TW202104874A - 檢測生體分子用的溫度響應性螢光粒子 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種溫度響應性螢光粒子,其係於包含至少一種兩親性分子而構成之分子集合體中,包含至少一種螢光分子,其中,藉由響應於溫度之固相-液相轉移,前述分子集合體於液相時前述螢光分子會進行螢光發光,於固相時會消光,藉此,螢光分子的螢光發光與消光係響應於溫度而可逆地轉換。再者,本發明提供一種於該溫度響應性螢光粒子的表面修飾有生體分子辨識元件之溫度響應性螢光探針,以及使用該溫度響應性螢光探針之生體分子的檢測法及定量法之測定法。
Description
本發明係關於檢測生體分子用的溫度響應性螢光粒子、使用該溫度響應性螢光粒子之溫度響應性螢光探針粒子、以及使用該粒子之生體分子的檢測法及生體分子的定量法。
近年來,生體分子(生物標記)的檢測及定量係多採用ELISA法。由於ELISA法是利用抗原-抗體反應,所以可得到高特異性,惟另一方面試劑的洗淨或酵素反應等操作較為繁瑣而耗費時間,並且生體分子的檢測濃度約1pM,仍有其侷限。
此外,亦有開發使ELISA法更進一步進展之生體分子的檢測法。例如在稱為數位ELISA法之方法中,係精心安排反應裝置以在微小液滴(飛升(Femtoliter))中進行酵素反應而實現高感度化(非專利文獻1、2)。然而,此等方法的測定原理與ELISA法相同,仍有操作較以往的ELISA法更繁瑣而耗費時間之問題。
Single Molecule Counting(SMCTM) Immunoassay Technology(單分子生物標記免疫檢測技術)係被開發作為分子檢測技術(非專利文獻3)。此技術亦
以ELISA法為原理,並精心安排檢測器的光學系以使檢測區域達到微小化而提升檢測感度。然而必須使用專用且昂貴的檢測器,並且重複掃描微小區域,所以測定耗費時間。
此外,有使用免疫層析法者(非專利文獻4),惟由於感度低,而有無法使用在疾病或感染的早期發現,藉由目視判定而有判定者之辨識感度差別等,偽陰性率(20至30%)亦高之缺點。
於藉由生物標記之疾病或感染的早期診斷中,需具有1pM以下的檢測感度,因而期待更高感度、簡便且在短時間可實施之檢測法的開發。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
非專利文獻1:Rissin D. M., et al, Nat. Biotechnol. 2010:28(6):595-9
非專利文獻2:Kim S. H., et al, Lab Chip, 2012, 12, 4986-4991.
非專利文獻3:Hwang J., et al, Methods, 2019, 158,69-79.
非專利文獻4:Hurt C. A., et al, J. Clin. Virol., 2007, 39, 132-135
本發明之課題在於提供一種簡便且在短時間可檢測低濃度的標的生體分子(生物標記)之標的生體分子的測定法、以及該測定法所使用之溫度響應性螢光粒子及溫度響應性螢光探針。
本發明者們係合成以下述式I表示之具有螢光性之方酸(Squaric Acid)衍生物作為螢光分子。並且發現到將本化合物納入於具有凝膠-液晶相轉移之脂質囊泡時,其螢光發光在脂質囊泡顯示凝膠相之溫度下未被觀察到,當加熱該脂質囊泡的分散液並轉換至液晶相時,則顯現出強螢光發光,因而完成本發明之溫度響應性螢光粒子。然後闡明此現象的機轉,並闡明前述螢光分子於凝膠相時藉由凝集而消光,於液晶相時藉由解離而進行螢光發光。再者,根據此溫度響應性螢光粒子與機轉,朝向將前述溫度響應性螢光粒子的表面以生體分子辨識元件進行修飾而得之溫度響應性螢光探針粒子進行開發,而確立了一種作為標的之生體分子的檢測法及該生體分子的定量法。
惟R1及R2各自獨立地表示可為相同或相異之疏水性基。
具體而言,本發明係提供一種溫度響應性螢光粒子,其係於包含至少一種兩親性分子(於本說明書中,在該分子為脂質分子之情形下亦稱為「兩親性脂質分子」)而構成之分子集合體中,包含至少一種螢光分子,其中
藉由響應於溫度之固相-液相轉移,前述分子集合體於液相時前述螢光分子會進行螢光發光,於固相時會消光,
藉此,螢光分子的螢光發光與消光係響應於溫度而可逆地轉換。前述分子集合體較佳係具有單分子膜或雙分子膜。
於上述所述之溫度響應性螢光粒子中,前述分子集合體於固相時具有凝集的螢光分子,於液相時具有解離的螢光分子,
該螢光分子為以下述一般式A所表示之化合物。在前述分子集合體為具有脂質雙重層之分子集合體的情況,前述固相為凝膠相,此外,前述液相為液晶相。
本發明之溫度響應性螢光粒子於前述分子集合體的相轉移中,有於液晶相時會因為螢光分子的解離而進行螢光發光,於凝膠相時會因為螢光分子的凝集而消光的情況。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,前述螢光分子有為方酸衍生物的情況。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,前述螢光分子有為以下述一般式I表示之化合物的情況;
惟R1及R2各自獨立地表示可為相同或相異之疏水性基。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,R1及R2有為直鏈飽和烴的情況。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,R1及R2有選自正丁基、正戊基或正己基的情況。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,前述兩親性分子有為磷脂質的情況。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,前述分子集合體有為雙分子膜囊泡,例如脂質囊泡的情況。
於本發明之溫度響應性螢光粒子中,前述雙分子膜囊泡有含有0.3mol%以上之以前述一般式I表示之化合物。
此外,本發明係提供一種具有修飾前述溫度響應性螢光粒子的表面的生體分子辨識元件之溫度響應性螢光探針粒子。
於本發明之溫度響應性螢光探針粒子中,前述生體分子辨識元件有為抗體或該抗體的可變區域或該抗體的fab片段的情況。
此外,本發明係提供一種生體分子的檢測或定量法,其特徵係包含:使前述溫度響應性螢光探針粒子與生體試樣與於被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件接觸之步驟,洗淨該基板之步驟,以及測定螢光發光之步驟。
再者,本發明係提供一種藉由螢光發光檢測標的生體分子之生體分子的檢測法,其係包含:以經由標的生體分子之特異性分子辨識,將前述溫度響應性螢光探針粒子固著於熱源之步驟;
並且包含:藉由從熱源往溫度響應性螢光探針粒子之熱傳導使該溫度響應性螢光粒子的溫度上升,藉此使溫度響應性螢光探針粒子響應於溫度而從凝膠相往液晶相之相轉移,並藉由該相轉移使溫度響應性螢光探針粒子中的螢光分子進行螢光發光,然後檢測該螢光發光之步驟。
再者,本發明係提供一種生體分子的檢測法,其係包含:形成包含前述溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子、捕獲用生體分子辨識元件和熱源而構成之複合體之步驟;以及
藉由前述複合體的形成而促進從熱源往溫度響應性螢光探針之熱傳導,並藉由前述溫度響應性螢光探針從凝膠相往液晶相之相轉移使前述螢光分子進行螢光發光,然後測定該螢光發光之步驟。
此外,本發明係提供一種生體分子的檢測法,其係包含:形成包含前述溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子和捕獲用生體分子辨識元件而構成之複合體之步驟,
去除未與前述捕獲用生體分子辨識元件形成複合體之溫度響應性螢光探針之步驟,以及
測定來自構成前述複合體之溫度響應性螢光探針粒子的螢光發光之步驟。
於前述生體分子的檢測法中,係提供一種生體分子的定量法,其係藉由計數產生螢光發光之溫度響應性(以下有時亦稱為「溫度感受性」)螢光探針粒子的數目,來計數被試驗試樣中之標的生體分子的數目。
於本發明之生體分子的定量法中,在前述產生螢光發光之溫度響應性螢光探針粒子數的計測中,有檢測藉由從前述被試驗試樣所製作之微小液滴(微滴)中所含有之1分子的前述標的生體分子所產生之螢光發光,而計測具有該螢光發光之微小液滴的數目的情況。或是於本發明之生體分子的定量法中,亦可使用基板(例如:微孔板)藉由攝影機來拍攝而一次取得螢光發光的數據。
於本發明之生體分子的定量法中,相對於標的生體分子之檢測極限有被試驗試樣的每1檢體為1分子的標的生體分子的情況。
亦即,本發明係關於下列內容。
[1]
一種溫度響應性螢光粒子,其係於包含至少一種兩親性分子而構成之分子集合體中,包含至少一種螢光分子,其中
藉由響應於溫度之固相-液相轉移,前述分子集合體於固相時使前述螢光分子會消光,於液相時則會進行螢光發光,
藉此,響應於溫度而使螢光分子的消光與螢光發光可逆地轉換。
[2]
如[1]所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述分子集合體於固相時具有凝集的螢光分子,於液相時具有解離的螢光分子,該螢光分子為以下述一般式A表示之化合物。
[3]
如[2]所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述螢光分子為以下述一般式I表示之化合物;
惟R1及R2各自獨立地表示可為相同或相異之疏水性基。
[4]
如[1]至[3]中任一項所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述分子集合體具有脂質雙重層,並藉由響應於溫度之凝膠-液晶相轉移,前述分子集合體於凝膠相時使前述螢光分子會消光,於液晶相時則會進行螢光發光,
藉此,響應於溫度而使螢光分子的消光與螢光發光可逆地轉換。
[5]
如[1]至[4]中任一項所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述兩親性分子為磷脂質。
[6]
如[5]所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述分子集合體為雙分子膜囊泡。
[7]
如[6]所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述雙分子膜囊泡為脂質囊泡。
[8]
如[6]或[7]所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述雙分子膜囊泡含有0.3mol%以上之以前述一般式I表示之化合物。
[9]
一種溫度響應性螢光探針粒子,其係具有:修飾如[1]至[8]中任一項所述之溫度響應性螢光粒子的表面的生體分子辨識元件。
[10]
如[9]所述之溫度響應性螢光探針粒子,其中前述生體分子辨識元件為生物素(Biotin)、抗體或該抗體的可變區域或該抗體的fab片段、適體(Aptamer)。
[11]
如[1]至[10]中任一項所述之溫度響應性螢光探針粒子,其中溫度響應性螢光探針粒子的固相-液相轉移溫度為30℃以下。
[12]
一種生體試樣中所含有之生體分子的檢測或定量法,其係包含:
(1)使如[9]或[10]所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣與被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件接觸之步驟,
(2)加熱該基板之步驟,以及
(3)測定螢光發光之步驟。
[13]
一種生體分子的檢測或定量法,其係包含:
(1)使如[9]或[10]所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣與被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件接觸之步驟,
(2)洗淨該基板之步驟,以及
(3)測定螢光發光之步驟。
[14]
如[13]所述之方法,其中溫度響應性螢光探針粒子的固相-液相轉移溫度為30℃以下。
[15]
如[12]至[14]中任一項所述之方法,其中前述步驟(1)為使如[9]或[10]所述之溫度響應性螢光探針粒子、辨識生體分子辨識元件之元件、檢測用生體分子辨識元件、和生體試樣與被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件接觸之步驟。
[16]
如[15]所述之方法,其中生體分子辨識元件為生物素,辨識生體分子辨識元件之元件為鏈親和素、親和素或中性親和素。
[17]
一種生體分子的檢測法,其係包含:
形成包含如[9]或[10]所述之溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子、捕獲用生體分子辨識元件和熱源而構成之複合體之步驟;以及
藉由前述複合體的形成而促進從熱源往溫度響應性螢光探針之熱傳導,並藉由前述溫度響應性螢光探針從固相(包含凝膠相。以下同)往液相(包含液晶相。以下同)之相轉移使前述螢光分子進行螢光發光,測定該螢光發光之步驟。
[18]
一種生體分子的檢測法,其係包含:形成包含如[9]或[10]所述之溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子和捕獲用生體分子辨識元件而構成之複合體之步驟,
去除未與前述捕獲用生體分子辨識元件形成複合體之溫度響應性螢光探針粒子之步驟,以及
測定來自構成前述複合體之溫度響應性螢光探針粒子的螢光發光之步驟。
[19]
一種生體分子的定量法,其係在如[17]或[18]所述之生體分子的檢測法中,藉由計數進行螢光發光之溫度響應性螢光探針粒子的數目,來計數被試驗試樣中之標的生體分子的數目。
[20]
一種生體分子的檢測或測定用套組,其係含有如[9]或[10]所述之溫度響應性螢光探針粒子。
[21]
如[20]所述之生體分子的檢測或測定用套組,其中包含捕獲用生體分子辨識元件。
[22]
如[21]所述之生體分子的檢測或測定用套組,其中捕獲用生體分子辨識元件被固定在基板。
[23]
如[21]或[22]所述之生體分子的檢測或測定用套組,其中包含檢測用生體分子辨識元件。
[24]
如[20]至[23]中任一項所述之生體分子的檢測或測定用套組,其中包含辨識生體分子辨識元件之元件。
[25]
如[20]至[24]中任一項所述之生體分子的檢測或測定用套組,其中生體分子辨識元件為生物素,辨識生體分子辨識元件之元件為鏈親和素、親和素或中性親和素。
[26]
如[20]至[25]中任一項所述之生體分子的檢測或測定用套組,其中包含洗淨液。
藉由本發明,可提供一種能夠簡便且可在短時間內檢測出低濃度的標的生體分子(生物標記)之測定法,以及使用於該測定法之溫度響應性螢光粒子及溫度響應性螢光探針粒子。更具體而言,於本發明中,與以往的螢光探針粒子不同,於溫度響應性螢光探針粒子中可調節消光狀態與發光狀態的轉換溫度。因此可提供一種適合於各種檢測裝置、檢測器、測定條件之溫度的響應之螢光探針粒子,本發明可在廣泛用途中實施作為簡便、迅速且高感度之生體分子的檢測法及生體分子的定量法。
圖1A為顯示作為SQR22的分光特性之SQR22溶液於可見光下的外觀(上段)與於紫外線(365nm)下的螢光發光(下段)的照片圖。其中表示:1.己烷、2.環己烷、3.甲苯、4.苯、5.二氯甲烷、6.四氫呋喃、7.三氯甲烷、8.乙醇、9.甲醇、10.丙酮、11.乙腈、12.二甲基甲醯胺、13.二甲基亞碸、14.水。
圖1B為顯示作為SQR22的分光特性之螢光量子產率及最大螢光發光波長與溶劑的極性之關係圖。
圖2A為說明屬於螢光色素之SQR22的化學結構,與將SQR22導入於脂質雙分子膜粒子(脂質囊泡)之脂質雙分子膜粒子(以下記載為「NVSQ」)之圖。
圖2B為顯示藉由導入於脂質雙分子膜粒子之SQR22的加熱與冷卻所形成之可逆性溫度響應性之圖。係顯示藉由加熱與冷卻之脂質囊泡膜中之SRQ22的可逆性溫度響應性之圖。照片係顯示於25℃(螢光OFF)及約50℃(螢光ON)時之PC16-NVSQ分散液(脂質/SQR22=50w/w、SQR22濃度=10μM)的螢光。
圖2C為顯示將PC16-NVSQ加熱至25℃及50℃時之螢光強度的經時變化圖。箭頭顯示將樣本(約23℃)注入於在設定溫度保溫之石英槽之點。
圖2D為顯示重複進行10循環的加熱與冷卻後之PC16-NVSQ(SQR22濃度=1μM)之螢光切換的重現性之圖。螢光強度係在48℃(加熱)及25℃(冷卻)時測定。
圖3A為顯示含SRQ22分子集合體(NVSQ)之示意圖與各種磷脂醯膽鹼(PC)的分子結構之圖。
圖3B為顯示含SQR22之脂質雙分子膜粒子分散液的紫外線可見光近紅外線吸收光譜與外觀之圖。
圖4A為顯示PC-NVSQ的溫度響應性螢光特性之圖。顯示於25℃時之PC-NVSQ分散液的螢光(SQR22濃度=10μM)。從左邊依序顯示PC14-、PC15-、PC16-、PC17-、及PC18-NVSQ。
圖4B為顯示PC-NVSQ分散液的螢光發光光譜(脂質/SQR22=50w/w)之圖。對於PC14-、PC15-、PC16-、PC17-、及PC18-NVSQ,分別於40、45、50、55、及60℃測定螢光發光光譜(λex=570nm)。
圖4C為顯示升溫及降溫時之PC-NVSQ分散液之螢光強度的變化之圖(SQR22濃度=1μM)。數據是從3次不同的實驗所得到之結果的平均值±標準差。
圖5A為顯示於加熱及冷卻時之含有3.3莫耳%的SQR22之PC16多重層脂質囊泡上之螢光的可逆性切換的顯微鏡觀察中,藉由980nm的NIR雷射照射進行加熱之含有SQR22之脂質囊泡的螢光切換之概要圖。
圖5B為觀測固定在洋菜糖凝膠之脂質囊泡的螢光圖像之照片的圖。係顯示加熱前(0秒)、加熱中(43秒)、冷卻後(77秒)。
圖5C為觀測於加熱及冷卻時之含有3.3莫耳%的SQR22之PC16多重層脂質囊泡中之SQR22的螢光強度隨時間經過的變化之圖。
圖5D為顯示於加熱及冷卻時之單一脂質囊泡的縮時攝影圖像之圖。
圖6A為顯示SQR22的含量相異之PC16-脂質囊泡之螢光(25℃)(SQR22濃度=10μM)的外觀,作為顯示螢光切換的機制之分光分析的結果之照片的圖。
圖6B為顯示由溫度不同對SQR22的含量相異之PC16-脂質囊泡分散液的螢光強度所產生之變化之圖。數據係於降溫時取得。
圖6C為顯示PC16-脂質囊泡的SQR22含量與於25℃及45℃時的螢光強度之相關,以及於25℃(FI25)及45℃(FI45)時的螢光強度之比(SQR22:1μM)之圖。
圖6D1為顯示含有3.3莫耳%的SQR22(SQR22濃度=10μM)之PC16-脂質囊泡的UV-vis-NIR光譜之由溫度不同所產生之變化之圖。
圖6D2為顯示含有0.1莫耳%的SQR22(SQR22濃度=10μM)之PC16-脂質囊泡的UV-vis-NIR光譜之由溫度不同所產生之變化之圖。
圖6E為顯示含有3.3莫耳%及0.1莫耳%的SQR22(SQR22濃度=10μM)之PC16-脂質囊泡的UV-vis-NIR光譜之由溫度不同所產生之最大吸收波長(λmax)的變化之圖。
圖7為顯示脂質雙分子膜粒子中之SQR22的螢光切換的推測機制之概要圖。在從脂質雙分子膜粒子的凝膠相往液晶相之轉移溫度(T),藉由SQR22的可逆性凝集所成之消光以及藉由解離所成之發光係引起螢光之關斷/導通的轉換。
圖8為顯示3.3莫耳%之SQR23的化學結構,與含有SQR23之PC16脂質囊泡分散液於升溫時之螢光強度的變化(SQR23濃度=1μM)之圖。數據是從3次不同的實驗中所得到之結果的平均值±標準差。
圖9為顯示經0.5莫耳%的生物素做表面修飾之PC16-脂質囊泡(SQR22的含量為3.3莫耳%)(溫度響應性螢光探針粒子模型)於升溫時之螢光強度的變化(SQR22濃度=1μM)之圖。
圖10A為說明觀測到藉由透過生物素化溫度響應性螢光探針粒子與鏈黴親和素固定化基板(熱源)的分子辨識之鍵結,所成之螢光發光的變化之實驗群之圖。(A)使生物素化溫度響應性螢光探針粒子作用於鏈黴親和素固定化基板,(B)使未經修飾溫度響應性螢光粒子作用於鏈黴親和素固定化基板,(C)使生物素化溫度響應性螢光探針粒子作用於以過剩量的生物素封端之鏈黴親和素固定化基板。
圖10B為顯示上述圖10A中所說明之實驗的實驗結果之圖。係表示從開始進行鏈黴親和素固定化基板的加溫(亦稱為加熱,以下同)後之各實驗群中之螢光強度的經時變化。
圖11為顯示將生物素化溫度響應性螢光探針粒子添加於鏈黴親和素固定化基板後的培養時間與開始加溫後的螢光強度到達最大為止的時間之關係之圖。
圖12A為示意性顯示使用市售的三明治ELISA套組之PSA的檢測之圖(參考圖)。
圖12B為示意性顯示使用生物素化溫度響應性螢光探針粒子之PSA的檢測之圖。
圖12C為顯示於使用生物素化溫度響應性螢光探針粒子之PSA的檢測中,PSA濃度與開始加溫後的螢光強度到達最大為止的時間之關係之圖。數據為三次的獨立測定之平均值±標準差。
圖13A為說明藉由透過生物素化溫度響應性螢光探針與鏈黴親和素化金奈米粒子(熱源)的分子辨識之鍵結,來檢測1個溫度響應性螢光探針所發出之螢光之例子的實驗系之圖。
圖13B為顯示上述圖12A中所說明之實驗系的實驗結果之圖。(A)至(C)表示於已混合生物素化溫度響應性螢光探針與鏈黴親和素化金奈米粒子之實驗系中,(D)表示於已混合作為陰性對照之無生物素化溫度響應性螢光探針與鏈黴親和素化金奈米粒子之實驗系中之螢光強度的經時變化。
圖14A為顯示使用微流體裝置之分子數的數位計數方法的例子之圖。係顯示由微流體裝置所形成之微小液滴化與螢光檢測的構成。
圖14B為顯示微小液滴的直徑與容積之關係之圖。
圖14C為顯示在從卜瓦松(Poisson)分布所估計之標的分子數/微小液滴數=0.1的條件之內含於1個微小液滴之標的分子數的次數之圖。
圖14D為說明藉由微小液滴化與螢光發光微小液滴的計數所算出之分子數濃度的圖。
圖15為示意性顯示採用了使同一生體分子辨識元件附加於溫度響應性螢光探針粒子與檢測用生體分子辨識元件之生體分子的檢測之圖。A為有加熱,B為無加熱之情形時的示意圖,C顯示於1分子的生體分子中鍵結有4聚物的溫度響應性螢光探針粒子。
圖16A為實施例15之概要圖。
圖16B為實施例15中所使用之各微孔的號碼之圖。
圖16C為實施例15之微孔於10秒時點中的照片(上圖)以及於244秒時點中的照片(下圖)。
圖16D顯示實施例15的結果。橫軸顯示經過時間(秒),縱軸顯示平均螢光強度。
圖17A為實施例16之概要圖。
圖17B顯示實施例16的結果。橫軸顯示經過時間(秒),縱軸顯示平均螢光強度。
圖17C為顯示於實施例16中,於180秒時點之螢光強度(縱軸)與鏈黴親和素的濃度(橫軸)之相關關係。
圖18為實施例17之概要圖。
圖19A為實施例18之概要圖。
圖19B顯示實施例18的結果(照片)。
圖19C為從實施例18的測定結果所製作之圖。橫軸顯示添加於微孔之鏈黴親和素的量,縱軸顯示螢光強度。
1.溫度響應性螢光粒子
本發明的實施型態之一為溫度響應性螢光粒子。
溫度響應性螢光粒子係於包含至少一種兩親性分子而構成之分子集合體中,包含至少一種螢光分子。亦即,本發明係利用:伴隨著熱轉移(亦即從固相往液相之轉移或從凝膠相往液晶相之轉移),使由螢光分子的凝集所成之消光狀態解離而成為發光狀態之現象。因此,本發明中所使用之溫度響應性螢光粒子只要可保持分子集合體形態,從固相狀態往液相狀態引起相轉移者即可,則無特別限制地使用。前述分子集合體較佳係具有單分子膜或雙分子膜。前述分
子集合體尤佳係具有脂質雙分子膜(亦稱為脂質雙重層)。本發明者們於製作載持螢光分子之單分子膜乳化物時,亦確認到大部分的螢光分子(SQR22)被納入於疏水部而觀察到螢光發光(數據未顯示)。
前述兩親性分子(例如:脂質分子)並不限定於來自生體之脂質,亦包含可藉由以半合成、合成所製造之磷脂質等低分子或其衍生物、高分子、胜肽、胺基酸、羧酸等為原料而藉由合成所製造之兩親性分子。
前述溫度響應性螢光粒子係藉由響應於溫度之固相-液相轉移,前述分子集合體於液相時使前述螢光分子解離而進行螢光發光,於固相時凝集而消光,藉此可響應於溫度而可逆地轉換螢光分子的螢光發光與消光。
亦即如下述實施例中所詳細說明般,前述分子集合體係顯示響應於溫度之固相-液相轉移,於液相時具有已解離的螢光分子而進行螢光發光,於固相時具有已凝集的螢光分子並藉由凝集起因消光(aggregation-caused quenching)而消光。在前述分子集合體為具有脂質雙重層之分子集合體之情形,前述固相為凝膠相,此外,前述液相為液晶相。
由於前述螢光分子被配置在由水相中成為分子集合狀態所建構之疏水性的區域,例如以單分子膜所包圍之區域或是脂質雙分子膜等雙分子膜中,所以較佳為兩親性或脂溶性的螢光分子。通常螢光分子具有藉由凝集而消光之性質,所以只要是響應於固相-液相轉移(例如脂質雙分子膜的凝膠-液晶相轉移)而顯示出凝集與解離之螢光分子,則可轉換消光與發光。
該螢光分子的例子可列舉以下述一般式A所表示之化合物。
生體分子係有菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate)、核黃素(Flavin)類、蛋白質、胺基酸等吸收600nm以下之波長的光並發出600nm以下之波長的螢光(本身螢光)者。因此,於生體分子的檢測中使用最大吸收波長與最大螢光發光波長為600nm以下之螢光探針時,於螢光測定中會有由夾雜分子的本身螢光所造成之干涉之問題。因此,本發明之以一般式(A)表示之化合物較佳是最大吸收波長與最大螢光發光波長為600nm以上之螢光分子,在進一步考量到將980nm以上之波長的光照射於水時,由水的吸收所造成之發熱會作用於溫度響應性粒子之情形,尤佳是最大吸收波長與最大螢光發光波長位於600至900nm的範圍之螢光分子。
前述螢光分子之前述式(A)之化合物的更具體例子可列舉方酸衍生物。
前述方酸衍生物的例子可列舉以下述一般式I表示之化合物;
惟R1及R2各自獨立地表示可為相同或相異之疏水性基。
以一般式A或一般式I表示之化合物不僅為游離體,亦可包含其鹽。該鹽係因化合物種類的不同而不同,例如可列舉鹼金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽等)、
鹼土金屬鹽(鈣鹽、鎂鹽等)、鋁鹽、銨鹽等無機鹼鹽以及三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、N,N'-二苄基乙二胺等有機鹼鹽等鹼加成鹽;或是鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽;或檸檬酸鹽、草酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、三氟乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、甲烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等有機酸鹽等酸加成鹽。
於前述方酸衍生物中,R1及R2可為直鏈烴,亦可為分枝鏈烴,此外,可為飽和烴,亦可為不飽和烴。較佳可列舉直鏈飽和烴,惟只要是前述螢光分子於前述分子集合體的液晶相為解離,於凝膠相為凝集即可,不限定於此。
作為R1及R2的更具體例,例如,可列舉碳數2至10的烴基,更具體而言,可選自正丁基、正戊基或正己基,惟只要於前述分子集合體的液晶相時會解離,於凝膠相時會凝集即可,不限定於此。
作為前述兩親性分子之例,可列舉磷脂質。
磷脂質的種類並無特別限定,較佳為甘油磷脂質(亦稱為二醯基型磷脂質),尤其在形成顯示相轉移之安定的脂質雙分子膜時,較佳為於親水部具有磷膽鹼基之二醯基型磷脂質。二醯基型磷脂質的醯基鏈長可為相同亦可為相異。具有磷膽鹼基之二醯基型磷脂質,包含飽和磷脂質及不飽和磷脂質,兩者於本發明中皆可使用,此外,亦可組合此等而使用。飽和磷膽鹼可使用合成或半合成,例如接近於100%的氫化率之氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂等天然系磷脂質及其衍生物,此外,可使用二肉豆蔻醯基磷膽鹼、二(十五烷醯基)磷膽鹼、二棕櫚醯基磷膽鹼、二(十七烷醯基)磷膽鹼、二硬脂醯基磷膽鹼等。
此外,作為前述分子集合體之例,可列舉具有以單分子膜(亦稱為單層)包圍之疏水性芯之乳化物或脂質奈米粒子、具有封閉為球殼狀之膜構造之小胞的囊泡。該囊泡可列舉脂質雙分子膜囊泡(亦稱為脂質體),惟並不限定於此。可使用作為本發明之溫度響應性螢光粒子,亦即可使用作為前述分子集合體之粒子,只要是在特定溫度進行固相-液相轉移或凝膠-液晶相轉移之分子集合體即可,並不限定於多重層或單層或是其粒徑等。
為了防止脂質囊泡等之分子集合體的凝集或融合,可於構成成分包含於親水部具有荷電殘基或高分子鏈之兩親性分子。如此所得到之脂質囊泡等之分子集合體,可透過由電荷所帶來之靜電排斥或由高分子鏈所帶來之立體阻礙效果而具有高的分散安定性。
作為具有荷電殘基之兩親性分子之例,於該分子為脂質分子之情形,可列舉於親水部具有磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸之陰離子性磷脂質或是L-麩胺酸,N-(3-羧基-1-側氧丙基)-,1,5-二(十六烷基)酯(SA)等羧酸型脂質、於親水基具有胺基酸之胺基酸型脂質。
此外,作為具有高分子鏈之兩親性分子之例,於該分子為脂質分子之情形,可列舉1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-單甲氧基聚(乙二醇)。聚(乙二醇)的分子量並無限制,就防止脂質囊泡的凝集而言,較佳為1000至5000的分子量。
此外,作為兩親性分子,於該分子為脂質分子之情形,亦可使用:1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC14)、1,2-二(十五烷醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC15)(Avanti Polar Lipids Inc.製)、1,2-二(十七烷醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC17)(Avanti Polar Lipids Inc.製)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC18)、1,2-二棕櫚
醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC16(亦稱為DPPC))、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DOPC)、1,5-二(十六烷基)-N-琥珀基-L-麩胺酸(DHSG)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)等。
前述脂質囊泡等分子集合體中之螢光分子的凝集起因消光係與依賴於該分子集合體中的濃度,伴隨著螢光分子濃度的降低,凝集起因消光亦減少。因此,本發明之溫度響應性螢光粒子係以0.3mol%以上,較佳為0.7mol%以上,尤佳為1.0mol%以上的濃度含有以前述一般式I表示之化合物。
該溫度響應性螢光粒子的製造可藉由在前述分子集合體的製造時使前述式I的化合物共存而取得。分子集合體之製造的例子可依循一般所知之脂質囊泡的製造方法來製造(Sheng Dong et al,ACS Appl.Nano Mater.2018,1,1009-1013)。
本發明之溫度響應性螢光粒子可利用在下述溫度響應性螢光探針粒子的製造。
2.溫度響應性螢光探針粒子
本發明的另一實施型態為溫度響應性螢光探針粒子。
前述溫度響應性螢光探針粒子可藉由以生體分子辨識元件來修飾溫度響應性螢光粒子的表面而取得。於本說明書中所謂「元件」,意指發揮特定的功能,例如生體分子辨識功能等之分子,可互換性地使用「元件」與「分子」之用語。此外,於本說明書中所謂「辨識」,意指辨識標的的分子並結合於該分子。再者,「生體分子辨識元件」不僅是其本身直接辨識生體分子,並且亦包括經由與其他分子或分子複合體(例如:鏈黴親和素與辨識生體分子之生物素化抗體之複合體等)之結合而間接地辨識生體分子元件者。
作為前述生體分子辨識元件之例,可列舉抗體或該抗體的可變區域或該抗體的fab片段(以下記載為「抗體等」)。於本說明書中,該元件,例如抗體等係如下述所說明般稱為「檢測用生體分子辨識元件」,在元件為抗體等之情形,亦稱為「檢測抗體」。
另一方面,以將標的生體分子固定在測定容器底面等為目的,有時使用對於標的生體分子的其他表位之元件,例如抗體等。於本說明書中,將該元件稱為「捕獲用生體分子辨識元件」,在元件為抗體等之情形,亦稱為「捕獲抗體」。
前述生體分子辨識元件藉由與檢測或測定對象之標的生體分子結合,可形成標的生體分子與前述溫度響應性螢光粒子之複合體。
如先前技術之三明治ELISA法中所使用般,在使用抗體作為前述生體分子辨識元件之情形,係使用結合於同一抗原的相異表位之檢測抗體與捕獲抗體的2種抗體。檢測抗體係經由該抗體將抗原與溫度響應性螢光粒子結合。捕獲抗體則具有藉由固定在孔等之測定容器的底面等,而在測定容器的底面等捕獲被試驗對象的標的生體分子並加以固著之功用。
與三明治ELISA法相同,於本發明之溫度響應性螢光探針粒子中,係將檢測抗體使用作為用以結合於前述溫度響應性螢光粒子之抗體,此外,將捕獲抗體使用作為用以將標的生體分子固著於孔等之測定容器的底面等之抗體。
亦即,於前述生體分子辨識元件為抗體時,在(a)由前述溫度響應性螢光粒子與檢測抗體所構成之溫度響應性探針粒子、(b)檢測抗體與屬於捕獲抗體的抗原之標的生體分子、以及(c)已固定在孔等之測定容器的底面之捕獲抗
體,形成溫度響應性螢光探針粒子(檢測抗體於膜表面經修飾之溫度響應性螢光粒子)-標的生體分子(抗原)-捕獲抗體-測定容器之複合體時,溫度響應性螢光探針粒子係成為固著於測定容器底面之狀態。在此狀態加溫測定容器底面時,藉由來自測定容器底面的熱傳導,前述複合體的溫度迅速上升。此時複合體中的溫度響應性螢光探針粒子從固相相轉移至液相,藉此,於固相中凝集而消光之溫度響應性螢光粒子中的螢光分子解離而進行螢光發光。另一方面,於被試驗試樣中不存在標的生體分子,亦即不存在抗原時,不形成前述複合體。因此,溫度響應性螢光探針粒子無法固著於測定容器底面,即使加熱測定容器底面,亦僅停留在由經由溶劑之熱傳遞所進行的緩慢升溫,所以維持更長時間的固相狀態而維持消光狀態。
於本說明書中,所謂「熱源」,意指產生熱之裝置(例如:熱板、加熱板、水浴等)、接受由該裝置所產生之熱而間接地產生熱之物質(例如:已固定有捕獲用生體分子辨識元件之基板等)、以及產生熱之機制(例如:加溫等)。此外,作為使溫度響應性螢光探針粒子升溫之熱源,除了上述孔底面的加溫以外,例如可利用金奈米粒子等金屬粒子或磁珠等。例如於金奈米粒子之情形,係藉由雷射照射引發光熱轉換而發熱,於磁珠之情形,可藉由照射交流磁場進行感應加熱而使用作為熱源。利用與標的生體分子之結合將前述溫度響應性螢光探針粒子固著於此等熱源,而形成溫度響應性螢光探針粒子-標的生體分子與熱源之複合體,並藉由雷射或交流磁場的照射來加熱熱源時,前述溫度響應性螢光粒子迅速地升溫,形成液相而進行螢光發光。因此,藉由使用含有金屬粒子或磁珠之被試驗試樣的微小液滴,可利用在微小液滴中之標的生體分子的檢測。
依循卜瓦松分布時,藉由設定為每1個微小液滴中內含有平均5個溫度響應性螢光探針粒子與熱源,於99%以上的微小液滴中至少內含有1個以上的溫度響應性螢光探針粒子與熱源。雖依賴於大小或形狀的不同,惟於1個溫度響應性螢光探針粒子中含有數千至數萬個分子的螢光分子,由於可藉由1個溫度響應性螢光探針粒子所含有之數千至數萬個分子的螢光分子來增幅檢測1個分子的標的生體分子,所以可使用作為高感度地檢測標的生體分子之分子檢測法。
本發明之溫度響應性螢光探針粒子,亦即上述表面經生體分子辨識元件修飾之溫度響應性螢光粒子,可依循一般所知的方法來製造經檢測抗體修飾之脂質囊泡而取得(日本國際公開手冊WO2000/064413、日本特開2003-73258號公報、日本特開昭58-134032號公報、Manjappa S.A.,et al,J.Controlled Release 2011,150,2-22、Li T.,et al,Nanomed.:Nanotechnol.Biol.Medicine,2017,13,1219-1227)。
於先前技術之ELISA法的測定操作中,必須進行將已結合於標的生體分子之抗體-酵素接合物與未結合於標的生體分子之抗體-酵素接合物分離之操作,及/或將未結合於標的生體分子之抗體-酵素接合物洗淨之操作。另一方面,由於本發明係利用對於標的生體分子的表位之抗原-抗體反應藉由往固著於熱源附近之溫度響應性螢光探針粒子的熱傳導的迅速升溫,以及利用經由溶劑對未結合於標的生體分子之溫度響應性螢光粒子之熱傳遞的緩慢溫度變化之差距,不進行ELISA中所需之分離操作或洗淨操作,以測定螢光發光強度,可簡便、短時間且以高感度檢測標的生體分子。
另一方面,三明治ELISA法於商業上已利用對於各種生體分子之測定套組。亦即有於作為測定容器之孔底面等已固定有捕獲抗體之測定用微孔板,或是含有檢測抗體之套組。因此,例如可採用此商業上可利用之三明治ELISA測定套組。製作本發明之溫度響應性螢光探針粒子,取得包含於此等套組之檢測抗體或是於孔底面等已固定有捕獲抗體之微孔板,則可實施本發明。
此外,於三明治ELISA法中,藉由已固定在微孔板的孔底面之捕獲抗體、以及抗原(標的生體分子)、生物素化檢測抗體、與辣根過氧化物酶(HRP)標識鏈黴親和素所形成之複合體,可商業性地利用測定抗原之測定套組(參考圖12 A)。因此,係製造表面經生物素標識之溫度響應性螢光粒子作為本發明之溫度響應性螢光探針粒子,並混合已固定在微孔板的孔底面之捕獲抗體、以及抗原(標的生體分子)、生物素化檢測抗體、鏈黴親和素、與該表面經生物素標識之溫度響應性螢光粒子,形成此等之複合體,然後以熱源加熱微孔板的孔底面,使溫度響應性螢光粒子迅速地相轉移而進行螢光發光,藉此可測定被試驗試樣中的抗原(標的生體分子)(參考圖12B)。亦即,此情形時之生體辨識元件並非單獨的檢測抗體,而可說是修飾溫度響應性螢光粒子的表面後之生物素-鏈黴親和素-生物素化檢測抗體之複合體。或者是藉由導入順丁烯二醯亞胺末端聚乙二醇型脂質而以順丁烯二醯亞胺基修飾脂質囊泡的表面,並且使對檢測抗體進行胃蛋白酶處理後還原所得之片段化抗體之Fab'的硫醇基進行反應而製作之複合體,亦可說是溫度響應性螢光脂質囊泡-片段化檢測抗體之複合體。如此,作為生體辨識元件,不限定於單獨的抗體,此外,亦不限定於生物素-鏈黴親和素,可利用藉由分子辨識等形成具有強的結合性之複合體之各種分子,而藉此製造本發明之溫度響應性螢光探針粒子並使用。
作為藉由分子辨識之複合體形成可利用之分子種類,例如可列舉醣鏈與凝集素(Lectin)之組合、核酸的互補性鹼基序列、受體與配位分子之組合、核酸適體、胜肽適體,惟並不限定於此等。
3.生體分子的檢測或定量法
本發明的另一實施型態係作為標的之生體分子的檢測或定量法。該生體分子的檢測或定量法係與先前的檢測法,例如藉由胞吞作用(Endocytosis)或膜融合將螢光探針粒子或該粒子所含有之螢光分子往細胞膜輸送以檢測細胞之方法,或是檢測出藉由螢光分子從螢光探針粒子中釋出所產生之螢光之方法等完全不同。
如上述所說明般,上述溫度響應性螢光探針粒子及溫度響應性螢光粒子可不進行分離操作或洗淨操作而測定螢光發光,並且可在短時間、簡便且以高感度檢測或測定標的生體分子。或者是亦可不進行加熱,而是藉由洗淨操作檢測或定量生體分子。此外,藉由使被試驗試樣微小液滴化,亦可利用作為標的生體試樣的分子檢測法。
因此,本發明係提供一種生體試樣中所含有之生體分子的檢測或定量法,其係包含:(1)使如上述2.所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣接觸被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件之步驟,(2)加熱該基板之步驟,以及(3)測定螢光發光之步驟。
此外,步驟(1)所使用之溫度響應性螢光探針粒子的固相-液相轉移溫度(於該探針粒子為具有脂質雙重層之分子集合體之情形,亦稱為「凝膠-液晶相轉移溫度」),於實施本發明時藉由使用相轉移溫度為室溫以下之粒子,可不進行上述步驟(2),僅僅洗淨基板來去除未結合於捕獲用生體分子辨識元件之
溫度響應性螢光探針粒子,藉此亦可檢測或測定生體分子。因此,於其他實施樣態中,本發明係提供一種生體分子的檢測或定量法,其係包含:(1')使如上述2.所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣接觸被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件之步驟,(2')洗淨該基板之步驟,以及(3')測定螢光發光之步驟。從處理的容易性來看,該方法所使用之溫度響應性螢光探針粒子的固相-液相轉移溫度較佳為30℃以下,尤佳為25℃以下,更佳為20℃以下,特佳為15℃以下(例如:10℃、5℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-22℃或低於-22℃)。如下述實施例所示,藉由適當地調節兩親性分子之疏水性基的長度或不飽和度、種類、該分子的組合,可製作出成為期望的固相-液相轉移溫度之溫度響應性螢光探針粒子。
此外,於上述步驟(1)前,可進行設定溫度響應性螢光探針粒子的固相-液相轉移溫度之步驟,及/或製造成為該設定溫度之溫度響應性螢光探針粒子之步驟。固相-液相轉移溫度可根據進行實驗時的室溫,適當地設定為使固相-液相轉移溫度成為室溫以下之溫度。
本發明之生體分子的檢測或定量法所使用之溫度響應性螢光探針粒子的濃度並無特別限定,於捕獲用生體分子辨識元件的接觸時,該探針粒子於溶液中較佳以1.0μg/ml以上,尤佳以2.0μg/ml以上,更佳以5.0μg/ml以上的濃度含有。
本發明所使用之基板並無特別限定,例如可列舉聚苯乙烯等聚合物、玻璃珠、磁性粒子、微孔板、免疫層析用濾紙、玻璃濾片等不溶性基板。從處理的容易性來看,較佳為微孔板。
上述本發明之生體分子的檢測或定量法所使用之生體試樣,例如可列舉從動物或細胞所採集之試樣。此外,前述試樣可為包含標的生體分子之已知的試樣,或是不知是否含有標的生體分子之不明的試樣。作為該動物或細胞,例如可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、犬、猴、紅毛猩猩、黑猩猩、人類等哺乳動物或來自該動物之細胞。作為來自動物之試樣,例如可列舉血液、血清、血漿、唾液、尿、淚、汗、乳汁、鼻汁、精液、胸水、消化管分泌液、腦脊髓液、組織間液及淋巴液等,較佳為血液、血清或血漿。此等試樣可藉由其本身一般所知的方法來得到,例如血清或血漿可依循常用方法從被檢測動物採血並且分離液性成分而調製,腦脊髓液可藉由脊椎穿刺等一般所知的手段來採集。
於上述步驟(1)或(1')中,使如上述2.所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣接觸被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件之方法並無特別限定。例如可藉由將包含生體試樣之溶液與溫度響應性螢光探針粒子依序添加於基板上而進行,惟並不限定於此方法。或者是,亦可將預先混合生體試樣及溫度響應性螢光探針所製作之溶液添加於基板上(亦即可使生體試樣與溫度響應性螢光探針同時接觸基板)。上述接觸時的條件並無特別限制,通常是在0至45℃的溫度下接觸,較佳是在0至40℃的溫度下接觸,尤佳是在4至37℃的溫度下,更佳是在25℃至37℃的溫度下接觸。此外,接觸時間亦無特別限制,典型而言為6小時以下,較佳為2小時以下,尤佳為1小時以下。此外,接觸時間的下限亦無特別限制,典型而言為10秒以上,較佳為1分鐘以上,尤佳為10分鐘以上。
此外,藉由將與上述2.的溫度響應性螢光探針粒子所具有之生體分子辨識元件(例如:生物素等)為相同者附加於檢測用生體分子辨識元件,可經
由辨識該生體分子辨識元件之元件(例如:鏈黴親和素等)結合溫度響應性螢光探針粒子與檢測用生體分子辨識元件。因此於一樣態中,上述步驟(1)或(1')可為使如上述2.所述之溫度響應性螢光探針粒子、辨識生體分子辨識元件之元件與檢測用生體分子辨識元件、以及生體試樣,接觸被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件之步驟。關於接觸方法,可與上述所述之方法同樣地進行。例如可藉由將包含生體試樣之溶液、檢測用生體分子辨識元件、辨識生體分子辨識元件之元件以及溫度響應性螢光探針粒子依序添加於基板上而進行,惟並不限定於此順序。此外,亦可將檢測用生體分子辨識元件、辨識生體分子辨識元件之元件、溫度響應性螢光探針粒子分別與捕獲用生體分子辨識元件接觸。或者是,亦可將預先混合生體試樣、檢測用生體分子辨識元件、辨識生體分子辨識元件之元件及溫度響應性螢光探針粒子所製作之溶液添加於基板上(亦即可使生體試樣、溫度響應性螢光探針、辨識生體分子辨識元件之元件及檢測用生體分子辨識元件同時接觸基板)。本方法之示意圖係如圖15A至圖15C所示。如圖15C所示,藉由該方法對1個生體分子結合複數個溫度響應性螢光探針粒子,可提升檢測感度。於較佳樣態中,上述生體分子辨識元件為生物素,辨識生體分子辨識元件之元件為鏈黴親和素、親和素或中性親和素。
於上述步驟(2)中,基板的加熱方法,例如可藉由將基板靜置在設定為期望溫度之熱板或加熱板上或是水浴中之方法,或是如上述所示般使金奈米粒子結合於溫度響應性螢光探針粒子或捕獲用生體分子辨識元件,並將雷射照射在該金奈米粒子來進行,惟並不限定於此方法。
前述步驟(2)例如可藉由將包含溫度響應性螢光探針粒子與生體試樣之溶液與洗淨液替換,且視需要將該洗淨液與其他洗淨液替換1次以上而
進行,惟並不限定於此方法。前述洗淨液例如可使用緩衝液,該緩衝液例如可列舉乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、檸檬酸磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)、麥克里萬緩衝液(McIlvaine Buffer),或是於此等中含有非離子性界面活性劑(例如:Tween 20等)之溶液(例如:PBS-T等)等。
再者,本發明之生體分子的檢測法可藉由包含下列步驟之操作來實施:
以經由標的生體分子之特異性分子辨識,將前述溫度響應性螢光探針粒子固著於熱源之步驟;以及
藉由從熱源往溫度響應性螢光探針粒子之熱傳導使該溫度響應性螢光粒子的溫度上升,藉此使溫度響應性螢光探針粒子響應於溫度而從固相往液相相轉移,並藉由該相轉移使溫度響應性螢光探針粒子中的螢光分子進行螢光發光,然後檢測該螢光發光之步驟。
換言之,本發明之生體分子的檢測法為一種生體分子的檢測法,其係包含:形成包含前述溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子、捕獲用生體分子辨識元件和熱源而構成之複合體之步驟;以及
藉由前述複合體的形成而促進從熱源往溫度響應性螢光探針之熱傳導,並藉由前述溫度響應性螢光探針粒子從固相往液相之相轉移使前述螢光分子進行螢光發光,然後測定該螢光發光之步驟。
或者是可為一種生體分子的檢測法,其係包含:形成包含前述溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子和捕獲用生體分子辨識元件而構成之複合體之步驟,
去除未與前述捕獲用生體分子辨識元件形成複合體之溫度響應性螢光探針之步驟,以及
測定來自構成前述複合體之溫度響應性螢光探針粒子的螢光發光之步驟。
此時,作為溫度響應性螢光探針粒子,不僅是直接經生體分子辨識元件的表面修飾之前述溫度響應性螢光粒子,亦可利用例如生物素-鏈黴親和素的強結合性,使用表面經生物素化之溫度響應性螢光粒子來形成生物素化溫度響應性螢光粒子-鏈黴親和素-檢測抗體之複合體,而藉此利用作為溫度響應性螢光探針粒子。或者是亦可能藉由導入順丁烯二醯亞胺末端聚乙二醇型脂質而以順丁烯二醯亞胺基修飾脂質囊泡的表面,並且使對檢測抗體進行胃蛋白酶處理後還原所得之片段化抗體之Fab'的硫醇基進行反應,形成溫度響應性螢光脂質囊泡-片段化檢測抗體,而藉此利用作為溫度響應性螢光探針粒子。
螢光發光的檢測或測定方法並無特別限定,可使用一般的光纖型螢光檢測器、微孔板讀取機、螢光顯微鏡、具備攝影機(例如:CCD攝影機等)之檢測器(例如:Celvin等)來檢測或測定。此外,與ELISA法中的方法相同,亦可使用標的生體分子的濃度為已知之試樣(標準品)製作檢量線,並使用該檢量線來定量生體試樣中之生體分子的濃度。再者,亦可藉由下列所述之生體分子的定量法來定量。亦即,本發明之生體分子的檢測法可應用作為生體分子的定量法。
4.生體分子的定量法
本發明的另一實施型態為生體分子的定量法。
於上述生體分子的檢測法中,係藉由計數產生螢光發光之溫度響應性螢光探針粒子的數目,可實施作為計數被試驗試樣中之標的生體分子的數目之生體分子的定量法(絕對定量法)。
於1個溫度響應性螢光探針粒子中含有數千至數萬個螢光分子,由於1個粒子的螢光具有數千至數萬個螢光分子的發光強度,所以可藉由通常的高感度檢測器檢測。
在標的生體分子1分子使1個溫度響應性螢光探針粒子與熱源形成複合體之濃度條件,產生螢光發光之溫度響應性螢光探針粒子的數目係對應於標的生體分子的數目。
於此計數中,例如可將溫度響應性螢光探針粒子、熱源、標的生體分子封入於使用微流體裝置所製作之微小液滴,並以螢光發光之微小液滴的數目來計數。在此情形,係以於各微小液滴中存在標的生體分子1分子或是不存在之濃度條件為對象。
同樣地,若是將溫度響應性螢光探針粒子、熱源、標的生體分子注入於微陣列,且於各陣列中存在標的生體分子1分子或是不存在之濃度條件,則可藉由計數檢測出螢光發光之陣列的數目計數標的生體分子的數目。
螢光的檢測或測定方法並無特別限定,可使用一般的光纖型螢光檢測器、微孔板讀取機、螢光顯微鏡、高感度攝影機等來檢測。
亦即,於本發明之生體分子的定量法中,相對於標的生體分子之檢測界限,可說是被試驗試樣的每1檢體為標的生體分子1分子。
此外,藉由上述「生體分子的檢測法」所述之方法對標的生體分子的濃度為已知之標準液測定螢光強度而製作檢量線,並且將對被試驗試樣進行同樣操作所取得之螢光強度適用在前述檢量線,藉此可求出被試驗試樣所含有之標的生體分子的濃度(相對定量)。
本發明之定量法由於利用溫度響應性螢光探針粒子,所以可在不進行ELISA中所需之分離操作或洗淨操作下,對標的生體分子實施簡便、迅速且為高感度之定量法。
5.包含溫度響應性螢光探針粒子之套組
於其他樣態中,係提供一種包含本發明之溫度響應性螢光探針粒子之生體分子的檢測或測定用套組。於本發明之套組中,除了溫度響應性螢光探針粒子之外,可含有其他試劑等,此等試劑等可預先與上述溫度響應性螢光探針粒子成為一體,或是容納於不同容器。試劑等可列舉捕獲用生體分子辨識元件、固定有捕獲用生體分子辨識元件之基板、檢測用生體分子辨識元件、辨識生體分子辨識元件之元件、洗淨液、生體分子的濃度為已知之標準品、陽性對照、陰性對照、記載有準則之指示書等。此等試劑等亦可視需要預先混合。關於上述捕獲用生體分子辨識元件、固定有該元件之基板、檢測用生體分子辨識元件、辨識生體分子辨識元件之元件、洗淨液、生體分子的濃度為已知之標準品之具體例,係如上述1.至2.所述之內容。於較佳的一樣態中,生體分子辨識元件為生物素,辨識生體分子辨識元件之元件為鏈黴親和素、親和素或中性親和素。
上述套組所包含之捕獲用生體分子辨識元件較佳係預先被固定在基板。該基板的具體例係如上述3.所述之內容。
於本說明書中所提及之全部文獻係藉由援引而將其整體納入於本說明書中。在此所敘述之實施例係例示本發明之實施型態,並不應解釋為限定本發明之範圍者。
[實施例]
(實施例1)螢光色素(SQR22)的合成
方酸螢光色素(SQR22)的合成法係如流程1所示。
(i)甲苯、迴流、6小時;
(ii)5N鹽酸、乙酸/水(1:1)、迴流、2小時;
(iii)n-BuOH/甲苯(4:1)、迴流、3小時;
(iv)NatOBu、THF、室溫、3小時
首先依循既有報告來合成前驅物N,N-二丁基苯胺1及方醯基氯2(Li F.,et al.Chem.Eur.J.20,9991-9997(2014);Easwaran A.,et al.J.Am.Chem.Soc.2004,126,6590-6598)。於甲苯迴流下使1與2反應6小時而得到氯化物中間物。於5N鹽酸乙酸/水(1/1)混合溶劑中使此氯化物中間物水解而得到化合物3。依循既有報告合成吲哚鹽4(Liu D.,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,4103-4107)。於正丁醇/甲苯(1:1混合溶液)迴流下使化合物3與4反應而得到化合物
5。於室溫下,於THF中使用NatOBu使化合物5水解而得到SQR22。藉由NMR及質譜分析來鑑定SQR22。
1H NMR(CDCl3,400MHz,δ ppm):0.89(t,J=7.3Hz,6H,-CH3);1.25-1.35(m,4H,-CH2-);1.41(s,6H,-CH3);1.50-1.57(m,4H,-CH2-);3.27-3.31(m,4H,-CH2-);5.75(s,1H,=CH-);6.60(d,J=9.2Hz,2H,ArH),7.04-7.36(m,4H,ArH);8.03(d,J=9.1Hz,2H,ArH).13C NMR(CDCl3,400MHz,δ ppm):14.12,20.47,25.64,29.61,50.12,51.07,89.87,111.95,113.27,118.85,122.74,125.18,128.82,130.95,140.06,141.59,151.19,169.22,181.33,181.80,185.51,187.28.MS(ESI)m/z(M+)443.
(實施例2)SQR22的分光學特性
使SQR22溶解於有機溶劑並於UV燈上(365nm)觀察螢光發光。接著藉由紫外線可見光分光光度儀(V-670型,日本分光股份有限公司)與螢光分光光度儀(Agilent Cary Eclipse,Agilent Technology股份有限公司)來測定紫外線可見光吸收光譜(SQR22濃度=10μM)與螢光發光光譜(SQR22濃度:1μM)。SQR22係溶解於各種溶劑,並顯示出因應溶劑的極性之分光特性(圖1A、圖1B、表1)。
SQR22的UV-vis-NIR光譜在極性溶劑中,於630nm附近顯示出最大吸收(表1)。於溶劑的極性增加時,630nm附近的吸收減少,於470nm附近顯現出其他吸收峰。於水中觀察到500至700nm的寬廣吸收。螢光發光光譜隨著溶劑極性的增加,最大螢光發光的波長於遠紅外線區域中緩慢地位移至640至663nm(圖1B及表1)。於此遠紅外線區域中,量子產率位於0.13至0.44的範圍(圖1B及表1)。最大螢光發光波長於二甲基甲醯胺及二甲基亞碸中為552及565nm,量子產率大幅降低至0.02。吸收光譜係反應色素分子的聚集狀態,在相對於單體的吸收顯示出長波長位移(J波段)或短波長位移(H波段)之情形,表示出
J凝集體或H凝集體的形成(Eisfeld,A.et al.,Chemical Physics,2006,324,376-384)。二甲基甲醯胺及二甲基亞碸中之吸收光譜的短波長位移及更低的量子產率,表示出H凝集體的形成。於水中未觀測到SQR22的螢光發光,從較寬廣的吸收峰,表示由H凝集體及J凝集體混合物的形成所帶來之消光。
分光學數據係顯示出SQR22於非極性環境中,在具有550至640nm範圍的激發波長之遠紅外線區域(640至700nm)發出強的螢光。由於此激發波長與市售的標準性紅色雷射(約630nm)一致,所以適合於螢光成像等各種用途。由於SQR22於低極性溶劑中顯示出高的量子產率,所以適合在標識低極性環境之用途。因此,SQR22可考量為標識脂質雙分子膜的疏水性非極性環境用之極具潛力的螢光探針。
(實施例3)含有SQR22之分子集合體的調製
首先將三種類的兩親性分子:1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC16)(日本精化股份有限公司製)、L-麩胺酸,N-(3-羧基-1-側氧丙基)-,1,5-二(十六烷基)酯(SA)(日本精化股份有限公司製)以及1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-單甲氧基聚(乙二醇)(5000)(PEG-DSPE)(日油股份有限公司製),以PC16/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06(莫耳比)溶解於三級丁醇,進行凍結乾燥而得到混合脂質粉末。將SQR22的儲備溶液(乙醇)添加於所得到之混合脂質粉末(混合脂質粉末/SQR22=50/1[重量比]),並將此溶解於三級丁醇並進行凍結乾燥而得到含SQR22混合脂質粉末。使含SQR22混合脂質粉末分散於磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)(5mg/mL),並使用渦旋混合器進行水合分散。將此分散液加入於EXTRUDER(商品名稱,Northern Lipids Inc.製),一面加壓一面於60℃依序穿透孔徑0.45μm、0.20μm、0.05μm的聚碳酸酯膜過濾器(Merck Millipore公司製),而得到含SQR22分子集合體(脂質囊泡)分散液(圖2A)。
被納入於脂質囊泡之SQR22的螢光發光於約25℃時,在UV光(波長=365nm)下未被觀察到(圖2B)。然而,深具涵義的是發現到加熱脂質囊泡分散液時,顯現出強螢光發光(圖2B)。然後在溫度降低至室溫時,螢光發光再次消失。如圖2C所示,螢光發光迅速地響應於溫度變化,於50℃時之螢光發光增強速度常數為7.0%/秒。此測定值由於反應了到達目標溫度為止之製程,所以可考量為實際的響應速度較觀察數據更快。加熱與冷卻的循環中之螢光切換,可穩定地重複進行至少10循環(圖2D)。關於此響應於溫度之深具涵義的螢光發光特性,本發明者們係假設導入於脂質囊泡之SQR22的螢光發光特性是藉由脂質雙分子膜的相轉移所轉換。為了驗證此假設,接下來使用含有PC16之醯基鏈長(碳
數:14至18)相異之5種1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC),來調製含有SQR22之相轉移溫度相異之脂質囊泡。
(實施例4)含有SQR22之相轉移溫度相異之脂質囊泡的調製
與前述相同,將三種類的兩親性分子:磷脂醯膽鹼(PC)、SA以及PEG-DSPE,以PC/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06(莫耳比)溶解於三級丁醇,進行凍結乾燥而得到混合脂質粉末。PC係使用醯基鏈長相異之1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC14)(Avanti Polar Lipids Inc.製)、1,2-二(十五烷醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC15)(Avanti Polar Lipids Inc.製)、1,2-二(十七烷醯基)-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC17)(Avanti Polar Lipids Inc.製)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(PC18)(Avanti Polar Lipids Inc.製)的4種(圖3A)。將SQR22的儲備溶液(乙醇)添加於所得到之混合脂質粉末(混合脂質粉末/SQR22=50/1[重量比]),並將此溶解於三級丁醇並進行凍結乾燥而得到含SQR22混合脂質粉末。
使含SQR22混合脂質粉末分散於磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)(5mg/mL),並使用渦旋混合器進行水合分散。將此分散液加入於EXTRUDER(商品名稱,Northern Lipids Inc.製),一面加壓一面於60℃依序穿透孔徑0.45μm、0.20μm、0.05μm的聚碳酸酯膜過濾器(Merck Millipore公司製),而得到含SQR22分子集合體(脂質囊泡)分散液。藉由動態光散射法(Zeta-Sizer Nano ZS,Malvern Panalytical Ltd)測定所得到之脂質囊泡的大小。從乙醇中之SQR22的吸光度(631nm),決定分散液中之SQR22的濃度。不論使用5種PC的哪一種,脂質囊泡的大小皆約為100nm(表2)。分子集合體的分散液呈藍色,在可見光吸收光譜中於625至637nm觀測到極大吸收(圖3B、表2)。
(實施例5)含有SQR22之脂質囊泡的溫度響應性螢光特性
調查5種PC-NVSQ的螢光特性。所調製之PC-NVSQ的螢光發光於約25℃的UV光(λ=365nm)下,除了PC14-NVSQ之外其他未觀測到(圖4A)。加熱時,全部PC-NVSQ分散液發出強的螢光,螢光發光光譜不論脂質種類為何皆相同(圖4B)。加熱條件的最大螢光發光波長於PC14-、PC15-、PC16-及PC17-NVSQ為664nm,於PC18-NVSQ為662nm。根據最大發光波長與SQR22的極性指數之間的相關(圖1B),SQR22周圍的極性可推測為與具有極性指數4.3至5.8之乙醇、甲醇、丙酮、乙腈等相匹敵,係佐證SQR22位於脂質雙重層膜的非極性區域之論點。
PC-NVSQ的螢光強度與溫度之相關曲線係明確地顯示出SQR22的螢光強度依賴於構成雙分子膜之脂質種類,而在相異的溫度範圍內變化(圖
4C)。為了分析SQR22的螢光強度與脂質雙分子膜的相轉移溫度之間的相關,係於降溫時測定具有相異的醯基鏈長之全部PC-NVSQ中之螢光強度的變化(從液晶狀態往凝膠狀態之轉移)。不論於何種情形,皆顯示典型的S字型曲線,SQR22的螢光強度因溫度的降低而減少。螢光強度急遽地減少之起始溫度於PC14-、PC15-、PC16-、PC17-及PC18-NVSQ之各者,為29±1、36±1、41±1、47±1、及55±1℃由於由PC14、PC15、PC16、PC17及PC18所構成之脂質雙分子膜的凝膠-液晶相轉移溫度分別為24、35、40、49及55℃,所以於降溫時使螢光強度減少之臨界溫度與脂質雙分子膜的相轉移溫度幾乎一致。關於PC14-NVSQ,其S型曲線的協同性低,反而是曲線的反曲點(26±0.2℃)接近於相轉移溫度。再者,係於升溫時試驗PC16-NVSQ之螢光強度的變化(從凝膠狀態往液晶狀態之轉移)。於升溫時螢光強度增加之起始溫度約為40±1℃,此係與由PC16所構成之脂質雙分子膜的相轉移溫度(40℃)極為一致。因此,於升溫及降溫中,引起螢光強度的增減之臨界溫度可說是對應於脂質雙分子膜固有的相轉移溫度。加熱及冷卻的循環中之螢光轉換於任一PC-NVSQ中皆可穩定地重複進行至少10循環(圖中未顯示)。
因此,從此等結果中可得知含有SQR22且在特定溫度顯示出相轉移動作之分子集合體,係發揮溫度響應性螢光粒子的功能。螢光之消光與發光的轉移溫度係對應於脂質雙分子膜的相轉移溫度,且由於可藉由脂質成分的選擇來調節轉移溫度,所以可令人期待在溫度感測中的各種應用。
(實施例6)由螢光成像所形成之溫度響應螢光的觀測
為了驗證對使用螢光顯微鏡之溫度成像之應用,係嘗試觀測溫度響應性螢光粒子的螢光成像。於此試驗中,係使用具有與PC16-NVSQ(螢光切換溫度;40
℃)為相同的成分組成之大的多重層脂質囊泡。於螢光顯微鏡下觀測:照射近紅外線雷射(波長:980nm)以局部加熱水時之發光,以及阻斷雷射照射後之冷卻時之消光(圖5A至圖5D)。如圖5B至圖5D所示,雷射照射前(33℃)之螢光強度的變化僅是些微。於開始雷射照射時,螢光強度急速增加(約40%/秒),螢光強度與照射前相比增加15倍。於阻斷雷射照射使溫度下降時,螢光強度降低。其結果顯示出本溫度響應性螢光粒子為溫度成像用之極具潛力的工具。
(實施例7)溫度響應螢光粒子之動作機制的解析
至目前為止,係有人提出伴隨著6-十二醯基-2-二甲基胺基萘(勞丹(Laurdan))或1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)等脂質雙分子膜的相轉移使螢光發光波長或異向性變化之例子,惟如本發明般之螢光分子的消光與發光因應分子集合體的相轉移動作而轉換之報告例則仍未被發現。因此係嘗試解析螢光發光與消光的轉換機制。
在詳細解析圖3B所示之分光學數據時,脂質雙分子膜中之SQR22的吸收峰與溶劑中的單體相比僅些微地往長波長位移,並且在短波長的580nm中觀測到肩峰。從該內容來看,係表示於凝膠相的脂質雙分子膜中SQR22自我凝集體的形成,可考量為凝集起因消光(aggregation-caused quenching)。在此情形,由於以單體與凝集體存在之色素處於平衡狀態,所以藉由減少脂質膜中之SQR22的含量使凝集體的比率降低而消除消光。為了驗證此假設,係調製含有各種量的SQR22之PC16-脂質囊泡並調查此等之螢光特性。如圖6A所示,於減少SQR22的含量時,於室溫的凝膠相中亦發出螢光。由溫度所導致之螢光發光的變化程度係藉由減少SQR22的含量而減少,將SQR22的含量減少至0.1mol%時,溫度依賴性的螢光強度變化幾乎被消除(圖6B)。
此結果係支持凝膠相的脂質雙分子膜中之螢光分子的凝集引發消光之論點,隨著減少螢光分子的含量,平衡由凝集體移往單體而消除消光。25℃及45℃時之螢光強度的點繪係顯示出:不論是脂質雙分子膜於25℃時處於凝膠相,於45℃時處於液晶狀態之任一情形,隨著SQR22含量的增加,螢光強度皆減少(圖6C)。此可考量為即使脂質雙分子膜處於液晶狀態,於增加SQR22的含量時亦部分地消光之故。然而,由於在凝膠相(25℃)中之更強的消光,所以25℃及45℃時之螢光強度間的更大強度比係隨著SQR22含量的增加而達成,45℃時的螢光強度(FI45)相對於25℃時的螢光強度(FI25)之比在0.1mol%及3.3mol%的SQR22中分別為1.1±0.01及62.5±1.03。
含有3.3mol%及0.1mol%的SQR22之PC16-脂質囊泡之UV-vis光譜的比較,係支持凝膠相中之脂質雙分子膜中之SQR22的凝集(圖6D1及圖6D2)。含有3.3mol%的SQR22之PC16-脂質囊泡之SQR22的吸收峰於25℃時為636nm。隨著溫度的上升,吸收峰往更短波長位移。於脂質囊泡的相轉移溫度(40℃)附近的42℃時到達625nm。於更低溫度的長波長位移係表示出凝膠相中之J凝集體的形成。溫度超過40℃時,580nm附近之短波長位移後的肩峰(推測為H凝集體)亦減少。與此相對照,含有0.1mol%的SQR22之脂質囊泡中之吸收峰的變化程度遠較於含有3.3mol%的SQR22之脂質囊泡更小(圖6E)。0.1mol%的SQR22中之580nm附近的肩峰雖可能表示出微量H凝集體的存在,但由溫度所形成之吸收的變化為小至可忽視的程度。
根據此等實驗性證據,脂質雙重層分子膜中的SQR22之螢光特性的轉換機制係如圖7所示。於含有3.3mol%的SQR22之脂質囊泡中,在相轉移溫度以下的凝膠相中,由於SQR22的凝集(H-及J-凝集體)而消光(凝集起因消
光)。於脂質雙分子膜的相轉移溫度以上而轉移至液晶狀態時,SQR22的自我凝集體解離而發出螢光(解離激發螢光)。根據分子集合的調控之螢光轉換的機制對於開發具有高的溫度感度之溫度感測器乃為重要。
(實施例8)含有SQR22的類似物之溫度響應性螢光粒子
為了調查此螢光轉換的機制是否可於SQR22的類似物中一般化,係測定含有疏水性基相異的類似物SQR23之脂質囊泡的溫度響應性。依循既有報告來合成SQR23(Dong,S.ACS Appl.Nano Mater.2018,1,1009-1013)。脂質囊泡的調製係依循實施例3所示之方法,而調製出於由PC16/SA/PEG-DSPE=9/1/0.06(莫耳比)所構成之脂質囊泡中含有3.3mol%的SQR23之脂質囊泡。
如圖8所示,於導入3.3mol%的SQR23之脂質囊泡中,同樣於脂質囊泡的相轉移溫度(40℃)附近觀察到螢光的增大,可得知發揮作為溫度響應性螢光粒子的功能。在先前的研究中,於導入0.1mol%的SQR23之脂質囊泡未觀測到消光(Dong,S.ACS Appl.Nano Mater.2018,1(3),1009-1013),此係與實施例7所述之SQR22的結果一致,可考量為於SQR23亦與SQR22相同地藉由凝集與解離來轉換消光與發光。
(比較例1)未顯示相轉移動作之分子集合體
本發明所使用之分子集合體的要件為在特定溫度顯示相轉移者。在此係例示於不符合此要件之分子集合體,不會引起響應於溫度之螢光之消光與發光的轉換者來進行說明。將PEG-DSPE與SQR22(50/1,重量比)溶解於三級丁醇後,進行凍結乾燥而得到凍結乾燥粉末。使所得到之凍結乾燥粉末分散於磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)而得到藍色透明的分散液。所得到之分散液在UV光照射下(365nm),於室溫發出強的螢光,且即使提高溫度亦未觀測到螢光強度的變化。
此係由於PEG-DSPE所形成之處於無序相的微胞未顯示相轉移,所以未引起由因應相轉移之SQR22的凝集及解離所形成之消光與發光的轉換之故,於此未顯示相轉移動作之分子集合體中,無法達成本發明所期望之目的。
(比較例2)含高膽固醇脂質囊泡
將由PC16/膽固醇/SA/PEG-DSPE(5/5/1/0.06,莫耳比)所構成之混合脂質與SQR22(混合脂質:SQR22=50/1,重量比)溶解於三級丁醇後,進行凍結乾燥而得到凍結乾燥粉末。使所得到之凍結乾燥粉末分散於磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)。將此分散液加入於EXTRUDER(商品名稱,Northern Lipids Inc.製),一面加壓一面於60℃中依序穿透孔徑0.45μm、0.20μm、0.05μm的聚碳酸酯膜過濾器(Millipore公司製)。大部分的SQR22於聚碳酸酯膜過濾器中被過濾,所得到之脂質囊泡分散液僅含有些許SQR22,於室溫未觀測到螢光的消光。由於此脂質囊泡含有45莫耳%的膽固醇,所以是不顯示相轉移動作之分子集合體,並且是無法穩定地載持螢光分子之分子集合體的例子,於此分子集合體中無法得到期望之溫度響應性的螢光特性。
(實施例9)以生體辨識分子修飾溫度響應性螢光粒子的表面後之溫度響應性螢光探針粒子的調製
將PC16、SA、生物素化1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-單甲氧基聚(乙二醇)(2000)(生物素化PEG-DSPE)(Avanti Polar Lipids Inc.製),以PC16/SA/生物素化PEG-DSPE=9/1/0.05(莫耳比)溶解於三級丁醇,進行凍結乾燥而得到混合脂質粉末。將SQR22的儲備溶液(乙醇)添加於所得到之混合脂質粉末(相對於脂質為3.3莫耳%的SQR22),將其溶解於三級丁醇並進行凍結乾燥而得到含SQR22混合脂質粉末。
使含SQR22混合脂質粉末分散於磷酸緩衝液生理食鹽水(PBS)(5mg/mL),並使用渦旋混合器進行水合分散。將此分散液加入於EXTRUDER(商品名稱,Northern Lipids Inc.製),一面加壓一面於60℃依序穿透孔徑0.45μm、0.20μm、0.05μm的聚碳酸酯膜過濾器(Merck Millipore公司製),而得到表面經生物素修飾之含SQR22脂質囊泡分散液。藉由動態光散射法(Zeta-Sizer Nano ZS,Malvern Panalytical Ltd)所得到之分子集合體的大小為93.0±46.2nm。調查螢光強度的溫度變化之結果,對應於脂質囊泡的相轉移溫度(40℃)係觀測到溫度響應性之螢光強度的增大(圖9)。從該結果來看,可令人期待發揮在表面載持有分子辨識部位之溫度響應性螢光探針粒子的功能。
(實施例10)使用溫度響應性螢光探針粒子之生體分子的檢測(利用微孔板作為熱源之例)
在此係顯示利用微孔板作為熱源之一例。使用實施例9中所調製之生物素化溫度響應性螢光探針粒子來實施生體分子的實證試驗。將生物素化溫度響應性螢光探針粒子分散液(SQR22濃度=5μg/mL,40μL)添加於經鏈黴親和素塗覆完成之96孔的微孔板(Thermo Fisher Scientific股份有限公司製),進行2小時的培養後,載置於加熱至80℃之加熱板(RSH-1DR、AS-One股份有限公司製),並測量螢光強度隨時間經過的變化。螢光強度的檢測係使用光纖型螢光檢測器(FLE1100型,日本板硝子股份有限公司製)。除了生物素化溫度響應性螢光探針粒子(標準試樣)(圖10A的(A))之外,將使用PEG-DSPE取代生物素化PEG-DSPE之脂質囊泡設成為對照試樣(圖10A的(B)),以調查脂質囊泡與鏈黴親和素之非特異性結合的影響。此外,以生物素溶液(50μg/mL,150μL)來處理經鏈黴親和素塗覆之微孔,亦調查生物素與基板之非特異性結合的影響(圖10A的(C))。於全
部的試驗中,將SQR22濃度固定為5μg/mL,將從添加試樣於微孔至開始加熱為止之時間固定為2小時。如圖10B所示,於標準試樣中,於加熱開始的10秒以內螢光強度上升,相對於此,於對照試樣中需時40秒。此係由於在標準試樣中,藉由生物素與鏈黴親和素之特異性分子辨識使溫度響應性螢光探針結合於基板(熱源),熱迅速從熱源傳遞至溫度響應性螢光探針並進行相轉移而使螢光強度增大,但在對照試樣中,溫度響應性螢光探針於溶液中游離,溶液全體的溫度到達轉移溫度者需耗費時間之故。因此,由於此方法可從螢光響應來區分經由特異性分子辨識而結合於熱源之溫度響應性螢光探針,以及未結合之溫度響應性螢光探針,所以可利用在參與溫度響應性螢光探針與熱源之間的特異性分子辨識之生體分子的檢測。
接著為了驗證本發明的迅速性,係探討添加試樣於孔後之培養時間。將生物素化溫度響應性螢光探針粒子分散液(SQR22濃度=5μg/mL,40μL)添加於經鏈黴親和素塗覆完成之96孔的微孔板,於室溫靜置30秒、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘及30分鐘後,載置於加熱至80℃之加熱板(RSH-1DR,AS-One股份有限公司製)並測量螢光強度隨時間經過的變化。將使用PEG-DSPE取代生物素化PEG-DSPE之脂質囊泡添加於經鏈黴親和素塗覆完成之96孔的微孔板並進行2小時的培養,將此設為陰性對照(Negative control)。在無分子辨識結合之陰性對照中,開始加熱後的螢光強度到達最大為止需時42.5秒,相對於此,於生物素化溫度響應性螢光探針粒子中,在30秒的培養縮短為30秒,於進一步延長培養時間時雖可縮短,但在20分鐘的培養時間時到達幾乎一定(圖11)。因此,於本實施例之方法中,在30秒的培養與30秒的加熱(合計1分鐘),可檢測出由特異性分子辨識所形成之結合。
(實施例11)
在此係顯示使用實施例9中所調製之生物素化溫度響應性螢光探針粒子,對於有用於作為前列腺癌的篩選、治療效果的判定或復發的早期發現之腫瘤標記進行臨床檢查之前列腺特異抗原(PSA),來探討檢測感度之例。首先購入市售的人類PSA-total ELISA套組(製造號碼:RAB0331,Sigma-Aldrich公司製)。於此套組中,除了經PSA捕獲抗體塗覆完成之ELISA板、人類PSA標準品、生物素化人類PSA檢測抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標識鏈黴親和素之外,亦裝入有各種緩衝液、ELISA停止溶液、HRP基質。將人類PSA標準品(或檢體)、生物素化人類PSA檢測抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標識鏈黴親和素依序添加於經PSA捕獲抗體塗覆完成之ELISA板並進行洗淨後,最後添加基質(3,3',5,5;-四甲基聯苯胺)並檢測出由酵素反應所產生之生成物的呈色(圖12A)。依循製造來源的準則,PSA的檢測界濃度為10pg/mL。
係探討將該檢測取代為溫度響應性螢光探針粒子時之檢測感度。亦即將人類PSA標準品、生物素化人類PSA檢測抗體、鏈黴親和素依序添加於經PSA捕獲抗體塗覆完成之ELISA板並進行洗淨後,最後添加生物素化溫度響應性螢光探針並將ELISA板載置於加熱板(80℃),並測定螢光強度隨時間經過的變化(圖12B)。螢光強度的測定係使用光纖型螢光檢測器(FLE1100型,日本板硝子股份有限公司製)。該結果如圖12C所示。於陰性對照(無PSA)中,開始加熱後的螢光強度到達最大為止的時間為43.3秒(三次測定的平均值),相對於此,於ELISA的檢測界限濃度之10pg/mL的PSA的存在下,縮短至30.7秒。此係由於在陰性對照中不存在標的分子的PSA,所以生物素化溫度響應性螢光探針游離,但在PSA的存在下,藉由以抗體所進行之三明治型分子辨識,使生物素化
溫度響應性螢光探針固著於微孔板而使熱迅速地傳遞之故。然後稀釋PSA,且即使稀釋至ELISA之檢測界限的10萬倍低濃度之10-4pg/mL,亦成為32.1秒而能夠檢測出與陰性對照之差異。
因此,在使用本發明之溫度響應性螢光探針之情形,可得知PSA的檢測界限濃度較ELISA套組的檢測臨限低10萬倍以上,確認到可大幅提升感度。
(實施例12)使用溫度響應性螢光探針粒子之生體分子的檢測(利用金奈米粒子作為熱源之例子)
在此係顯示利用金奈米粒子作為熱源之一例。溫度響應性螢光探針粒子係使用實施例9中所顯示之生物素化溫度響應性螢光探針粒子。金奈米粒子係使用市售之經鏈黴親和素結合金奈米粒子(20nm,Cytodiagnostics Inc.製)。首先分別調製生物素化溫度響應性螢光探針粒子為70粒子/1.5mL,經鏈黴親和素結合金奈米粒子為70粒子/1.3mL之分散液。生物素化溫度響應性螢光探針粒子的粒子濃度係從以一片膜脂質囊泡計之脂質囊泡的平均大小、脂質濃度及脂質的分子占有面積來概略算出,經鏈黴親和素結合金奈米粒子的粒子濃度則依循販售來源的規格書。混合此分散液並稀釋2倍而成為70粒子/5.6mL後,於室溫靜置12小時而形成生物素化溫度響應性螢光探針粒子與經鏈黴親和素結合金奈米粒子之複合體。從該分散液中每次採集40μL並移往96孔的微孔板(AS-One股份有限公司製)。將96孔的微孔板設置在螢光顯微鏡(BZ-X710型,Keyence股份有限公司製),一面照射綠色雷射(波長:545±25nm)使金奈米粒子光熱轉換而發熱,並且藉由光纖型螢光檢測器(FLE1100型,日本板硝子股份有限公司製)從溫度響應性螢光探針粒子來測定螢光發光。此外,將未生物素化之含有PEG-DSPE之
溫度響應性螢光探針粒子設成為對照試樣,並在相同條件測定螢光發光(圖13A)。
在使用生物素化溫度響應性螢光探針粒子之情形,係確認未被觀測到螢光的增大之孔(圖13B的(C))以及螢光強度增大之孔(圖13B的(A)、(B))。另一方面,在使用未生物素化溫度響應性螢光探針粒子之情形,並無螢光強度增大之孔(圖13B的(D))。從該結果來看,可考量為只有在藉由生物素與鏈黴親和素的分子辨識使溫度響應性螢光探針粒子與金奈米粒子結合時,才藉由金奈米粒子的熱而觀測到溫度響應性螢光探針粒子的螢光發光。本實驗條件係於40μL中平均存在有0.5個溫度響應性螢光探針粒子與金奈米粒子之複合體之設定,從卜瓦松分布來預估每次分割為40μL時所含有之複合體的數目時,係成為0個(61%)、1個(30%)、2個以上(9%)。圖13A所示之檢測陽性的結果(A)為觀測到螢光中之顯示最大的螢光強度之例,其他係與檢測陽性的結果(B)為同等之螢光強度。從該結果來看,檢測陽性的結果(B)為1個脂質囊泡的代表性螢光強度之可能性高。於試樣溶液40μL中,於1個溫度響應性螢光探針粒子中檢測出1個分子的生體分子時,其檢測感度相當於4.2×10-17M。
(實施例13)使用溫度響應性螢光探針粒子之生體分子的數位計數(利用微流體裝置之例)
在此係例示使用溫度響應性螢光探針粒子之生體分子的數位計數方法(圖14A)。藉由使用微流體裝置來製作內含溫度響應性螢光探針粒子、熱源、檢體之微小液滴,並藉由計數從溫度響應性螢光探針粒子發出螢光之微小液滴的數目,可計數檢體所含有之標的分子的數目(圖14A)。
如圖14B所示,微小液滴的容積可從液滴的直徑算出,例如在50μm直徑的微小液滴中,可算出為65μL。微小液滴的直徑可藉由裝置的流路與流速調控。
於本方法中,於微小液滴中內含有至少1個以上的溫度響應性螢光探針粒子與熱源,依循卜瓦松分布時,藉由設定為每1個微小液滴中內含有平均5個溫度響應性螢光探針粒子與熱源,於99%以上的微小液滴中至少內含有1個以上的溫度響應性螢光探針粒子與熱源。於數位計數時,必須是欲檢測之標的分子於微小液滴中為1分子或0分子之條件,此條件亦可從卜瓦松分布來預估(圖14C)。
如圖14D所示,由於僅內含有欲檢測之標的分子之微小液滴發出螢光,所以發出螢光之微小液滴的數目(NF)係對應於標的分子數。此外,微小液滴的容積(V)可從直徑算出,所以藉由計數微小液滴總數(N),亦可換算為濃度。
(實施例14)含有SQR之生物素化DPPC囊泡的調製與特性評估
〈1.含有SQR之生物素化DPPC囊泡的調製與特性評估〉
將1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DPPC)、1,5-二(十六烷基)-N-琥珀基L-麩胺酸(DHSG)、以及1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000](生物素化PEF2000-DSPE)溶解於三級丁醇而調製儲備溶液。SQR22DPPC脂質體是由DPPC、DHSG、生物素化PEF2000-DSPE及SQR22所構成,莫耳比為86.6:9.6:0.5:3。將儲備溶液的必要量加入於圓底燒瓶,接著藉由凍結乾燥機將混合溶液凍結乾燥一晚。加入Dulbecco磷酸緩衝液生理食鹽水使凍結乾燥後的混合脂質進行水合,而得到3至5mg/mL的脂質囊泡分散液。為了分解為較小顆粒,係一面將溫度保持在60℃一面對脂質囊泡分散液進行10至15
分鐘的渦旋混合,或是於室溫攪拌脂質囊泡分散液2小時。設置EXTRUDER並將EXTRUDER連接於附溫控功能之水泵。將EXTRUDER加熱至60℃。於渦旋混合後將脂質囊泡分散液加入於EXTRUDER,施加氮氣壓力以將分散液從聚碳酸酯膜(0.2μm×1、0.1μm×1、0.05μm×3)擠壓出。使用Zeta-Sizer來確認脂質囊泡的粒形與ζ電位。脂質的濃度係依循製造商的說明書,藉由磷脂質C套組來決定。從在乙醇中的相異濃度之SQR22的吸光度製作SQR22的標準曲線。從631nm中的吸光度計算出含有SQR之生物素化DPPC囊泡分散液之SQR22的濃度。亦同樣地製作含有SQR之生物素化DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼)囊泡分散液並評估特性。
(實施例15)使用96孔的微孔板與攝影機之裝置的驗證(加熱)
接著並非藉由螢光檢測器,而是藉由使用96孔的微孔板與攝影機之裝置來進行驗證。本實施例之概要圖係如圖16A所示。
步驟
〈i.塗覆鏈黴親和素之微孔的準備〉
將鏈黴親和素樣本溶解於DPBS,進行稀釋而調製出20μg/mL的儲備溶液。將各鏈黴親和素樣本100μL加入於需進行塗覆之孔。於室溫放置一晚以使溶液乾燥。去除殘留的溶液並加入100μL的0.1%牛血清白蛋白(BSA:Bovine Serum Albumin)。將微孔板放置1小時以將非特異性結合部位封阻。去除上清液並以DPBS 100μL將孔洗淨2次。
〈ii.樣本的調製〉
使用DPBS來稀釋含有SQR之生物素化DPPC囊泡分散液(SQR-DPPC),並將SQR22濃度設成為5、2、1、0.1、0.01μg/ml。將各濃度的樣本80μL添加於經
鏈黴親和素塗覆之孔。將80μL的樣本追加添加於非經鏈黴親和素塗覆之孔作為陰性對照。於室溫進行1小時的培養(穩定地振動30分鐘)。以100μL的DPBS將樣本微孔洗淨2次。以80μL的DPBS再次填滿全部的微孔。
〈iii.使用Celvin(凝膠分析儀)之螢光強度觀察〉
開啟SnapAndGo軟體,選擇系列模式且為了樣本的配置而關閉分析室,並等待至校正結束為止。開啟熱板的電源並預熱至50℃為止。於校正後點選圖像擷取設定選單的橫側。於設定選單中,將曝光時間調整為3秒,延遲時間調整為7秒,且每隔20秒拍攝照片並進行處理。選擇激發波長470nm(藍色光)、強度50。選擇680nm的濾波器。將樣本微孔板放置在熱板上,關閉分析室並開始攝影。為了進行更適合的分析,係選擇各圖像的對比值。將全部圖像儲存為ImageJ分析用。
〈iv.圖像分析〉
開啟ImageJ軟體。點選「Analyze」並於「Tools」中選擇ROI管理者功能。以ImageJ開啟圖像。使用圓形來選擇分析對象之孔的區域。於ROI管理者中點選Add,並將以圓形所包圍之區域追加至分析用。對全部樣本重複進行此步驟。
點選ROI管理者選單的「measure」鍵,複製數據並貼於Excel檔案。在此係使用平均值作為螢光強度變化的指標。對全部圖像重複進行本步驟。收集全部數據並進行分析。
各孔的濃度及孔的照片如圖16B及圖16C所示。此外,圖像分析的結果如表3所示,由表3所製作之圖表如圖16D所示。1、2及5μg/mL的濃度之SQR-DPPC樣本(圖16B的(3)、(2)及(1))係顯示出明顯的S字型曲線,惟0.01及0.1μg/mL(圖16B的(5)及(4))不明顯,幾乎呈平坦。於陰性對照與緩衝液群之
間幾乎無相異。此係意指於鏈黴親和素不存在之情形,陰性對照群的全部囊泡被洗除。再者,圖16B之(5)的濃度與SQR22相關者僅為0.01μg/mL,惟該平均強度較陰性對照及緩衝液群高10%,從該內容來看,顯示出SQR-DPPC的存在。至目前為止之試驗的感度與SQR22相關者約為0.01μg/mL。
(實施例16)藉由含有SQR之生物素化DPPC囊泡分散液所進行之相異量之鏈黴親和素的檢測(加熱)
本實施例之概要圖如圖17A所示。在此係使用生物素與鏈黴親和素之複合體,且為了確認塗覆於微孔板的孔之鏈黴親和素之藉由生物素化脂質囊泡所辨識之辨識能,係以相異濃度將鏈黴親和素塗覆於孔表面,並探討是否可藉由含有SQR之生物素化DPPC囊泡分散液檢測出鏈黴親和素的濃度差。由於本實施例中所使用之DPPC囊泡的凝膠-液晶相轉移溫度為40℃,所以含有SQR之生物素化DPPC囊泡加熱至50℃時發出較強的紅色螢光。將孔洗淨2次以去除未結合之含有SQR之生物素化DPPC囊泡。於本實施例中,螢光強度的檢測係使用凝膠分析儀(Celvin)與Image J。
步驟
〈i.塗覆鏈黴親和素之孔的準備〉
將鏈黴親和素溶解於DPBS,進行稀釋而調製出20μg/mL的儲備溶液。以DPBS稀釋鏈黴親和素並將濃度調節為20、10、5、1、0.1、0.01及0.001μg/mL的濃度。將各鏈黴親和素樣本100μL加入於孔。於室溫放置一晚以使溶液乾燥。去除殘留的溶液並加入100μL的0.1% BSA。將孔板放置1小時以將非特異性結合部位封阻。去除上清液並以DPBS 100μL將孔洗淨2次。
〈ii.樣本的調製〉
使用DPBS稀釋含有SQR之生物素化DPPC囊泡分散液,並將SQR22濃度設成為5μg/ml(SQR-DPPC)。將100μL的SQR-DPPC分散液添加於經各量的鏈黴親和素塗覆之孔。亦將100μL的SQR-DPPC分散液追加添加於非經鏈黴親和
素塗覆之陰性對照。於室溫進行1小時的培養。以100μL的DPBS將樣本孔洗淨2次。以100μL的DPBS再次填滿全部的孔。
〈iii.使用Celvin之螢光強度觀察〉
以與實施例15所述之方法相同來取得圖像數據。
〈iv.圖像分析〉
以與實施例15所述之方法相同來進行圖像分析。
結果
將含有相異濃度的鏈黴親和素之鏈黴親和素溶液添加於微孔板的孔,並以相異量的鏈黴親和素來塗覆微孔的底面。依照步驟中所述之方法來測定各孔的螢光強度。將15秒時的螢光強度常態化為零之結果係如表4及圖17B及17C所示。從此等數據來看,係明確地顯示出含有SQR之生物素化DPPC囊泡鍵結於經鏈黴親和素塗覆之囊泡,且於50℃的加熱中發出SQR22螢光。螢光強度係對應於塗覆用鏈黴親和素溶液的濃度,若為1μg/mL以上,則可藉由Celvin來檢測。
(實施例17)藉由含有SQR22之生物素化DPPC囊泡與鏈黴親和素之複合體所進行之鏈黴親和素的檢測(加熱)
本實施例之概要圖如圖18所示。在此為了確認塗覆於微孔板的孔之鏈黴親和素之藉由含有SQR22之生物素化DPPC囊泡所辨識之辨識能,係使用生物素化囊泡與鏈黴親和素之複合體,並調查哪個混合比率具有效果。於本實施例中係使用凝膠-液晶相轉移溫度為41℃之DPPC囊泡,並於50℃將微孔板加熱90秒。於本實施例中,螢光強度的檢測係使用凝膠分析儀(Celvin)與Image J。
步驟
〈i.塗覆鏈黴親和素之孔的準備〉
將鏈黴親和素溶解於DPBS,進行稀釋而調製出20μg/mL的儲備溶液。將各鏈黴親和素樣本100μL加入於孔。於室溫放置一晚以使溶液乾燥。去除殘留的溶液並加入100μL的0.1% BSA。將微孔板放置1小時以將非特異性結合部位封阻。去除上清液並以DPBS 100μL將孔洗淨2次。
〈ii.囊泡-鏈黴親和素複合體的調製〉
稀釋鏈黴親和素儲備液以調製出10、5、2.5、1.25及0.625μg/mL濃度的鏈黴親和素樣本。準備5根空的1.5mL管,將所調製之鏈黴親和素的各樣本40μL加入於管。接著將脂質濃度為2.5mg/mL之含有SQR之生物素化DPPC囊泡(SQR-DPPC)分散液40μL添加於全部的管,而調製出囊泡-鏈黴親和素的莫耳比為4:1、2:1、1:1、1:2、1:4之複合體。藉由渦旋混合器攪拌混合物以促進複合體的形成,並於室溫對混合物進行1小時的培養。又,100nm之B-SQR-DPPC-L的重量約為59200kDa,為鏈黴親和素之分子量(55kDa)的1000倍。因此,2.5mg/mL(脂質濃度)的SQR-DPPC與2.5μg/mL的鏈黴親和素幾乎同數。
將100μL的各混合物添加於經鏈黴親和素塗覆之孔。亦將100μL的SQR-DPPC添加於經5μg/mL濃度的SQR的鏈黴親和素塗覆之孔作為陽性對照,將另外100μL的B-SQR-DPPC-L添加於非經鏈黴親和素塗覆之孔作為陰性對照。僅將處理緩衝液添加於非經鏈黴親和素塗覆之孔作為緩衝液。於室溫對孔板進行1小時的培養,以100μL DPBS將全部的孔洗淨2次。接著將100μL DPBS加入於孔。
〈iii.使用Celvin之螢光強度觀察〉
開啟SnapAndGo軟體,選擇系列模式且為了樣本的配置而關閉分析室,並等待至校正結束為止。開啟熱板的電源並預熱至50℃為止。於校正後點選圖像擷取設定選單的橫側。於設定選單中,將曝光時間調整為3秒,延遲時間調整為7秒,且每隔20秒拍攝照片並進行處理。選擇激發波長470nm(藍色光)、強度50。選擇680nm的濾波器。將樣本孔板放置在熱板上,關閉分析室並開始攝影。為了進行更適合的分析,係選擇各圖像的對比值。將全部圖像儲存為ImageJ分析用。
〈iv.圖像分析〉
以與實施例15所述之方法相同來進行圖像分析。
結果
分析結果如表5所示。係採用90秒時的螢光強度並將15秒時的螢光強度常態化為零。螢光強度在脂質體與鏈黴親和素之混合莫耳比為1:2時被強化。此可考量為藉由脂質體與鏈黴親和素之複合體化,因檢測使更多的SQR22脂質體參與所引起之故。
(實施例18)藉由相異濃度之含有SQR之生物素化DPPC囊泡分散液所進行之採用相異量的鏈黴親和素之螢光強度的測定試驗(非加熱)
本實施例之概要圖如圖19A所示。在此係使用生物素與鏈黴親和素之複合體,且為了確認塗覆於微孔板的微孔之鏈黴親和素之藉由生物素化DOPC囊泡所辨識之辨識能,係以相異濃度將鏈黴親和素塗覆於孔表面,並探討是否可藉由2種相異SQR濃度之含有SQR22之生物素化DOPC囊泡分散液檢測出鏈黴親和素的濃度差。由於本實施例中所使用之DOPC囊泡分散液的凝膠-液晶相轉移溫度為-22℃,所以含有SQR22之生物素化DOPC囊泡分散液甚至在室溫即發出較強的紅色螢光。雖不需加熱孔,但為了去除未結合之含有SQR22之生物素化DOPC囊泡,必須將孔洗淨2次。於本實施例中,螢光強度的檢測係使用凝膠分析儀(Celvin)與Image J。
步驟
〈i.塗覆鏈黴親和素之孔的準備〉
將鏈黴親和素溶解於DPBS,進行稀釋而調製出20μg/mL的儲備溶液。以每1微孔40μL將稀釋為各種濃度(0.0125、0.125、0.25、1.25、2.5、12.5μg/mL)之鏈黴親和素溶液添加於96孔的微孔板(greiner bio-one)。添加後,於乾燥機中乾燥45分鐘(內部溫度30至40℃),以將鏈黴親和素固定在孔底面。以每1孔100μL將1%BSA添加於此經鏈黴親和素修飾微孔板並進行10分鐘的封阻。封阻後藉由0.05% Tween-PBS洗淨液(PBS-T、Takara Bio Inc.)洗淨3次。
〈ii.樣本的調製〉
使用DPBS稀釋含有SQR之生物素化DOPC囊泡分散液,並將SQR22濃度設成為2.0、5.0μg/ml(SQR-DOPC)。將100μL的SQR-DOPC分散液添加於經各量的鏈黴親和素塗覆之孔,並靜置10分鐘。最後以PBS-T將未結合之含有SQR之生物素化DOPC囊泡分散液洗淨3次。此外,僅僅不進行使用DPBS固定鏈黴親和素(Streptavidin)之操作,其他於相同條件進行BSA封阻、洗淨、含有各濃度的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液的添加、洗淨、以及藉由Celvin所進行之測定作為陰性對照,並放置在各樣本孔的旁邊。
〈iii.使用Celvin之螢光強度觀察〉
開啟SnapAndGo軟體,選擇系列模式且為了樣本的配置而關閉分析室,並等待至校正結束為止。於校正後點選圖像擷取設定選單的橫側。於設定選單中,將曝光時間調整為30秒,並拍攝照片並進行處理。選擇激發波長625nm(紅色光)、強度50。選擇780nm的濾波器。為了進行更適合的分析,係選擇各圖像的對比值。將全部圖像儲存為ImageJ分析用。數據是從各孔樣本的螢光強度中減去空白的螢光強度後之值。
結果
各孔的配置(位址)與每個微孔之校正後的螢光強度分別如圖19B及表6所示。此外,從表6所製作之圖表如圖19C所示。於表7的ROI No中,粗體字表示stv(鏈黴親和素)(+)BSA(+)DOPC(+),除此之外為stv(-)BSA(+)DOPC(+)。
含有5.0μg/mL的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液與含有2.0μg/mL的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液,從每1孔之鏈黴親和素的結合量(假定添加於孔之鏈黴親和素100%地結合)為0.01μg/孔開始,以Celvin所測定之螢光強度皆增加,於0.1μg/孔時強度顯示出幾乎一定值。該一定值之值是以含有5.0μg/mL的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液者為高。另一方面,於陰性對照中,減去空白後者並未觀察到因孔場所的不同所造成之顯著差異,所以進行平均化並以虛線顯示於圖(圖19C)。
此虛線在含有5.0μg/mL的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液與含有2.0μg/mL的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液中,是以含有5.0μg/mL的SQR之生物素化DOPC囊泡分散液者為高,與鏈黴親和素結合量為0.01μg/孔以下之值幾乎一致。因此可得知具有含SQR囊泡的非特異性吸附,且此與含SQR囊泡的濃度相依。然而,兩種含SQR囊泡分散液皆在鏈黴親和素結合量為0.05μg/微孔時,觀察到與陰性對照之顯著差異。
從上述內容來看,係顯示出可藉由本發明來進行感度較一般的ELISA法更佳且更簡便之生體分子的檢測及測定。表7係顯示本發明之方法(TLip-ELISA)與ELISA法之性能比較的結果。
[產業上之可應用性]
本發明之溫度響應性螢光粒子可利用在溫度響應性螢光探針粒子的製作。此外,該溫度響應性螢光探針粒子可定量且以1分子層級來數位地計數與疾病或感染相關聯之生物標記而檢測。因此,本發明之溫度響應性螢光探針粒子或使用其之檢測法或定量法可利用作為疾病或感染的診斷藥或診斷方法。
本申請案係以於日本提出申請之日本特願2019-100299(申請日:2019年5月29日)為基礎,且其內容被全部涵蓋於本說明書中。
Claims (16)
- 一種溫度響應性螢光粒子,其係於包含至少一種兩親性脂質分子而構成之分子集合體中,包含至少一種螢光分子,其中藉由響應於溫度之固相-液相轉移,前述分子集合體於固相時前述螢光分子會消光,於液相時則會進行螢光發光,藉此,響應於溫度而使螢光分子的消光與螢光發光可逆地轉換。
- 如請求項1至3中任一項所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述分子集合體具有脂質雙重層,並藉由響應於溫度之凝膠-液晶相轉移,前述分子集合體於凝膠相時前述螢光分子會消光,於液晶相時則會進行螢光發光,藉此,響應於溫度而使螢光分子的消光與螢光發光可逆地轉換。
- 如請求項1至4中任一項所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述兩親性分子為磷脂質。
- 如請求項5所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述分子集合體為雙分子膜囊泡。
- 如請求項6所述之溫度響應性螢光粒子,其中前述雙分子膜囊泡含有0.3mol%以上之以前述一般式I表示之化合物。
- 一種溫度響應性螢光探針粒子,其係具有:修飾如請求項1至7中任一項所述之溫度響應性螢光粒子的表面的生體分子辨識元件。
- 如請求項8所述之溫度響應性螢光探針粒子,其中前述生體分子辨識元件為生物素(Biotin)、抗體或該抗體的可變區域或該抗體的fab片段、適體(Aptamer)。
- 一種生體試樣中所含有之生體分子的檢測或定量法,其係包含:(1)使如請求項8或9所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣接觸被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件之步驟,(2)加熱該基板之步驟,以及(3)測定螢光發光之步驟。
- 一種生體分子的檢測或定量法,其係包含:(1)使如請求項8或9所述之溫度響應性螢光探針粒子和生體試樣接觸被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件之步驟,(2)洗淨該基板之步驟,以及(3)測定螢光發光之步驟。
- 如請求項10或11所述之生體分子的檢測或定量法,其中前述步驟(1)為使如請求項8或9所述之溫度響應性螢光探針粒子、辨識生體分子辨識元件之元件、檢測用生體分子辨識元件和生體試樣與被固定在基板之捕獲用生體分子辨識元件接觸之步驟。
- 如請求項12所述之生體分子的檢測或定量法,其中生體分子辨識元件為生物素,辨識生體分子辨識元件之元件為鏈黴親和素、親和素或中性親和素。
- 一種生體分子的檢測法,其係包含:形成包含如請求項8或9所述之溫度響應性螢光探針粒子、標的生體分子、捕獲用生體分子辨識元件和熱源而構成之複合體之步驟;以及藉由前述複合體的形成而促進從熱源往溫度響應性螢光探針之熱傳導,並藉由前述溫度響應性螢光探針從固相往液相之相轉移使前述螢光分子進行螢光發光,然後測定該螢光發光之步驟。
- 一種生體分子的定量法,其係在如請求項14所述之生體分子的檢測法中,藉由計數進行螢光發光之溫度響應性螢光探針粒子的數目,來計數被試驗試樣中之標的生體分子的數目。
- 一種生體分子的檢測或測定用套組,其係含有如請求項8或9所述之溫度響應性螢光探針粒子。
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