JP7306791B2 - 併用療法のための医薬組成物 - Google Patents
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Description
いない要求に対処する。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される:
(項目1)
FXRアゴニストと、少なくとも1つのPPAR-アルファアゴニスト、PPAR-デルタアゴニストおよび/またはPPAR-アルファおよびデルタ二重アゴニストと、任意選択により1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
(項目2)
項目1に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも1つのPPAR-アルファアゴニストがフィブラートである、医薬組成物。
(項目3)
項目2に記載の医薬組成物であって、前記フィブラートが、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ビニフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブリン酸、ニコフィブラート、ピリフィブラート、プラフィブリド、ロニフィブラート、テオフィブラートおよびトコフィブラートまたは薬学的に許容可能なその塩もしくはエステル、およびフェノキシ部分が任意選択により置換さるピペペリジン、4-ヒドロキシピペリジン、ピペリド-3-エンまたはピペラジンで置換される2-フェノキシ-2-メチルプロパン酸の誘導体から選択される、医薬組成物。
(項目4)
項目3に記載の医薬組成物であって、前記フィブラートが、ベザフィブラート、フェノフィブラートおよびクロフィブラートまたは薬学的に許容可能なその塩もしくはエステルから選択される、医薬組成物。
(項目5)
項目4に記載の医薬組成物であって、前記フィブラートがフェノフィブラートである、医薬組成物。
(項目6)
項目3に記載の医薬組成物であって、前記フィブラートが、2-[3-[1-(4-フルオロベンゾイル)-ピペリジン-4-イル]フェノキシル-2-メチルプロパン酸である、医薬組成物。
(項目7)
項目1に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも1つのPPAR-デルタアゴニストが、{4-[({4-メチル-2-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-1,3-チアゾール-5-イル}メチル)スルファニル]-2-メチルフェノキシ}酢酸、{2-メチル-4-[5-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-2H-[1,2,3]トリアゾール-4-イルメチルシルファニル]-フェノキシ}-酢酸または[4-[[[2-[3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル]-4-メチル-5-チアゾリル]メチル]チオ]-2-メチルフェノキシ]-酢酸または薬学的に許容可能なその塩である、医薬組成物。
(項目8)
項目1に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも1つのPPAR-アルファおよびデルタ二重アゴニストが、2-[2,6ジメチル-4-[3-[4-(メチルチオ)フェニル]-3-オキソ-1(E)-プロペニル]フェノキシル]-2-メチルプロパン酸、(2S)-2-メトキシ-3-[4-[2-(5-メチル-2-フェニル-4-オキサゾリル)エトキシ]-7-ベンゾチオフェニル]プロパン酸、N-[(4-メトキシフェノキシ)カルボニル]-N-{4-[2-(5-メチル-2-フェニル-1,3-オキサゾール-4-イル)エトキシ]ベンジル}グリシン、(2S)-2-エトキシ-3-[4-[2-(4-メチルスルホニルオキシフェニル)エトキシ]フェニル]プロパン酸または(2S)-2-エトキシ-3-[4-(2-{2-メチル-5-[4-(メチルスルファニル)フェニル]-1H-ピロール-1-イル}エトキシ)フェニル]プロパン酸または薬学的に許容可能なその塩である、医薬組成物。
(項目9)
スタチンをさらに含む、項目1に記載の医薬組成物。
(項目10)
項目9に記載の医薬組成物であって、前記スタチンが、シンバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、メバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、フルインドスタチン、ベロスタチン、ダルバスタチン、ロスバスタチン、ジヒドロコンパクチンおよびコンパクチンから選択される、医薬組成物。
(項目11)
FXRアゴニストと、少なくとも1つのスタチンと、任意選択により1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
(項目12)
項目1、9または11に記載の医薬組成物であって、前記FXRアゴニストが、式Aの化合物:
R 1 は水素または未置換C 1 ~C 6 アルキルであり;
R 2 は水素またはα-ヒドロキシルであり;
Xは、C(O)OH、C(O)NH(CH 2 ) m SO 3 H、C(O)NH(CH 2 ) n CO 2 HまたはOSO 3 Hであり;
R 4 はヒドロキシルまたは水素であり;
R 7 はヒドロキシルまたは水素であり;
mは、1、2または3であり;
nは、1、2または3である。)
である、医薬組成物。
(項目13)
項目12に記載の医薬組成物であって、R 1 が未置換C 1 ~C 6 アルキルである、医薬組成物。
(項目14)
項目13に記載の医薬組成物であって、R 1 がメチル、エチルまたはプロピルである、医薬組成物。
(項目15)
項目14に記載の医薬組成物であって、R 1 がエチルである、医薬組成物。
(項目16)
項目12に記載の医薬組成物であって、Xが、C(O)OH、C(O)NH(CH 2 )SO 3 H、C(O)NH(CH 2 )CO 2 H、C(O)NH(CH 2 ) 2 SO 3 HおよびC(O)NH(CH 2 ) 2 CO 2 Hから選択される、医薬組成物。
(項目17)
項目16に記載の医薬組成物であって、XがC(O)OHである、医薬組成物。
(項目18)
項目12に記載の医薬組成物であって、XがOSO 3 Hである、医薬組成物。
(項目19)
項目12に記載の医薬組成物であって、R 4 がヒドロキシルであり、R 7 が水素である、医薬組成物。
(項目20)
項目12に記載の医薬組成物であって、前記FXRアゴニストが式IまたはIAの化合物:
R 1A は水素または未置換C 1 ~C 6 アルキルであり;
R 2 は水素またはα-ヒドロキシルであり;
R 4 はヒドロキシルまたは水素であり;
R 7 はヒドロキシルまたは水素である。)
である、医薬組成物。
(項目21)
項目20に記載の医薬組成物であって、R 1A が未置換C 1 ~C 6 アルキルである、医薬組成物。
(項目22)
項目21に記載の医薬組成物であって、R 1A がメチル、エチルまたはプロピルである、医薬組成物。
(項目23)
項目22に記載の医薬組成物であって、R 1A がエチルである、医薬組成物。
(項目24)
項目12に記載の医薬組成物であって、前記FXRアゴニストが、式IIまたはIIAの化合物:
R 1A は水素または未置換C 1 ~C 6 アルキルであり;
R 2 は水素またはα-ヒドロキシルであり;
R 3 はヒドロキシル、NH(CH 2 ) m SO 3 HまたはNH(CH 2 ) n CO 2 Hであり;
R 4 はヒドロキシルまたは水素であり;
R 7 はヒドロキシルまたは水素であり;
mは1、2または3であり;
nは1、2または3である。)
である、医薬組成物。
(項目25)
項目24に記載の医薬組成物であって、R 1A が未置換C 1 ~C 6 アルキルである、医薬組成物。
(項目26)
項目25に記載の医薬組成物であって、R 1A がメチル、エチルまたはプロピルである、医薬組成物。
(項目27)
項目26に記載の医薬組成物であって、R 1A がエチルである、医薬組成物。
(項目28)
項目12に記載の医薬組成物であって、前記FXRアゴニストが、
(項目29)
項目12に記載の医薬組成物であって、前記FXRアゴニストが、
(項目30)
必要とする対象に項目1、9または11に記載の医薬組成物を投与することを含む、FXR介在性疾患もしくは状態または脂質レベル上昇に関連する状態を処置または予防する方法。
(項目31)
項目30に記載の方法であって、前記疾患または状態が、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、原発性硬化性胆管炎(PSC)、門脈圧亢進症、胆汁酸下痢、慢性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、アルコール性肝疾患、進行性線維症による肝損傷、肝臓線維症、循環器疾患および高脂血症から選択される、方法。
(項目32)
項目30に記載の方法であって、前記状態が、抵抗性原発性胆汁性肝硬変;付随する肝臓機能検査上昇および高脂血症がある原発性胆汁性肝硬変;原発性硬化性胆管炎;非アルコール性誘発性脂肪性肝炎;B、C型肝炎またはアルコールに関連する慢性肝疾患;高脂血症が遺伝的構成要素を伴うかまたは伴わない原発性高脂血症である、高脂血症;および冠動脈疾患、脳血管動脈性疾患、末梢性血管疾患、大動脈瘤または頸動脈アテローム性動脈硬化症が関連する高脂血症から選択される、方法。
(項目33)
必要とする対象に項目1、9または11に記載の医薬組成物を投与することを含む、線維症を阻害するかまたは食い止める方法。
(項目34)
項目33に記載の方法であって、前記線維症が、肝臓線維症、腎臓線維症および腸線維症から選択される、方法。
または薬学的に許容可能なその塩またはアミノ酸抱合体(式中、
R1は、水素または未置換C1~C6アルキルであり;
R2は、水素またはα-ヒドロキシルであり;
Xは、C(O)OH、C(O)NH(CH2)mSO3H、C(O)NH(CH2)nCO2HまたはOSO3Hであり;
R4はヒドロキシルまたは水素であり;
R7はヒドロキシルまたは水素であり;
mは1、2または3であり;
nは1、2または3である。)
である。
または薬学的に許容可能なその塩またはアミノ酸抱合体(式中、
R1Aは、水素または未置換C1~C6アルキルであり;
R2は、水素またはα-ヒドロキシルであり;
R4はヒドロキシルまたは水素であり;
R7は、ヒドロキシルまたは水素である。)
から選択される。
または薬学的に許容可能なその塩またはアミノ酸抱合体(式中、
R1Aは水素または未置換C1~C6アルキルであり;
R2は、水素またはα-ヒドロキシルであり;
R3は、ヒドロキシル、NH(CH2)mSO3HまたはNH(CH2)nCO2Hであり;
R4はヒドロキシルまたは水素であり;
R7はヒドロキシルまたは水素であり;
mは1、2または3であり;
nは1、2または3である。)
から選択される。
便宜上、本願、実施例および付属の特許請求の範囲で使用されるある一定の用語をここでまとめる。
ステージ1-門脈ステージ:大きさが正常な三つ組み;門脈炎症、僅かな胆管損傷。このステージで肉芽腫が検出されることが多い。
ステージ2-門脈周囲ステージ:三つ組みが拡大;門脈周囲の線維症および/または炎症。一般的にはこのステージは、小胆管の増殖の知見を特徴とする。
ステージ3-隔壁ステージ:活動性および/または受動性線維性隔壁。
ステージ4-胆道肝硬変:小結節が存在;ガーランド(garland)
この実験は、マウスの総胆管結紮により誘発される線維症におけるOCAおよびアトルバスタチン単独および併用の効果を評価するために行った。
Japan SLCから雄C57BL/6マウス(6週齢)を入手した。温度(23±2°C)、湿度(45±10%)、照明(12時間人工的明暗サイクル;8:00~20:00に照明。)および換気(換気速度:40回/時間超)が制御された条件下で、特定の病原体不含の施設にてこの動物を維持した。施設の雑菌混入を防ぐために実験室で高圧(20±4Pa)を維持した。最大6匹/ケージでKN-600(夏目製作所、日本)に動物を収容した。寝床に滅菌Paper-Clean(Japan SLC)を使用し、週に1回交換した。手術日前に3週間、滅菌固形高脂肪飼料(HFD)および水を自由摂取で与えた。
群1:偽手術
偽手術マウス(n=8)に、BDL手術後第0日~第6日に1日1回、5mL/kgの体積でビヒクル(0.5%CMC)を経口投与した。
群2:BDL-ビヒクル
BDL手術マウス(n=12)に、BDL手術後第0日~第6日に1日1回、5mL/kgの体積でビヒクル(0.5%CMC)を経口投与した。
群3:BDL-OCA
BDL手術マウス(n=12)に、BDL手術後第0日~第6日に1日1回、5mg/kgの用量でOCAを加えたビヒクルを経口投与した。
群4:BDL-アトルバスタチン
BDL手術マウス(n=12)に、BDL手術後第0日~第6日に1日1回、10mg/kgの用量でアトルバスタチンを加えたビヒクルを経口投与した。
群5:OCA-BDL-アトルバスタチン
BDL手術マウス(n=12)に、BDL手術後第0日~第6日に1日1回、5mg/kgの用量でOCAおよび10mg/kgの用量でアトルバスタチンを加えたビヒクルを経口投与した。
第0日に胆管結紮手術を行った。ペントバルビタール麻酔下での総胆管の結紮によって、マウスにおいて、徐々に肝臓の線維症につながる胆汁うっ滞を確立した。手術前日のマウスの体重に基づいて、マウスを2つの手術コホートに分けた。剃毛した後、腹腔を開き、5~0手術用絹糸で2回総胆管を結紮し、結紮糸の間で総胆管を切り離した。腹膜および皮膚を縫合術で閉じた。麻酔からの回復のためにマウスを清潔なケージ(安静ケージ)に移した。偽手術マウスの手術は、他の群と同様であるが、胆管を結紮せずにを行った。
生存能、臨床兆候および挙動を毎日監視した。処置期間中、体重を毎日記録した。処置期間中、ケージごとに、餌消費を週2回測定した。第6日に、エーテル麻酔(和光純薬工業)下で直接的な心臓穿刺を通じた全採血によって動物を屠殺した。
コラーゲン沈着を可視化するために、ピクロ-シリウスレッド溶液(Waldeck,Germany)を使用して、ブアン固定した左側肝臓切片を染色した。線維症領域の定量分析のために、100倍の拡大率でデジタルカメラ(DFC295;Leica,Germany)を用いて中心静脈周囲でシリウスレッド染色切片の明視野画像を捕捉し、ImageJソフトウェア(National Institute of Health,USA)を使用して、5カ所の視野/切片における陽性領域を測定した。Prism Software 6(GraphPad Software,Inc.USA)を用いて統計学的解析を行った。
線維症領域のパーセンテージを推定するために、シリウスレッド染色によって、(通常の方法に従い)肝臓切片において組織病理学的分析を行った。シリウスレッド染色肝臓切片の代表的な顕微鏡写真を図1A~1Eで示す。BDL-ビヒクル群は、BDL-偽手術群と比較して、シリウスレッド-陽性領域の顕著な増加を示した。表1および図2で示されるように、BDL-OCA+アトルバスタチン群は、BDL-ビヒクル群と比較して、シリウスレッド-陽性領域の顕著な減少を示した。
この実験は、APOE*3Leiden.CETPトランスジェニックマウスでの、食餌誘発性NASHおよび肝臓線維症の発症におけるOCAおよびフェノフィブラートの単独または併用の効果を評価するために行った。肝臓遺伝子発現プロファイリングおよび続く経路分析は、この併用が、単剤療法処置の何れかにより制御されない新規遺伝子を制御するか否か、および/または単剤療法によっても影響を受ける遺伝子をより強く制御するか否かを判定するために行った。
雄APOE*3Leiden.CETPトランスジェニックマウス(9~21週齢)を入手して、ケージあたり2~5匹のマウスを収容した。24%ラードおよび1%(w/w)コレステロールを含有する高脂肪飼料をマウスに与えた。導入期間は高脂肪飼料で15週間であった。第16週に、4時間の絶食後、週齢、体重、血漿コレステロールおよびトリグリセリドに基づき、マウスを釣り合わせた。
群1:HFC参照群処置開始
マウス(n=15)に、第0~14週の実行中に高脂肪飼料を与えた。
群2:HFC対照群
マウス(n=15)に、第0~24週に高脂肪飼料を与えた。
群3:HFC+OCA
マウス(n=15)に、第16~24週に1日1回、10mg/kgの用量でOCAを加えた高脂肪飼料を与えた。
群4:HFC+低用量フェノフィブラート
マウス(n=15)に、第16~24週に1日1回、10mg/kgの用量でフェノフィブラートを加えた高脂肪飼料を与えた。
群5:HFC+高用量フェノフィブラート
マウス(n=15)に、第16~24週に1日1回、40mg/kgの用量でフェノフィブラートを加えた高脂肪飼料を与えた。
群6:HFC+OCA+低用量フェノフィブラート
マウス(n=15)に、第16~24週に、10mg/kgの用量でOCAを加えた高脂肪飼料を1日1回、および10mg/kgの用量のフェノフィブラートを1日1回、与えた。
群7:HFC+OCA+高用量フェノフィブラート
マウス(n=15)に、第16~24週に、10mg/kgの用量でOCAを加えた高脂肪飼料を1日1回および、40mg/kgの用量のフェノフィブラートを1日1回、与えた。
群8:固形飼料対照群
マウス(n=8)に第0~24週に固形飼料を与えた。
14週間にわたり、マウスに高脂肪固形飼料(HFC)を与えた。HFC食で15週間後、週齢、体重、4時間絶食後の血漿コレステロールおよびトリグリセリドに基づき、HFCマウスを7つの群に釣り合わせた。OCAおよびフェノフィブラートの単独または併用で、第15週から開始してマウスを処置し、非空腹状態で第25週に屠殺した。屠殺の1週間前に、D2Oのボーラスのi.p.注射および続く飲用水への4%D2Oの添加によって、マウスをD2Oで標識した。心臓穿刺によって血漿(EDTA)を得て、-70℃で保存した。肝臓の重量を測定し、4片の肝臓に分離し:1片(中葉)を10%ホルマリン中で固定し(NASHおよび線維症組織学用)、3片(シニスターローブ(sinister lobe))を液体N2中で瞬間凍結し、-70℃で個々に保存した。
炎症はNASHの重要な特性である。炎症は、Liang et al.,PlosOne 2014 Dec,9(12)による手順に従いカテゴリーに分け、炎症細胞凝集体の数を定量的に分析することによってスコア化した。特に炎症のレベルは、100x拡大率(視野サイズ3.1mm2;5つの異なる視野の平均)を使用して視野あたりの炎症病巣の数を数えることによって評価した。
NASH飼料でのAPOE*3-Leiden.CETPマウスの炎症において、単独での、およびフェノフィブラート(10および40mg/kg)と併用した、OCA10mg/kgの効果を調べた。低用量での薬物投与の10週間後、OCA(10mg/kg)もフェノフィブラート(10mg/kg)も、炎症細胞病巣の数を減少させなかった(図3Aおよび3Bおよび表2)。一方、併用は、ビヒクル対照ならびに各単剤療法治療群と比較して、炎症を顕著に軽減させた。より高用量のフェノフィブラート(40mg/kg/d)も、ビヒクル対照と比較して炎症を顕著に軽減させた。OCAとの併用時、それだけで高用量のフェノフィブラートが最大に近い効果を示したので、さらなる抗炎症効果は明らかではなかった。まとめると、OCA+低用量フェノフィブラートの併用での炎症の顕著な軽減(-63%)が認められた。さらに、高用量のフェノフィブラートでの顕著な軽減(-74%)およびOCAとの併用での同等の軽減(-79%)が認められた。表2および図3Aおよび3Bを参照。
以前に詳述されているように(Verschurenら、2014)核酸抽出を行った。簡潔に述べると、ガラスビーズおよびRNAzol(Campro Scientific,Veenendaal,The Netherlands)を使用して、個々の肝臓試料から全RNAを抽出した。Fragment Analyzer(Advanced Analytical Technologies,USA)およびRNA6000 Nano Lab-on-a-ChipキットおよびBioanalyzer 2100(Agilent Technologies,Amstelveen,The Netherlands)を使用して、RNA濃度および量を決定した。全ての試料が質的な要件を満たし、これらをRNA配列決定手順で使用した。
根底にある機序および経路への知見を得るために、処置マウスからの肝臓mRNA試料において、次世代配列決定を行った。根底にある機序および経路への知見を得るために、2つの分析を行った。
線維症および炎症を防ぐことにおけるFXR活性化の重要性は、進行性加齢性損傷および炎症を伴い(Yang 2007)炎症遺伝子の発現上昇を呈する(Kim 2007)FXRノックアウトマウスからの肝臓において明らかとなる。これらの報告と一致して、OCAは、HepG2細胞およびマウス初代肝細胞において抗炎症特性を発揮した。OCAで予め処置し、次いで炎症誘発性刺激に曝露したHepG2細胞は、TNF-α mRNAレベル、シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)誘導およびTNF-α-刺激型誘発性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)発現の50%~60%の低下を示した。同様に、OCA処置した初代肝細胞は、炎症誘発性刺激に反応して、iNOSおよび単球化学誘引物質タンパク質-1(MCP-1)遺伝子発現(40%~50%)の誘導鈍化を示した(Wang 2008)。細胞遊走の機序におけるOCAの効果は直接試験していないが、OCAは、IL-1βにより誘導されるiNOSまたはCOX-2産生を阻害し、薬理学的に誘導されるラット大動脈平滑筋細胞遊走を消失させた(Li 2007)。炎症性腸疾患の2種類の動物モデル(DSSおよびトリニトロベンゼンスルホン酸)の腸組織(Gadaleta 2011)およびI型糖尿病のラットモデルの腎臓(Wang 2010)において、OCAによる炎症性浸潤物の同様の阻害が明らかになった。したがって、OCAによる抗炎症効果の促進の所見から、フェノフィブラートとOCAの併用での遺伝子発現の変化が、多くの疾患状態において炎症および炎症細胞遊走の阻害を促進し得ることが示唆される。
この実験は、雄レプチン欠損ob/ob-NASHマウスにおける線維症ステージ(生検前と生検後)に対する、OCAおよびアトルバスタチン単独および併用での8週間の処置の効果を評価するために行った。
JanVier,Franceから雄Lepob/Lepobマウス(5週齢)を購入した。順化および食餌誘発期中、温度制御状態(22±1℃;50±10%相対湿度)で12:12の明暗サイクル下(3AM~3PMに照明)で特別注文のキャビネットにおいて1ケージあたり5匹ずつ、マウスを群で収容した。食餌誘発および試験期間を通じて、特別注文NASH飼料(S8189,Ssniff,Germany)(40%脂肪、40%炭水化物(20%フルクトース)および2%コレステロール)または通常のげっ歯類固形飼料(ob/ob-CHOW)(Altromin 1324,Brogaarden,Denmark)および水道水をマウスに自由摂取させた。介入前に全部で18週間、その飼料でこれらの動物を維持し、試験期間を通じてその飼料のままにした。術後回復期中および試験期間を通じて動物を1匹ずつ収容した。
群1:Lepob/Lepob-NASHビヒクル
マウス(n=10)に、第0週~第8週に1日1回、5mL/kgの体積でビヒクル(0.5%CMC)を経口投与した。
群2:Lepob/Lepob-NASH OCA
マウス(n=10)に、第0週~第8週に1日1回、30mg/kgの用量でOCAを加えたビヒクルを経口投与した。
群3:Lepob/Lepob-NASH
マウス(n=11)に、第0週~第8週に1日1回、10mg/kgの用量でアトルバスタチンを加えたビヒクルを経口投与した。
群4:Lepob/Lepob-NASH OCA+アトルバスタチン
マウス(n=9)に、1日1回、30mg/kgの用量のOCAおよび30mg/kgの用量のアトルバスタチンとの組み合わせを加えたビヒクルを経口投与した。
食餌誘発の15週間後(試験開始3週間前)、線維症および脂肪肝の肝臓進行の評価のために、および肝臓線維症ステージ評価のために、肝臓生検を得た。第-1週に、肝臓線維症ステージ、脂肪肝スコアおよび体重に従い、処置群への層別無作為化を行った。
手術日に、100%酸素中イソフルラン(2~3%)でマウスに麻酔をかけた。正中線で腹部を小さく切開し、肝臓の左側の葉を露出させた。肝臓組織の円錐型の楔(約100mg)をこの葉の末端部分から切除し、重量を測定し、組織学用に4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で固定した。双極凝固(ERBE VIO 100電気手術器)を用いて肝臓の切断面を直ちに電気的に凝固させた。肝臓を腹腔に戻し、腹部を縫合し、ステープラーで皮膚を閉じた。手術日に、水分補給のためにマウスに温めた塩水(0.5mL)を与えた。術後回復のために、手術日および術後第1および2日に、カルプロフェン(5mg/mL~0.01mL/10g)およびエンロフロキサジン(enrofloxazin)(5mg/mL~1mL/kg)を皮下投与した。
組織学的評価のための肝臓生検標品:4%PFA中で一晩保存後、自動化されたMiles Scientific Tissue-TEK VIP Tissue Processorにて、肝臓生検をパラフィン中で一晩浸透させ、続いてパラフィンブロック中に包埋した。5匹の異なる動物からの生検を1つのブロック上に包埋した。次いでブロックの形を整え、Microm HM340E Microtome(Thermo Scientific)上で2個の3μm切片になるように切った(シリウスレッド用に1個およびH&E染色用に1個)。2個のブロックを1枚のスライド上に置き、1枚のスライドあたり全部で10検体の生検が10匹の異なる動物に相当するようにした。切片を一晩乾燥させた。 Kleinerら(2005)(以下参照)により概説されるように、処置群への層別化および無作為化のための線維症ステージの評価を行った。
ベースライン時および処置の第8週に、朝(午前7~8時)、トリグリセリドの非空腹(摂食)血漿レベルを測定するために血液試料を得た。覚醒状態で(切れ込みを入れることにより)尾静脈から血液試料を回収した。血液採取約18時間前に最後の薬物用量を投与した。血液採取後にマウスに再び餌を与えた。
非空腹状態で第8週に動物を屠殺した。屠殺約18時間前に最後の薬物用量を投与し、屠殺前には動物に薬物投与を行わない。CO2/O2によって、麻酔(イソフルラン)中に動物を誘導し、腹腔を開き、最後の血漿の回収のために心臓の血液を得た。剖検時、肝臓全体を摘出し、重量を測定した。左側の葉からの生検を切り取り、組織学および生化学的分析用に4%PFA中で固定した。中葉を小片に細切し、生化学的分析(TG)のために液体窒素中で瞬間凍結した。続いて、後の任意選択の組織学用に残存肝臓組織を4%PFA中で固定した。
試験前生検:試験開始のおよそ3週間前に、肝臓組織の円錐型の楔(約100mg)をこの左側葉の末端部分から切除し、重量を測定し、すぐに4%PFA中に入れた。
Kleinerおよび共同研究者(Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease,Kleiner et al,Hepatology 41;2005)で概説される臨床基準の使用による線維症ステージの評価のために、左側の葉からの肝臓生検前および生検後組織を回収し、これを以下の表5で再現した。図4は、線維症スコア化におけるOCAおよびアトルバスタチン単独および併用の効果を記載する。OCAおよびアトルバスタチンの併用は、ビヒクルから有意ではないものの(p値=0.09)、線維症スコアを低下させる傾向を示す。
トリグリセリドレベル:リチウム-ヘパリンチューブに100μLの血液を回収した。血漿を分離し、試料を分析まで-80℃で保存した。製造者の説明書に従い、市販のキット(Roche Diagnostics,Germany)とともに自動分析装置Cobas C-111を使用して、1点測定(single determinations)でトリグリセリドレベルを測定した。図5Aおよび5Bで示されるように、OCAおよびアトルバスタチンの併用によって、統計学的に有意にトリグリセリドレベルを低下させた。
この実験は、ヒト肝細胞においてコラーゲン合成を変化させる能力を調べるため、PPARアゴニストまたはスタチンと併用したOCAの効果を評価するために行う。
適切な細胞培養培地は、ウェイマウスMB-752/1、ハムF12、RPMI1640、ダルベッコ改変イーグル培地、ウィリアムス培地E、リーボビッツL15および改変チー(Chee)培地を含む。IV型コラゲナーゼ、I型コラーゲン、パーコール、培地および追加物質を培地に添加し(例えば、血清、抗生物質、アミノ酸、DEXなどのホルモン、インスリンおよび成長因子)、灌流緩衝液および他の溶液は市販されていたか、または市販の材料から調製した。サンドイッチ肝細胞培養において、他のタイプのコラーゲン(II~IV型)、ラミニン、フィブロネクチンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンを使用し得る。しかし、IおよびIV型コラーゲンがフィブロネクチンおよびラミニンよりも優れていたことが示されている。
肝細胞を単離するために、2段階インサイチューコラゲナーゼ灌流法を利用する。簡潔に述べると、雌ルイスラットから肝細胞を単離する。動物に麻酔をかける。インサイチューで門脈を通じて灌流緩衝液で最初に肝臓を灌流する。肝臓に入れる前に灌流液を平衡化する。続いて、肝臓に対して灌流緩衝液中でコラゲナーゼを灌流させる。次いで、肝臓を解体し、氷冷灌流緩衝液に移す。肝臓カプセルを引き裂き、得られた細胞懸濁液をろ過する。遠心により細胞ペレットを回収し、再懸濁する。パーコールを懸濁液に添加し、パーコール密度遠心技術を使用して肝細胞を単離する。混合物を遠心し、細胞ペレットを培地で2回洗浄する。トリパンブルー排除によって肝細胞生存能を判定する。あるいは、新鮮単離肝細胞の代わりに凍結保存肝細胞を使用し得る。
コラーゲン被覆組織培養プレート上で単離肝細胞を培養し、血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、上皮増殖因子、インスリン、グルカゴンおよびヒドロコルチゾンを加えた培地中で維持する。I型コラーゲン溶液および培地を混合することによってコラーゲンゲル化溶液を調製する。ゲル化溶液で組織培養プレートをコーティングし、ゲル形成を促進するために37℃で温置する。適正な密度で肝細胞を播種し、37℃で維持する。24時間ごとに培地を交換する。
タウロコール酸蓄積および胆道排出を最適化するために、サンドイッチ肝細胞培養において、特定の培地、例えばウィリアムス培地Eおよびダルベッコ改変イーグル培地を使用し得る。
試験しようとするFXRアゴニストは、「OCA」および6-エチルケノデオキシコール酸(6-ECDCA)としても知られるオベチコール酸である。
5種類の試験物品、FXRアゴニスト、PPAR-アルファアゴニスト、PPAR-デルタアゴニスト、二重PPAR-アルファ/デルタアゴニスト(またはあるいはPPAR-アルファアゴニストおよびPPAR-デルタアゴニストを一緒に)およびスタチンの潜在力を評価して、ヒト肝細胞においてコレステロール合成および脂質プロファイルを変化させる能力を決定する。3つの異なる濃度の試験物品への72時間の曝露後、サンドイッチ培養したヒト肝細胞(SCHH)において変化を評価する。投与溶液は培地中で毎日新鮮なものを調製し、SCHHの投与は3日間毎日行う。実験は、Transporter Certified(商標)Human Hepatocytes(N=1)の1つの(1)ロットを用いて24ウェル方式で行う。3つ組データを提供するために、3つの(3)ウェルで各試験条件を行う(平均±標準偏差として表す。)。対照として溶媒対照処置プレートを使用し、ベースライン機能について評価する。試験期間の終わりに、内部標準を個々のウェルに添加し、続いて網羅的な脂質プロファイリングのために抽出試薬を添加する。試料を室温で1時間振盪し、遠心する。上清を窒素下で蒸発乾固させ、再懸濁し、分析する。
PPAR-アルファアゴニスト、PPAR-デルタアゴニスト、PPAR-アルファおよびデルタ二重アゴニスト(または代替的には、PPARアルファアゴニストおよびPPARデルタアゴニストとFXRアゴニスト)のそれぞれとの、および/またはスタチンとのFXRアゴニストの併用に対して、ヒト肝細胞においてコレステロール合成および脂質プロファイルを変化させるためのそれらの能力を評価する。評価する具体的な組み合わせは次のとおりである:
・FXRアゴニストとPPAR-アルファアゴニスト
・FXRアゴニストとPPAR-デルタアゴニスト
・FXRアゴニストとPPAR-アルファおよびデルタ二重アゴニストおよび/またはFXRアゴニストとPPAR-アルファアゴニストおよびPPAR-デルタアゴニスト
・FXRアゴニストとスタチン
FXRアゴニスト、PPAR-アルファアゴニスト、PPAR-デルタアゴニスト、PPAR-アルファおよびデルタ二重アゴニスト(またはPPAR-デルタアゴニストと組み合わせたPPAR-アルファアゴニスト)および/またはスタチンの三重併用に対して、ヒト肝細胞においてコレステロール合成および脂質プロファイルを変化させるためのそれらの能力を評価する。3つの異なる濃度での試験物品への72時間の曝露後にサンドイッチ培養ヒト肝細胞(SCHH)において変化を評価する。培地中で毎日新鮮な投与溶液を調製し、SCHHの投薬は3日間にわたり毎日行う。Transporter Certified(商標)Human Hepatocytes(N=1)の1つの(1)ロットを使用して、24ウェル方式で実験を行う。3つ組データを提供するために、3つの(3)ウェルで各試験条件を行う(平均±標準偏差として表す。)。試料を調製し、実施例2で詳述するように、網羅的な脂質プロファイリングについて分析する。脂質プロファイルおよびコレステロール合成の変化を実施例2の併用投与からの効果と比較する。評価する具体的な組み合わせは次のとおりである:
・FXRアゴニストとPPAR-アルファアゴニストおよびスタチン
・FXRアゴニストとPPAR-デルタアゴニストおよびスタチン
・FXRアゴニストとPPAR-アルファおよびデルタ二重アゴニスト(または、代替的に、PPAR-アルファアゴニストおよびPPAR-デルタアゴニスト)およびスタチン
動物
22℃で12:12時間の明暗サイクルで標準的なケージに動物を個々に収容する。雄C57BL/6マウス(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)に対して脂肪に富む飼料(40%kcal、Primex部分的硬化植物油ショートニング)、フルクトース(22wt%)およびコレステロール(2wt%)(Research Diets,New Brunswick,NJ、cat.no.D09100301)を自由に摂取できるようにする。対照飼料としてフルクトースまたはコレステロール不含の低脂肪飼料(10%kcal;以後LFDと呼ぶ。)を使用する(Research Diets,cat.no.D09100304)。この有効なLFDの使用によって、実験食を与える動物と比較するための、「正常」肝臓表現型を維持する対照マウス群が確立される。
対照HFD:
対照LFD:
HFD+FXRアゴニスト:
HFD+PPARα(すなわちフェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ベゾフィブラートまたはシプロフィブラート):
HFD+PPARδ(すなわちGW501516):
HFD+PPARα+PPARδ:
HFD+二重PPARα/δ(すなわちGFT505):
HFD+スタチン(すなわち、アトルバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン)
HFD+FXRアゴニスト+PPARα:
HFD+FXRアゴニスト+PPARδ:
HFD+FXRアゴニスト+PPARα+PPARδ:
HFD+FXRアゴニスト+二重PPARα/δ:
HFD+FXRアゴニスト+スタチン:
屠殺時に、肝臓の右中葉および/または左側葉を切除し(各葉の≧50%を回収)、10%中性緩衝ホルマリン中で固定する(室温で少なくとも7日間)。組織端部および中央の両方の代表的な同様の大きさの切片を選択するために、肝臓組織を慎重に切除する。肝臓組織をパラフィン包埋し、切片にし(5μm)、載せる。形態学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用し、肝臓線維症の評価のためにマッソントリクロムおよびシリウスレッド染色を使用する。本試験に対しては病理学者が盲検で組織病理学的分析を行う。Kleinerおよび共同研究者により概説される基準の使用によってNAFLDおよびNASHをスコア化する。線維症の定量的評価については、x20拡大率のScanScope CS全スライドスキャニングシステム(Aperio,Vista,CA)の使用によってシリウスレッド染色切片全体をスキャンする。画像を抽出し、Image-Pro Analyzerソフトウェア(MediaCybernetics v.6.2,Bethesda,MD)を用いてカラーキューブ(color cube)に基づく方法によって組織全体からのシリウスレッド染色コラーゲンプロファイルを測定する。各動物からの3~4個の代表的切片(さらなる切片が評価される総合的な肝臓線維症評価実験を除く。)から総コラーゲン染色(総面積の%として報告)を評価する。全ての組織学的分析を盲検で行う。
100%酸素中のイソフルラン(2~3%)でマウスに麻酔をかける。正中線の約0.5cm左に腹部を小さく切開し、肝臓の左側の葉を露出させる。肝臓組織の楔(約50mg)をこの葉の末端部分から切除し、すぐにバイアルに入れ、液体窒素中で瞬間凍結する。楔型の吸収性ゼラチンスポンジ(GelFoam,Pfizer,NY)を肝臓の切り口に挿入する。止血が達成されて(一般的には1分以内)ゼラチンスポンジが生検部位によく付着したら、肝臓を腹腔に戻し、腹壁を縫合し、皮膚をステープルで留める。術後痛をコントロールするために、手術時にマウスにブプレノルフィン(0.05mg/kg、皮下)の注射を1回行う。偽手術マウスに対して、肝臓において切除を行わないことを除き、同一の手順を行う。
Olympus AU400e Bioanalyzer(Olympus America Diagnostics,Center Valley,PA)を使用することによって、血漿グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)レベルを測定する。ALTおよびASTの測定のために、血漿試料をPBSで1:10希釈する。市販の電気化学発光キット(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)を用いて、製造者の説明書に従い、総血漿アディポネクチンおよび空腹時血清インスリンを測定する。
Folchら出典のプロトコールを使用して、肝臓から総肝臓脂質を抽出する。10mLの2:1クロロホルム-メタノール溶液中で凍結肝臓組織(約0.3g)をホモジェナイズ処理する。脂肪不含ろ紙を用いてホモジェネートをろ過し、予め重量を測定した15mLガラスバイアルに漏斗で入れる。さらなる5mLの2:1クロロホルム-メタノールを添加し、続いて2.5mLの0.9%NaClを添加する。10℃で5分間、1,800gでの遠心によって脂質を分離し、水層を廃棄し、脂質ペレットが乾燥するまでチューブに対して窒素をフラッシュする。脂質ペレットを含有するチューブの重量を再測定し、総肝臓の1gあたりの抽出総脂質を計算する。コラーゲンの酸加水分解によるヒドロキシプロリン残基の比色決定によって肝臓中の総コラーゲン含量を測定する(Quickzyme,Leiden,Netherlands)。
肝臓の左側の葉から組織コア(50~100mg)を回収し、液体窒素中で瞬間凍結し、処理まで-80℃で保存する。プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液中で組織をホモジェナイズ処理する。BCAタンパク質アッセイキット(Pierce,Rockford,IL)を用いて透明化上清のタンパク質濃度を測定する。還元4~12%Nupageゲル(Life Technologies,Carlsbad,CA)上で肝臓組織溶解液(約50μg)を分離し、ニトロセルロース膜に移す。50kDaと60kDaマーカーとの間で膜を切り、5%ブロットでブロッキングする。上半分を抗コラーゲン-1%1(1:1,000;cat.no.NBP1-30054;Novus Biologicals,Littleton,CO)で探索し、コラーゲン-1%1タンパク質のCOOH-末端テロペプチド部分を検出する。正規化のために、下半分を抗グリセルアルデヒド3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH,1:7,500;cat.no.3683;Cell Signaling Technologies,Danvers,MA)で探索する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗ウサギ抗体との温置後、タンパク質発現を高感度化学発光(Thermo Scientific,Rockford,IL)で検出し、FluorChem System(Cell Biosciences,Santa Clara,CA)で濃度測定を行う。コラーゲン-1α1の濃度測定分析は、グリコシル化型または部分的に処理されたコラーゲン-1α1タンパク質に対応する、140kDa成熟タンパク質ならびに僅かに大きいバンドの両方を含む。
6mm組織くり抜きツール(coring tool)を用いて、または生検方法によって肝臓の左側の葉からの組織試料を回収し、液体窒素中で瞬間凍結し、処理するまで-80℃で保存する。TRI試薬(Life Technologies)を使用して肝臓試料(約50~150mg)からの全RNAを抽出し、次いでQiagen RNeasy Plus Miniキット(Qiagen,Valencia,CA)でさらに精製する。Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上でAgilent 6000ナノキットを使用することによってRNAの完全性を判定する。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies)を使用することによってcDNAを調製する。ABI Prism 7900HT機器(Applied Biosystems,Foster City,CA)上でTaqMan遺伝子発現アッセイオンデマンドおよびUniversal Master Mix(Life Technologies)によって、遺伝子発現の変化を確認する。正規化のためにペプチジルプロリルイソメラーゼA(Ppia)およびGapdhを使用して、相対的な閾値サイクル(CT)法によって、遺伝子発現の変化を計算する。遺伝子アレイについては、ABI Pmris 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)を使用することによって、cDNA試料をMouse Fibrosis RT2 Profiler PCR Arrays(PAMM-120C、RT2 SYBR Green/ROX qPCR Master Mix;SABiosciences)上で試験する。DataAssist v3.0ソフトウェア(Applied Biosystems/Life Technologies)を使用して、比較CT法によって、アレイ上での遺伝子発現の変化を計算する。Mouse Fibrosis RT2 Profiler PCR Array中に含まれる5個のハウスキーピング遺伝子の中で、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(Hprt)およびGapdhは、DataAssist v3.0ソフトウェアにより計算される安定性スコアによれば、最も安定な発現を有する。選択された内因性対照遺伝子の平均は、各遺伝子の相対的発現を計算するための正規化因子として使用する。線維症アレイを用いることにより得られた結果を確認するために、アレイにより上方制御されるか、下方制御されるか、または不変であると判定される遺伝子の選択のためにTaqMan遺伝子発現アッセイを行う。
72週間にわたる経口投与オベチコール酸(1日25mg)またはプラセボでの処置を評価するために、非肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎の患者において、多施設二重盲検比較の、平行群間無作為化臨床試験を行った。臨床施設および糖尿病状態により層別化された、コンピュータで作成した中央一括管理される手順を使用して、患者を1:1で無作為に割り当てた。主要転帰の目安は、ベースラインから処置終了まで線維症の悪化がない、非アルコール性脂肪性肝疾患活性スコアの少なくとも2点の低下として定義される、中央一括でスコア化された肝臓組織学における改善であった。24週間でのアラニンアミノトランスフェラーゼの変化を測定した:アラニンアミノトランスフェラーゼの相対的変化-24%、95%CI-45~-3。
次の試験対象患者基準:スクリーニング時点で18歳以上、無作為化前90日以内の、得られた肝臓生検に基づく明確なまたは境界非アルコール性脂肪性肝炎の組織学的エビデンスおよび組織学的非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)活性スコア4以上で、スコア(脂肪肝スコア0~3、肥大0~2および小葉炎症0~3)の各構成要素においてスコアが1以上、に従い、患者を試験に登録する。登録施設において、登録の目的のための生検のグレードおよびステージ決定を行った。除外基準には、肝硬変、肝疾患の他の原因、大量アルコール摂取(女性の場合>20g/日または男性の場合>30g/日)または他の交絡条件が含まれる(下記参照)。
適正基準を満たす患者を経口オベチコール酸、25mg1日1回、またはプラセボに無作為に割り当てた(1:1)。コード番号が貼られた同一容器中の同一錠剤としてオベチコール酸およびプラセボを与えた。患者、研究者、臨床現場スタッフおよび病理学者に対して処置の割り当てが分からないようにする。
無作為化後、患者は、第2、4および12週、および次いで第72週の処置完了まで12週間ごと、および次いで24週間後に、治験来院のために再訪した。通例の生化学的試験および脂質、グルコースおよびインスリンの空腹時濃度の評価のために、これらの来院時に血液試料を得た。最初の評価時に体重、身長および腹囲および臀部周囲を測定し、中間の時間(interim times)を指定した。全患者が、健康な食習慣、体重減少、運動および、適応があれば、高血圧、高コレステロール血症および糖尿病の管理に関する標準的な助言を受けた。
次の除外基準の何れかに合致する患者は、登録資格がないものとみなした:1)スクリーニング前1年以内の3か月連続を超える、現在または過去の著しいアルコール摂取(著しいアルコール摂取は、平均で、女性では20g/日超、男性では30g/日超として定義した。);2)施設の研究者の判断に基づき、アルコール摂取を確実に定量不能;3)無作為化前1年の2週間超にわたるNAFLDと歴史上関連がある薬物の使用;4)以前のまたは計画的な肥満手術または手順;5)登録前60日以内の80.3mmol/mol以上のHbAlcとして定義される糖尿病のコントロール不良;6)肝臓生検における肝硬変の存在、7)血小板数<100x109/L;8)次の異常の何れかの存在により定義されるような肝代償不全の臨床エビデンス:血清アルブミンが32g/L未満、INRが1.3超、直接ビリルビンが22.2μmol/L超または食道静脈瘤、腹水もしくは肝性脳症の病歴;9)他の形態の慢性肝疾患のエビデンス:B型肝炎表面抗原(HBsAg)の存在により定義されるようなB型肝炎、C型肝炎ウイルス(HCV)RNAまたは陽性C型肝炎抗体(抗HCV)の存在により定義されるようなC型肝炎、適合する肝臓組織学により定義されるような進行中の自己免疫肝疾患のエビデンス、少なくとも2つの基準(主にアルカリホスファターゼ上昇に基づく胆汁うっ滞の生化学的エビデンス、抗ミトコンドリア抗体[AMA]の存在および非化膿性破壊性胆管炎および小葉内胆管破壊の組織学的エビデンス)の存在により定義されるような原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、正常限界を下回るセルロプラスミンおよび適合する肝臓組織学により定義されるようなウィルソン病、肝臓組織学における診断特性により定義されるようなアルファ-1-アンチトリプシン(A1AT)欠乏(正常未満のアルファ-1アンチトリプシンレベルにより確認、施設の研究者の裁量で排除)、肝臓生検上での3+または4+可染鉄の存在により定義されるようなヘモクロマトーシスまたは鉄過負荷の病歴、典型的な曝露および病歴に基づいて定義されるような薬物誘発性肝疾患、既知の胆管閉塞、肝臓癌の疑いもしくは証明またはNASH以外の何らかの他のタイプの肝疾患;10)300U/L超の血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT);11)176.8μmol/L以上の血清クレアチニン;12)肝臓生検を安全に得ることが不可能;13)胆道分流の病歴;14)ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染に対して陽性であることが分かっている;15)平均余命が5年未満と思われる活動性で重篤な医学的疾患;16)スクリーニングの前年の、吸入または注射薬物を含む活性物質乱用;17)妊娠、妊娠の計画、妊娠の可能性および試験中の有効なバースコントロールの使用を望まないことまたは授乳;18)無作為化前30日中でのIND試験への参加;19)施設の研究者の意見での、コンプライアンスを妨げるか、または試験完了を妨害する、何らかの他の状態;または20)インフォームドコンセントを与えられないこと。
マンテル・ヘンツェル検定を使用して主要転帰および二成分二次転帰(binary secondary outcomes)を解析し;処置群に対するベースラインから72週間まで、および転帰のベースライン値までの連続転帰におけるANCOVAモデル関連変化を使用して連続的二次転帰を分析した。SAS(SAS Institute 2011,Base SAS 9.3 Procedures Guide)およびStata(StataCorp 2013,Stata Statistical Software:release 13)を使用して、統計学的解析を行った。
主要評価項目は、ベースラインから処置終了まで線維症の悪化がない、少なくとも2点のNAFLD活性スコアの低下として定義されるような中央一括でスコア化された肝臓組織学の改善であった。線維症の悪化は、ステージにおける何らかの数値の上昇として定義した。二次的な組織学的転帰には、非アルコール性脂肪性肝炎の解消、NAFLD活性スコアの変化および、肝細胞膨張、脂肪肝、小葉および門脈の炎症および線維症に対する個々のスコアの変化が含まれる。線維症の改善は、ステージにおける何らかの数値的な低下として定義した。線維症ステージ1a、1bおよび1cは、分析目的で、ステージ1とした。他の二次転帰としては、血清アミノトランスフェラーゼおよびγ-グルタミルトランスペプチダーゼ濃度、インスリン抵抗性の評価の空腹時ホメオスタシスモデル(HOMA-IR)、身体測定値(体重、ボディーマスインデックス、ウエストとヒップの比率、胴回り)および健康関連のクオリティー・オブ・ライフスコアの、ベースラインから72週間の変化が挙げられる。
低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)レベルに対するスタチンの効果を評価するために、実施例9で得られたデータのサブ解析を行った。これらの二次解析の目的は、より重篤なNASHの患者のサブグループにおける、プラセボに対するOCAの効果を決定すること、および血清LDLコレステロールに対するスタチン同時使用の効果を評価することであった。次のように3つの群において対象データを評価した:
・群A(n=64、スタチンなし)には、ベースライン(第0日)でスタチンがなく、第72週まで(第72週を含む。)一連の試験を通じてスタチンを開始しない、オベチコール酸(OCA)処置群の対象が含まれた。
・群B(n=47、ベースラインスタチン)には、ベースラインでスタチンがあり、試験中、第72週まで(第72週を含む。)スタチンを継続したOCA処置群の対象が含まれた。
・群C(n=23、新規スタチン)には、ベースラインでスタチンがなかったが、ベースライン後から第72週まで(第72週を含む。)の時間にスタチン処置を開始したOCA処置群の対象が含まれた。
・ベースラインおよび第72週に以下で列挙する平均および中央値の特徴を評価する。
〇臨床検査値:LDL-C、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)、アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ
〇年齢
〇性別:%男性、%女性
〇%糖尿病
〇組織学:脂肪肝、膨張、炎症、線維症
・上記特徴のベースラインから第72週の平均および中央値%変化を評価する。
ベースラインでスタチンありの患者においてOCA処置中にLDLコレステロールが上昇したが、レベルは、スタチンなしのプラセボ処置患者の値を超えなかった。OCA処置中のスタチン開始によって、LDLがプレOCAベースラインを下回るレベルに逆転された。図8で示されるように、OCA関連LDL上昇は、OCA処置中のスタチン療法開始により逆転されると思われた。
Claims (8)
- FXRアゴニストおよびベザフィブラートの2方向の組み合わせと、
任意選択により、1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、FXR介在性疾患もしくは状態を処置または予防するための薬剤の製造における使用のための医薬組成物であって、
前記FXRアゴニストが、式(1)の化合物:
または薬学的に許容可能なその塩であり、前記医薬組成物が、前記FXRアゴニストおよびベザフィブラート以外のいずれの治療剤も含まず、前記FXR介在性疾患もしくは状態が、
a)原発性胆汁性肝硬変(PBC)、原発性硬化性胆管炎(PSC)、門脈圧亢進症、胆汁酸下痢、慢性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、アルコール性肝疾患、進行性線維症による肝損傷、肝臓線維症、および高脂血症;あるいは
b)原発性胆汁性肝硬変(PBC)、原発性硬化性胆管炎(PSC)、薬物誘発性胆汁うっ滞、遺伝性胆汁うっ滞、胆道閉鎖および妊娠の肝内胆汁うっ滞から選択される胆汁うっ滞性疾患
から選択される、医薬組成物。 - 前記FXRアゴニストが、前記式(1)の化合物の遊離酸である、請求項1に記載の使用のための医薬組成物。
- 前記FXRアゴニストが、前記式(1)の化合物の薬学的に許容可能な塩である、請求項1に記載の使用のための医薬組成物。
- 前記胆汁うっ滞性肝疾患がPBCである、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
- FXRアゴニストおよびベザフィブラートの2方向の組み合わせと、
任意選択により、1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、FXR介在性疾患もしくは状態を処置または予防するための医薬組成物であって、
前記FXRアゴニストが、式(1)の化合物:
または薬学的に許容可能なその塩であり、前記医薬組成物が、前記FXRアゴニストおよびベザフィブラート以外のいずれの治療剤も含まず、前記FXR介在性疾患もしくは状態が、
a)原発性胆汁性肝硬変(PBC)、原発性硬化性胆管炎(PSC)、門脈圧亢進症、胆汁酸下痢、慢性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、アルコール性肝疾患、進行性線維症による肝損傷、肝臓線維症、および高脂血症;あるいは
b)原発性胆汁性肝硬変(PBC)、原発性硬化性胆管炎(PSC)、薬物誘発性胆汁うっ滞、遺伝性胆汁うっ滞、胆道閉鎖および妊娠の肝内胆汁うっ滞から選択される胆汁うっ滞性疾患
から選択される、医薬組成物。 - 前記FXRアゴニストが、前記式(1)の化合物の遊離酸である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記FXRアゴニストが、前記式(1)の化合物の薬学的に許容可能な塩である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記胆汁うっ滞性肝疾がPBCである、請求項5~7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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