q、J=3.4Hz、1H)、3.73~3.80(m、1H)、3.57~3.64(m、1H)、3.50~3.55(m、1H)、3.45(s、3H)、3.40(s、3H);ESI-MS:m/z 314[M+H]+。
乾燥ピリジン(12.7mL)中の化合物52a(0.85g、2.7mmol)の溶液に、DMAP(0.16g、1.3mmol)及びDMTrCl(1.46g、4.3mmol)を(小分けして)添加し、室温で4時間撹拌した。反応混合物をメタノール(9mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分をEtOAcに溶解し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~0.2%のMeOH)により行い、灰白色の泡状物として化合物52bを得た(1.4g、収率:85%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.24(s、1H)、7.37(d、J=7.6Hz、2H)、7.29(t、J7.6Hz、2H)、7.22(m、6H)、6.87(dd、J=9.0、2.1Hz、4H)、6.04(d、J=4.8Hz、1H)、5.53(d、J=6.2Hz、1H)、4.47(q、J=5.5Hz、1H)、4.05(q、J=4.4Hz、1H)、3.85(t、J=4.8Hz、1H)、3.72(d、J=9.6Hz、6H)、3.45(s、3H)、3.35(s、3H)、3.20(d、J=4.8Hz、2H);ESI-MS:m/z 638.2[M+Na]+。
化合物52b(0.9g、1.46mmol)、スルファミン酸塩17a(1.53g、1.75mmol)及びDMAP(0.9g、7.31mmol)を、各々別々に乾燥DCM(3×25.0mL)に溶解した。各溶液を、N2下、3Å活性化モレキュラーシーブとともに少なくとも2時間撹拌することにより乾燥させた。DMAP溶液に、DCM中の化合物52bの溶液及びDCM中のスルファミン酸塩17aの溶液をそれぞれ添加した。得られた反応混合物を36時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を飽和NaHCO3水溶液、食塩水及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄した。合わせた有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~0.4%のMeOH)により精製し、化合物52c(0.38g、収率:19%)並びにモノ及びジDMTr-脱保護化生成物を含有するより極性の画分(0.8g)を得た。
DCM(10.6mL)中の化合物52c(0.38g、0.28mmol)の溶液に、DCA(DCM中10%の0.9mL、1.1mmol)及び水(30μL、1.4mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した。反応混合物を、ピリジン(0.1mL、1.4mmol)及び数滴のメタノールを添加することによりクエンチし、減圧下で濃縮した。同様の反応プロトコルを、上記の0.8gの極性の画分に適用した。両方の反応の残分を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~6%のMeOH)により精製し、白色粉末として化合物52dを得た(0.4g、収率:62%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm11.27(br s、1H)、8.74(s、1H)、8.62(s、1H)、8.54(br t、J=5.9Hz、1H)、8.23(s、1H)、8.06(d.J=7.6Hz、2H)、7.64~7.70(m、1H)、7.52~7.59(m、2H)、7.36(br s、1H)、6.36(dd、J=19.3、2.1Hz、1H)、6.28(d、J=6.2Hz、1H)、5.90(br s、1H)、5.58(br d、J=52.7Hz、1H)、5.22(t、J=5.5Hz、1H)、4.52~4.64(m、1H)、4.07~4.14(m、2H)、3.95~4.01(m、1H)、3.64(dd、J=12.4、3.4Hz、1H)、3.56(dd、J=11.7、2.8Hz、1H)、3.43(s、3H)、3.38(s、3H)、3.12~3.24(m、2H);ESI-MS:m/z 748.5[M+H]+。
乾燥MeCN/DMF(5mL、4:1)混合物中の化合物52d(100mg、0.134mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45M溶液の2.38mL、1.14mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで10分処理した後、乾燥MeCN(1.0mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(80mg、0.27mmol)の溶液を添加した(注記:MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。tBuOOHの溶液(デカン中5~6Mの126μL、0.67mmol)を添加し、撹拌を更に30分継続した。反応混合物をDCMで希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮した。残分をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7%のMeOH)により精製し、化合物52eを得た。
ESI-MS:m/z 863.1[M+H]+。
上記の化合物52eを、エタノール中30%のメチルアミン溶液(10mL)中で、室温で2.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を水/MeCN(4:1)混合物に溶解し、DCMで洗浄し、濃縮した。粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:XBridge OBD C18 5μm、150×30mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物55、アンモニウム塩を得た(25mg、収率:52dからで26%)。ナトリウム塩への最終的な変換を、Dowex 50WX8 Naイオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行った。
1H NMR(400MHz、D2O)δ8.13(br s、1H)、8.00(br d、J=5.6Hz、1H)、7.42(br s、1H)、7.06(br s、1H)、6.42~6.33(m、2H)、5.41(br s、1H)、5.35~5.16(m、1H)、5.05~4.88(m、1H)、4.65(br s、1H)、4.53~4.40(m、2H)、4.33~4.20(m、2H)、3.88~3.76(m、1H)、3.60(s、4H)、3.48(s、3H).
19F NMR(376MHz、D2O)δ-165.090(s、1F)、-196.605(s、1F);31P NMR(162MHz、D2O)δ-1.899(s、1P);ESI-MS:m/z 706.0[M+H]+。
メチル5-(ジエトキシメチル)-1H-イミダゾール-4-カルボキシレート53a[CAS番号85109-99-5](3.24g、14.1mmol)及び乾燥MeCN(120mL)の入っている反応フラスコを、氷浴にて冷却した。水素化ナトリウム(鉱油中55%分散液の1.23g、28.5mmol)を添加し、得られた混合物を室温で45分撹拌した。
別個のフラスコにて、ヨードトリメチルシラン(3.23mL、22.6mmol)を、乾燥トルエン(50mL)中の1,2-ジ-O-アセチル-3-O-メチル-5-O-ベンゾイル-D-リボフラノース([10300-21-7]、5g、14.1mmol)の溶液に添加した。得られた溶液を室温で20分撹拌した後、氷浴にて冷却した上記の反応フラスコにゆっくりと移した。得られた反応混合物を変換完了まで50℃で撹拌した(約3.5時間)。室温まで冷却した後、EtOAcを添加した。有機相を水及び食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘキサン中の0~40%のEtOAc)により行い、無色のガムとして化合物53bを得た(4.3g、収率:58%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.0(m、3H)、7.70(t、J=7.6Hz、1H、)、7.56(m、2H)、6.36(m、1H)、6.23(s、1H)、5.49(dd、J=4.1、2.8Hz、1H)、4.63(m、2H)、4.26(m、2H)、3.78(s、3H)、3.68(m、1H)、3.47(m、1H)2.11(s、2H)1.11(m、6H);
ESI-MS:m/z 521.2[M+H]+。
80%AcOH水溶液中の化合物53b(4.3g、8.25mmol)の溶液(50mL)を、室温で16時間撹拌した。次に反応溶液を氷冷水に注ぎ、DCMで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:ヘキサン中の0~30%のEtOAc)により行い、白色固体として化合物58cを得た(1.7g、収率:52%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm-10.27(s、1H)、8.34(s、1H)、8.00(m、2H)、7.70(m、1H)、7.55(t、J=7.9Hz、2H)、6.40(d、J=2.1Hz、1H)、5.54(q、J=2.3Hz、1H)、4.65(t、J=4.1Hz、2H)、4.34(m、1H)、4.19(dd、J=7.9、5.2Hz、1H)、3.87(s、1H).
ヒドラジン(THF中1M、362mL、362mmol)を、無水EtOH(200mL)中の化合物53c(8.1g、18.12mmol)の溶液に添加した。反応混合物を還流温度で撹拌し、THFを完全に蒸発させた(反応は、THFの存在下では非常に遅かった)。反応を完了(約72時間)した後、溶媒を減圧下で除去した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~10%のMeOH)により精製した。得られた生成物を水に溶解し、Amberlite(登録商標)IR120水素形態の添加によりpHを5に調整した。樹脂を濾過により除去し、水ですすぎ、濾液を蒸発させ、高真空下で乾燥させ、淡い黄色固体として化合物53dを得た(3.5g、68%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.75(s、1H)、8.65(s、1H)、8.54(s、1H)、5.92(d、J=6.9Hz、1H)、5.75(s、1H)4.39(t、J=5.9Hz、1H)、4.11(q、J=3.0Hz、1H)、3.83(q、J=2.8Hz、2H)、3.69(dd、J=12.1、3.1Hz、2H)、3.64(dd、J=12.1、3.1Hz、2H)、3.42(s、3H)、3.16(s、1H);ESI-MS:m/z 283.1[M+H]+。
DMAP(0.75g、6.18mmol)及びDMTrCl(6.6g、19.7mmol)(小分けしたもの)を、乾燥ピリジン(52mL)中の化合物53d(3.5g、12.3mmol、無水トルエン及び乾燥ピリジンと共蒸発させることにより乾燥)の溶液に添加した。得られた反応混合物を4時間撹拌した後、これを、メタノール(10mL)の添加によりクエンチし、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、淡いピンク色の泡状物として化合物53eを得た(4.8g、収率:67%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.76(s、1H)、8.50(d、J=16.5Hz、2H)、7.28(m、4H)、7.20(m、5H)6.84(d、J=9.0Hz、4H)、5.99(d、J=4.8Hz、1H)、5.82(d、J=5.5Hz、1H)、4.67(d、J=5.5Hz、1H)4.19(q、J=4.1Hz、1H)、3.94(t、J=4.8Hz、1H)、3.73(s、6H)、3.37(s、3H)、3.23(q、J=3.4Hz、2H):ESI-MS:m/z 585.3[M+H]+。
化合物53e(0.53g、0.9mmol)、スルファミン酸塩17a(0.876g、1.08mmol)及びDMAP(0.55g、4.5mmol)を、別々に乾燥DCM(3×20mL)に溶解した。各溶液を、N2下、3Å活性化モレキュラーシーブとともに少なくとも2時間撹拌することにより乾燥させた。DMAP溶液に、化合物53eの溶液及びスルファミン酸塩17aの溶液をそれぞれ添加した。得られた反応混合物を36時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMで徹底的にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、淡い黄色の泡状物として化合物53fを得た(0.45g、収率:38%)。
ESI-MS:m/z 1321.5[M+H]+。
DCM(20mL)中の化合物53f(0.75g、0.52mmol)の溶液に、DCA(DCM中10%の1.75mL、2.1mmol)及び水(47μL、2.6mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した(約2時間)。反応混合物を、ピリジン(0.2mL、2.6mmol)及び数滴のメタノールを添加することによりクエンチし、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~7%のMeOH)により精製し、灰白色粉末として化合物53gを得た(0.33g、収率:82%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.77(s、1H)、11.24(s、1H)、8.75(s、1H)、8.60~8.64(m、3H)、8.60(s、1H)、8.04(d、J=7.6Hz、2H)、7.63~7.67(m、1H)、7.53~7.58(m、2H)、6.34(d、J=4.8Hz、1H)、6.37(dd、J=20.0、2.1Hz、1H)、5.89(d、J=6.2Hz、1H)、5.59(ddd、J=52.3、4.8、2.1Hz、1H)、5.46(t、J=4.8Hz、1H)、5.18(t、J=4.8Hz、1H)、4.56~4.65(m、1H)、4.13~4.18(m、2H)、4.00(td、J=7.4、3.1Hz、1H)、3.76(s、1H)、3.60~3.69(m、1H)、3.36(s、3H)、3.26~3.31(m、1H)、3.15~3.23(m、1H);ESI-MS:m/z 717.3[M+H]+。
注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した。
乾燥DMF(7mL)中の化合物53g(100mg、0.14mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45M溶液の2.48mL、1.12mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで30分処理した。次いでこれに、乾燥THF(1.0mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(75mg、0.25mmol)の溶液を滴下した。混合物を室温で3時間撹拌した後、乾燥THF(0.5mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(21mg、0.07mmol)の追加の溶液を添加した。得られた懸濁液を16時間更に撹拌した。tBuOOH(デカン中5~6Mの140μL、0.70mmol)を添加し、反応物を更に30分撹拌した。混合物を減圧下で部分的に濃縮した。残分を濾過し、濾液を撹拌下でH2O(20mL)に注ぎ、懸濁液を得た。固体を回収し、DCM/MeOH(3mL/1mL)に溶解し、分取薄層クロマトグラフィ(DCM:MeOH-8:1)により精製した。所望の画分を回収し、MeCN/DMSO(10mL/2mL)中で2時間かけてすりつぶし、懸濁液を得た。濾過後、濾液を蒸発乾固させ、DMSO(2mL)中の溶液として粗化合物53hを得て、次のステップに直接使用した。
ESI-MS:m/z=832.1[M+H]+。
DMSO(2mL)中の化合物53hの前の溶液を、MeNH2(EtOH中30%、3mL)で処理し、室温で2時間撹拌した。混合物を蒸発乾固させ、別のバッチと合わせ、逆相分取HPLC(カラムWaters Xbridge Prep OBD 5μm C18 150×30;条件 水(10mMのNH4CO3)(A)-ACN(B)、B0で開始、B30で終了;勾配時間(分)7、100%Bの保持時間(分))1、流速(mL/分25)により精製し、凍結乾燥後、白色固体として化合物27、アンモニウム塩を得た(5mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.63(s、1H)、8.45(s、1H)、7.98(s、1H)、6.77(s、1H)、6.24~6.33(m、2H)、5.11~5.34(m、3H)、4.55(br s、1H)、4.28~4.42(m、2H)、4.23(br s、1H)、4.08~4.20(m、1H)、3.61(br d、J=12.96Hz、1H)、3.44(s、3H)、3.33(br d、J=13.69Hz、1H)、
19F NMR(376MHz、D2O)δppm-198.29~-197.44(m、1F)、
31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.34(s、1P);
ESI-MS:m/z=675.3[M+H]+。
Dowex 50W×8、200-400(10mL、H形態)をビーカーに添加し、脱イオンH2O(30mL)で洗浄した。次いで樹脂に、15%H2SO4脱イオンH2O溶液(30mL)を添加し、混合物を15分撹拌し、デカントした(30mL)。樹脂を、15%H2SO4脱イオンH2O溶液を含むカラムに移し、15%H2SO4(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで中性になるまで脱イオンH2Oで洗浄した。樹脂をビーカーに戻し、15%NaOH脱イオンH2O溶液(30mL)を添加し、混合物を15分穏やかに撹拌し、デカントした(1回)。樹脂をカラムに移し、15%のNaOHのH2O溶液(少なくとも4CV)で洗浄し、次いで脱イオンH2Oで中性になるまで洗浄し、化合物27、アンモニウム塩(5mg)を最小量の脱イオンH2O(3mL)に溶解し、カラムの上部に添加し、脱イオンH2Oで溶出した。所望の画分を一緒に貯めて凍結乾燥し、白色固体として化合物27、ナトリウム塩を得た(2.1mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.75(s、1H)、8.52(br s、1H)、7.84~8.36(m、1H)、6.65~7.24(m、1H)、6.38(br d、J=19.07Hz、2H)、5.28~5.46(m、1H)、5.26(br dd、J=8.53、4.77Hz、1H)、4.81~4.93(m、1H)、4.63(br s、1H)、4.42(br dd、J=10.54、7.78Hz、2H)、4.19~4.34(m、2H)、3.58~3.75(m、1H)、3.54(s、3H)、3.30~3.48(m、1H)、
19F NMR(377MHz、D2O)δppm-197.75(br s、1F);
31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.15(s、1P);
ESI-MS:m/z 675.2[M+H]+。
化合物54a(1g、1.5mmol)及びサルファメート3o(1.3g、1.5mmol)を、DCE(10mL)に溶解した。4Åモレキュラーシーブ(粉末)を添加し、反応混合物をN2下、室温で2時間撹拌した。DCE(2mL)中のDMAP(913mg、7.5mmol)及び4Åモレキュラーシーブ粉末(0.5g)の混合物を、N2下、室温で6時間撹拌し、次いで上記の混合物に添加した。(注記:DCEを使用前に活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた)。反応混合物を、50℃で終夜撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、DCMですすいだ。濾液を飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、水相をDCMで抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の1~2%のMeOH)により精製し、1.8g(収率:83%)の、化合物54b及びその2’結合位置異性体(構造を示さず)の混合物を得て、後者は、化合物54aが部分的に2’→3’TBSシフトした成績体であった。
ESI-MS:m/z 1097.5[M+H]+。
上記の生成物混合物(2.6g、1.84mmol)を、DCM(30mL)に溶解し、これに、DCA(610μL、7.40mmol)及び水(330μL、1.84mmol)を添加した。反応混合物を、脱保護完了まで室温で撹拌(約1時間)した後、これを、メタノール(4mL)中のピリジン(1.5mL、18.4mmol)を添加することによりクエンチし、続いて水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分を分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD 5μm、150×30mm;移動相:H2O(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、白色固体として純粋な化合物54cを得た(600mg、収率:40%)。
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm12.09(br s、1H)、11.62(br s、1H)、9.26(s、1H)、8.99(s、1H)、8.89(s、1H)、8.45(br s、1H)、8.24(s、1H)、6.10(d、J=6.0Hz、1H)、5.82(d、J=6.0Hz、1H)、5.71(d、J=6.3Hz、1H)、5.48(br s、1H)、4.91~5.00(m、2H)、4.72(q、J=5.8Hz、1H)、4.29~4.40(m、1H)、4.03~4.12(m、1H)、3.87(br t、J=4.3Hz、1H)、3.60~3.74(m、2H)、3.44(s、3H)、3.35~3.42(m、1H)、3.29(dd、J=14.1、7.8Hz、1H)、2.75(spt、J=6.8Hz、1H)、1.11(d、J=6.8Hz、3H)、1.09(d、J=6.9Hz、3H)、0.63(s、9H)、-0.08(s、3H)、-0.34(s、3H);
ESI-MS:m/z 795.4[M+H]+。
乾燥THF(48mL)及び乾燥DMF(4mL)の混合物中の、化合物54c(400mg、0.5mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45M溶液の8.9mL、4.03mmol)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで30分処理した後、乾燥THF(4mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(273mg、0.91mmol)を、10分かけて滴下した(注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で3時間撹拌した。次に、tBuOOHの溶液(デカン中5~6M溶液の500μL、2.5mmol)を添加し、撹拌を更に30分継続した。反応混合物を、セライトパッドを通して濾過し、濃縮した。残分をDCMに溶解し、水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の1~10%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物54dを得た(130mg、収率23%)。
ESI-MS:m/z 910.5[M+H]+。
化合物54d(58mg)を、エタノール中30%のメチルアミン溶液(2mL)中で、室温で2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分をピリジン(2mL)に溶解した後、Et3N(30mg、0.27mmol)及びトリエチルアミン三フッ化水素酸塩(21.7mg、0.13mmol)を添加し、得られた混合物を50℃で1日間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却し、イソプロポキシトリエチルシラン(0.1mL、0.54mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。減圧下での濃縮後に得られた残分を、分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD 5μm、150×25mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物3、アンモニウム塩を得た(4mg)。
1H NMR(400MHz、D2O)δppm9.26(s、1H)、9.02(s、1H)、8.74(s、1H)、7.94(s、1H)、6.40(d、J=1.5Hz、1H)、6.01(d、J=8.5Hz、1H)、5.39(td、J=9.1、5.3Hz、1H)、5.25(dd、J=7.9、4.5Hz、1H)、5.06~5.11(m、1H)、4.55(s、1H)、4.48(br d、J=12.0Hz、1H)、4.09~4.18(m、2H)、3.86(br d、J=14.6Hz、1H)、3.72(br d、J=14.3Hz、1H)、3.65(s、3H);
31P NMR(162MHz、D2O)δppm-2.22(s、1P);ESI-MS:m/z 673.2[M+H]+。
乾燥ピリジン(33mL)中の3’-デオキシ-3’-フルオロイノシン55a[CAS番号117517-20-1](2.2g、8.14mmol)の溶液に、DMAP(0.49g、4.0mmol)及びDMTrCl(4.4g、13mmol)(小分けしたもの)を添加し、変換完了まで室温で撹拌(約2.5時間)した。反応混合物をメタノール(10mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により行い、灰白色の泡状物として化合物55bを得た(3.3g、収率:71%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.22(d、J=2.1Hz、1H)、7.93(d、J=1.4Hz、1H)、7.36(d、J=8.3Hz、2H)、7.28(t、J=7.6Hz、2H)、7.23(m、5H)、6.86(dd、J=8.3、6.2Hz、4H)、5.92(d、J=7.6Hz、1H)、5.14(dd、J=54.1、4.5Hz、1H)、5.02(dq、J=23.2、3.9Hz、1H)、4.35(dt、J=25.9、4.3Hz、1H)、3.74(s、6H)、3.29(dq、J=37.5、5.2Hz、2H):ESI-MS:m/z 572.0[M+H]+。
化合物55b(0.66g、1.15mmol)、サルファメート17a(1.21g、1.38mmol)及びDMAP(0.704g、5.76mmol)を、各々別個に乾燥DCM(3×20.0mL)に溶解し、不活性雰囲気下、活性化3Åモレキュラーシーブで少なくとも2時間乾燥させた。次に、化合物55b及びサルファメート17aの溶液を、引き続いてDMAP溶液の入っている反応フラスコに移した。得られた反応混合物を24時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、引き続いて飽和NaHCO3水溶液及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、灰白色の泡状物として化合物55cを得た(0.475g、収率:31%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.47(s、1H)、11.23(s、1H)、8.66(s、1H)、8.56(s、1H)、8.48(s、1H)、8.19(s、1H)、8.03(d、J=7.6Hz、2H)、7.84(s、1H)、7.65(t、J=7.2Hz、H1)、7.55(t、J=7.6Hz、2H)、7.48(d、J=76Hz、2H)、7.36(q、J=4.8Hz、4H)、7.32(m、4H)、7.23(t、J=7.6Hz、4H)、7、19(t、J=7.9Hz、5H)、6.90(dd、J=9.0、6.9Hz、4H)、6、81(dd、J=9.0、6.2Hz、4H)、6.34(m、1H)、6.23(d、J=6.2Hz、1H)、5.78(m、2H)、5.50(d、J=53.7Hz、1H)、4.72(m、2H)、4.43(d、J=24.1Hz、1H)4.01(t、J=7.9Hz、1H)、3.74(s、1H)、3.70(t、J=2.4Hz、12H)、3.25(dd、J=10.7、3.8Hz、1H)、2.99(d、J13.1Hz、1H)、2、70(dd、J=14.59.0Hz、1H)、ESI-MS:m/z 1310.0[M+H]+。
DCM(12.6mL)中の化合物55c(0.453g、0.34mmol)の溶液に、DCA(DCM中10%の1.14mL、1.38mmol)及び水(31μL、1.72mmol)を添加し、脱保護化完了まで室温で撹拌した(約2時間)。反応混合物を、ピリジン(0.14mL、1.72mmol)及び数滴のメタノールを添加することによりクエンチした。得られた懸濁液を20分撹拌し、濾過し、乾燥させ、化合物55dを得た(0.21g、収率:86%)。
1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.5(d、J=3.4Hz、1H)、11.25(s、1H)、8.75(s、1H)、8.69(t、J=6.0Hz、1H)、8.61(s、1H)、8.35(s、1H)、8.09(d、J=3.4Hz、1H)、8.05(d、7.6Hz、2H)、7.66(t、J=7.2Hz、1H)、7.56(t、J=7.6Hz、2H)、6.32(dd、J=20.0、2.1Hz、1H)、6.21(d、J=7.6Hz、1H)、5.85(d.J=6.2Hz、1H)、5.60(m、1H)、5.49(m、3H)、5.34(d、J=4.8Hz、1H)、4.57(m、1H)、4.40(dt、J=26.9、3.4Hz、1H)、3.92(q、J=6.0Hz、1H)、3.65(t、J=4.1Hz、2H)、3.17(t、J=6.2Hz、2H);ESI-MS:m/z 706.0[M+H]+。
DMF/THF(1:2、30mL、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥)中の化合物55d(260mg、0.37mmol)及び1H-テトラゾ-ル(MeCN中3~4%の2.15mL、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、不活性雰囲気下、3Åモレキュラーシーブで2時間処理した後、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(129μL、0.41mmol)を一度に添加した。得られた反応混合物を室温で終夜振盪した。追加量の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(23μL、0.074mmol)を添加し、振盪を更に1日継続し、完全な変換とした。tBuOOH(デカン中5.5M溶液の134μL、0.74mmol)を添加し、反応混合物を更に1時間振盪した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンですすいだ。濾液を水で十分に洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~5%のMeOH)により精製し、化合物55eを得た(20mg、収率:7%)。ESI-MS:m/z 820.4[M+H]+。
化合物55e(20mg、0.024mmol)を、エタノール中33%のメチルアミン溶液(10mL)中で、変換完了まで室温で撹拌した(約1時間)。反応混合物を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をMeCN中ですりつぶし、続いて分取逆相HPLC(固定相:XBridge C18 OBD、5μm、250×30mm;移動相:0.25%炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製し、化合物39、アンモニウム塩を得た。ナトリウム塩への最終的な変換を、Na陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物39、ナトリウム塩を得た(13.5mg、収率:80%)。
31P NMR(162MHz、DMSO-d6)δppm-2.06(s、1P);ESI-MS:m/z 663.3[M+H]+。
乾燥ピリジン(30mL)中の3’-(O-メチル)イノシン(56a、1.5g、5.31mmol、CAS番号75479-64-0)の溶液に、DMAP(0.32g、2.65mmol)及びDMTrCl(2.69g、7.97mmol)(小分けしたもの)を添加し、変換完了まで室温で撹拌した。反応混合物をメタノール(15mL)でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた残分を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。有機層を水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。精製を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2.5%のMeOH)により行い、淡い褐色の泡状物として化合物56bを得た(2.19g、収率:71%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.35(s、1H)、8.22(s、1H)、8.00(s、1H)、7.34(d、J=7.6Hz、2H)、7.27(t、J=7.6Hz、2H)、7.21(m、5H)、6.84(m、4H)、5.89(d、J=4.8Hz、1H)、5.62(d、J=6.2Hz、1H)、4.78(q、J=5.3Hz、1H)、4.13(q、J=4.6Hz、1H)、3.99(t、J=5.2Hz、1H)、3.73(s、6H)、3.37(s、3H)、3.22(d、J=4.1Hz、2H);ESI-MS:m/z 585[M+H]+。
反応フラスコに、DMAP(0.76g、6.2mmol)、乾燥DCM(25mL)及び活性化3Åモレキュラーシーブを入れた。得られた混合物を不活性雰囲気下、室温で少なくとも2時間撹拌した。同時に、各々乾燥DCM(2×25mL)中の、化合物56b(0.73g、1.24mmol)の溶液及び化合物56c(1.0g、1.49mmol)の溶液を、活性化3Åモレキュラーシーブで乾燥させた(約2時間)。両方の溶液(それぞれ化合物56b及び化合物56c)を、引き続いて反応フラスコに移した。得られた反応混合物を24時間撹拌した。モレキュラーシーブを濾過により除去し、ジクロロメタンで徹底的にすすいだ。濾液を、飽和NaHCO3水溶液、食塩水、及び飽和NH4Cl水溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残分をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~2%のMeOH)により精製し、化合物56dを得た(0.54g、収率:39%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm8.72(s、1H)、8.66(s、1H)、8.27(s、1H)、8.09(m、1H)、8.05(m、2H)、7.99(s、1H)、7.65(m、1H)、7.56(t、J=7.6Hz、2H)、7.29(d、J=6.9Hz、2H)、7.24(t、J=7.6Hz、2H)、7.18(m、5H)、6.87(d、J=9.0Hz、1H)、6.81(dd、J=9.0、4.1Hz、4H)、6.46(m、1H)、6.24(d、J=3.4Hz、1H)、5.66(m、1H)、4.63(t、J=2.8Hz、1H)、4.54(m、1H)、4.11(m、1H)、3.93(m、1H)、3.71(s、6H)、3.32(d、J=8.3Hz、13H)、3.26(m、3H)、3.19(m、3H)、2.99(m、1H)、2.58(m、4H)、2.35(m、1H)、0.89(s、9H)、0.11(s、6H);ESI-MS:m/z 1116[M+H]+。
Et3N(2.65mL、19.0mmol)及びEt3N.3HF(0.31mL、1.9mmol)を、ピリジン(9.5mL)中の化合物56d(0.53g、0.47mmol)の溶液に添加した。反応混合物を変換完了まで45℃で撹拌(約5時間)し、次いで室温まで冷却した。イソプロポキシトリメチルシラン(1.34mL、7.6mmol)を添加し、撹拌を終夜継続した。減圧下で濃縮し、粗5’脱保護化化合物を得て、これをDCM(13.3mL)に再溶解した。水(40μL、2.37mmol)及びジクロロ酢酸(DCM中10%の1.57mL、1.9mmol)を添加し、得られた反応混合物を1時間撹拌した(完全変換)後、これを、ピリジン(200μL、2.37mmol)及び数滴のメタノールの添加によりクエンチした。減圧下での濃縮後に得られた残分を、シリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~9%のMeOH)により精製し、化合物56eを得た(220mg、収率:2ステップで66.6%)。1H NMR(500MHz、DMSO-d6)δppm12.43(br s、1H)、11.20(br s、1H)、8.72(s、1H)、8.63(s、1H)、8.57(br t、J=5.5Hz、1H)、8.33(s、1H)、8.04(m、3H)、7.65(t、J=7.2Hz、1H)、7.56(t、J=7.9Hz、2H)、6.43(t、J=6.9Hz、1H)、6.17(d、J=5.5Hz、1H)、5.45(m、2H)、5.26(t、J=5.5Hz、1H)、4.38(m、1H)、4.23(t、J=4.1Hz、1H)、4.12(q、J=3.7Hz、1H)、3.84(m、1H)、3.68(m、1H)、3.57(m、1H)、3.40(s、3H)、3.12(m、2H)、2.84(m、1H)、2.33(m、1H):ESI-MS:m/z 699[M+H]+。
乾燥MeCN/THF(1:2、9mL)中の化合物56e(200mg、0.286mmol)及び1H-テトラゾール(MeCN中0.45Mの溶液の5.09mL、0.99mmol、使用前に4Åモレキュラーシーブで乾燥)の溶液を、N2下、4Åモレキュラーシーブで30分処理した後、乾燥MeCN(2mL)中の2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(イソプロピル)ホスホロジアミダイト(155mg、0.52mmol)を、10分かけて滴下した(注記:THFをNa/ベンゾフェノンにてフレッシュとして蒸留し、MeCNを使用前にCaH2にてフレッシュとして蒸留した)。得られた反応混合物を室温で30分撹拌した。tBuOOHの溶液(デカン中5~6Mの溶液の286μL、1.43mmol)を添加し、撹拌を更に30分継続した。混合物をDCM(20mL)で希釈し、珪藻土パッドを通して濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカでのカラムクロマトグラフィ(勾配溶出:DCM中の0~8%のMeOH)により精製し、白色固体として化合物56fを得た(130mg、収率:44%(純度:約80%LCUV))。ESI-MS:m/z=814.3[M+H]+。
上記の化合物22f(130mg、0.072mmol)を、エタノール中30%のメチルアミン溶液(15mL)中で、室温で2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残分を水に溶解し、DCMで洗浄し、凍結乾燥した。粗生成物を分取逆相HPLC(固定相:XBridge OBD C18 5μm、150×30mm;移動相:10mM炭酸水素アンモニウム水溶液(A)-MeCN(B);勾配溶出)により精製した。ナトリウム塩への最終的な変換を、ナトリウム陽イオン交換樹脂で充填したカラムで水溶液を溶出することにより行い、凍結乾燥後、ふわふわした白色固体として化合物40、ナトリウム塩を得た(5.8mg、収率:22fからで3%)。1H NMR(400MHz、D2O)δppm8.39(s、1H)、7.91(br d、J=13.2Hz、2H)、7.24(br s、1H)、6.26(br s、1H)、6.18(br d、J=8.3Hz、1H)、5.49(br s、1H)、4.87~5.06(m、1H)、4.51(br s、1H)、4.30(br d、J=3.7Hz、1H)、4.10(br s、3H)、3.42(s、3H)、3.38(br s、2H)、2.53~2.75(m、2H);
31P NMR(162MHz、D2O)ppm-1.23(s、1P);ESI-MS:m/z=657.0[M+H]+。
インビトロ・アッセイ
実施例1
STING SPA結合アッセイ
ヒトSTING SPA結合アッセイは、トリチウム標識された2’,3’cGAMP(環状(グアノシン-(2’→5’)-モノホスフェート-アデノシン-(3’→5’)-モノホスフェート)の、ビオチン化STINGタンパク質への置換を測定する。4つの膜貫通ドメインを欠いており、232位にRを有する(H232R)Q86WV6の残基139-379を含む可溶化態様の組み替えSTINGを、E.coliで発現させた。集団について対立遺伝子頻度が58%であることに基づき、H232Rは、野生型であると考えられる(Yi,et.al.,「Single Nucleotide Polymorphisms of Human STING can affect innate immune response to cyclic dinucleotides」 PLOS ONE.2013,8(10),e77846)。STINGコンストラクトは、N末端にHISタグを有しており、それに続き、TEVプロテアーゼ切断部位及びAVIタグを有しており、BirAビオチンリガーゼによる直接ビオチン化を可能にする(Beckett et al.,A minimal peptide substrate in biotin holoenzyme synthetase-catalyzed biotinylation.(1999)Protein Science 8,921-929)。精製後、かつビオチン化の前に、HISタグを切断させる。
232位にRを有し(H232R)、N末端に6HISタグを有し、それに続きFLAGタグ、TEVプロテアーゼ開裂部位及びビオチン化のためのAVIタグを有する、Q86WV6の残基1-379由来のヒトSTINGを、HEK293-EXPI細胞内で組換え発現した。精製膜をこれらの細胞から調製し、STING発現を確認し、イムノブロットにより定量化した。Greiner 384ウェルアッセイプレート中でSTING含有膜を試験化合物と合わせ、STING SPA結合アッセイに使用したのと同じアッセイバッファー中、室温で1時間インキュベートした。次に、[3H]-2’3’-cGAMPを添加し、プレートを室温で30分間インキュベートした。反応物を予め洗浄したPall 5073フィルタープレートに移し、各ウェルを50μLのアッセイバッファーで3回洗浄した。フィルタープレートを50℃で1時間乾燥させた。各ウェルに、10μLのMicroscintシンチレーション流体を添加し、プレートを密封し、ウェル当たり1分間TopCount(Perkin Elmer)で読み取った。
化合物を、S200 biacore SPR装置(GE Healthcare)で分析した。E.coliで産生した切断型STINGタンパク質を、ビオチン捕捉(GE Healthcare#BR100531)を介して、一連のSストレプトアビジンチップ上に固定した。化合物を、実施バッファー(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、0.005%P20、1mM TECEP)中、100uM~0.195uMまで1:2希釈でスクリーニングした。1:1結合モデルを用いて定常状態の親和性及び動態評価を行った(STINGはダイマーとして処理した)。実験パラメータは以下のとおりであった。IFM化合物については60秒オン、300秒オフ、環状ジ-GMP(60秒オン/60秒オフ)、チオール異性体1(60秒オン/300秒オフ)、及びcGAMP(60秒オン/1200secオフ)、流速50μL/min及び25℃、40Hzでのデータ収集。
ヒトSTING経路のアゴニズムは、インターフェロン調節因子(IRF)により誘導可能なSEAPレポーターコンストラクトの安定な組み込みによって、ヒトTHP1単球細胞株由来のTHP1-ISG細胞(Invivogen、カタログ番号thp-isg)において評価される。THP1-Blue ISG細胞は、5つのインターフェロン(IFN)刺激応答配列と共に、ISG54ミニマルプロモーターの制御下で、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を発現する。結果として、THP1-Blue ISG細胞により、SEAP活性を測定してIRF活性化をモニタリングすることが可能になる。細胞培養上清中のIRF誘導性SEAPのレベルは、アルカリホスファターゼ検出培地、SEAP検出試薬によって容易に評価される。これらの細胞は、ゼオシン耐性である。このアッセイにおいて、陽性対照として2’3’cGAMPを使用した。アッセイを行なうために、60,000個の細胞を、白色で底が不透明の組織培養処理された384ウェルプレートに30μL/ウェルで分配した。
マウスSTING経路のアゴニズムは、インターフェロン誘導性Luciaルシフェラーゼレポーターコンストラクトの安定な組み込みによって、マウスRAW-264.7マクロファージ細胞株由来のRAW Lucia細胞(Invivogen、カタログ番号rawl-isg)において評価される。RAW Lucia細胞は、5つのインターフェロン(IFN)刺激応答配列と共に、ISG54ミニマルプロモーターの制御下で、分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。結果として、RAW Lucia細胞により、ルシフェラーゼの活性を測定してIRF活性化をモニタリングすることが可能になる。細胞培養上清中のIRF誘導によるルシフェラーゼのレベルは、ルシフェラーゼ検出試薬QUANTI-Luc(商標)を用いて容易に評価される。これらの細胞は、ゼオシン耐性である。このアッセイにおいて、陽性対照として2’3’cGAMPを使用する。アッセイを行うために、100,000個の細胞を、組織培養処理された透明で底が平らな96ウェルプレートに90μL/ウェルで分配した。試験化合物を10μLの体積で添加した。このアッセイを、37℃、5%CO2で、24時間及び48時間インキュベートした。インキュベート後、アッセイプレートから20μLの細胞上清を新しい96ウェル白色プレートに移し、50uLのQUANTI-Luc基質を加えた。プレートをインキュベートし、室温で5分間振盪した後、0.1秒の積分時間で発光をEnVision 2104で読み取った。
THP1-Blue ISG細胞を使用して、STING経路活性化後の培養上清へのIFN-βの分泌を測定する。アッセイを行うために、抗INF-β捕捉抗体を96ウェルMultiArrayプレート(Mesoscale Discovery)上にコーティングした。1時間のインキュベート後、プレートを洗浄し、このコーティングされたプレート内で、STINGヒト細胞レポーターアッセイプレート由来の50μLの上清又はIFN-β標準を、Sulfotagを付加した20μLの共役検出抗体と混合した。プレートをインキュベートし、2時間振盪し、洗浄し、読み取りバッファーを加えた。電気化学発光をSectorImagerで測定した。
STING経路のアゴニズムは、ホスホ-STING(S366)、ホスホ-TBK1(S172)及びホスホ-IRF3(S396)のウェスタンブロットによって、THP1 BLUE ISG細胞において測定された。簡潔に述べると、90μLの核酸注入バファー中の5百万の細胞を、10μLの試験化合物と混合した。これらの混合物を、Amaxa Nucleofector(Lonza)上でプログラムV-001を用いてエレクトロポレーションした。細胞を新鮮な培地を入れた12ウェルプレートに移し、37℃、5%CO2で1時間回復させた。次いで、細胞を冷HBSSで洗浄し、RIPAバッファーに溶解させた。サンプルは、総タンパク質を正規化し、ProteinSimpleサンプルバッファー又はLDSローディングバッファーのいずれかで希釈した。サンプルを95℃で5分間加熱変性した後、PeggySue(ProteinSimple)を使用してホスホ-及び総STING及びIRF3を測定し、一方、NuPAGE(Invitrogen)システムを使用してTBK1を測定した。データを、Compass又はLicor Odygseyソフトウェアを使用してそれぞれ分析した。
全ての試験において、雌性Balb/cマウスはCharles River Labs(Wilmington,MA)から得て、6~8週齢になり、体重が約20gになったときに使用した。全ての動物を、実験での使用前に最低5日間、あらゆる輸送関連ストレスから順応及び回復させた。逆浸透処理し塩素を添加した水及び食品照射された餌(Laboratory Autoclavable Rodent Diet 5010、Lab Diet)を不断給餌で与え、動物を12時間の明暗サイクルに維持した。使用前にケージ及び床敷きをオートクレーブ処理し、毎週交換した。全ての実験は、The Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行い、Institutional Animal Care and Use Committee of Janssen R&D(Spring House,PA)により承認された。各実験群には、8匹のマウスが含まれていた。500,000個のCT26結腸癌腫瘍細胞をBalb/cマウスに皮下移植し、腫瘍を100~300mm3に成長させることによって、マウスCT26腫瘍モデルにおけるインビボ有効性を決定した。
*IC50及びEC50は、少なくとも3つの値の平均である。
**群当たり8匹のマウス
(-)実施せず。
STING初代ヒトPBMCサイトカイン誘導アッセイ
ヒトSTING経路のアゴニズムは、ヒト全血由来の初代ヒト末梢血単核細胞(PBMC)において評価される。1パイント(約420mL)のドナー新鮮血(AliCells Inc,(Alameda,CA))を、リンパ球分離培地(1.077-1.080g/mL(Corning(Manassas,VA)))の上に層状化し、次いで500gにて室温で20分間中断することなく遠心分離する。血清とリンパ球分離培地との界面で回収されたPBMCを、採取し、洗浄し、次いで計数する。PBMCは、B細胞、T細胞などのリンパ球及び単球のサブタイプから構成され、文献において、これらのサブタイプは、異なるレベルのSTINGタンパク質を発現するとして特徴付けられている。2’3’-cGAMPなどのSTINGアゴニストに応答して、これらの細胞が活性化され、様々な炎症性及び抗ウイルス性サイトカインの発現が誘導される。また、STINGアゴニストで刺激すると、これらの細胞は、活性化マーカーを上方調節する。サイトカイン誘導レベルは、ELISA、Luminex及びMSDを含む様々な方法によって測定することができる。活性化マーカーのアップレギュレーションのレベルは、フローサイトメトリーによって測定することができる。
初代ヒト肝細胞は、B型肝炎ウイルスに感染し得、確定された感染中に、ウイルスタンパク質、例えばHBsAg及びHBeAgを産生し、これについてELISAにより検出し得る。エンテカビルなどの化合物を用いる療法的治療により、HBV再生を抑制し得、これについてウイルスタンパク質の産生減少により測定し得る。(細胞数)4x105個/ウェルの初代ヒト肝細胞(BioReclamation、ウェストベリー、NY)を、500μL/ウェルの組織培養処理された底が平らな24ウェルプレートに分配し得る。24時間後、細胞を30~75moiのHBVに感染させ得る。翌日、PHHを3回洗浄し得、新鮮な維持培地を細胞に添加し得る。同時に、PBMCを、上述のとおり単離し得る。PBMCを刺激するために、10,000,000個の細胞を、組織培養物処理された底が平らな24ウェルプレートに400μL/ウェルで分配し得る。試験化合物を体積100μLで添加し得、次いで培養物を37℃、5%CO2で48時間インキュベートし得る。上清を採取し得る。フローサイトメトリーを使用して、活性化マーカーのアップレギュレーションについて細胞を測定し得る。簡潔に述べると、細胞を、CD56、CD19、CD3、CD8a、CD14、CD69、CD54、CD161、CD4及びCD80を対象とする蛍光標識抗体で染色し得る。Attune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher、カールスバッド、CA)でサンプルを分析し得る。
以下の態様を包含し得る。
[1] 式(I)の化合物
B 1 及びB 2 は、独立して、b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b11、b12、b13、b14、b15、b16、b17、b18、b19、b20、b21、b22、b23、b24、b25、b26、b27、b28、b29、b30、b31、b32、及びb33からなる群から選択され;
R 1b は、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R 1b がフルオロのとき、R 1a は水素又はフルオロであり;
R 1c は、独立して、水素又はメチルから選択され;
R 2a は、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;1~7個のハロゲン置換基又はメトキシで任意選択で独立して置換されるC 1~3 アルコキシ;C 3~6 アルケニルオキシ;C 2~6 アルキニルオキシ;ヒドロキシ(C 1~3 )アルコキシ;又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、若しくはヒドロキシから選択される1~3個の置換基で任意選択で独立して置換されるC 1~3 アルキルから選択され;R 3 は、水素であり;
又は、R 2a は-O-であり、R 2c は-CH 2 -であり、これにより、R 2a と、R 2c と、これらが結合する原子とが、5員環を形成し;
R 2b は、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R 2b がフルオロのとき、R 2a は水素又はフルオロであり;
R 2c は、独立して、水素、フルオロ、CH 3 、又はCH 2 Fから選択され;
X 1 及びX 2 は、独立して、O、S、及びCH 2 からなる群から選択され;
Y及びY 1 は、各々独立して、存在しない、又はO若しくはNHからなる群から選択され;
Z及びZ 1 は、独立して、O及びNHからなる群から選択され;
M及びM 1 のうちの一方は、
これにより、Mが
またこれにより、M 1 は、
R 4 は、独立して、ヒドロキシ、メチル、BH 3 、及び-SR 5 からなる群から選択され;R 5 は、独立して、水素、-CH 2 O(O)R 6 、-CH 2 OC(O)OR 6 、-CH 2 CH 2 SC(O)R 6 、及び-CH 2 CH 2 S-SCH 2 R 6 からなる群から選択され;
R 6 は、独立して、1~5個のフルオロ若しくはヒドロキシ置換基、C 1~6 アルキル、C 6~10 アリール、又はC 3~12 シクロアルキルで任意選択で独立して置換されるC 6~10 アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、C 3~12 シクロアルキル、及びC 1~20 アルキルからなる群から選択される)
若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態
(ただし、B 1 及びB 2 が各々b6であり、Z-M-YがOS(O 2 )NHであり、Y 1 -M 1 -Z 1 がOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oであるとき、R 1a はOH以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B 2 がb6、X 2 がO、R 2a がOCH 3 、R 2b がH、R 2c がH、Z-M-YがOS(O) 2 NH、Y 1 -M 1 -Z 1 がOP(O)(OH)O、B 1 がb7、X 1 がO、R 1a がOCH 3 、R 1b がH、及びR 1c がHである、化合物以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B 2 がb6、X 2 がO、R 2a がF、R 2b がH、R 2c がH、Z-M-Yが( * R)OP(O)(SH)O、Y 1 -M 1 -Z 1 がNHS(O) 2 O、B 1 がb21、X 1 がO、R 1a がOH、R 1b がH、及びR 1c がHである、化合物以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B 2 がb30、X 2 がO、R 2a がH、R 2b がH、R 2c がH、Z-M-YがOS(O) 2 NH、Y 1 -M 1 -Z 1 がOP(O)(OH)O、B 1 がb7、X 1 がO、R 1a がOCH 3 、R 1b がH、及びR 1c がHである、化合物以外である)。
[2] R 1a が、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;メトキシ;ヒドロキシ(C 1~3 )アルコキシ;又は1~7個のフルオロ置換基で任意選択で独立して置換されるC 1~3 アルキルから選択される、
上記[1]に記載の化合物。
[3] B 1 及びB 2 が、各々b6である、上記[1]に記載の化合物。
[5] Z-M-YがOSO 2 NH、Y 1 -M 1 -Z 1 がOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oである、上記[1]に記載の化合物。
[6] Z-M-YがOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oであり、Y 1 -M 1 -Z 1 がNHSO 2 Oである、上記[1]に記載の化合物。
[7] 化合物1~55。
[8] 以下
[9] 上記[1]~[8]のいずれか一項に記載の化合物、並びに医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤及び医薬的に許容される希釈剤のうち少なくとも1つを含む、医薬組成物。
[10] 前記組成物が、固体経口投与形態である、上記[9]に記載の医薬組成物。
[11] 前記組成物が、シロップ剤、エリキシル剤又は懸濁剤である、上記[9]に記載の医薬組成物。
[12] 上記[7]に記載の化合物、並びに医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤及び医薬的に許容される希釈剤のうち少なくとも1つを含む、医薬組成物。
[13] STINGによって調節される疾患、症候群又は状態を治療する方法であって、前記治療を必要とする対象に治療有効量の上記[1]に記載の化合物を投与することを含む、方法。
[14] 疾患、症候群又は状態を治療する方法であって、前記疾患、症候群又は状態が、STINGのアゴニズムによって影響を受けるものであり、前記治療を必要とする対象に治療有効量の上記[1]に記載の化合物を投与することを含む、方法。
[15] 前記疾患、症候群又は状態が、癌である、上記[14]に記載の方法。
[16] 前記癌が、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び線維肉腫からなる群から選択される、上記[15]に記載の方法。
[17] 前記疾患、症候群、又は状態が、ウイルス感染である、上記[14]に記載の方法。
[18] 前記ウイルス感染が、B型肝炎である、上記[17]に記載の方法。
[19] ウイルス感染、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び線維肉腫からなる群から選択される疾患、症候群又は状態を治療する方法であって、前記治療を必要とする対象に、治療有効量の上記[9]に記載の組成物を投与することを含む、方法。
[20] 前記ウイルス感染が、B型肝炎である、上記[19]に記載の方法。
[21] 疾患、症候群、状態、又は障害を治療する方法であって、前記疾患、症候群、状態、又は障害がSTINGのアゴニズムによって影響を受けるものであり、前記治療を必要とする対象に治療有効量の(a)式(I)に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩形態及び(b)腫瘍溶解性ウイルス又は抗癌ワクチンを投与することを含む、方法。
[22] 前記抗癌ワクチンが、独立して、抗原ワクチン、全細胞ワクチン、樹状細胞活性化ワクチン、DNAワクチン、Bacillus Calmette-Guerin(BCG)ワクチン、Sipuleucel-T(Provenge)、Talimogene laherparepvec(T-Vec;Imlygic(商標))、腫瘍溶解性ウイルス系ワクチン、及びアデノウイルス系ワクチンからなる群から選択される、上記[21]に記載の方法。
[23] ウイルス感染、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び線維肉腫からなる群から選択される疾患、症候群又は状態の治療を必要とする対象において前記疾患、症候群又は状態を治療するための薬剤を調製するための、上記[1]に記載の化合物の使用。
[24] ウイルス感染、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び線維肉腫からなる群から選択される疾患、症候群又は状態の治療を必要とする対象において前記疾患、症候群又は状態を治療する方法において使用するための、上記[1]に記載の化合物の使用。
[25] 式(I)の特定の化合物の調製に有用な、化合物17a。
Claims (20)
- 式(I)の化合物
B1及びB2は、独立して、b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b11、b12、b13、b14、b15、b16、b17、b18、b19、b20、b21、b22、b23、b24、b25、b26、b27、b28、b29、b30、b31、b32、及びb33からなる群から選択され;
R1bは、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R1bがフルオロのとき、R1aは水素又はフルオロであり;
R1cは、独立して、水素又はメチルから選択され;
R2aは、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;1~7個のハロゲン置換基又はメトキシで任意選択で独立して置換されるC1~3アルコキシ;C3~6アルケニルオキシ;C2~6アルキニルオキシ;ヒドロキシ(C1~3)アルコキシ;又はフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、若しくはヒドロキシから選択される1~3個の置換基で任意選択で独立して置換されるC1~3アルキルから選択され;R3は、水素であり;
又は、R2aは-O-であり、R2cは-CH2-であり、これにより、R2aと、R2cと、これらが結合する原子とが、5員環を形成し;
R2bは、独立して、水素、フルオロ、又はヒドロキシから選択され;ただし、R2bがフルオロのとき、R2aは水素又はフルオロであり;
R2cは、独立して、水素、フルオロ、CH3、又はCH2Fから選択され;
X1及びX2は、独立して、O、S、及びCH2からなる群から選択され;
Y及びY1は、各々独立して、存在しない、又はO若しくはNHからなる群から選択され;
Z及びZ1は、独立して、O及びNHからなる群から選択され;
M及びM1のうちの一方は、
ここで、
(i)Mが
(ii)M1 が
R4は、独立して、ヒドロキシ、メチル、BH3、及び-SR5からなる群から選択され;R5は、独立して、水素、-CH2O(O)R6、-CH2OC(O)OR6、-CH2CH2SC(O)R6、及び-CH2CH2S-SCH2R6からなる群から選択され;
R6は、独立して、1~5個のフルオロ若しくはヒドロキシ置換基、C1~6アルキル、C6~10アリール、又はC3~12シクロアルキルで任意選択で独立して置換されるC6~10アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、C3~12シクロアルキル、及びC1~20アルキルからなる群から選択される)
若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態
(ただし、B1及びB2が各々b6であり、Z-M-YがOS(O2)NHであり、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oであるとき、R1aはOH以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B2がb6、X2がO、R2aがOCH3、R2bがH、R2cがH、Z-M-YがOS(O)2NH、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O、B1がb7、X1がO、R1aがOCH3、R1bがH、及びR1cがHである、化合物以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B2がb6、X2がO、R2aがF、R2bがH、R2cがH、Z-M-Yが(*R)OP(O)(SH)O、Y1-M1-Z1がNHS(O)2O、B1がb21、X1がO、R1aがOH、R1bがH、及びR1cがHである、化合物以外であり;
ただし、式(I)の化合物は、B2がb30、X2がO、R2aがH、R2bがH、R2cがH、Z-M-YがOS(O)2NH、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O、B1がb7、X1がO、R1aがOCH3、R1bがH、及びR1cがHである、化合物以外である)。 - R1aが、独立して、水素;ヒドロキシ;フルオロ;メトキシ;ヒドロキシ(C1~3)アルコキシ;又は1~7個のフルオロ置換基で任意選択で独立して置換されるC1~3アルキルから選択される、
請求項1に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態。 - B1がb6、B2がb7である、請求項1に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態。
- Z-M-YがOSO2NH、Y1-M1-Z1がOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oである、請求項1に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態。
- Z-M-YがOP(O)(OH)O又はOP(O)(SH)Oであり、Y1-M1-Z1がNHSO2Oである、請求項1に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態、並びに医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤及び医薬的に許容される希釈剤のうち少なくとも1つを含む、医薬組成物。
- 前記組成物が、固体経口投与形態である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が、シロップ剤、エリキシル剤又は懸濁剤である、請求項9に記載の医薬組成物。
- 請求項7に記載の化合物、又はその医薬的に許容される塩形態、並びに医薬的に許容される担体、医薬的に許容される賦形剤及び医薬的に許容される希釈剤のうち少なくとも1つを含む、医薬組成物。
- STINGによって調節される疾患、症候群又は状態を治療する方法に用いるための医薬組成物であって、請求項1~7のいずれか一項に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態を含み、前記方法が、前記治療を必要とする対象に治療有効量の前記化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態を投与することを含む、医薬組成物。
- 疾患、症候群又は状態を治療する方法に用いるための医薬組成物であって、前記疾患、症候群又は状態が、STINGのアゴニズムによって影響を受けるものであり、前記医薬組成物が、請求項1に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態を含み、前記方法が、前記治療を必要とする対象に治療有効量の前記化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態を投与することを含む、医薬組成物。
- 前記疾患、症候群又は状態が、癌である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、黒色腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び線維肉腫からなる群から選択される、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記疾患、症候群、又は状態が、ウイルス感染である、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルス感染が、B型肝炎である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 疾患、症候群、状態、又は障害を治療する方法に用いるための医薬組成物であって、前記疾患、症候群、状態、又は障害がSTINGのアゴニズムによって影響を受けるものであり、前記医薬組成物が、請求項1~7のいずれか一項に記載の化合物、若しくはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、又は医薬的に許容される塩形態を含み、前記方法が、前記治療を必要とする対象に治療有効量の(a)前記化合物又はその医薬的に許容される塩形態及び(b)腫瘍溶解性ウイルス又は抗癌ワクチンを投与することを含む、医薬組成物。
- 前記抗癌ワクチンが、独立して、抗原ワクチン、全細胞ワクチン、樹状細胞活性化ワクチン、DNAワクチン、Bacillus Calmette-Guerin(BCG)ワクチン、Sipuleucel-T(Provenge)、Talimogene laherparepvec(T-Vec;Imlygic(商標))、腫瘍溶解性ウイルス系ワクチン、及びアデノウイルス系ワクチンからなる群から選択される、請求項19に記載の医薬組成物。
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