JP7284470B2 - 生体分子の検出のための温度応答性蛍光粒子 - Google Patents
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Description
本発明は、生体分子の検出のための温度応答性蛍光粒子、該温度応答性蛍光粒子を用いる温度応答性蛍光プローブ粒子、並びに、該粒子を用いる生体分子の検出法及び生体分子の定量法に関する。
近年、生体分子（バイオマーカー）の検出及び定量にはELISA法が多用されている。ELISA法は、抗原－抗体反応を利用するため、高い特異性が得られる一方、試薬の洗浄や酵素反応などの操作が煩雑で時間が掛かかる上、生体分子の検出濃度は1pM程度が限界である。
また、ELISA法をさらに進展させた生体分子の検出法も開発されている。例えば、デジタルELISA法と呼ばれる方法では、反応デバイスを工夫して微小液滴（フェムトリットル）中で酵素反応を行うことで高感度化を実現している（非特許文献１、２）。しかし、これらの方法の測定原理はELISA法と同じであり、従来のELISA法より操作が煩雑になり時間がかかる問題がある。
Single Molecule Counting (SMCTM) Immunoassay Technologyが、分子検出技術として開発されている（非特許文献３）。この技術もELISA法を原理としているが、検出器の光学系を工夫することで、検出領域を微小化して検出感度を向上させている。しかし、専用の高価な検出器が必要で、微小領域を繰り返しスキャンして測定するため測定に時間がかかる。
また、イムノクロマト法が使用されているが（非特許文献４）、感度が低いため疾病や感染の早期発見には使えない、目視判定による判定者の視認感度差などがあり、偽陰性率（２０～３０％）も高いとの欠点を有する。
バイオマーカーによる疫病や感染の早期診断には1pM以下の検出感度が必要であるため、より高感度で、簡便で、短時間で実施可能な検出法の開発が待たれている。
Rissin D.M., et al, Nat Biotechnol. 2010:28(6):595-9.
Kim S.H., et al, Lab Chip, 2012, 12, 4986-4991.
Hwang J., et al, Methods, 2019, 158, 69-79.
Hurt C. A., et al, J.Clin.Virol., 2007, 39, 132-135
簡便で、短時間で低濃度の標的生体分子（バイオマーカー）を検出できる標的生体分子の測定法、並びに、該測定法に用いる温度応答性蛍光粒子及び温度応答性蛍光プローブを提供することを課題とする。
本発明者らは、下記式Iで表される蛍光性を有するスクアリン酸誘導体を蛍光分子として合成した。本化合物をゲル－液晶相転移を有する脂質ベシクルに取り込ませると、その蛍光発光は脂質ベシクルがゲル相を示す温度下では観察されず、該脂質ベシクルの分散液を加熱し、液晶相に変換させると強い蛍光発光が現れることを見出し、本発明の温度応答性蛍光粒子を完成させた。そして、この現象の機序を解明し、前記蛍光分子がゲル相のときに凝集により消光し、液晶相のときに解離により蛍光発光することを解明した。さらに、この温度応答性蛍光粒子と機序を基に、前記温度応答性蛍光粒子の表面を生体分子認識素子で修飾した温度応答性蛍光プローブ粒子へ展開し、標的とする生体分子の検出法及び該生体分子の定量法を確立した。
（ただし、Ｒ1及びＲ2は、各々独立し、同一であってもよく又は異なってもよい、疎水性基を表す。）
具体的には、本発明は、少なくとも一種の両親媒性分子（本明細書では、該分子が脂質分子である場合には、「両親媒性脂質分子」とも言う。）を含み構成される分子集合体中に、少なくとも一種の蛍光分子を含む温度応答性蛍光粒子であって、
温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が液相のときに前記蛍光分子が蛍光発光し、固相のときに消光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の蛍光発光と消光とが可逆的に変換する温度応答性蛍光粒子を提供する。前記分子集合体は、好ましくは、単分子膜又は二分子膜を有する。
温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が液相のときに前記蛍光分子が蛍光発光し、固相のときに消光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の蛍光発光と消光とが可逆的に変換する温度応答性蛍光粒子を提供する。前記分子集合体は、好ましくは、単分子膜又は二分子膜を有する。
前記分子集合体は、固相のときに凝集した蛍光分子を有し、液相のときに解離した蛍光分子を有し、
該蛍光分子が下記一般式Aで表される化合物であることを特徴とする、上記記載の温度応答性蛍光粒子。前記分子集合体が脂質二重層を有する分子集合体である場合には、前記固相はゲル相であり、また前記液相は液晶相である。
該蛍光分子が下記一般式Aで表される化合物であることを特徴とする、上記記載の温度応答性蛍光粒子。前記分子集合体が脂質二重層を有する分子集合体である場合には、前記固相はゲル相であり、また前記液相は液晶相である。
本発明の温度応答性蛍光粒子は、前記分子集合体の相転移において、液晶相のときに蛍光分子の解離により蛍光発光し、ゲル相のときに蛍光分子の凝集により消光する場合がある。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、前記蛍光分子が、スクアリン酸誘導体である場合がある。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、前記蛍光分子が下記一般式Ｉで表される化合物である場合がある；
ただし、Ｒ1及びＲ2は、各々独立し、同一であってもよく又は異なってもよい、疎水性基を表す。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、Ｒ1及びＲ2が直鎖飽和炭化水素である場合がある。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、Ｒ1及びＲ2が、n-ブチル基、n-ペンチル基又はn-ヘキシル基から選択される場合がある。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、前記両親媒性分子がリン脂質である場合がある。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、前記分子集合体が二分子膜ベシクル、例えば脂質ベシクルである場合がある。
本発明の温度応答性蛍光粒子において、前記二分子膜ベシクルは、前記一般式Ｉで表される化合物を0.3mol％以上含有する場合がある。
また本発明は、前記温度応答性蛍光粒子の表面を修飾した生体分子認識素子を有する温度応答性蛍光プローブ粒子を提供する。
本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子において、前記生体分子認識素子が抗体又は該抗体の可変領域若しくは該抗体のfab断片である場合がある。
また、本発明は、前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子とを接触させるステップと、該基板を洗浄するステップと、蛍光発光を測定するステップと、を含むことを特徴とする、生体分子の検出又は定量法を提供する。
さらに、本発明は、前記温度応答性蛍光プローブ粒子を、標的生体分子を介した特異的分子認識で熱源に固着させるステップを含み、
熱源から温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導により該温度応答性蛍光粒子の温度が上昇することにより、温度応答性蛍光プローブ粒子が温度に応答してゲル相より液晶相へ相転移し、該相転移により温度応答性蛍光プローブ粒子中の蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を検知するステップを含む、標的生体分子を蛍光発光で検出する生体分子の検出法を提供する。
熱源から温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導により該温度応答性蛍光粒子の温度が上昇することにより、温度応答性蛍光プローブ粒子が温度に応答してゲル相より液晶相へ相転移し、該相転移により温度応答性蛍光プローブ粒子中の蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を検知するステップを含む、標的生体分子を蛍光発光で検出する生体分子の検出法を提供する。
さらに、本発明は、前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子と、熱源とで構成される複合体を形成させるステップと、
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブへの熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブのゲル相から液晶相への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法を提供する。
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブへの熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブのゲル相から液晶相への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法を提供する。
また、本発明は、前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記捕獲用生体分子認識素子と複合体を形成していない温度応答性蛍光プローブを除去するステップと、
前記複合体を構成する温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法を提供する。
前記捕獲用生体分子認識素子と複合体を形成していない温度応答性蛍光プローブを除去するステップと、
前記複合体を構成する温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法を提供する。
前記の生体分子の検出法において、蛍光発光する温度応答性（以下では、「温度感受性」と言うこともある。）蛍光プローブ粒子の数を計数することにより被験試料中の標的生体分子の数を計数する生体分子の定量法を提供する。
本発明の生体分子の定量法において、前記蛍光発光する温度感受性蛍光プローブ粒子の数の計測において、前記被験試料から作製した微小液滴（マイクロドロップレット）中に含まれる1分子の前記標的生体分子によって生じる蛍光発光を検出し、該蛍光発光を有する微小液滴の数を計測する場合がある。あるいは、本発明の生体分子の定量法において、基板（例：マイクロプレート）を用いてカメラで撮像して一挙に蛍光発光のデータを取得してもよい。
本発明の生体分子の定量法において、標的生体分子に対する検出限界が、被験試料１検体当たり標的生体分子1分子である場合がある。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］
少なくとも一種の両親媒性分子を含み構成される分子集合体中に、少なくとも一種の蛍光分子を含む温度応答性蛍光粒子であって、
温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が固相のときに前記蛍光分子が消光し、液相のときに蛍光発光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の消光と蛍光発光とが可逆的に変換することを特徴とする、温度応答性蛍光粒子。
［２］
前記分子集合体は、固相のときに凝集した蛍光分子を有し、液相のときに解離した蛍光分子を有し、 該蛍光分子が下記一般式Aで表される化合物であることを特徴とする、［１］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［１］
少なくとも一種の両親媒性分子を含み構成される分子集合体中に、少なくとも一種の蛍光分子を含む温度応答性蛍光粒子であって、
温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が固相のときに前記蛍光分子が消光し、液相のときに蛍光発光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の消光と蛍光発光とが可逆的に変換することを特徴とする、温度応答性蛍光粒子。
［２］
前記分子集合体は、固相のときに凝集した蛍光分子を有し、液相のときに解離した蛍光分子を有し、 該蛍光分子が下記一般式Aで表される化合物であることを特徴とする、［１］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［３］
前記蛍光分子が下記一般式Ｉで表される化合物であることを特徴とする、［２］に記載の温度応答性蛍光粒子；
前記蛍光分子が下記一般式Ｉで表される化合物であることを特徴とする、［２］に記載の温度応答性蛍光粒子；
ただし、Ｒ1及びＲ2は、各々独立し、同一であってもよく又は異なってもよい、疎水性基を表す。
［４］
前記分子集合体が脂質二重層を有し、温度に応答するゲル－液晶相転移により、前記分子集合体がゲル相のときに前記蛍光分子が消光し、液晶相のときに蛍光発光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の消光と蛍光発光とが可逆的に変換することを特徴とする、［１］～［３］のいずれかに記載の温度応答性蛍光粒子。
［５］
前記両親媒性分子がリン脂質であることを特徴とする［１］～［４］のいずれかに記載の温度応答性蛍光粒子。
［６］
前記分子集合体が二分子膜ベシクルであることを特徴とする［５］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［７］
前記二分子膜ベシクルが脂質ベシクルである、［６］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［８］
前記二分子膜ベシクルは、前記一般式Ｉで表される化合物を0.3mol％以上含有することを特徴とする、［６］又は［７］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載の温度応答性蛍光粒子の表面を修飾した生体分子認識素子を有することを特徴とする、温度応答性蛍光プローブ粒子。
［１０］
前記生体分子認識素子がビオチン、抗体又は該抗体の可変領域若しくは該抗体のfab断片、アプタマーであることを特徴とする、［９］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子。
［１１］
温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度が30℃以下であることを特徴とする、［１］～［１０］のいずれかに記載の温度応答性蛍光プローブ粒子。
［１２］
（１）［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップと、
（２）該基板を加熱するステップと、
（３）蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、該生体試料中に含まれる生体分子の検出又は定量法。
［１３］
（１）［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子とを接触させるステップと、
（２）該基板を洗浄するステップと、
（３）蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出又は定量法。
［１４］
温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度が30℃以下であることを特徴とする、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記ステップ（１）が、［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体分子認識素子を認識する素子と、検出用生体分子認識素子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップである、［１２］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである、［１５］に記載の方法。
［１７］
［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子と、熱源とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブ粒子の固相（ゲル相を含む。以下同様。）から液相（液晶相を含む。以下同様。）への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出法。
［１８］
［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記捕獲用生体分子認識素子と複合体を形成していない温度応答性蛍光プローブ粒子を除去するステップと、
前記複合体を構成する温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出法。
［１９］
［１７］又は［１８］に記載の生体分子の検出法において、蛍光発光する温度応答性蛍光プローブ粒子の数を計数することにより被験試料中の標的生体分子の数を計数することを特徴とする、生体分子の定量法。
［２０］
［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子を含む、生体分子の検出又は測定用キット。
［２１］
捕獲用生体分子認識素子を含む、［２０］に記載のキット。
［２２］
捕獲用生体分子認識素子が基板に固定されていることを特徴とする、［２１］に記載のキット。
［２３］
検出用生体分子認識素子を含む、［２１］又は［２２］に記載のキット。
［２４］
生体分子認識素子を認識する素子を含む、［２０］～［２３］のいずれかに記載のキット。
［２５］
生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである、［２０］～［２４］のいずれかに記載のキット。
［２６］
洗浄液を含む、［２０］～［２５］のいずれかに記載のキット。
［４］
前記分子集合体が脂質二重層を有し、温度に応答するゲル－液晶相転移により、前記分子集合体がゲル相のときに前記蛍光分子が消光し、液晶相のときに蛍光発光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の消光と蛍光発光とが可逆的に変換することを特徴とする、［１］～［３］のいずれかに記載の温度応答性蛍光粒子。
［５］
前記両親媒性分子がリン脂質であることを特徴とする［１］～［４］のいずれかに記載の温度応答性蛍光粒子。
［６］
前記分子集合体が二分子膜ベシクルであることを特徴とする［５］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［７］
前記二分子膜ベシクルが脂質ベシクルである、［６］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［８］
前記二分子膜ベシクルは、前記一般式Ｉで表される化合物を0.3mol％以上含有することを特徴とする、［６］又は［７］に記載の温度応答性蛍光粒子。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載の温度応答性蛍光粒子の表面を修飾した生体分子認識素子を有することを特徴とする、温度応答性蛍光プローブ粒子。
［１０］
前記生体分子認識素子がビオチン、抗体又は該抗体の可変領域若しくは該抗体のfab断片、アプタマーであることを特徴とする、［９］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子。
［１１］
温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度が30℃以下であることを特徴とする、［１］～［１０］のいずれかに記載の温度応答性蛍光プローブ粒子。
［１２］
（１）［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップと、
（２）該基板を加熱するステップと、
（３）蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、該生体試料中に含まれる生体分子の検出又は定量法。
［１３］
（１）［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子とを接触させるステップと、
（２）該基板を洗浄するステップと、
（３）蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出又は定量法。
［１４］
温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度が30℃以下であることを特徴とする、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記ステップ（１）が、［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体分子認識素子を認識する素子と、検出用生体分子認識素子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップである、［１２］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである、［１５］に記載の方法。
［１７］
［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子と、熱源とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブ粒子の固相（ゲル相を含む。以下同様。）から液相（液晶相を含む。以下同様。）への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出法。
［１８］
［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記捕獲用生体分子認識素子と複合体を形成していない温度応答性蛍光プローブ粒子を除去するステップと、
前記複合体を構成する温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出法。
［１９］
［１７］又は［１８］に記載の生体分子の検出法において、蛍光発光する温度応答性蛍光プローブ粒子の数を計数することにより被験試料中の標的生体分子の数を計数することを特徴とする、生体分子の定量法。
［２０］
［９］又は［１０］に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子を含む、生体分子の検出又は測定用キット。
［２１］
捕獲用生体分子認識素子を含む、［２０］に記載のキット。
［２２］
捕獲用生体分子認識素子が基板に固定されていることを特徴とする、［２１］に記載のキット。
［２３］
検出用生体分子認識素子を含む、［２１］又は［２２］に記載のキット。
［２４］
生体分子認識素子を認識する素子を含む、［２０］～［２３］のいずれかに記載のキット。
［２５］
生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである、［２０］～［２４］のいずれかに記載のキット。
［２６］
洗浄液を含む、［２０］～［２５］のいずれかに記載のキット。
本発明により、簡便で、短時間で低濃度の標的生体分子（バイオマーカー）を検出できる測定法、並びに、該測定法に用いる温度応答性蛍光粒子及び温度応答性蛍光プローブ粒子を提供できる。より具体的には、本発明では、従来の蛍光プローブ粒子と異なり、温度応答性蛍光プローブ粒子では消光状態と発光状態の変換温度を調節できる。よって、各種の検出デバイス、検出器、測定条件に適した温度で応答する蛍光プローブ粒子を提供でき、本発明は簡便、迅速、高感度な生体分子の検出法及び定量法として幅広い用途で実施できる。
１．温度応答性蛍光粒子
本発明の実施形態の１つは、温度応答性蛍光粒子である。
本発明の実施形態の１つは、温度応答性蛍光粒子である。
温度応答性蛍光粒子は、少なくとも一種の両親媒性分子を含み構成される分子集合体中に、少なくとも一種の蛍光分子を含む。即ち、本発明は、熱転移（即ち、固相から液相への転移、あるいはゲル相から液晶相への転移）に伴って蛍光分子の凝集による消光状態が解離して発光状態になるとの現象を利用したものである。よって、本発明で用いる温度応答性蛍光粒子は、分子集合体形態を保ったまま、固相状態から液相状態に相転移が起こるものであれば特に制限なく用いることができる。前記分子集合体は、好ましくは、単分子膜又は二分子膜を有する、より好ましくは、前記分子集合体は、脂質二分子膜（脂質二重層とも言う。）を有する。本発明者らは、蛍光分子を担持する単分子膜エマルジョンを作製したところ、大部分の蛍光分子（SQR22）が疎水部に取り込まれ、蛍光発光が認められることも確認している（データは示さず）。
前記両親媒性分子（例：脂質分子）は、生体由来の脂質に限定されるものではなく、半合成、合成により製造されるリン脂質などの低分子やその誘導体、高分子、ペプチド、アミノ酸、カルボン酸などを原料として合成により製造できる両親媒性分子を含む。
前記温度応答性蛍光粒子は、温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が液相のときに前記蛍光分子が解離して蛍光発光し、固相のときに凝集して消光し、これにより、温度に応答して蛍光分子の蛍光発光と、消光とを可逆的に変換することができる。
すなわち、下記実施例で詳細に記載するように、前記分子集合体は、温度に応答する固相－液相転移を示し、液相のときに解離した蛍光分子を有し蛍光発光し、固相のときに凝集した蛍光分子を有し凝集起因消光（aggregation-caused quenching）により消光する。前記分子集合体が脂質二重層を有する分子集合体である場合には、前記固相はゲル相であり、また前記液相は液晶相である。
前記蛍光分子は、水相中で分子集合状態となって構築される疎水性の領域、例えば、単分子膜で囲まれた領域、あるいは脂質二分子膜などの二分子膜中、に配置されるため、両親媒性ないし脂溶性の蛍光分子が好適である。通常、蛍光分子は凝集により消光する性質を有しているので、固相－液相転移（例えば、脂質二分子膜のゲル－液晶相転移）に応答して凝集と解離を示す蛍光分子であれば、消光と発光を変換できる。
該蛍光分子の例として、下記一般式Aで表される化合物を挙げることができる。
生体分子には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビン類、タンパク質、アミノ酸など、600 nm以下の波長の光を吸収して600 nm以下の波長の蛍光（自家蛍光）を発光するものがある。このため、生体分子の検出に最大吸収波長と最大蛍光発光波長が600 nm以下の蛍光プローブを使うと、蛍光測定において夾雑分子の自家蛍光による干渉が問題となる場合がある。よって、本発明の一般式（A）で表される化合物は、最大吸収波長と最大蛍光発光波長が600 nm以上にある蛍光分子であることが望ましく、さらに980 nm以上の波長の光を水に照射すると水の吸収による発熱が温度応答性粒子に作用することを考慮すると、最大吸収波長と最大蛍光発光波長が600～900 nmの範囲にある蛍光分子であることがより望ましい。
前記蛍光分子の前記式（A）の化合物のより具体的な例としては、スクアリン酸誘導体を挙げることができる。
前記スクアリン酸誘導体の例としては、下記一般式Ｉで表される化合物を挙げることができる；
ただし、Ｒ1及びＲ2は、各々独立し、同一であってもよく又は異なってもよい、疎水性基を表す。
一般式A又は一般式Iで表される化合物は、フリー体だけでなく、その塩も包含されるものとする。係る塩は化合物の種類によって異なるが、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基塩などの塩基付加塩、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩が挙げられる。
前記スクアリン酸誘導体において、Ｒ1及びＲ2は、直鎖炭化水素であってもよく、分岐鎖炭化水素であってもよく、また、飽和炭化水素であってもよく、不飽和炭化水素であってもよい。好ましくは、直鎖飽和炭化水素を挙げることができるが、前記分子集合体の液晶相で前記蛍光分子が解離し、ゲル相で凝集する限りこれに限定されない。
Ｒ1及びＲ2のより具体的な例としては、例えば、炭素数２～１０の炭化水素基が挙げられ、より具体的には、n-ブチル基、n-ペンチル基又はn-ヘキシル基から選択することができるが、前記分子集合体の液晶相で解離し、ゲル相で凝集する限りこれに限定されない。
前記両親媒性分子の例としては、リン脂質を挙げることができる。
リン脂質の種類に特に限定はないが、グリセロリン脂質（ジアシル型リン脂質とも言う。）が好ましく、特に相転移を示す安定な脂質二分子膜を形成するには、親水部にホスホコリン基を有するジアシル型リン脂質が好ましい。ジアシル型リン脂質のアシル鎖長は同じであっても異なっていても良い。ホスホコリン基を有するジアシル型リン脂質には、飽和リン脂質および不飽和リン脂質が含まれ、本発明ではいずれのものでも使用でき、また、これらを組み合わせて用いてもよい。飽和ホスホコリンは、合成、半合成、例えば100％に近い水添率の水添卵黄レシチン、水添大豆レシチンなどの天然系リン脂質及びその誘導体、また、ジミリストイルホスホコリン、ジペンタデカノイルホスホコリン、ジパルミトイルホスホコリン、ジヘプタデカノイルホスホコリン、ジステアロイルホスホコリン等を用いることができる。
そして、前記分子集合体の例として、単分子膜（単層とも言う。）で囲まれた疎水性コアを有するエマルジョンや脂質ナノ粒子、球殻状に閉じた膜構造を有する小胞であるベシクルを挙げることができる。かかるベシクルとしては、脂質二分子膜ベシクル（リポソームとも言う。）を挙げることができるが、これに限定されない。本発明の温度応答性蛍光粒子として使用できる、すなわち、前記分子集合体として使用可能な粒子は、特定の温度で固相－液相転移又はゲル－液晶相転移する分子集合体である限り、多重層若しくは単層、又は、粒子径等によって限定されない。
脂質ベシクルなどの分子集合体の凝集や融合を防止するため、親水部に荷電残基や高分子鎖をもつ両親媒性分子を構成成分に含ませることができる。こうして得られる脂質ベシクルなどの分子集合体は、電荷による静電反発や高分子鎖による立体排除効果により高い分散安定性を有している。
荷電残基をもつ両親媒性分子の例として、該分子が脂質分子の場合には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸を親水部に有するアニオン性リン脂質やL-glutamic acid, N-(3-carboxy-1-oxopropyl)-, 1,5-dihexadecyl ester（SA）などのカルボン酸型脂質、アミノ酸を親水基に有するアミノ酸型脂質が挙げられる。
また、高分子鎖をもつ両親媒性分子の例として、該分子が脂質分子の場合には、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-monomethoxy poly(ethylene glycol)が挙げられる。Poly(ethylene glycol)の分子量に制限はないが、脂質ベシクルの凝集を防止するには1000～5000の分子量が好ましい。
また、両親媒性分子として、該分子が脂質分子の場合には、1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC14）、1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC15）（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC17)（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC18）、1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC16（DPPCとも言う。））、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)、1,5-dihexadecyl-N-succiny-L-glutamate（DHSG）、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（DSPE）などを用いることもできる。
前記脂質ベシクルなどの分子集合体における蛍光分子の凝集起因消光は、該分子集合体中の濃度に依存し、蛍光分子の濃度の低下に伴って、凝集起因消光も低下する。そこで、本発明の温度応答性蛍光粒子は、前記一般式Ｉで表される化合物を0.3mol％以上、好ましくは0.7mol％以上、より好ましくは1.0mol％以上の濃度で含有する。
係る温度応答性蛍光粒子の製造は、前記分子集合体の製造の際に前記式Iの化合物を共存させることによって取得することができる。分子集合体の製造の例としては、公知の脂質ベシクルの製造方法に従って製造することができる（Sheng Dong et al, ACS Appl. Nano Mater. 2018, 1, 1009-1013）。
本発明の温度応答性蛍光粒子は、下記の温度応答性蛍光プローブ粒子の製造に利用できる。
２．温度応答性蛍光プローブ粒子
本発明のもう1つの実施形態は温度応答性蛍光プローブ粒子である。
本発明のもう1つの実施形態は温度応答性蛍光プローブ粒子である。
前記温度応答性蛍光プローブ粒子は、温度応答性蛍光粒子の表面を生体分子認識素子で修飾することにより取得できる。本明細書において、「素子」とは、特定の機能、例えば、生体分子認識機能など、を発揮する分子を意味し、「素子」と「分子」との用語は互換的に用いることができる。また、本明細書において、「認識」とは、標的の分子を認識し、該分子に結合すること意味する。さらに、「生体分子認識素子」は、それ自体が直接生体分子を認識するものだけでなく、他の分子や分子複合体（例：ストレプトアビジンと、生体分子を認識するビオチン化抗体との複合体等）との結合を介して、間接的に生体分子を認識するものも包含されるものとする。
前記生体分子認識素子の例として、抗体又は該抗体の可変領域若しくは該抗体のfab断片（以下、「抗体等」と記載）を挙げることができる。本明細書において、係る素子、例えば抗体等は、下記で説明するように「検出用生体分子認識素子」と言い、素子が抗体等の場合には、「検出抗体」とも言う。
一方、標的生体分子を測定容器底面等に固着する目的で、標的生体分子の別のエピトープに対する素子、例えば抗体等を使用する場合がある。本明細書において、かかる素子を、「捕獲用生体分子認識素子」と言い、素子が抗体等の場合には、「捕獲抗体」とも言う。
前記生体分子認識素子は、検出又は測定対象とする標的生体分子と結合することにより、標的生体分子と前記温度応答性蛍光粒子との複合体を形成することができる。
従来技術であるサンドイッチELISA法で使用されるように、前記生体分子認識素子として抗体を使用する場合、同一抗原の異なるエピトープに対して結合する検出抗体と捕獲抗体の２種類の抗体を使用する。検出抗体は、該抗体を介して抗原と温度応答性蛍光粒子とを結合させる。捕獲抗体はウェル等の測定容器の底面等に固定することにより被験対象である標的生体分子を測定容器の底面等に捕獲し、固着させる役割を有する。
サンドイッチELISA法と同様に、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子において、検出抗体を前記温度応答性蛍光粒子に結合させるための抗体として、また、捕獲抗体をウェル等の測定容器の底面等に標的生体分子を固着させるための抗体として使用する。
すなわち、前記生体分子認識素子が抗体のとき、(a) 前記温度応答性蛍光粒子と検出抗体とで構成される温度応答性プローブ粒子、(b) 検出抗体と捕獲抗体の抗原である標的生体分子、(c) ウェル等の測定容器の底面に固定された捕獲抗体とが、温度応答性蛍光プローブ粒子（検出抗体が膜表面に修飾された温度応答性蛍光粒子）－標的生体分子（抗原）－捕獲抗体－測定容器の複合体を形成するときに、温度応答性蛍光プローブ粒子は測定容器底面に固着された状態となる。この状態で、測定容器底面を加温すると、測定容器底面からの熱伝導により前記複合体の温度は速やかに上昇する。このとき複合体中の温度応答性蛍光プローブ粒子が固相から液相に相転移することにより、固相では凝集し消光していた温度応答性蛍光粒子中の蛍光分子が解離し、蛍光発光する。一方、被験試料中に標的生体分子、すなわち抗原が存在しないとき、前記複合体は形成されない。そこで、温度応答性蛍光プローブ粒子は測定容器底面に固着することはできず、測定容器底面を加熱しても、溶媒を介した熱伝達による緩徐な昇温に留まるため、固相の状態をより長時間維持し、消光状態を維持する。
本明細書において、「熱源」とは、熱を発生させる装置（例：サーモプレート、ホットプレート、ウォーターバス等）、該装置により発生した熱を受け取ることで間接的に熱を発生させる物質（例：捕獲用生体分子認識が固定された基板等）、及び熱を発生させる仕組み（例：加温等）を意味する。また、温度応答性蛍光プローブ粒子を昇温させる熱源として、上記のウェル底面の加温以外として、例えば、金ナノ粒子等の金属粒子や磁気ビーズ等を利用できる。例えば、金ナノ粒子の場合、レーザー照射により光熱変換が惹起され発熱し、磁気ビーズの場合、交流磁場を照射することにより誘導加熱することができ、熱源として使用できる。これらの熱源に前記温度応答性蛍光プローブ粒子を標的生体分子との結合を利用して固着させ、そこで、温度応答性蛍光プローブ粒子－標的生体分子と熱源との複合体を形成させ、レーザー又は交流磁場の照射により熱源を加熱すると、速やかに前記温度応答性蛍光粒子は昇温し、液相を形成し、蛍光発光する。そこで、金属粒子や磁気ビーズを含む被験試料の微小液滴を使用することにより、微小液滴中の標的生体分子の検出に利用できる。
ポアソン分布に従うと、微小液滴1個につき平均して５個の温度応答性蛍光プローブ粒子と熱源が内包される設定にすることで、99％以上の微小液滴に少なくとも1個以上の温度応答性蛍光プローブ粒子と熱源が内包される。大きさや形状にもよるが、温度応答性蛍光プローブ粒子１個には数千から数万分子の蛍光分子が含まれており、標的生体分子1分子を温度応答性蛍光プローブ粒子1個に含まれる数千から数万分子の蛍光分子で増幅して検出できるので、高感度で標的生体分子を検出する分子検出法として使用することができる。
本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子、すなわち、上記の表面が生体分子認識素子で修飾された温度応答性蛍光粒子は、公知の方法に従って、検出抗体で修飾された脂質ベシクルを製造し、取得することができる（国際公開パンフレットWO2000/064413、特開2003-73258号公報、特開昭58-134032号公報、Manjappa S. A., et al, J. Controlled Release 2011, 150, 2-22、Li T., et al, Nanomed.: Nanotechnol. Biol. Medicine, 2017, 13, 1219-1227）。
従来技術であるELISA法の測定操作では、標的生体分子に結合した抗体－酵素コンジュゲートと、標的生体分子に結合しなかった抗体－酵素コンジュゲートとを分離する操作、及び／又は、標的生体分子に結合しなかった抗体－酵素コンジュゲートとを洗浄する操作を必要とする。一方、本発明は、標的生体分子のエピトープに対する抗原－抗体反応を利用して熱源近傍に固着した温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導による速やかな昇温と、標的生体分子に結合していない温度応答性蛍光粒子に対した溶媒を介した熱伝達による緩徐な温度変化の差を利用するため、ELISA法で必要な分離操作や洗浄操作を行うことなく、蛍光発光強度を測定することで、簡便、短時間かつ高感度で標的生体分子を検出できる。
一方、サンドイッチELISA法は、すでに各種生体分子に対する測定キットが商業的に利用されている。すなわち、測定容器としてのウェルの底面等に捕獲抗体が固定された測定用マイクロウェルプレートや検出抗体がキットに含まれる。そこで、例えば、このような商業的に利用可能なサンドイッチELISA測定キットを利用することができる。本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子を作製し、このようなキットに含まれる検出抗体や、捕獲抗体がウェル底面等に固定されたマイクロウェルプレート等を入手すれば、本発明を実施することができる。
また、サンドイッチELISA法では、マイクロウェルプレートのウェルの底面に固定させた捕獲抗体と、抗原（標的生体分子）と、ビオチン化された検出抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジンとの複合体を形成させることにより抗原を測定する測定キットが商業的に利用できる（図１２Ａ参照）。そこで、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子として、表面をビオチンで標識した温度応答性蛍光粒子を製造し、マイクロプレートのウェルの底面に固定させた捕獲抗体と、抗原（標的生体分子）と、ビオチン化された検出抗体と、ストレプトアビジンと、該表面をビオチンで標識した温度応答性蛍光粒子とを混合し，これらの複合体を形成させ、マイクロプレートのウェル底面を熱源で加熱し、温度応答性蛍光粒子を速やかに相転移させて蛍光発光させることにより、被験試料中の抗原（標的生体分子）を測定することができる（図１２Ｂ参照）。すなわち、この場合の生体認識素子としては、検出抗体単独ではなく、温度応答性蛍光粒子の表面を修飾したビオチン－ストレプトアビジン－ビオチン化検出抗体の複合体と言える。あるいは、マレイミド末端ポリエチレングリコール型脂質を導入することにより脂質ベシクルの表面をマレイミド基にて修飾し、検出抗体をペプシン処理後還元して得られた断片化抗体であるFab’のチオール基を反応させることによって作製された複合体も、温度応答性蛍光脂質ベシクル－断片化検出抗体の複合体と言える。このように、生体認識素子として、抗体単独に限定されることはなく、また、ビオチン－ストレプトアビジンに限定されることもなく、分子認識等により強い結合性を有する複合体を形成する各種の分子を利用することによって、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子を製造し、使用することができる。
分子認識による複合体形成に利用できる分子種として、例えば、糖鎖とレクチンの組み合わせ、核酸の相補的塩基配列、受容体とリガンド分子の組み合わせ、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーを挙げることができるが、これらに限定されない。
３．生体分子の検出又は定量法
本発明のもう１つの実施形態は、標的とする生体分子の検出又は定量法である。かかる生体分子の検出又は定量法は、従来の検出法、例えばエンドサイトーシスや膜融合により、蛍光プローブ粒子や、該粒子に含まれる蛍光分子を細胞膜へと輸送し、細胞を検出する方法や、蛍光分子が蛍光プローブ粒子から放出されることにより生じる蛍光を検出する方法など、とは全く異なる。
本発明のもう１つの実施形態は、標的とする生体分子の検出又は定量法である。かかる生体分子の検出又は定量法は、従来の検出法、例えばエンドサイトーシスや膜融合により、蛍光プローブ粒子や、該粒子に含まれる蛍光分子を細胞膜へと輸送し、細胞を検出する方法や、蛍光分子が蛍光プローブ粒子から放出されることにより生じる蛍光を検出する方法など、とは全く異なる。
上記で説明のとおり、上記温度応答性蛍光プローブ粒子及び温度応答性蛍光粒子は、分離操作や洗浄操作を行うことなく、蛍光発光を測定することで、短時間、簡便かつ高感度で標的生体分子を検出又は測定できる。あるいは、加熱ではなく洗浄操作により、生体分子を検出又は定量することもできる。また、被験試料を微小液滴化することにより、標的生体試料の分子検出法としても利用できる。
従って、本発明は、（１）上記２．に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップと、（２）該基板を加熱するステップと、（３）蛍光発光を測定するステップと、を含むことを特徴とする、該生体試料中に含まれる生体分子の検出又は定量法を提供する。
また、ステップ（１）に用いる温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度（該プローブ粒子が脂質二重層を有する分子集合体である場合には、「ゲル－液晶相転移温度」とも言う。）が、本発明を実施する際に相転移温度が室温以下である粒子を用いることで、上記ステップ（２）を行うことなく、単に基板を洗浄して捕獲用生体分子認識素子に結合していない温度応答性蛍光プローブ粒子を除去することにより、生体分子を検出又は測定することもできる。従って、別の実施態様において、本発明は、（１’）上記２．に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子とを接触させるステップと、（２’）該基板を洗浄するステップと、（３’）蛍光発光を測定するステップと、を含むことを特徴とする、生体分子の検出又は定量法を提供する。かかる方法で用いる温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度は、取り扱いの容易性からは、30℃以下であることが好ましく、25℃以下であることがより好ましく、20℃以下であることがさらに好ましく、15℃以下（例：10℃、5℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-22℃又はそれ以下）であることがさらにより好ましい。下述の実施例で示す通り、両親媒性分子の疎水性基の長さや不飽和度、種類、該分子の組み合わせを適宜調節することで、所望の固相－液相転移温度となる温度応答性蛍光プローブ粒子を作製することができる。
また、上記ステップ（１）の前に、温度応答性蛍光プローブ粒子の固相－液相転移温度を設定するステップ、及び／又は該設定温度となるような温度応答性蛍光プローブ粒子を製造するステップを行ってもよい。固相－液相転移温度は、実験を行う際の室温に基づき、固相－液相転移温度が室温以下となるような温度を適宜設定することができる。
本発明の生体分子の検出又は定量法に用いる温度応答性蛍光プローブ粒子の濃度は、特に限定されないが、捕獲用生体分子認識素子の接触時において、該プローブ粒子が、溶液中に1.0μg/ml以上、より好ましくは2.0μg/ml以上、さらに好ましくは5.0μg/ml以上の濃度で含まれていることが好ましい。
本発明に用いる基板としては特に限定されず、例えば、ポリスチレンなどのポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、ガラスフィルターなどの不溶性基板を挙げることができる。取り扱いの容易性からは、好ましくは、マイクロプレートである。
上記本発明の生体分子の検出又は定量法に用いる生体試料としては、例えば、動物又は細胞から採取した試料が挙げられる。また、前記試料は、標的の生体分子を含むことが既知の試料であってもよいし、標的の生体分子が含まれるか不明な試料であってもよい。かかる動物又は細胞としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどの哺乳動物又は該動物に由来する細胞が挙げられる。動物由来の試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、脳脊髄液、組織間液、及びリンパ液などが挙げられ、好ましくは血液、血清又は血漿である。これらの試料は、自体公知の方法により得ることができ、例えば、血清や血漿は、常法に従って被検動物から採血し、液性成分を分離することにより調製することができ、脳脊髄液は、脊椎穿刺等の公知の手段により採取することができる。
上記ステップ（１）又は（１’）において、上記２．に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させる方法は特に限定されない。例えば、生体試料を含む溶液と、温度応答性蛍光プローブ粒子とを、この順に基板上に添加することにより行うことができるが、この方法に限定されない。あるいは、あらかじめ生体試料と温度応答性蛍光プローブとを混合して作製した溶液を、基板上に添加してもよい（即ち、生体試料と温度応答性蛍光プローブとを同時に基板に接触させてもよい）。上記接触の際の条件としては、特に制限されないが、通常０～４５℃の温度下で接触させ、好ましくは０～４０℃の温度下で接触させ、より好ましくは４～３７℃の温度下で、さらに好ましくは２５℃～３７℃の温度下で接触させる。また、接触させる時間としても特に制限はないが、典型的には６時間以下であり、好ましくは２時間以下、より好ましくは１時間以下である。また、接触時間の下限も特に制限されないが、典型的には1０秒以上、好ましくは１分以上、より好ましくは１０分以上である。
また、上記２．の温度応答性蛍光プローブ粒子が有する生体分子認識素子（例：ビオチン等）と同一のものを、検出用生体分子認識素子付加することで、該生体分子認識素子を認識する素子（例：ストレプトアビジン等）を介して、温度応答性蛍光プローブ粒子と、検出用生体分子認識素子とを結合させてもよい。従って、一態様において、上記ステップ（１）又は（１’）が、上記２．に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体分子認識素子を認識する素子と検出用生体分子認識素子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップであってもよい。接触方法については、上記で記載の方法と同様に行うことができる。例えば、生体試料を含む溶液と、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子及び温度応答性蛍光プローブ粒子を含む溶液とを、この順に基板上に添加することにより行うことができるが、この順番に限定されない。また、検出用生体分子認識素子と、生体分子認識素子を認識する素子と、温度応答性蛍光プローブ粒子を、別々に捕獲用生体分子認識素子と接触させてもよい。あるいは、あらかじめ生体試料、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子及び温度応答性蛍光プローブを混合して作製した溶液を、基板上に添加してもよい（即ち、生体試料、温度応答性蛍光プローブ生体分子認識素子を認識する素子及び検出用生体分子認識素子を同時に基板に接触させてもよい）。本方法の模式図を、図１５Ａ～１５Ｃとして示す。かかる方法により、図１５Ｃに示すように、１つの生体分子に対して複数の温度応答性蛍光プローブ粒子が結合することになり、検出感度を向上させることが可能となる。好ましい態様において、上記生体分子認識素子はビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子は、ストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。
上記ステップ（２）において、基板の加熱方法は、例えば、基板を所望の温度に設定したサーモプレート又はホットプレート上又はウォーターバス中に静置する方法や、上述した通り、温度反応性蛍光プローブ粒子又は捕獲用生体分子認識素子に金ナノ粒子を結合させ、該金ナノ粒子にレーザーを照射することにより行うこともできるが、これらの方法に限定されない。
前記ステップ（２）は、例えば、温度応答性蛍光プローブ粒子と生体試料とを含む溶液を、洗浄液と入れ替える、必要であれば該洗浄液を別の洗浄液に１回以上入れ替える、ことにより行うことができるが、この方法に限定されない。前記洗浄液としては、例えば、緩衝液を用いることができ、該緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、マッキルベイン緩衝液や、これらに非イオン性界面活性剤（例：Tween 20等）を含む溶液（例：PBS-T等）などが挙げられる。
さらには、本発明の生体分子の検出法は、
前記温度応答性蛍光プローブ粒子を、標的生体分子を介した特異的分子認識で熱源に固着させるステップ、及び、
熱源から温度応答性蛍光粒子への熱伝導により該温度応答性蛍光粒子の温度が上昇することにより、温度応答性蛍光プローブ粒子が温度に応答して固相より液相へ相転移し、該相転移により温度応答性蛍光プローブ粒子中の蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を検知するステップ、
を含む操作により実施することができる。
前記温度応答性蛍光プローブ粒子を、標的生体分子を介した特異的分子認識で熱源に固着させるステップ、及び、
熱源から温度応答性蛍光粒子への熱伝導により該温度応答性蛍光粒子の温度が上昇することにより、温度応答性蛍光プローブ粒子が温度に応答して固相より液相へ相転移し、該相転移により温度応答性蛍光プローブ粒子中の蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を検知するステップ、
を含む操作により実施することができる。
換言すると、本発明の生体分子の検出法は、
前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子と、熱源とで構成される複合体を形成させるステップと、
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブ粒子の固相から液相への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法である。
前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子と、熱源とで構成される複合体を形成させるステップと、
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブ粒子への熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブ粒子の固相から液相への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法である。
あるいは、
前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記捕獲用生体分子認識素子と複合体を形成していない温度応答性蛍光プローブを除去するステップと、
前記複合体を構成する温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法であってもよい。
前記温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記捕獲用生体分子認識素子と複合体を形成していない温度応答性蛍光プローブを除去するステップと、
前記複合体を構成する温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光発光を測定するステップと、
を含む、生体分子の検出法であってもよい。
このとき、温度応答性蛍光プローブ粒子としては、生体分子認識素子を直接表面修飾した前記温度応答性蛍光粒子だけではなく、例えば、ビオチン－ストレプトアビジンの強い結合性を利用して、表面をビオチン化した温度応答性蛍光粒子を使用して、ビオチン化温度応答性蛍光粒子－ストレプトアビジン－検出抗体との複合体を形成させることにより、温度応答性蛍光プローブ粒子として利用することも可能である。あるいは、マレイミド末端ポリエチレングリコール型脂質を導入することにより脂質ベシクルの表面をマレイミド基にて修飾し、検出抗体をペプシン処理後還元して得られた断片化抗体であるFab’のチオール基を反応させることによって、温度応答性蛍光脂質ベシクル－断片化検出抗体を形成させることにより、温度応答性蛍光プローブ粒子として利用することも可能である。
蛍光発光の検出又は測定方法に特に限定はないが、一般的な光ファイバ型蛍光検出器、マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、カメラ（例：CCDカメラ等）を備えた検出器（例：Celvin等）などを用いれば検出又は測定できる。また、ELISA法での方法と同様に、標的の生体分子の濃度が既知の試料（標準品）を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて、生体試料中の生体分子の濃度を定量することもできる。さらに、以下に記載の生体分子の定量法により定量することもできる。即ち、本発明の生体分子の検出法は、生体分子の定量法として応用できる。
４．生体分子の定量法
本発明のもう１つの実施形態は、生体分子の定量法である。
本発明のもう１つの実施形態は、生体分子の定量法である。
上記の生体分子の検出法において、蛍光発光する温度感受性蛍光プローブ粒子の数を計数することにより被験試料中の標的生体分子の数を計数する生体分子の定量法（絶対定量法）として実施できる。
温度感受性蛍光プローブ粒子1個には数千～数万の蛍光分子が含まれており、粒子1個の蛍光は数千～数万の蛍光分子の発光強度を有しているので、通常の高感度検出器にて検出できる。
標的生体分子１分子で温度感受性蛍光プローブ粒子１個と熱源が複合体を形成する濃度条件では、蛍光発光する温度感受性蛍光プローブ粒子の数が標的生体分子の数に対応する。
この計数には、例えばマイクロ流体デバイスを用いて作成される微小液滴に温度感受性蛍光プローブ粒子、熱源、標的生体分子を封入して、蛍光発光する微小液滴の数として計数できる。この場合、各微小液滴に標的生体分子が1分子ないし存在しない濃度条件が対象となる。
同様に、マイクロアレイに温度感受性蛍光プローブ粒子、熱源、標的生体分子を注入して、各アレイに標的生体分子が1分子ないし存在しない濃度条件であれば、蛍光発光が検出されるアレイの数を計数することで、標的生体分子の数を計数することもできる。
蛍光の検出方法に特に限定はないが、一般的な光ファイバ型蛍光検出器、マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、高感度カメラなどを用いれば検出できる。
すなわち、本発明の生体分子の定量法において、標的生体分子に対する検出限界が、被験試料１検体当たり標的生体分子1分子であると言うことができる。
また、標的生体分子の濃度が既知の標準液を上記「生体分子の検出法」に記載の方法で蛍光強度を測定することにより検量線を作成し、被験試料に対して同様の操作で取得される蛍光強度を前記検量線に適用することにより、被験試料に含まれる標的生体分子の濃度を求めることができる（相対定量）。
本発明の定量法は、温度応答性蛍光プローブ粒子を利用するため、ELISA法で必要な分離操作や洗浄操作を行う必要はなく、標的生体分子に対する、簡便、迅速かつ高感度な定量法として実施できる。
５．温度応答性蛍光プローブ粒子を含むキット
別の態様において、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子を含む、生体分子の検出又は測定用キットを提供する。本発明のキットには、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子に加えて他の試薬等が含まれていてもよく、これらの試薬等は、あらかじめ上記温度応答性蛍光プローブ粒子と一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。試薬等としては、捕獲用生体分子認識素子、捕獲用生体分子認識素子が固定された基板、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子、洗浄液、生体分子の濃度が既知の標準品、陽性対照、陰性対照、プロトコルを記載した指示書などが挙げられる。これらの試薬等は、必要に応じてあらかじめ混合しておくこともできる。上記捕獲用生体分子認識素子、該素子が固定された基板、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子、洗浄液、生体分子の濃度が既知の標準品についての具体例は、上記１．～２．で記載した通りである。好ましい一態様において、生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。
別の態様において、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子を含む、生体分子の検出又は測定用キットを提供する。本発明のキットには、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子に加えて他の試薬等が含まれていてもよく、これらの試薬等は、あらかじめ上記温度応答性蛍光プローブ粒子と一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。試薬等としては、捕獲用生体分子認識素子、捕獲用生体分子認識素子が固定された基板、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子、洗浄液、生体分子の濃度が既知の標準品、陽性対照、陰性対照、プロトコルを記載した指示書などが挙げられる。これらの試薬等は、必要に応じてあらかじめ混合しておくこともできる。上記捕獲用生体分子認識素子、該素子が固定された基板、検出用生体分子認識素子、生体分子認識素子を認識する素子、洗浄液、生体分子の濃度が既知の標準品についての具体例は、上記１．～２．で記載した通りである。好ましい一態様において、生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである。
上記キットに含まれる捕獲用生体分子認識素子は、あらかじめ基板に固定されていることが好ましい。かかる基板の具体例は、上記３．に記載した通りである。
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
（実施例１）蛍光色素(SQR22)の合成
スクアリン蛍光色素(SQR22)の合成法をスキーム1に示す。
スクアリン蛍光色素(SQR22)の合成法をスキーム1に示す。
まず、前駆体N,N-ジブチルアニリン1及び塩化スクアリル2を、既報に従い合成した（Li F., et al. Chem. Eur. J. 20, 9991-9997 (2014)； Easwaran A., et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 6590-6598）。1と2をトルエン還流下で６時間反応させ塩化物中間体を得た。この塩化物中間体を5N塩酸 酢酸/水 (1/1) 混合溶媒中で加水分解して化合物３を得た。既報に従いインドリウム塩4を合成した（Liu D., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 4103-4107）。化合物3と4をn-ブタノール/トルエン（１：１混合溶液）還流下で反応させて化合物5を得た。室温下、THF中でNatOBuを用いて化合物５を加水分解してSQR22を得た。NMR及び質量分析によりSQR22の構造を同定した。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, δ ppm): 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 6H, -CH3); 1.25-1.35 (m, 4H, -CH2-); 1.41 (s, 6H, -CH3); 1.50-1.57 (m, 4H, -CH2-); 3.27-3.31 (m, 4H, -CH2-); 5.75 (s, 1H, =CH-); 6.60 (d, J = 9.2 Hz, 2H, ArH), 7.04-7.36 (m, 4H, ArH); 8.03 (d, J = 9.1 Hz, 2H, ArH). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz, δ ppm): 14.12, 20.47, 25.64, 29.61, 50.12, 51.07, 89.87, 111.95, 113.27, 118.85, 122.74, 125.18, 128.82, 130.95, 140.06, 141.59, 151.19, 169.22, 181.33, 181.80, 185.51, 187.28. MS (ESI) m/z (M+) 443.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz, δ ppm): 0.89 (t, J = 7.3 Hz, 6H, -CH3); 1.25-1.35 (m, 4H, -CH2-); 1.41 (s, 6H, -CH3); 1.50-1.57 (m, 4H, -CH2-); 3.27-3.31 (m, 4H, -CH2-); 5.75 (s, 1H, =CH-); 6.60 (d, J = 9.2 Hz, 2H, ArH), 7.04-7.36 (m, 4H, ArH); 8.03 (d, J = 9.1 Hz, 2H, ArH). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz, δ ppm): 14.12, 20.47, 25.64, 29.61, 50.12, 51.07, 89.87, 111.95, 113.27, 118.85, 122.74, 125.18, 128.82, 130.95, 140.06, 141.59, 151.19, 169.22, 181.33, 181.80, 185.51, 187.28. MS (ESI) m/z (M+) 443.
（実施例２）SQR22の分光学的特性
SQR22を有機溶媒に溶解させ、UVランプ上（365nm）で蛍光発光を観察した。次いで、紫外可視分光光度計（V-670型、日本分光株式会社）と蛍光分光光度計（Agilent Cary Eclipse、アジレント・テクノロジー株式会社）で紫外可視吸収スペクトル（/QR22濃度=10μM）と蛍光発光スペクトル（SQR22濃度：1μM）を測定した。SQR22は各種の溶媒に溶解し、溶媒の極性に応じた分光特性を示した（図１Ａ、Ｂ、表１）。
SQR22を有機溶媒に溶解させ、UVランプ上（365nm）で蛍光発光を観察した。次いで、紫外可視分光光度計（V-670型、日本分光株式会社）と蛍光分光光度計（Agilent Cary Eclipse、アジレント・テクノロジー株式会社）で紫外可視吸収スペクトル（/QR22濃度=10μM）と蛍光発光スペクトル（SQR22濃度：1μM）を測定した。SQR22は各種の溶媒に溶解し、溶媒の極性に応じた分光特性を示した（図１Ａ、Ｂ、表１）。
SQR22溶液のUV-vis-NIRスペクトルは、極性溶媒中で630nm付近に最大吸収を示す（表１）。溶媒の極性が増加すると630nm付近の吸収が減少し、470nm付近に別の吸収ピークが現れた。水中では500～700nmの広い吸収が観察された。蛍光発光スペクトルは、溶媒の極性が増加するにつれて、最大蛍光発光の波長が遠赤外領域で640～663nmに徐々にシフトする（図１Ｂ及び表１）。この遠赤色領域では、量子収率は0.13～0.44の範囲にあった（図１Ｂ及び表１）。最大蛍光発光波長は、ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド中で552及び565nmであり、量子収率は0.02と大幅に低下した。吸収スペクトルは色素分子の会合状態を反映しており、モノマーの吸収に対して長波長シフト（Ｊバンド）又は短波長シフト（Hバンド）を示す場合、J凝集体又はH凝集体の形成が示唆される（Eisfeld, A. et al., Chemical Physics, 2006, 324, 376-384）。ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシドにおける吸収スペクトルの短波長シフト及びより低い量子収率は、H凝集体の形成を示唆している。水中ではSQR22の蛍光発光は観測されず、広い吸収ピークからH及びJ凝集体混合物の形成による消光が示唆される。
分光学的データは、SQR22が、非極性環境において550～640nmの範囲の励起波長を有する遠赤色領域（640～700nm）で強い蛍光を発することを示した。この励起波長は、市販の標準的な赤色レーザー（約630nm）と一致するため、蛍光イメージングなどのさまざまな用途に適している。SQR22は低極性溶媒中での高い量子収率を示すことから低極性環境を標識する用途に適している。したがって、SQR22は脂質二分子膜の疎水性非極性領域を標識するための有望な蛍光プローブであると考えられた。
（実施例３）SQR22を含有する分子集合体の調製
先ず、三種類の両親媒性分子：1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine （PC16）（日本精化株式会社製）、L-glutamic acid, N-(3-carboxy-1-oxopropyl)-, 1,5-dihexadecyl ester（SA）（日本精化株式会社製）及び1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-monomethoxy poly(ethylene glycol) (5000) (PEG-DSPE)（日油株式会社製）をPC16/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06(モル比）でt-ブタノールに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質粉末を得た。得られた混合脂質粉末にSQR22のストック溶液（エタノール）を添加し（混合脂質/SQR22=50/1［重量比］）、これをt-ブタノールに溶解させて凍結乾燥してSQR22含有混合脂質粉末を得た。SQR22含有混合脂質粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ（5mg/mL）、ボルテックスミキサーを用いて水和分散させた。この分散液をEXTRUDER（商品名、Northern Lipids Inc.製）に加え、加圧しながら60℃で孔径0.45μm、0.20μm、0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター（メルクミリポア社製）を順次透過させSQR22含有分子集合体（脂質ベシクル）分散液を得た（図２Ａ）。
先ず、三種類の両親媒性分子：1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine （PC16）（日本精化株式会社製）、L-glutamic acid, N-(3-carboxy-1-oxopropyl)-, 1,5-dihexadecyl ester（SA）（日本精化株式会社製）及び1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-monomethoxy poly(ethylene glycol) (5000) (PEG-DSPE)（日油株式会社製）をPC16/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06(モル比）でt-ブタノールに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質粉末を得た。得られた混合脂質粉末にSQR22のストック溶液（エタノール）を添加し（混合脂質/SQR22=50/1［重量比］）、これをt-ブタノールに溶解させて凍結乾燥してSQR22含有混合脂質粉末を得た。SQR22含有混合脂質粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ（5mg/mL）、ボルテックスミキサーを用いて水和分散させた。この分散液をEXTRUDER（商品名、Northern Lipids Inc.製）に加え、加圧しながら60℃で孔径0.45μm、0.20μm、0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター（メルクミリポア社製）を順次透過させSQR22含有分子集合体（脂質ベシクル）分散液を得た（図２Ａ）。
脂質ベシクルに取り込まれたSQR22の蛍光発光は、約25℃においてUV光（波長=365nm）下で観察されなかった（図２Ｂ）。しかし、興味深いことに、脂質ベシクル分散液を加熱すると強い蛍光発光が現れることを見出した（図２Ｂ）。さらに室温に温度が下がると、蛍光発光は再び消失した。図２Ｃに示すように、蛍光強度は温度変化に迅速に応答し、50℃における蛍光強度増加速度定数は7.0%/秒であった。この測定値は、目標温度に達するまでのプロセスを反映しているため、実際の応答速度は観察されたデータより速いと考えられる。加熱と冷却のサイクルにおける蛍光スイッチングは、少なくとも10サイクル安定して繰り返すことができた（図２Ｄ）。この温度に応答する興味深い蛍光発光特性について、発明者らは脂質ベシクルに導入したSQR22の蛍光発光特性が脂質二分子膜の相転移によって変換されるとの仮説を立てた。この仮説を実証するために、次にPC16を含めアシル鎖長（炭素数：14～18）の異なる５種類の1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（PC）を用いて、SQR22を含有する異なる相転移温度の脂質ベシクルを調製した。
（実施例４）SQR22を含有する相転移温度の異なる脂質ベシクルの調製
前記と同様に、三種類の両親媒性分子：ホスファチジルコリン（PC）、SA、及びPEG-DSPEをPC/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06（モル比）でt-ブタノールに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質粉末を得た。PCには、アシル鎖長の異なる1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC14）（Avanti Polar Lipids Inc製）、1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC15）（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC17)（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC18）（Avanti Polar Lipids Inc.製）の4種類を使用した（図３Ａ）。得られた混合脂質粉末にSQR22のストック溶液（エタノール）を添加し（混合脂質/SQR22=50/1［重量比］）、これをt-ブタノールに溶解させて凍結乾燥してSQR22含有混合脂質粉末を得た。
前記と同様に、三種類の両親媒性分子：ホスファチジルコリン（PC）、SA、及びPEG-DSPEをPC/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06（モル比）でt-ブタノールに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質粉末を得た。PCには、アシル鎖長の異なる1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC14）（Avanti Polar Lipids Inc製）、1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC15）（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC17)（Avanti Polar Lipids Inc.製）、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（PC18）（Avanti Polar Lipids Inc.製）の4種類を使用した（図３Ａ）。得られた混合脂質粉末にSQR22のストック溶液（エタノール）を添加し（混合脂質/SQR22=50/1［重量比］）、これをt-ブタノールに溶解させて凍結乾燥してSQR22含有混合脂質粉末を得た。
SQR22含有混合脂質粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ（5mg/mL）、ボルテックスミキサーを用いて水和分散させた。この分散液をEXTRUDER（商品名、Northern Lipids Inc.製）に加え、加圧しながら60℃で孔径0.45μm、0.20μm、0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター（メルクミリポア製）を順次透過させSQR22含有分子集合体（脂質ベシクル）分散液を得た。動的光散乱法（Zeta-Sizer Nano ZS、Malvern Panalytical Ltd）により得られた脂質ベシクルのサイズを測定した。エタノール中でのSQR22の吸光度（631nm）から分散液中のSQR22の濃度を決定した。5種類のＰＣのいずれを用いても脂質ベシクルのサイズは100nm程度であった（表２）。分子集合体の分散液は青色を呈し、可視吸収スペクトルでは625～637nmに極大吸収が観測された（図３Ｂ、表２）。
（実施例５）SQR22を含有する脂質ベシクルの温度応答性蛍光特性
５種類のPC-NVSQの蛍光特性を調べた。調製したPC-NVSQの蛍光発光は、約25℃のUV光（λ=365nm)下ではPC14-NVSQを除き観測されなかった（図４Ａ）。加熱すると、すべてのPC-NVSQ分散液は強い蛍光を発し、蛍光発光スペクトルは脂質種によらず同様であった（図４Ｂ）。加熱条件での最大蛍光発光波長は、PC14-、PC15-、PC16-、及びＰC17-NVSQでは664nm、PC18-NVSQでは662nmであった。最大発光波長とSQR22の極性指数との間の相関に基づいて（図１Ｂ）、SQR22の周囲の極性は、極性指数4.3～5.8を有するエタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリルなどに匹敵すると推定され、SQR22が脂質二重層膜の非極性領域に位置していることを支持する。
５種類のPC-NVSQの蛍光特性を調べた。調製したPC-NVSQの蛍光発光は、約25℃のUV光（λ=365nm)下ではPC14-NVSQを除き観測されなかった（図４Ａ）。加熱すると、すべてのPC-NVSQ分散液は強い蛍光を発し、蛍光発光スペクトルは脂質種によらず同様であった（図４Ｂ）。加熱条件での最大蛍光発光波長は、PC14-、PC15-、PC16-、及びＰC17-NVSQでは664nm、PC18-NVSQでは662nmであった。最大発光波長とSQR22の極性指数との間の相関に基づいて（図１Ｂ）、SQR22の周囲の極性は、極性指数4.3～5.8を有するエタノール、メタノール、アセトン、アセトニトリルなどに匹敵すると推定され、SQR22が脂質二重層膜の非極性領域に位置していることを支持する。
PC-NVSQの蛍光強度と温度との相関曲線は、SQR22の蛍光強度が二分子膜を構成する脂質種に依存して異なる温度範囲で変化することを明確に示した（図４Ｃ）。SQR22の蛍光強度と脂質二分子膜の相転移温度との間の相関を分析するために、異なるアシル鎖長を有する全てのPC-NVSQにおける蛍光強度の変化を降温時に測定した（液晶状態からゲル状態への転移）。いずれの場合も、典型的なS字型曲線を示しSQR22の蛍光強度は温度の低下により減少した。蛍光強度が急激に減少する開始温度は、PC14-、PC15-、PC16-、PC17-、及びPC18-NVSQの各々について、29±1、36±1、41±1、47±1、及び55±1℃であった。PC14、PC15、PC16、PC17及びPC18からなる脂質二分子膜のゲル－液晶相転移温度は、各々24、35、40、49及び55℃であることから、降温時に蛍光強度を減少させる臨界温度は、脂質二分子膜の相転移温度とほぼ一致した。PC14-NVSQについてはシグモイド曲線の協同性が低く、むしろ曲線の屈曲点（26±0.2℃）が相転移温度に近かった。さらに、PC16-NVSQの蛍光強度の変化を昇温時に試験した（ゲル状態から液晶状態への転移）。昇温時に蛍光強度が増加する開始温度は約40±1℃であり、これはPC16からなる脂質二分子膜の相転移温度（40℃）とよく一致している。したがって、昇温及び降温において、蛍光強度の増減を引き起こす臨界温度は、脂質二分子膜に固有の相転移温度に対応していると言える。加熱及び冷却のサイクルにおける蛍光変換は、いずれのPC-NVSQにおいても少なくとも10サイクル安定に繰り返すことができた（図示せず）。
従って、これらの結果から、SQR22を含有し、特定の温度で相転移挙動を示す分子集合体は、温度応答性蛍光粒子として機能することが明らかとなった。蛍光の消光と発光の転移温度は脂質二分子膜の相転移温度に対応しており、脂質成分の選択により転移温度を調節できることから、温度センシングにおいて様々な応用が期待できる。
（実施例６）蛍光イメージングによる温度応答蛍光の観測
蛍光顕微鏡を用いた温度イメージングへの応用を実証するために、温度応答性蛍光粒子の蛍光イメージング観測を試みた。この試験では、PC16-NVSQ（蛍光スイッチング温度; 40℃）と同じ成分組成を有する大きな多重層脂質ベシクルを用いた。近赤外線レーザー（波長：980nm）を照射して水を局所加熱した時の発光と、レーザー照射を遮断した後の冷却における消光を蛍光顕微鏡下で観察した（図５Ａ～Ｄ）。図５Ｂ～Ｄに示すように、レーザー照射前（33℃）の蛍光強度の変化はごくわずかであった。レーザー照射を始めると蛍光強度は急速に増加し（約40%/秒）、蛍光強度が照射前と比較して15倍に増加した。レーザー照射を遮断して温度が下がると、蛍光強度は低下した。この結果は、本温度応答性蛍光粒子が温度イメージングのための有望なツールであることを示している。
蛍光顕微鏡を用いた温度イメージングへの応用を実証するために、温度応答性蛍光粒子の蛍光イメージング観測を試みた。この試験では、PC16-NVSQ（蛍光スイッチング温度; 40℃）と同じ成分組成を有する大きな多重層脂質ベシクルを用いた。近赤外線レーザー（波長：980nm）を照射して水を局所加熱した時の発光と、レーザー照射を遮断した後の冷却における消光を蛍光顕微鏡下で観察した（図５Ａ～Ｄ）。図５Ｂ～Ｄに示すように、レーザー照射前（33℃）の蛍光強度の変化はごくわずかであった。レーザー照射を始めると蛍光強度は急速に増加し（約40%/秒）、蛍光強度が照射前と比較して15倍に増加した。レーザー照射を遮断して温度が下がると、蛍光強度は低下した。この結果は、本温度応答性蛍光粒子が温度イメージングのための有望なツールであることを示している。
（実施例７）温度応答蛍光粒子の作動機構の解析
これまでに、6-dodecanoyl-2-dimethylaminonaphthalene（laurdan）や1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene（DPH）など脂質二分子膜の相転移に伴い蛍光発光波長や異方性が変化する例が報告されているが、本発明のように分子集合体の相転移挙動に応じて蛍光分子の消光と発光が変換する報告例が見つからなかった。そこで、蛍光発光と消光が変換する機構の解析を試みた。
これまでに、6-dodecanoyl-2-dimethylaminonaphthalene（laurdan）や1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene（DPH）など脂質二分子膜の相転移に伴い蛍光発光波長や異方性が変化する例が報告されているが、本発明のように分子集合体の相転移挙動に応じて蛍光分子の消光と発光が変換する報告例が見つからなかった。そこで、蛍光発光と消光が変換する機構の解析を試みた。
図３Ｂに示す分光学的データを詳細に解析すると、脂質二分子膜中でのSQR22の吸収ピークは溶媒中のモノマーに比較してわずかに長波長シフトしており、かつ短波長の580nmにショルダーピークが観測される。このことから、ゲル相の脂質二分子膜中でSQR22の自己凝集体の形成が示唆され、凝集起因消光（aggregation-caused quenching）が考えられた。この場合、モノマーと凝集体として存在する色素は平衡状態にあるため、脂質膜中のSQR22の含有量を減らしていくことで凝集体の割合が減少して消光が解消される。この仮説を検証するために、様々な量のSQR22を含有するPC16-脂質ベシクルを調製して、それらの蛍光特性を調べた。図６Ａに示すように、SQR22の含有量を減らしていくと、室温のゲル相でも蛍光を発するようになった。温度による蛍光強度の変化の程度は、SQR22の含有量を減らすことによって減少し、SQR22の含量を0.1mol%まで減らすと、温度依存的な蛍光強度の変化はほぼ解消された（図６Ｂ）。
この結果は、ゲル相の脂質二分子膜中での蛍光分子の凝集が消光を誘起することを支持しており、蛍光分子の含量を減らしていくと平衡が凝集体からモノマーに移行するため、消光が解消される。25℃及び45℃での蛍光強度のプロットは、脂質二分子膜が25℃でゲル相、45℃で液晶状態にあるいずれの場合においても、SQR22の含有量の増加と共に蛍光強度が減少することを示す（図６Ｃ）。これは、脂質二分子膜が液晶状態にあるときでも、SQR22の含有量を増加させると部分的に消光するためと考えられる。しかし、ゲル相（25℃）でのより強い消光のために、25℃と45℃での蛍光強度の間のより大きな強度比はSQR22含有量の増加と共に達成され、25℃での蛍光強度（FI25）に対する45℃での蛍光強度（FI45）の比は、0.1及び3.3モル％のSQR22で1.1±0.01及び62.5±1.03であった。
3.3モル％及び0.1モル％のSQR22を含有するPC16-脂質ベシクルのUV-visスペクトルの比較は、ゲル相での脂質二分子膜におけるSQR22の凝集を支持する（図６Ｄ１及び図６Ｄ２）。3.3モル％のSQR22を含有するPC16-脂質ベシクルのSQR22の吸収ピークは25℃で636nmであった。温度が上昇するにつれて、吸収ピークはより短い波長にシフトする。脂質ベシクルの相転移温度（40℃）付近の42℃で625nmに達した。より低い温度での長波長シフトは、ゲル相におけるJ凝集体の形成を示唆する。温度が40℃を超えると、580nm付近の短波長シフトしたショルダーピーク（H凝集体と推定）も減少した。対照的に、0.1モル％のSQR22を含有する脂質ベシクルにおける吸収ピークの変化の程度は、3.3モル％のSQR22を含有する脂質ベシクルに比較してはるかに小さかった（図６Ｅ）。0.1モル％のSQR22における580nm付近のショルダーピークは、微量のH凝集体の存在を示唆している可能性があるが、温度による吸収の変化は無視できるほど小さかった。
これらの実験的証拠に基づいて、脂質二重層分子膜中のSQR22の蛍光特性が変換する機構を図７に示す。SQR22を3.3モル％含有する脂質ベシクルでは、相転移温度以下のゲル相においてSQR22の凝集（H-及びJ-凝集体）により消光される（凝集起因消光）。脂質二分子膜の相転移温度以上で液晶状態に転移すると、SQR22の自己凝集体が解離して蛍光を発する（離解誘起発光）。分子集合の制御に基づくこの蛍光変換の機構は、高い温度感度を有する温度センサの開発に重要である。
（実施例８）SQR22の類縁体を含有する温度応答性蛍光粒子
この蛍光変換の機構がSQR22の類縁体に一般化できるか調べるため、疎水性基の異なる類縁体SQR23を含有する脂質ベシクルの温度応答性を測定した。SQR23は既報に従い合成した（Dong, S. ACS Appl. Nano Mater. 2018, 1, 1009-1013）。脂質ベシクルの調製は実施例３に示した方法に従い、PC16/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06（モル比）からなる脂質ベシクルに3.3mol％のSQR23を含有させた脂質ベシクルを調製した。
この蛍光変換の機構がSQR22の類縁体に一般化できるか調べるため、疎水性基の異なる類縁体SQR23を含有する脂質ベシクルの温度応答性を測定した。SQR23は既報に従い合成した（Dong, S. ACS Appl. Nano Mater. 2018, 1, 1009-1013）。脂質ベシクルの調製は実施例３に示した方法に従い、PC16/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06（モル比）からなる脂質ベシクルに3.3mol％のSQR23を含有させた脂質ベシクルを調製した。
図８に示すように、3.3モル％のSQR23を導入した脂質ベシクルでも同様に、脂質ベシクルの相転移温度（40℃）付近で蛍光の増大を認め、温度応答性蛍光粒子として機能することが明らかとなった。以前の研究において、SQR23を0.1モル％の導入した脂質ベシクルでは消光は観測されておらず（Dong, S. ACS Appl. Nano Mater. 2018, 1(3), 1009-1013）、これは実施例７に記載したSQR22の結果と一致しており、SQR23においてもSQR22と同様に凝集と解離により消光と発光が変換しているものと考えられる。
（比較例１）相転移挙動を示さない分子集合体
本発明に用いられる分子集合体の要件は、特定の温度で相転移を示すことである。これに該当しない分子集合体では、温度に応答した蛍光の消光と発光の変換が起きないことを例示して説明する。PEG-DSPEとSQR22（50/1、重量比）をt-ブチルアルコールに溶解した後、凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ、青色透明な分散液を得た。得られた分散液はUVライト照射下（365nm）室温で強い蛍光を発し、温度を上げても蛍光強度の変化は観測されなかった。これはPEG-DSPEの形成する無秩序相にあるミセルは相転移を示さないため、相転移に応じたSQR22の凝集・解離による消光と発光の変換が起きないためで、このような相転移挙動を示さない分子集合体では本発明の所期の目的を達成できない。
本発明に用いられる分子集合体の要件は、特定の温度で相転移を示すことである。これに該当しない分子集合体では、温度に応答した蛍光の消光と発光の変換が起きないことを例示して説明する。PEG-DSPEとSQR22（50/1、重量比）をt-ブチルアルコールに溶解した後、凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ、青色透明な分散液を得た。得られた分散液はUVライト照射下（365nm）室温で強い蛍光を発し、温度を上げても蛍光強度の変化は観測されなかった。これはPEG-DSPEの形成する無秩序相にあるミセルは相転移を示さないため、相転移に応じたSQR22の凝集・解離による消光と発光の変換が起きないためで、このような相転移挙動を示さない分子集合体では本発明の所期の目的を達成できない。
（比較例２）コレステロール高含有脂質ベシクル
PC16/コレステロール/SA/PEG-DSPE（5/5/1/0.06、モル比）からなる混合脂質とSQR22（混合脂質：SQR22=50/1、重量比）をt-ブチルアルコールに溶解した後、凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させた。この分散液をEXTRUDER（商品名、Northern Lipids Inc.製）に加え、加圧しながら60℃で孔径0.45μm、0.20μm、0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター（ミリポア製）を順次透過させた。大部分のSQR22はポリカーボネートメンブランフィルターでろ過され、得られた脂質ベシクル分散液にはわずかなSQR22しか含有されておらず、室温における蛍光の消光は観測されなかった。この脂質ベシクルは45モル％のコレステロールを含有するため相転移挙動を示さない分子集合体であるとともに、蛍光分子を安定に担持できない分子集合体の例で、このような分子集合体では所望の温度応答性の蛍光特性は得られない。
PC16/コレステロール/SA/PEG-DSPE（5/5/1/0.06、モル比）からなる混合脂質とSQR22（混合脂質：SQR22=50/1、重量比）をt-ブチルアルコールに溶解した後、凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させた。この分散液をEXTRUDER（商品名、Northern Lipids Inc.製）に加え、加圧しながら60℃で孔径0.45μm、0.20μm、0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター（ミリポア製）を順次透過させた。大部分のSQR22はポリカーボネートメンブランフィルターでろ過され、得られた脂質ベシクル分散液にはわずかなSQR22しか含有されておらず、室温における蛍光の消光は観測されなかった。この脂質ベシクルは45モル％のコレステロールを含有するため相転移挙動を示さない分子集合体であるとともに、蛍光分子を安定に担持できない分子集合体の例で、このような分子集合体では所望の温度応答性の蛍光特性は得られない。
（実施例９）温度応答性蛍光粒子の表面を生体認識分子で修飾した温度応答性蛍光プローブ粒子の調製
PC16、SA、biotinylated 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine -N-monomethoxy poly(ethylene glycol) (2000) (biotinylated PEG-DSPE)（Avanti Polar Lipids Inc.製）をPC16/SA/biotinylated PEG-DSPE=9/1/0.05（モル比）でt-ブタノールに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質粉末を得た。得られた混合脂質粉末にSQR22のストック溶液（エタノール）を添加し（脂質に対して3.3モル％のSQR22）、これをt-ブタノールに溶解させて凍結乾燥してSQR22含有混合脂質粉末を得た。
PC16、SA、biotinylated 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine -N-monomethoxy poly(ethylene glycol) (2000) (biotinylated PEG-DSPE)（Avanti Polar Lipids Inc.製）をPC16/SA/biotinylated PEG-DSPE=9/1/0.05（モル比）でt-ブタノールに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質粉末を得た。得られた混合脂質粉末にSQR22のストック溶液（エタノール）を添加し（脂質に対して3.3モル％のSQR22）、これをt-ブタノールに溶解させて凍結乾燥してSQR22含有混合脂質粉末を得た。
SQR22含有混合脂質粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に分散させ（5mg/mL）、ボルテックスミキサーを用いて水和分散させた。この分散液をEXTRUDER（商品名、Northern Lipids Inc.製）に加え、加圧しながら60℃で孔径0.45μm、0.20μm、0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルター（メルクミリポア製）を順次透過させ表面をビオチンで修飾したSQR22含有脂質ベシクル分散液を得た。動的光散乱法（Zeta-Sizer Nano ZS、Malvern Panalytical Ltd製）により得られた分子集合体のサイズは93.0±46.2nmであった。蛍光強度の温度変化を調べた結果、脂質ベシクルの相転移温度（40℃）に対応して温度応答性の蛍光強度の増大が観測された（図９）。この結果から、分子認識部位を表面に担持した温度応答性蛍光プローブ粒子として機能することが期待された。
（実施例１０）温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた生体分子の検出（熱源にマイクロプレートを利用する例）
ここでは、熱源にマイクロプレートを利用する一例を示す。実施例９で調製したビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子を用いて、生体分子検出の実証試験を実施した。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子分散液（SQR22濃度=5μg/mL、40μL）をストレプトアビジンコート済み96ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）に添加し、2時間インキュベーションした後、80℃に加熱したホットプレート（RSH-1DR、株式会社AS-One製）に乗せて蛍光強度の経時変化を計測した。蛍光強度の検出には、光ファイバ型蛍光検出器（FLE1100型、日本板硝子株式会社製）を使用した。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子（標準試料）（図１０Ａの(A)）の他、ビオチン化PEG―DSPEの代わりにPEG-DSPEを使用した脂質ベシクルを対照試料として（図１０Ａの（B)）、脂質ベシクルとストレプトアビジンの非特異的結合の影響を調べた。また、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルをビオチン溶液（50μg/mL、150μL）で処理し、ビオチンと基板との非特異的結合の影響も調べた（図１０Ａの(C)）。全ての試験においてSQR22濃度を5μg/mL、試料をウェルに添加してから加熱を開始するまでの時間を2時間に固定した。図１０Ｂに示す通り、標準試料では、加熱を開始してから10秒以内に蛍光強度が上昇するのに対し、対照試料では40秒を要した。これは、標準試料ではビオチンとストレプトアビジンの特異的分子認識により温度応答性蛍光プローブが基板（熱源）に結合しているため、熱源から温度応答性蛍光プローブに速やかに熱が伝わり相転移して蛍光強度が増大するが、対照試料では温度応答性蛍光プローブが溶液中に浮遊しており、溶液全体の温度が転移温度に達するのに時間がかかるためである。従って、この方法は特異的な分子認識を介して熱源に結合している温度応答性蛍光プローブと結合してない温度応答性蛍光プローブを蛍光応答から区別できることから、温度応答性蛍光プローブと熱源の間の特異的な分子認識に関与する生体分子の検出に利用できる。
ここでは、熱源にマイクロプレートを利用する一例を示す。実施例９で調製したビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子を用いて、生体分子検出の実証試験を実施した。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子分散液（SQR22濃度=5μg/mL、40μL）をストレプトアビジンコート済み96ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）に添加し、2時間インキュベーションした後、80℃に加熱したホットプレート（RSH-1DR、株式会社AS-One製）に乗せて蛍光強度の経時変化を計測した。蛍光強度の検出には、光ファイバ型蛍光検出器（FLE1100型、日本板硝子株式会社製）を使用した。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子（標準試料）（図１０Ａの(A)）の他、ビオチン化PEG―DSPEの代わりにPEG-DSPEを使用した脂質ベシクルを対照試料として（図１０Ａの（B)）、脂質ベシクルとストレプトアビジンの非特異的結合の影響を調べた。また、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルをビオチン溶液（50μg/mL、150μL）で処理し、ビオチンと基板との非特異的結合の影響も調べた（図１０Ａの(C)）。全ての試験においてSQR22濃度を5μg/mL、試料をウェルに添加してから加熱を開始するまでの時間を2時間に固定した。図１０Ｂに示す通り、標準試料では、加熱を開始してから10秒以内に蛍光強度が上昇するのに対し、対照試料では40秒を要した。これは、標準試料ではビオチンとストレプトアビジンの特異的分子認識により温度応答性蛍光プローブが基板（熱源）に結合しているため、熱源から温度応答性蛍光プローブに速やかに熱が伝わり相転移して蛍光強度が増大するが、対照試料では温度応答性蛍光プローブが溶液中に浮遊しており、溶液全体の温度が転移温度に達するのに時間がかかるためである。従って、この方法は特異的な分子認識を介して熱源に結合している温度応答性蛍光プローブと結合してない温度応答性蛍光プローブを蛍光応答から区別できることから、温度応答性蛍光プローブと熱源の間の特異的な分子認識に関与する生体分子の検出に利用できる。
次いで、本方法の迅速性を検証するため、試料をウェルに添加した後のインキュベーション時間の検討を行った。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子分散液（SQR22濃度=5μg/mL、40μL）をストレプトアビジンコート済み96ウェルプレートに添加し、30秒間、5分間、10分間、15分間、20分間及び30分間室温で静置した後、80℃に加熱したホットプレート（RSH-1DR型、株式会社AS-One製）に乗せて蛍光強度の経時変化を計測した。ビオチン化PEG-DSPEの代わりにPEG-DSPEを使用した脂質ベシクルをストレプトアビジンコート済み96ウェルプレートに添加し、2時間のインキュベーションしたものを陰性対照（Negative control）とした。分子認識結合のない陰性対照では、加熱を開始してから蛍光強度が最大に達するまでに42.5秒要するのに対し、ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子では30秒間のインキュベーションで30秒に短縮され、さらにインキュベーション時間を長くすると短縮されるが20分間のインキュベーションでほぼ一定に達する（図１１）。従って、本実施例の方法では、30秒のインキュベーションと30秒の加熱（合計1分）で特異的分子認識による結合を検出できる。
（実施例１１）
ここでは、実施例９で調製したビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子を用いて、前立腺がんのスクリーニング、治療効果の判定や再発の早期発見に有用な腫瘍マーカーとして臨床的に検査される前立腺特異抗原（PSA）について検出感度を検討した例を示す。市販のヒトPSA-total ELISAキット（製品番号：RAB0331、Sigma-Aldrich社製）を購入した。このキットには、PSA捕獲抗体コート済みELISAプレート、ヒトPSA標準品、ビオチン化ヒトPSA検出抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジンの他、各種バッファー、ELISA停止溶液、HRP基質が入っている。PSA捕獲抗体コート済みELISAプレートにヒトPSA標準品（あるいは検体）、ビオチン化ヒトPSA検出抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジンを順次添加・洗浄した後、最後に基質（3,3',5,5;-tetramethylbenzidine）を添加して酵素反応による生成物の呈色を検出する（図１２Ａ）。製造元のプロトコルに従うと、PSAの検出限界濃度は10pg/mLである。
ここでは、実施例９で調製したビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子を用いて、前立腺がんのスクリーニング、治療効果の判定や再発の早期発見に有用な腫瘍マーカーとして臨床的に検査される前立腺特異抗原（PSA）について検出感度を検討した例を示す。市販のヒトPSA-total ELISAキット（製品番号：RAB0331、Sigma-Aldrich社製）を購入した。このキットには、PSA捕獲抗体コート済みELISAプレート、ヒトPSA標準品、ビオチン化ヒトPSA検出抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジンの他、各種バッファー、ELISA停止溶液、HRP基質が入っている。PSA捕獲抗体コート済みELISAプレートにヒトPSA標準品（あるいは検体）、ビオチン化ヒトPSA検出抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジンを順次添加・洗浄した後、最後に基質（3,3',5,5;-tetramethylbenzidine）を添加して酵素反応による生成物の呈色を検出する（図１２Ａ）。製造元のプロトコルに従うと、PSAの検出限界濃度は10pg/mLである。
この検出をビオチン化温度応答性蛍光プローブに置き換えた時の検出感度を検討した。すなわち、PSA捕獲抗体コート済みELISAプレートにヒトPSA標準品、ビオチン化ヒトPSA検出抗体、ストレプトアビジンを順次添加・洗浄した後、最後にビオチン化温度応答性蛍光プローブを添加してELISAプレートをホットプレート（80℃）に乗せて蛍光強度の経時変化を測定した（図１２Ｂ）。蛍光強度の測定には、光ファイバ型蛍光検出器（FLE1100型、日本板硝子株式会社製）を使用した。その結果を図１２Ｃに示す。陰性対照（PSAなし）では加熱を開始してから蛍光強度が最大に達するまでの時間が43.3秒（三回の測定の平均値）であったのに対し、ELISAの検出限界濃度である10pg/mLのPSAの存在下では30.7秒に短縮された。これは、陰性対照では標的分子のPSAが存在しないため、ビオチン化温度応答性蛍光プローブは浮遊しているが、PSAの存在下では抗体によるサンドイッチ型の分子認識によりビオチン化温度応答性蛍光プローブがプレートに固着して熱が速やかに伝わるためである。さらにPSAを希釈して、ELISAの検出限界の10万倍低濃度の10-4pg/mLまで希釈しても32.1秒と陰性対照との差異を検出できた。
従って、本発明の温度応答性蛍光プローブを使った場合、PSA の検出限界濃度はELISAキットの検出限界より１０万倍以上低いことが明らかとなり、大幅な感度向上が可能であることが確認された。
（実施例１２）温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた生体分子の検出（熱源に金ナノ粒子を利用する例）
ここでは熱源に金ナノ粒子を利用する一例を示す。温度応答性蛍光プローブ粒子には、実施例９で示したビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた。金ナノ粒子には市販のストレプトアビジン結合金ナノ粒子（20nm、Cytodiagnostics Inc.製）を用いた。まず、ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子が70粒子/1.5mL、ストレプトアビジン結合金ナノ粒子が70粒子/1.3mLの分散液を各々調製した。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子の粒子濃度は、一枚膜脂質ベシクルとして脂質ベシクルの平均サイズ、脂質濃度、及び脂質の分子占有面積から概算し、ストレプトアビジン結合金ナノ粒子の粒子濃度は販売元の仕様書に従った。この分散液を混合し、さらに2倍希釈して70粒子/5.6mLとしてから、12時間室温で静置してビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子とストレプトアビジン結合金ナノ粒子の複合体を形成させた。この分散液から40μLずつ採取して96ウェルプレート（株式会社AS-One製）に移した。蛍光顕微鏡（BZ-X710型、株式会社キーエンス）に96ウェルプレートをセットし、緑色レーザー（波長：545±25nm）を照射して金ナノ粒子を光熱変換で発熱させながら、光ファイバ型蛍光検出器（FLE1100型、日本板硝子株式会社）で温度応答性蛍光プローブ粒子から蛍光発光を測定した。また、ビオチン化してないPEG-DSPEを含む温度応答性蛍光プローブ粒子を対照試料として、同条件で蛍光発光を測定した（図１３Ａ）。
ここでは熱源に金ナノ粒子を利用する一例を示す。温度応答性蛍光プローブ粒子には、実施例９で示したビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた。金ナノ粒子には市販のストレプトアビジン結合金ナノ粒子（20nm、Cytodiagnostics Inc.製）を用いた。まず、ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子が70粒子/1.5mL、ストレプトアビジン結合金ナノ粒子が70粒子/1.3mLの分散液を各々調製した。ビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子の粒子濃度は、一枚膜脂質ベシクルとして脂質ベシクルの平均サイズ、脂質濃度、及び脂質の分子占有面積から概算し、ストレプトアビジン結合金ナノ粒子の粒子濃度は販売元の仕様書に従った。この分散液を混合し、さらに2倍希釈して70粒子/5.6mLとしてから、12時間室温で静置してビオチン化温度応答性蛍光プローブ粒子とストレプトアビジン結合金ナノ粒子の複合体を形成させた。この分散液から40μLずつ採取して96ウェルプレート（株式会社AS-One製）に移した。蛍光顕微鏡（BZ-X710型、株式会社キーエンス）に96ウェルプレートをセットし、緑色レーザー（波長：545±25nm）を照射して金ナノ粒子を光熱変換で発熱させながら、光ファイバ型蛍光検出器（FLE1100型、日本板硝子株式会社）で温度応答性蛍光プローブ粒子から蛍光発光を測定した。また、ビオチン化してないPEG-DSPEを含む温度応答性蛍光プローブ粒子を対照試料として、同条件で蛍光発光を測定した（図１３Ａ）。
ビオチン化した温度応答性蛍光プローブ粒子を使用した場合、蛍光の増大が観測されないウェル（図１３Ｂの(C)）と蛍光強度が増大するウェルが確認された（図１３Ｂの(A)、(B)）。一方、ビオチン化してない温度応答性蛍光プローブ粒子を使用した場合、蛍光強度が増大するウェルはなかった（図１３Ｂの(D)）。この結果から、ビオチンとストレプトアビジンの分子認識により温度応答性蛍光プローブ粒子と金ナノ粒子が結合した時に限り、金ナノ粒子の熱により温度応答性蛍光プローブ粒子の蛍光発光が観測されたものと考えられる。本実験条件は、40μL中に平均して0.5個の温度応答性蛍光プローブ粒子と金ナノ粒子の複合体が存在する設定で、40μLずつ分割した時に含まれる複合体の数をポアソン分布から見積もると、0個（61％）、1個（30％）、2個以上（9％）となる。図１３Ａに示した検出陽性の結果(A)は蛍光が観測された中で最大の蛍光強度を示した例で、他は検出陽性の結果(B)と同等の蛍光強度であった。このことから、検出陽性の結果(B)が脂質ベシクル1個の代表的な蛍光強度である可能性が高い。試料溶液40μL中において、温度応答性蛍光プローブ粒子1個で生体分子1分子を検出すると、その検出感度は4.2×10-17Mに相当する。
（実施例１３）温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた生体分子のデジタル計数（マイクロ流体デバイスを利用する例）
ここでは、温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた生体分子のデジタル計数の方法を例示する（図１４Ａ）。マイクロ流体デバイスを用いることで、温度応答性蛍光プローブ粒子、熱源、検体を内包した微小液滴を作製し、温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光を発する微小液滴の数をカウントすることで検体に含まれる標的分子の数をカウントできる（図１４Ａ）。
ここでは、温度応答性蛍光プローブ粒子を用いた生体分子のデジタル計数の方法を例示する（図１４Ａ）。マイクロ流体デバイスを用いることで、温度応答性蛍光プローブ粒子、熱源、検体を内包した微小液滴を作製し、温度応答性蛍光プローブ粒子からの蛍光を発する微小液滴の数をカウントすることで検体に含まれる標的分子の数をカウントできる（図１４Ａ）。
図１４Ｂに示すように、微小液滴の容積は液滴の直径から算出でき、例えば50μmの直径の微小液滴では65pLと算出される。微小液滴の直径は、デバイスの流路と流速により制御できる。
本方法では、微小液滴中に少なくとも1個以上の温度応答性蛍光プローブ粒子と熱源が内包されており、ポアソン分布に従うと、微小液滴1個につき平均して5個の温度応答性蛍光プローブ粒子と熱源が内包される設定にすることで、99％以上の微小液滴に少なくとも1個以上の温度応答性蛍光プローブ粒子と熱源が内包される。デジタル計数には、検出したい標的分子が微小液滴中に1分子ないし0分子とする条件が必要で、このような条件はポアソン分布から見積もることができる（図１４Ｃ）。
図１４Ｄに示すように、検出したい標的分子が内包された微小液滴だけ蛍光を発するので、蛍光を発する微小液滴の数（NF）は標的分子数に対応する。また、微小液滴の容積（V）は直径から算出できるので、微小液滴の総数（N）をカウントすることで濃度への換算も可能である。
（実施例１４）SQR含有ビオチン化DPPCベシクルの調製と特性評価
＜I. SQR含有ビオチン化DPPCベシクルの調製と特性評価＞
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,5-ジヘキサデシル-N-スクシニル-L-グルタミン酸（DHSG）、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル（ポリエチレングリコール）-2000]（ビオチン化PEG2000-DSPE）をtert-ブチルアルコールに溶解してストック溶液を調製した。SQR22 DPPCリポソームは、DPPC、DHSG、ビオチン化PEG2000-DSPE、及びSQR22で構成され、モル比は86.6：9.6：0.5：3である。丸底フラスコにストック溶液の必要量を加え、次いで、混合溶液を凍結乾燥機で一晩凍結乾燥させた。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を加えて、凍結乾燥した混合脂質を水和し、3～5 mg/mLの脂質ベシクル分散液を得た。小さなペレットを分解するために、温度を60℃に保ちながら、脂質ベシクル分散液を10～15分間ボルテックスするか、あるいは脂質ベシクル分散液を室温で2時間攪拌した。EXTRUDERをセットアップし、温度制御機能付きのウォーターポンプにEXTRUDERを接続した。EXTRUDERを60℃に加熱した。ボルテックス後、脂質ベシクル分散液をEXTRUDERに加え、窒素ガス圧をかけて分散液をポリカーボネート膜（0.2μm x 1、0.1μm x 1、0.05μm x 3）から押し出した。ゼータサイザーを使用して、脂質ベシクルの粒形とζ電位を確認した。脂質の濃度は、メーカーの説明書に従い、phospholipid C kitによって決定した。SQR22の標準曲線を、エタノール中の異なる濃度でのSQR22の吸光度から作成した。SQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液のSQR22の濃度を、631 nmでの吸光度から計算した。SQR含有ビオチン化DOPC（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン）ベシクル分散液も、同様にして作製し、特性を評価した。
＜I. SQR含有ビオチン化DPPCベシクルの調製と特性評価＞
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPPC）、1,5-ジヘキサデシル-N-スクシニル-L-グルタミン酸（DHSG）、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル（ポリエチレングリコール）-2000]（ビオチン化PEG2000-DSPE）をtert-ブチルアルコールに溶解してストック溶液を調製した。SQR22 DPPCリポソームは、DPPC、DHSG、ビオチン化PEG2000-DSPE、及びSQR22で構成され、モル比は86.6：9.6：0.5：3である。丸底フラスコにストック溶液の必要量を加え、次いで、混合溶液を凍結乾燥機で一晩凍結乾燥させた。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を加えて、凍結乾燥した混合脂質を水和し、3～5 mg/mLの脂質ベシクル分散液を得た。小さなペレットを分解するために、温度を60℃に保ちながら、脂質ベシクル分散液を10～15分間ボルテックスするか、あるいは脂質ベシクル分散液を室温で2時間攪拌した。EXTRUDERをセットアップし、温度制御機能付きのウォーターポンプにEXTRUDERを接続した。EXTRUDERを60℃に加熱した。ボルテックス後、脂質ベシクル分散液をEXTRUDERに加え、窒素ガス圧をかけて分散液をポリカーボネート膜（0.2μm x 1、0.1μm x 1、0.05μm x 3）から押し出した。ゼータサイザーを使用して、脂質ベシクルの粒形とζ電位を確認した。脂質の濃度は、メーカーの説明書に従い、phospholipid C kitによって決定した。SQR22の標準曲線を、エタノール中の異なる濃度でのSQR22の吸光度から作成した。SQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液のSQR22の濃度を、631 nmでの吸光度から計算した。SQR含有ビオチン化DOPC（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン）ベシクル分散液も、同様にして作製し、特性を評価した。
（実施例１５）96ウェルプレートとカメラを用いた装置での検証（加熱）
次に、蛍光検出器ではなく、96ウェルプレートとカメラを用いた装置で検証を行った。本実施例の概要図を図１６Ａとして示す。
次に、蛍光検出器ではなく、96ウェルプレートとカメラを用いた装置で検証を行った。本実施例の概要図を図１６Ａとして示す。
手順
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンサンプルをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。コーティングする必要があるウェルに対し、各ストレプトアビジンサンプルを100μL加えた。室温で一晩放置し、溶液を乾燥させた。残留する溶液を取り除き、100μLの0.1％ ウシ血清アルブミン（BSA）を加えた。プレートを1時間放置して、非特異的結合部位をブロッキングした。上清を除去し、DPBS 100μLでウェルを2回洗浄した。
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンサンプルをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。コーティングする必要があるウェルに対し、各ストレプトアビジンサンプルを100μL加えた。室温で一晩放置し、溶液を乾燥させた。残留する溶液を取り除き、100μLの0.1％ ウシ血清アルブミン（BSA）を加えた。プレートを1時間放置して、非特異的結合部位をブロッキングした。上清を除去し、DPBS 100μLでウェルを2回洗浄した。
＜ii. サンプルの調製＞
DPBSを用いることでSQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液（SQR-DPPC）を希釈し、SQR22濃度を5、2、1、0.1、0.01 μg/mlとした。各濃度のサンプル80μLを、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加した。陰性対照として、80μLのサンプルを、ストレプトアビジン非コーティングウェルに追加で添加した。室温で1時間インキュベートした（30分間は穏やかに振とうした）。サンプルウェルを100μLのDPBSで2回洗浄した。80μLのDPBSですべてのウェルを再度満たした。
DPBSを用いることでSQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液（SQR-DPPC）を希釈し、SQR22濃度を5、2、1、0.1、0.01 μg/mlとした。各濃度のサンプル80μLを、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加した。陰性対照として、80μLのサンプルを、ストレプトアビジン非コーティングウェルに追加で添加した。室温で1時間インキュベートした（30分間は穏やかに振とうした）。サンプルウェルを100μLのDPBSで2回洗浄した。80μLのDPBSですべてのウェルを再度満たした。
＜iii. Celvin（ゲルアナライザー）を用いた蛍光強度観察＞
SnapAndGoソフトウェアを開き、シリアルモードを選択し、サンプルの配置のためにチャンバーを閉じ、キャリブレーションが終了するまで待った。サーモプレートの電源を入れ、50°Cまで予熱した。キャリブレーション後、画像キャプチャ設定メニューの横をクリックした。設定メニューで、露光時間を3秒に、遅延時間を7秒に調整して、20秒ごとに写真を撮って処理した。励起波長470 nm（青色光）、強度50を選択した。フィルターを680 nmとして選択した。サンプルプレートをサーモプレートの上に置き、チャンバーを閉じて撮影を開始した。より適した分析のため、各画像のコントラスト値を選択した。ImageJ分析用にすべての画像を保存した。
SnapAndGoソフトウェアを開き、シリアルモードを選択し、サンプルの配置のためにチャンバーを閉じ、キャリブレーションが終了するまで待った。サーモプレートの電源を入れ、50°Cまで予熱した。キャリブレーション後、画像キャプチャ設定メニューの横をクリックした。設定メニューで、露光時間を3秒に、遅延時間を7秒に調整して、20秒ごとに写真を撮って処理した。励起波長470 nm（青色光）、強度50を選択した。フィルターを680 nmとして選択した。サンプルプレートをサーモプレートの上に置き、チャンバーを閉じて撮影を開始した。より適した分析のため、各画像のコントラスト値を選択した。ImageJ分析用にすべての画像を保存した。
＜iv. 画像分析＞
ImageJソフトウェアを開いた。「Analyze」をクリックし、「Tools」でROIマネージャー機能を選択した。ImageJで画像を開いた。円形を使用して、分析対象のウェルの領域を選択した。ROIマネージャーでAddをクリックして、円形で囲まれた領域を分析用に追加した。すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返した。
ImageJソフトウェアを開いた。「Analyze」をクリックし、「Tools」でROIマネージャー機能を選択した。ImageJで画像を開いた。円形を使用して、分析対象のウェルの領域を選択した。ROIマネージャーでAddをクリックして、円形で囲まれた領域を分析用に追加した。すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返した。
ROIマネージャーメニューの「measure」ボタンをクリックし、データをコピーしてExcelファイルに貼り付けた。ここでは、蛍光強度変化の指標として平均値を使用した。すべての画像に対して本手順を繰り返した。すべてのデータを収集して分析した。
各ウェルの濃度及びウェルの写真を図１６Ｂ及び１６Ｃに示す。また、画像分析の結果を表３に、表３から作成したグラフを図１６Ｄに示す。1、2、及び5μg/mLの濃度のSQR-DPPCサンプル（図１６Ｂの(3)、(2)、及び(1)）は、明確なS字型曲線を示したが、0.01及び0.1μg/mL（図１６Ｂの(5)及び(4)）は明確ではなく、ほとんどフラットであった。陰性対照とバッファー群の間にほとんど違いがなかった。これは、ストレプトアビジンが存在しない場合には、陰性対照群のすべてのベシクルが洗い流されたことを意味する。さらに、図１６Ｂの(5)の濃度はSQR22に関してたった0.01μg/mLであったが、その平均強度は陰性対照及びバッファー群よりも10％高く、このことから、SQR-DPPCの存在が示される。これまでの試験の感度は、SQR22に関して約0.01μg/mLであった。
（実施例１６）SQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液による異なる量のストレプトアビジンの検出（加熱）
本実施例の概要図を図１７Ａとして示す。ここでは、ビオチンとストレプトアビジンの複合体を使用して、マイクロプレートウェルにコーティングされたストレプトアビジンの、ビオチン化脂質ベシクルによる認識能を確認するために、異なる濃度で、ウェルの表面にストレプトアビジンをコーティングし、SQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液により、ストレプトアビジンの濃度差を検出できるか否かを検討した。本実施例で用いたDPPCベシクルのゲル－液晶相転移温度は40℃であるため、SQR含有ビオチン化DPPCベシクルは、50℃に加熱すると強い赤色の蛍光を発する。ウェルを2回洗浄して未結合のSQR含有ビオチン化DPPCベシクルを除去した。本実施例では、蛍光強度の検出にゲルアナライザー（Celvin）とImage Jを使用した。
本実施例の概要図を図１７Ａとして示す。ここでは、ビオチンとストレプトアビジンの複合体を使用して、マイクロプレートウェルにコーティングされたストレプトアビジンの、ビオチン化脂質ベシクルによる認識能を確認するために、異なる濃度で、ウェルの表面にストレプトアビジンをコーティングし、SQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液により、ストレプトアビジンの濃度差を検出できるか否かを検討した。本実施例で用いたDPPCベシクルのゲル－液晶相転移温度は40℃であるため、SQR含有ビオチン化DPPCベシクルは、50℃に加熱すると強い赤色の蛍光を発する。ウェルを2回洗浄して未結合のSQR含有ビオチン化DPPCベシクルを除去した。本実施例では、蛍光強度の検出にゲルアナライザー（Celvin）とImage Jを使用した。
手順
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。DPBSでストレプトアビジンを希釈して、20、10、5、1、0.1、0.01、および0.001μg/mLの濃度に調節した。ウェルに対して各ストレプトアビジンサンプルを100μL加えた。室温で一晩放置し、溶液を乾燥させた。残留する溶液を取り除き、100μLの0.1％ BSAを加えた。プレートを1時間放置して、非特異的結合部位をブロッキングした。上清を除去し、DPBS 100μLでウェルを2回洗浄した。
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。DPBSでストレプトアビジンを希釈して、20、10、5、1、0.1、0.01、および0.001μg/mLの濃度に調節した。ウェルに対して各ストレプトアビジンサンプルを100μL加えた。室温で一晩放置し、溶液を乾燥させた。残留する溶液を取り除き、100μLの0.1％ BSAを加えた。プレートを1時間放置して、非特異的結合部位をブロッキングした。上清を除去し、DPBS 100μLでウェルを2回洗浄した。
＜ii. サンプルの調製＞
DPBSを用いることでSQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液を希釈し、SQR22濃度を5μg/mLとした（SQR-DPPC）。100μLのSQR-DPPC分散液を、各量のストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加した。100μLのSQR-DPPC分散液を、ストレプトアビジン非コーティングの陰性対照にも添加した。室温で1時間インキュベートした。サンプルウェルを100μLのDPBSで2回洗浄した。100μLのDPBSですべてのウェルを再度満たした。
DPBSを用いることでSQR含有ビオチン化DPPCベシクル分散液を希釈し、SQR22濃度を5μg/mLとした（SQR-DPPC）。100μLのSQR-DPPC分散液を、各量のストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加した。100μLのSQR-DPPC分散液を、ストレプトアビジン非コーティングの陰性対照にも添加した。室温で1時間インキュベートした。サンプルウェルを100μLのDPBSで2回洗浄した。100μLのDPBSですべてのウェルを再度満たした。
＜iii. Celvinを用いた蛍光強度観察＞
実施例１５に記載の方法と同様にして、画像データを取得した。
実施例１５に記載の方法と同様にして、画像データを取得した。
＜iv. 画像分析＞
実施例１５に記載の方法と同様にして、画像分析を行った。
実施例１５に記載の方法と同様にして、画像分析を行った。
結果
異なる濃度のストレプトアビジンを含むストレプトアビジン溶液をマイクロプレートのウェルに添加し、ウェルの底面を異なる量のストレプトアビジンでコーティングした。各ウェルの蛍光強度を、手順で記載の方法で測定した。15秒での蛍光強度をゼロに正規化した結果を表４及び図１７Ｂ及び１７Ｃに示す。これらのデータから、SQR22含有ビオチン化DPPCベシクルが、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルに結合し、50℃での加熱中にSQR22蛍光を発したことが明確に示された。蛍光強度は、コーティング用のストレプトアビジン溶液の濃度に対応し、1μg/mL以上であればCelvinで検出可能であった。
異なる濃度のストレプトアビジンを含むストレプトアビジン溶液をマイクロプレートのウェルに添加し、ウェルの底面を異なる量のストレプトアビジンでコーティングした。各ウェルの蛍光強度を、手順で記載の方法で測定した。15秒での蛍光強度をゼロに正規化した結果を表４及び図１７Ｂ及び１７Ｃに示す。これらのデータから、SQR22含有ビオチン化DPPCベシクルが、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルに結合し、50℃での加熱中にSQR22蛍光を発したことが明確に示された。蛍光強度は、コーティング用のストレプトアビジン溶液の濃度に対応し、1μg/mL以上であればCelvinで検出可能であった。
（実施例１７）SQR22含有ビオチン化DPPCベシクルとストレプトアビジンの複合体によるストレプトアビジンの検出（加熱）
本実施例の概要図を図１８として示す。ここでは、マイクロプレートウェルにコーティングされたストレプトアビジンの、SQR22含有ビオチン化DPPCベシクルによる認識能を強化するため、ビオチン化ベシクルとストレプトアビジンの複合体を使用して、いずれの混合割合が効果的であるか調べた。本実施例では、ゲル－液晶相転移温度は41℃であるDPPCベシクルを用いて、マイクロプレートを50℃で90秒間加熱した。本実施例では、蛍光強度の検出にゲルアナライザー（Celvin）とImage Jを使用した。
本実施例の概要図を図１８として示す。ここでは、マイクロプレートウェルにコーティングされたストレプトアビジンの、SQR22含有ビオチン化DPPCベシクルによる認識能を強化するため、ビオチン化ベシクルとストレプトアビジンの複合体を使用して、いずれの混合割合が効果的であるか調べた。本実施例では、ゲル－液晶相転移温度は41℃であるDPPCベシクルを用いて、マイクロプレートを50℃で90秒間加熱した。本実施例では、蛍光強度の検出にゲルアナライザー（Celvin）とImage Jを使用した。
手順
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。ウェルに対して各ストレプトアビジンサンプルを100μL加えた。室温で一晩放置し、溶液を乾燥させた。残留する溶液を取り除き、100μLの0.1％ BSAを加えた。プレートを1時間放置して、非特異的結合部位をブロッキングした。上清を除去し、DPBS 100μLでウェルを2回洗浄した。
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。ウェルに対して各ストレプトアビジンサンプルを100μL加えた。室温で一晩放置し、溶液を乾燥させた。残留する溶液を取り除き、100μLの0.1％ BSAを加えた。プレートを1時間放置して、非特異的結合部位をブロッキングした。上清を除去し、DPBS 100μLでウェルを2回洗浄した。
＜ii. ベシクル－ストレプトアビジン複合体の調製＞
ストレプトアビジンストックを希釈して、10、5、2.5、1.25、及び0.625μg/mLの濃度のストレプトアビジンサンプルを調製した。空の1.5 mLチューブを5本準備し、調製したストレプトアビジンの各サンプル40μLをチューブに加えた。次いで、脂質濃度が2.5 mg/mLのSQR含有ビオチン化DPPCベシクル（SQR-DPPC）分散液40μLをすべてのチューブに添加して、ベシクル-ストレプトアビジンのモル比が4：1、2：1、1：1、1：2及び1：4の複合体を調製した。混合物をボルテックスミキサーで撹拌して、複合体形成を促進し、混合物を室温で1時間インキュベートした。なお、100 nmのB-SQR-DPPC-Lの重量は約59200kDaで、ストレプトアビジンの分子量（55kDa）の1000倍である。従って、2.5 mg/mL（脂質濃度）のSQR-DPPCは、2.5 μg/mLのストレプトアビジンとほぼ同数である。
ストレプトアビジンストックを希釈して、10、5、2.5、1.25、及び0.625μg/mLの濃度のストレプトアビジンサンプルを調製した。空の1.5 mLチューブを5本準備し、調製したストレプトアビジンの各サンプル40μLをチューブに加えた。次いで、脂質濃度が2.5 mg/mLのSQR含有ビオチン化DPPCベシクル（SQR-DPPC）分散液40μLをすべてのチューブに添加して、ベシクル-ストレプトアビジンのモル比が4：1、2：1、1：1、1：2及び1：4の複合体を調製した。混合物をボルテックスミキサーで撹拌して、複合体形成を促進し、混合物を室温で1時間インキュベートした。なお、100 nmのB-SQR-DPPC-Lの重量は約59200kDaで、ストレプトアビジンの分子量（55kDa）の1000倍である。従って、2.5 mg/mL（脂質濃度）のSQR-DPPCは、2.5 μg/mLのストレプトアビジンとほぼ同数である。
100μLの各混合物をストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加した。陽性対照として、100μLのSQR-DPPCを、5μg/mLの濃度のSQRでストレプトアビジンコーティングウェルに添加し、陰性対照として、別の100μLのB-SQR-DPPC-Lをストレプトアビジン非コーティングウェルに添加した。バッファーのみとして、ストレプトアビジン非コーティングウェルに処理バッファーのみを加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、すべてのウェルを100μL DPBSで2回洗浄した。次いで、ウェルに100μL DPBSを加えた。
＜iii. Celvinを用いた蛍光強度観察＞
SnapAndGoソフトウェアを開き、シリアルモードを選択し、サンプルの配置のためにチャンバーを閉じ、キャリブレーションが終了するまで待った。サーモプレートの電源を入れ、50°Cまで予熱した。キャリブレーション後、画像キャプチャ設定メニューの横をクリックした。設定メニューで、露光時間を3秒に、遅延時間を7秒に調整して、20秒ごとに写真を撮って処理した。励起波長470 nm（青色光）、強度50を選択した。フィルターを680 nmとして選択した。サンプルプレートをサーモプレートの上に置き、チャンバーを閉じて撮影を開始した。より適した分析のため、各画像のコントラスト値を選択した。ImageJ分析用にすべての画像を保存した。
SnapAndGoソフトウェアを開き、シリアルモードを選択し、サンプルの配置のためにチャンバーを閉じ、キャリブレーションが終了するまで待った。サーモプレートの電源を入れ、50°Cまで予熱した。キャリブレーション後、画像キャプチャ設定メニューの横をクリックした。設定メニューで、露光時間を3秒に、遅延時間を7秒に調整して、20秒ごとに写真を撮って処理した。励起波長470 nm（青色光）、強度50を選択した。フィルターを680 nmとして選択した。サンプルプレートをサーモプレートの上に置き、チャンバーを閉じて撮影を開始した。より適した分析のため、各画像のコントラスト値を選択した。ImageJ分析用にすべての画像を保存した。
＜iv. 画像分析＞
実施例１５に記載の方法と同様にして、画像分析を行った。
実施例１５に記載の方法と同様にして、画像分析を行った。
結果
分析結果を表５に示す。90秒での蛍光強度を採用し、15秒での蛍光強度をゼロに正規化した。蛍光強度は、リポソームとストレプトアビジンとの混合モル比が1：2のときに強化された。これは、リポソームとストレプトアビジンとの複合体化により、検出により多くのSQR22リポソームが関与することによって引き起こされたと考えられる。
分析結果を表５に示す。90秒での蛍光強度を採用し、15秒での蛍光強度をゼロに正規化した。蛍光強度は、リポソームとストレプトアビジンとの混合モル比が1：2のときに強化された。これは、リポソームとストレプトアビジンとの複合体化により、検出により多くのSQR22リポソームが関与することによって引き起こされたと考えられる。
（実施例１８）異なる濃度のSQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液による異なる量のストレプトアビジンを用いた蛍光強度の測定実験（非加熱）
本実施例の概要図を図１９Ａとして示す。ここでは、ビオチンとストレプトアビジンの複合体を使用して、マイクロプレートウェルにコーティングされたストレプトアビジンの、ビオチン化DOPCベシクルによる認識能を確認するために、異なる濃度で、ウェルの表面にストレプトアビジンをコーティングし、2つの異なるSQR濃度のSQR22含有ビオチン化DOPCベシクル分散液により、ストレプトアビジンの濃度差を検出できるか否かを検討した。本実施例で用いたDOPCベシクル分散液のゲル－液晶相転移温度は-22℃であるため、SQR22含有ビオチン化DOPCベシクル分散液は、室温でさえ強い赤色の蛍光を発する。ウェルを加熱する必要はないが、未結合のSQR22含有ビオチン化DOPCベシクルを除去するためにウェルを2回洗浄する必要がある。本実施例では、蛍光強度の検出にゲルアナライザー（Celvin）とImage Jを使用した。
本実施例の概要図を図１９Ａとして示す。ここでは、ビオチンとストレプトアビジンの複合体を使用して、マイクロプレートウェルにコーティングされたストレプトアビジンの、ビオチン化DOPCベシクルによる認識能を確認するために、異なる濃度で、ウェルの表面にストレプトアビジンをコーティングし、2つの異なるSQR濃度のSQR22含有ビオチン化DOPCベシクル分散液により、ストレプトアビジンの濃度差を検出できるか否かを検討した。本実施例で用いたDOPCベシクル分散液のゲル－液晶相転移温度は-22℃であるため、SQR22含有ビオチン化DOPCベシクル分散液は、室温でさえ強い赤色の蛍光を発する。ウェルを加熱する必要はないが、未結合のSQR22含有ビオチン化DOPCベシクルを除去するためにウェルを2回洗浄する必要がある。本実施例では、蛍光強度の検出にゲルアナライザー（Celvin）とImage Jを使用した。
手順
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。96ウェルマイクロプレート（greiner bio-one）へ、各種濃度（0.0125, 0.125, 0.25, 1.25, 2.5, 12.5 μg/mL）に希釈したストレプトアビジン溶液を1ウェル辺り40 μL添加した。添加後、乾燥機で45分乾燥（内部温度30～40℃）させ、ウェル底面にストレプトアビジンを固定させた。このストレプトアビジン修飾マイクロプレートに1%BSAを1ウェル辺り100 μL添加し10分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、0.05% Tween-PBS洗浄液（PBS-T、Takara Bio Inc.）にて3回洗浄を行った。
＜i. ストレプトアビジンをコーティングしたウェルの準備＞
ストレプトアビジンをDPBSに溶解し、希釈して20μg/mLのストック溶液を調製した。96ウェルマイクロプレート（greiner bio-one）へ、各種濃度（0.0125, 0.125, 0.25, 1.25, 2.5, 12.5 μg/mL）に希釈したストレプトアビジン溶液を1ウェル辺り40 μL添加した。添加後、乾燥機で45分乾燥（内部温度30～40℃）させ、ウェル底面にストレプトアビジンを固定させた。このストレプトアビジン修飾マイクロプレートに1%BSAを1ウェル辺り100 μL添加し10分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、0.05% Tween-PBS洗浄液（PBS-T、Takara Bio Inc.）にて3回洗浄を行った。
＜ii. サンプルの調製＞
SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液をDPBSで希釈し、SQR22濃度を2.0, 5.0μg/mLとした（SQR-DOPC）。100μLのSQR-DOPC分散液を、各量のストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加し、10分間静置した。最後に未結合のSQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液をPBS-Tで3回洗浄した。また、陰性対照は、DPBSを用いることでStreptavidinを固定させる操作だけ行わず、BSAブロッキング、洗浄、各濃度SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液の添加、洗浄、Celvinによる測定を同条件で行い、各サンプルウェルの隣に置いた。
SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液をDPBSで希釈し、SQR22濃度を2.0, 5.0μg/mLとした（SQR-DOPC）。100μLのSQR-DOPC分散液を、各量のストレプトアビジンでコーティングされたウェルに添加し、10分間静置した。最後に未結合のSQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液をPBS-Tで3回洗浄した。また、陰性対照は、DPBSを用いることでStreptavidinを固定させる操作だけ行わず、BSAブロッキング、洗浄、各濃度SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液の添加、洗浄、Celvinによる測定を同条件で行い、各サンプルウェルの隣に置いた。
＜iii. Celvinを用いた蛍光強度観察＞
SnapAndGoソフトウェアを開き、シリアルモードを選択し、サンプルの配置のためにチャンバーを閉じ、キャリブレーションが終了するまで待った。キャリブレーション後、画像キャプチャ設定メニューの横をクリックした。設定メニューで、露光時間30秒に調整して、写真を撮って処理した。励起波長625nm（赤色光）、強度50を選択した。フィルターを780 nmとして選択した。より適した分析のため、各画像のコントラスト値を選択した。ImageJ分析用にすべての画像を保存した。データは、各ウェルサンプルの蛍光強度からブランクの蛍光強度を引いた値とした。
SnapAndGoソフトウェアを開き、シリアルモードを選択し、サンプルの配置のためにチャンバーを閉じ、キャリブレーションが終了するまで待った。キャリブレーション後、画像キャプチャ設定メニューの横をクリックした。設定メニューで、露光時間30秒に調整して、写真を撮って処理した。励起波長625nm（赤色光）、強度50を選択した。フィルターを780 nmとして選択した。より適した分析のため、各画像のコントラスト値を選択した。ImageJ分析用にすべての画像を保存した。データは、各ウェルサンプルの蛍光強度からブランクの蛍光強度を引いた値とした。
結果
各ウェルの配置(アドレス)と、ウェル毎の補正後の蛍光強度を、それぞれ図１９Ｂ及び表６に示す。また、表６より作成したグラフを、図１９Ｃに示す。なお、表７のROI Noにおいて、太字はstv（ストレプトアビジン）(+) BSA(+) DOPC(+)を表し、それ以外はstv(-) BSA(+) DOPC(+)を示す。
各ウェルの配置(アドレス)と、ウェル毎の補正後の蛍光強度を、それぞれ図１９Ｂ及び表６に示す。また、表６より作成したグラフを、図１９Ｃに示す。なお、表７のROI Noにおいて、太字はstv（ストレプトアビジン）(+) BSA(+) DOPC(+)を表し、それ以外はstv(-) BSA(+) DOPC(+)を示す。
5.0μg/mL SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液も2.0μg/mL SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液も、1ウェル辺りのストレプトアビジンの結合量（ウェルに加えたストレプトアビジンが100％結合したと仮定）が0.01μg/ウェルからCelvinで測定した蛍光強度が増加し、0.1μg／ウェルでほぼ強度が一定値を示した。その一定値の値は5.0μg/mL SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液の方が高かった。他方、陰性対照では、ブランクを引いたものはウェルの場所による有意な相違は認められなかったので、平均化してグラフには点線で示した（図１９Ｃ）。
この点線は、5.0μg/mL SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液と2.0μg/mL SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液では、5.0μg/mL SQR含有ビオチン化DOPCベシクル分散液の方が高くなっており、ストレプトアビジン結合量が0.01μg/ウェル以下の値とほぼ一致していた。従って、SQR含有ベシクルの非特異的な吸着があり、それがSQR含有ベシクル濃度に依存していることが分かった。しかしながら、両SQR含有ベシクル分散液ともにストレプトアビジン結合量0.05μg/ウェルにて陰性対照との有意な相違が認められた。
以上のことより、本発明により、一般的なELISA法よりも感度よく、簡便な生体分子の検出及び測定が可能となることが示された。表７に、本発明の方法（TLip-LISA）と、ELISA法の性能比較の結果を示す。
本発明の温度応答性蛍光粒子は、温度応答性蛍光プローブ粒子の作製に利用できる。そして、該温度応答性蛍光プローブ粒子は、疾病や感染に関連するバイオマーカーを定量ないし1分子レベルでデジタル計数し検出できる。そこで、本発明の温度応答性蛍光プローブ粒子やこれを用いる検出法や定量法は、疾病や感染の診断薬や診断方法として利用できる。
本出願は、日本で出願された特願２０１９－１００２９９（出願日：２０１９年５月２９日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (14)
- 少なくとも一種の両親媒性脂質分子を含み構成される分子集合体中に、少なくとも一種の蛍光分子を含む温度応答性蛍光粒子であって、
温度に応答する固相－液相転移により、前記分子集合体が固相のときに前記蛍光分子が消光し、液相のときに蛍光発光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の消光と蛍光発光とが可逆的に変換し、
前記分子集合体は、固相のときに凝集した蛍光分子を有し、液相のときに解離した蛍光分子を有し、
前記蛍光分子は、下記一般式Ｉで表される化合物であり、
- 前記分子集合体が脂質二重層を有し、温度に応答するゲル－液晶相転移により、前記分子集合体がゲル相のときに前記蛍光分子が消光し、液晶相のときに蛍光発光し、
これにより、温度に応答して蛍光分子の消光と蛍光発光とが可逆的に変換することを特徴とする、請求項１に記載の温度応答性蛍光粒子。 - 前記両親媒性分子がリン脂質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の温度応答性蛍光粒子。
- 前記分子集合体が二分子膜ベシクルであることを特徴とする、請求項３に記載の温度応答性蛍光粒子。
- 前記二分子膜ベシクルは、前記一般式Ｉで表される化合物を0.3mol％以上含有することを特徴とする、請求項４に記載の温度応答性蛍光粒子。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の温度応答性蛍光粒子の表面を修飾した生体分子認識素子を有することを特徴とする、温度応答性蛍光プローブ粒子。
- 前記生体分子認識素子がビオチン、抗体又は該抗体の可変領域若しくは該抗体のfab断片、アプタマーであることを特徴とする、請求項６に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子。
- （１）請求項６又は７に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップと、
（２）該基板を加熱するステップと、
（３）蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、該生体試料中に含まれる生体分子の検出又は定量法。 - （１）請求項６又は７に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子とを接触させるステップと、
（２）該基板を洗浄するステップと、
（３）蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出又は定量法。 - 前記ステップ（１）が、請求項６又は７に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、生体分子認識素子を認識する素子と、検出用生体分子認識素子と、生体試料とを、基板に固定された捕獲用生体分子認識素子に接触させるステップである、請求項８又は９に記載の方法。
- 生体分子認識素子がビオチンであり、生体分子認識素子を認識する素子がストレプトアビジン、アビジン又はニュートラアビジンである、請求項１０に記載の方法。
- 請求項６又は７に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子と、標的生体分子と、捕獲用生体分子認識素子と、熱源とを含み構成される複合体を形成させるステップと、
前記複合体の形成により熱源から温度応答性蛍光プローブへの熱伝導が促進され、前記温度応答性蛍光プローブの固相から液相への相転移により前記蛍光分子が蛍光発光し、該蛍光発光を測定するステップと、
を含むことを特徴とする、生体分子の検出法。 - 請求項１２に記載の生体分子の検出法において、蛍光発光する温度応答性蛍光プローブ粒子の数を計数することにより被験試料中の標的生体分子の数を計数することを特徴とする、生体分子の定量法。
- 請求項６又は７に記載の温度応答性蛍光プローブ粒子を含む、生体分子の検出又は測定用キット。
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