JP7253834B2 - 心不全を治療するための改善された化合物 - Google Patents

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Description

本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ－１３２の有効な阻害剤であるオリゴヌクレオチド、並びに医学、特に心臓障害及び／又は線維化障害の予防又は治療におけるその使用に言及する。
心不全は、世界中で最も多い病理学的死亡原因の１つである。心筋梗塞（ＭＩ）は、その後進行性心臓リモデリングにつながり、その結果、予後不良の心不全が生じるので、心不全の最も重要な原因である。心不全のために現在使用されている薬理学的な治療法の選択肢は、アンジオテンシン調節剤、β－ブロッカー、利尿剤、アルドステロンアンタゴニスト、アンジオテンシン－ＩＩ－受容体ブロッカーとネプリライシン阻害剤との合剤、血管拡張剤、又は強心剤を含む。いくつかの臨床試験で、これら剤の全てについて心不全によって誘導される死亡率が著しく低下することが示されているが、５年死亡率は、およそ５０％と容認し難いままである。従って、心不全のための新規かつより効率的な治療アプローチを開発することが大いに必要とされている。
心筋細胞の病的な肥大成長は、心臓リモデリング、心不全、及び突然心臓死の発症につながる恐れがある。心筋細胞の肥大成長は、心臓容量及び／又は圧の過負荷によって引き起こされる心臓壁応力の増大に対する応答である。最初に、心肥大は、壁応力の減少及び心拍出量の増加を目的とする代償機序である。しかし、長期にわたる心肥大は、収縮不全、心代償不全、そして、最後には心不全に進行する（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，２００８；Ｂａｒｒｙ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，２０１０）。生理的肥大から病的肥大への移行は、アポトーシス若しくは壊死を通じた筋細胞の喪失、オートファジーにおける変化、収縮反応における異常、カルシウム恒常性の調節不全、アドレナリン受容体の脱感作、又は心線維症を含む多くの要因に依存して発生し得る（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，２００８；Ｂａｒｒｙ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，２０１０）。肥大シグナル伝達は、大部分はインスリンシグナル伝達経路によって媒介される（ＤｅＢｏｓｃｈ ａｎｄ Ｍｕｓｌｉｎ，２００８；Ｂａｒｒｙ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，２０１０）。インスリン及びインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）はいずれも、ホスホイノシチン－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を活性化するＩＧＦ－１受容体を介して心筋細胞における肥大促進経路を活性化する（ＭｃＭｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＰＩ３Ｋ活性は、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔのリン酸化を介してそれを活性化させ、そして、活性型Ａｋｔは、抗肥大性ＦｏｘＯ転写因子をリン酸化して、それを不安定化させ、核への局在を阻止する（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｋｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｏｎｎｅｂａｕｍ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，２０１０）。対照的に、サーチュイン－１（Ｓｉｒｔ－１）によってＦｏｘＯ因子がアセチル化されると、それは安定化し、核に移行する（Ｆｒｅｓｃａｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。安定化したＦｏｘＯ転写因子は、抗肥大性遺伝子の発現を制御するために、核に局在する。ＦｏｘＯタンパク質の抗肥大機能は、大部分は、アトロギン－１等のＦｏｘＯ因子の抗肥大性遺伝子標的の発現を介した肥大促進性カルシニューリンシグナル伝達経路の抑制を通じて媒介される（Ｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｒｏｎｎｅｂａｕｍ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，２０１０；Ｇｌａｓ，２０１０）。更に、ＦｏｘＯ転写因子は、また、心筋細胞においてアポトーシスを誘導し、そして、オートファジーを制御する（Ｒｏｎｎｅｂａｕｍ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，２０１０）。
マイクロＲＮＡは、有害な心臓リモデリングにおいて重要な役割を有することが示されている。国際公開公報第２０１３／０３４６５３号には、ｍｉＲ－１３２及び／又はｍｉＲ－２１２が、心肥大を誘導する可能性があるので、心不全治療の潜在的治療標的を構成し得ることが記載されている。
国際公開公報第２０１６／０４２５６１号には、ヒトｍｉＲ－１３２のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的なポリヌクレオチド剤を治療的有効量を被験体に投与することによって、脂質関連障害を治療する方法が記載されている。
本発明者らは、心筋細胞におけるｍｉＲ－１３２発現の有効な阻害剤である新規オリゴヌクレオチドアナログを同定した。以下ではＣＤＲ１３２Ｌと表されるオリゴヌクレオチドアナログは、ヌクレオシド間ホスホロチオエート結合を有する、ＤＮＡ基本構造単位（building block）及びＬＮＡ基本構造単位からなるミクシマー（ｍｉｘｍｅｒ）である。これは、ヒト肝細胞株及び単離新生仔ラット心筋細胞において著しい毒性を有しない。更に、ＣＤＲ１３２Ｌは、同じヌクレオチド配列を有するが、ＬＮＡ基本構造単位の分布は異なる他のオリゴヌクレオチドアナログと比較して、優れた効果を呈することが示された。
いくつかの動物モデルでＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験した。心肥大のトランスジェニックマウスモデルでは、ＣＤＲ１３２Ｌは、ｍｉＲ－１３２の発現低下に関連する逆心臓リモデリングを引き起こした。ＭＩ後の心不全のマウスモデルでは、ＣＤＲ１３２Ｌ治療は、ＭＩ後の左心室機能不全及び収縮期の収縮機能の負荷非依存性パラメータを低減することが見出された。更に、ＣＤＲ１３２Ｌを投与した結果、心機能が改善され、そして、ｍｉＲ－１３２発現、心臓ストレスシグナル伝達、及びＭＩ後の肥大が減少した。ＭＩ後の心不全のブタモデルでは、ＣＤＲ１３２Ｌ治療は、不適応なリモデリングを防ぎ、左心室の機能を改善することが見出された。更に、ＣＤＲ１３２Ｌは、ＢＮＰ、ＡＮＰ等の病的心不全マーカーの組織発現を正常化し、そして、ミオシン重変化（ｍｙｏｓｉｎｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｎｇｅ）アイソフォームをシフトさせる（ＭＹＨ７／６比）。
更なる研究において、本発明者らは、心筋梗塞のインビボマウスモデル並びに肝線維症及び肺線維症のインビトロモデルにおいて、オリゴヌクレオチドアナログＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化治療効果を同定した。
従って、オリゴヌクレオチドＣＤＲ１３２Ｌは、医学、特に心臓障害及び／又は線維化障害の予防又は治療において活性剤として有用である。
従って、本発明の第１の態様は、式Ｉ：
５’－ＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＡＣＴＧＴＴ－３’
（式中、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣは、デオキシリボヌクレオチド基本構造単位であり、
少なくとも１つのＧ又はＴの基本構造単位は、架橋ヌクレオチド基本構造単位及び／又はモルホリノヌクレオチド基本構造単位である）
の配列を含むオリゴヌクレオチドアナログを提供する。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式ＩＩ：
５’－Ａ＋ＴＧ＋ＧＣ＋ＴＧ＋ＴＡ＋ＧＡＣＴＧ＋Ｔ＋Ｔ－３’
（式中、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣは、デオキシリボヌクレオチド基本構造単位であり、
＋Ｇ及び＋Ｔは、架橋ヌクレオチド基本構造単位及び／又はモルホリノヌクレオチド基本構造単位であり、特に、＋Ｇ及び＋Ｔは、ＬＮＡ基本構造単位である）
の配列を含む又は有する。
式Ｉ又は式ＩＩのオリゴヌクレオチドアナログは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、例えば、ヌクレアーゼ分解に対して安定化されたヌクレオシド間結合、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジアミデート結合を含み得る。具体的な実施形態では、全てのヌクレオシド間結合が、修飾結合、特に、ホスホロチオエート結合である。
より具体的な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドＣＤＲ１３２Ｌに関する。
オリゴヌクレオチドＣＤＲ１３２Ｌは、式ＩＩＩ：
５’－ｄＡ＊＋Ｔ＊ｄＧ＊＋Ｇ＊ｄＣ＊＋Ｔ＊ｄＧ＊＋Ｔ＊ｄＡ＊＋Ｇ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊＋Ｔ＊＋Ｔ－３’
（式中、ｄＡは、２’デオキシアデノシンであり、ｄＧは、２’デオキシグアノシンであり、ｄＣは、２’デオキシシチジンであり、Ｔは、チミジンであり、
＋Ｔは、ＬＮＡ－Ｔ基本構造単位であり、＋Ｇは、ＬＮＡ－Ｇ基本構造単位であり、＊は、ホスホロチオエート結合である）
の配列を有する。
本発明の更なる態様は、活性剤としての式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの配列を含むオリゴヌクレオチドアナログと、薬学的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物に関する。
本発明のより更なる態様は、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの配列を含むオリゴヌクレオチドアナログの医学的使用に関する。特定の実施形態では、医学的使用は、ｍｉＲ－１３２の病的発現に関連する、それを伴う、及び／又はそれによって引き起こされる障害を治療又は予防するための使用に関する。特定の実施形態では、医学的使用は、心臓障害、特に、心肥大関連障害の治療又は予防に関する。特定の実施形態では、医学的使用は、線維化障害、例えば、病的線維症、特に、心線維化障害、肺線維化障害、又は肝線維化障害に関連する、それを伴う、及び／又はそれによって引き起こされる線維化障害の治療に関する。
ＣＤＲ１３２Ｌの毒性学プロファイリング。治療用量の範囲にわたってＨｅｐＧ２細胞及びＮＲＣＭにおいてＣＤＲ１３２Ｌの著しい毒性はみられなかった（図１Ａ及び１Ｂ参照）。 ＣＤＲ１３２Ｌの毒性学プロファイリング。治療用量の範囲にわたってＨｅｐＧ２細胞及びＮＲＣＭにおいてＣＤＲ１３２Ｌの著しい毒性はみられなかった（図１Ａ及び１Ｂ参照）。 トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与による心不全の左心室逆リモデリング。心不全のマウスモデルにおける心不全の回復におけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。試験の概要。心肥大のモデル：心臓でｍｉＲ－１３２が過剰発現しているトランスジェニック（ＴＧ）マウス（Ｕｃａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２）。処理：週１回２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ。ＣＤＲ１３２Ｌ又はプラセボ（図２Ａを参照）。群：野生型（ＷＴ）同腹仔＋プラセボ、ＷＴ＋ＣＤＲ１３２Ｌ、ＴＧ＋プラセボ、ＴＧ＋ＣＤＲ１３２Ｌ。ｎ＝６／群。 トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与による心不全の左心室逆リモデリング。心不全のマウスモデルにおける心不全の回復におけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ｍｉＲ－１３２の発現レベルは、ｑＰＣＲを介して検出した。統計検定：対応のないｔ検定。（図２Ｂ）。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝６／群。 トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与による心不全の左心室逆リモデリング。心不全のマウスモデルにおける心不全の回復におけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。代表的な心エコー画像（図３Ａ）。 トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与による心不全の左心室逆リモデリング。心不全のマウスモデルにおける心不全の回復におけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ＣＤＲ１３２Ｌは、心筋重量及び拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）によって測定されるように肥大を回復させる（図３Ｂ）。 トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与による心不全の左心室逆リモデリング。心不全のマウスモデルにおける心不全の回復におけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ＣＤＲ１３２Ｌは、左心室のほとんどのセグメントにおいて局所収縮機能を改善する（ＡＢ、基部前壁；ＡＭ、中部前壁；ＡＡ、心尖部前壁；ＰＡ 心尖部後壁；ＰＭ、中部後壁、及びＰＢ、基部後壁）（図３Ｃ）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。試験の概要。心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデル：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおける冠動脈（ＬＡＤ）の永久結紮（Ｋｏｌｋ ｅｔ ａｌ．，２００９）。群：ＭＩ又はシャム、ＣＤＲ１３２Ｌ又はプラセボで処理 処理：２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ、ＭＩ後の７及び１４日目 エンドポイント：ＭＩ後の２８日目のＬＶ機能。ｎ＝６～７／群（図４）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＭＩ後の左心室機能不全を改善する（図５Ａ）。収縮期の収縮機能の負荷非依存性パラメータも改善された（図５Ｂ）（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＭＩ後の左心室機能不全を改善する（図５Ａ）。収縮期の収縮機能の負荷非依存性パラメータも改善された（図５Ｂ）（＊ｐ＜０．０５）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、長軸ストレインレート（ＬＳＲ）も改善し、従って、心臓の遠隔領域の個々の心臓セグメントにおいてＭＩ後の収縮不全を回復させる。（＊ｐ＜０．０５）（図６）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。ＣＤＲ１２３Ｌ処理は、心臓組織、例えば、遠隔（非梗塞）領域及び梗塞周囲ゾーンにおいてｍｉＲ－１３２発現を有効にサイレンシングする（図７Ａ）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。組織学的レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌは、ＭＩ後の心臓の遠隔領域において心筋細胞サイズを減少させる（図７Ｂ）。 ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与。ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。組織レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌは、ＭＩ後の心臓において心臓ストレスシグナルＡＮＰの発現を減少させる（図７Ｃ）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。試験の設定。９０分間の虚血（ＬＡＤ閉塞）及びその後の再灌流によって惹起される心筋梗塞のブタモデル。群：プラセボ又はＣＤＲ１３２Ｌ、ｎ＝６／群。処理：２回、ＭＩ後の３及び２８日目、それぞれ０．３ｍｇ／ｋｇ冠内及び０．５ｍｇ／ｋｇ静脈内（図８）。エンドポイント：ＭＩ後の８週間。主要評価項目：ＥＦ及びＬＶリモデリング。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率、及び左心室機能の測定によって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、機能を改善する（図９Ａ～Ｄ）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率、及び左心室機能の測定によって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、機能を改善する（図９Ａ～Ｄ）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率、及び左心室機能の測定によって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、機能を改善する（図９Ａ～Ｄ）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率、及び左心室機能の測定によって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、機能を改善する（図９Ａ～Ｄ）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、生存／遠隔心筋に対応するセグメントにおいてセグメントの収縮力を改善する；エンドポイントにおける心臓ＭＲＩ：ｎ＝６／群、赤色の領域：ｐ＜０．０５（図９Ｅ）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＮＯＧＡ、エンドポイントにおける電気解剖マッピングによって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、心尖領域におけるＬＶバイアビリティを改善する、：ｎ＝６／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５（図１０）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＡＮＰ及びＢＮＰにおける病的心不全マーカーの組織発現を正常化し、そして、ミオシン重変化（ｍｙｏｓｉｎｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｎｇｅ）アイソフォーム、すなわち、ＭＹＨ７／６比シフトさせる（図１１）。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。組織学的レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、遠隔ＬＶ領域における心筋細胞肥大を有効に減少させる、ＬＶ領域の代表的な顕微鏡写真（ＷＧＡ／ＤＡＰＩ染色２０×）（図１２Ａ）及びグラフ表示（図１２Ｂ）、ｎ＝６／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５。 ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験。心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。組織学的レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、遠隔ＬＶ領域における心筋細胞肥大を有効に減少させる、ＬＶ領域の代表的な顕微鏡写真（ＷＧＡ／ＤＡＰＩ染色２０×）（図１２Ａ）及びグラフ表示（図１２Ｂ）、ｎ＝６／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５。 ブタにおけるＣＤＲ１３２ＬのＰＤプロファイル／ターゲットエンゲージメント。ＣＤＲ１３２Ｌ処理の単回投与は、心臓のｍｉＲ－１３２レベルを用量依存的にサイレンシングする（図１３）。 臓器毒性学プロファイリング。生体内投与におけるＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ブタにおいて臓器毒性を全く惹起しない（図１４）。 心不全のマウスモデルでの心臓におけるＦｏｘＯ３及びＳＥＲＣＡ２のｍＲＮＡレベル。対照であるスクランブルオリゴヌクレオチド又はＣＤＲ１３２Ｌのいずれかの腹腔内注射で毎週４回処理した対照及びｍｉＲ－１３２ ＴＧマウスにおいて心臓のＦｏｘＯ３及びＳｅｒｃａ２ ｍＲＮＡレベルを測定した。全ての値は、平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５（図１５Ａ及び１５Ｂ）。 さまざまなオリゴヌクレオチドの比較。この試験の目的は、２つの比較オリゴヌクレオチドと共に、本発明にかかる新規ｍｉＲ－１３２－３ｐ阻害剤ＣＤＲ１３２Ｌの治療効果を評価することであった。実験デザイン及び結果を図１６に示す：（Ａ）実験設定の概要。０日目に新生仔ラット心筋細胞を播種し、そして、１日目にオリゴヌクレオチドＣＤＲ１３２Ｌ、ＣＤＲ２ｕ１、又はＣＤＲ３０１（各１００ｎＭ）で処理した。エンドポイントにおいて、遺伝子発現解析のために細胞を収集した。（Ｂ）ＣＤＲ１３２Ｌ、ＣＤＲ２ｕ１、又はＣＤＲ３０１で処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの発現レベル。（Ｃ）ＣＤＲ１３２Ｌ、ＣＤＲ２ｕ１、又はＣＤＲ３０１で処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの標的遺伝子であるＦｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｏ３（ＦｏｘＯ３）の発現レベル。データは、平均±ＳＤである。両側スチューデントｔ検定によってオリゴヌクレオチド対プラセボのＰ値を決定した。ＣＤＲ１３２Ｌ及びＣＤＲ３０１によりＮＲＣＭを処理したところ、ｍｉＲ－１３２－３ｐレベルが９６％と著しく低下し、一方、ＣＤＲ２ｕ１はｍｉＲＮＡ発現を３０％低下させた（図１６Ａ～Ｂ）。更に、ＣＤＲ１３２Ｌによる処理は、ｍｉＲ－１３２－３ｐの標的遺伝子であるＦｏｘｏ３を著しく低下させたが、これはＣＤＲ２ｕ１及びＣＤＲ３０１では達成されなかった（図１６Ｃ）。 心線維症におけるＣＤＲ１３２Ｌの効果。この試験の目的は、線維症のインビボモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化治療効果を評価することであった。抗線維化活性をインビボにおいて証明するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおける左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）の永久結紮による心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデルを使用した。ＣＤＲ１３２Ｌ処理を７及び１４日目に、プラセボ（ＣＤＲ１３２Ｌのスクランブルオリゴアナログ、２０ｍｇ／ｋｇ）及びＣＤＲ１３２Ｌ（２０ｍｇ／ｋｇ）を適用した。群は、プラセボ又はＣＤＲ１３２Ｌのいずれかを投与した、対照手術群（シャム手術マウス）及びＬＡＤ結紮マウス（ＭＩ、心筋梗塞）を含んでいた：シャム＋プラセボ、シャム＋ＣＤＲ１３２Ｌ、ＭＩ＋プラセボ、ＭＩ＋ＣＤＲ１３２Ｌ。ｎ＝６～７／群。実験計画を図１７で説明する。 心線維症におけるＣＤＲ１３２Ｌの効果。この試験の目的は、線維症のインビボモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化治療効果を評価することであった。ＭＩ後の心不全におけるインビボのＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化効果の評価を図１８に示す。線維症（ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色によって検出されるコラーゲン沈着及びβ－アクチンに対するＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ３ａ１）遺伝子発現の％として示される）は、ＭＩの後にＣＤＲ１３２Ｌによる処理によって減弱した。群は、プラセボ（黒色カラム）又はＣＤＲ１３２Ｌ（白色カラム）のいずれかを投与した対照手術群（シャム手術マウス）及びＬＡＤ結紮マウス（ＭＩ、心筋梗塞）を含んでいた：シャム＋プラセボ、シャム＋ＣＤＲ１３２Ｌ、ＭＩ＋プラセボ、ＭＩ＋ＣＤＲ１３２Ｌ。プラセボ又はＣＤＲ１３２Ｌで処理したＭＩマウス間で統計検定（独立ｔ検定）を実施した。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝６～７／群。組織学的結果によれば、ＣＤＲ１３２Ｌ処理後に線維症が減弱した（図１８Ａ）。これは、分子レベルで確認され、ＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ３ａ１）のような線維化マーカーの遺伝子発現が減少した（図１８Ｂ）。 肺及び肝臓の線維症におけるＣＤＲ１３２Ｌの効果。ＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化効果を肺及び肝臓の線維症についてインビトロモデルで試験した。図１９は、肝線維症のインビトロモデルを示す：（Ａ）実験設定の概要。０日目にヒト初代肝線維芽細胞（ＰｅｌｏＢｉｏｔｅｃｈによって提供）を播種し、１日目に線維化刺激（正常成長培地（１０％ＦＢＳを補給した完全線維芽細胞培地）中の１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β）及びＣＤＲ１３２Ｌ（１００ｎＭ）で処理した。エンドポイントにおいて、細胞増殖及び線維化マーカーの遺伝子発現を評価した。（Ｂ）ＣＤＲ１３２Ｌで処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの発現レベル。（Ｃ）ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ（ブロムデスオキシウリジン）の取り込みをモニタリングすることによって評価した増殖。エンドポイントの２０時間前にＢｒｄＵ試薬を培地に添加した。（Ｄ）線維化マーカー遺伝子（コラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）、コラーゲン１Ａ２（ＣＯＬ１Ａ２）、及びマトリクスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２））の発現レベル。（Ｂ）及び（Ｄ）において、点線は未刺激対照細胞の発現レベルを示す。データは、平均±ＳＤである。両側スチューデントｔ検定によってＣＤＲ１３２Ｌ対対照のＰ値を決定した。トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）によってＨＰＬＦを刺激すると（図１９Ａ）、ｍｉＲ－１３２－３ｐがわずかに誘導され、これは、ＣＤＲ１３２Ｌ処理によって著しく減少した（図１９Ｂ）。更に、この化合物は、線維芽細胞の増殖（図１９Ｃ）、並びにＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、及びＭＭＰ２を含む線維化遺伝子発現（図１９Ｄ）を減少させた。 肺及び肝臓の線維症におけるＣＤＲ１３２Ｌの効果。ＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化効果を肺及び肝臓の線維症についてインビトロモデルで試験した。図２０は、肺線維症のインビトロモデルを示す：（Ａ）実験設定の概要。０日目に正常ヒト肺線維芽細胞（Ｌｏｎｚａによって提供）を播種し、そして、１日目に線維化刺激（線維芽細胞成長培地中の高ＦＢＳ（５％）及びＣＤＲ１３２Ｌ（１００ｎＭ）で処理した。エンドポイントにおいて、細胞増殖及び遺伝子発現を評価した。（Ｂ）ＣＤＲ１３２Ｌで処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの発現レベル。（Ｃ）ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ（ブロムデスオキシウリジン）の取り込みをモニタリングすることによって評価した増殖。エンドポイントの２０時間前にＢｒｄＵ試薬を培地に添加した。（Ｂ）において、点線は未刺激対照細胞の発現レベルを示す。データは、平均±ＳＤである。両側スチューデントｔ検定によってＣＤＲ１３２Ｌ対対照のＰ値を決定した。ＮＨＬＦ細胞では、高ＦＢＳ（正常成長条件の２％ＦＢＳに比べて５％）による線維化刺激後（図２０Ａ）、ｍｉＲ－１３２－３ｐの上昇は観察されなかった（図２０Ｂ）。それにもかかわらず、ＣＤＲ１３２Ｌによる処理は、標的となったマイクロＲＮＡを著しく減少させ（図２０Ｂ）、線維芽細胞を増殖させた（図２０Ｃ）。
式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドＤＮＡ基本構造単位、及び架橋ヌクレオチド基本構造単位、及び／又はモルホリノヌクレオチド基本構造単位（ＤＮＡ）からなっていてよい。「架橋ヌクレオチド」とは、リボース部分が２’及び４’炭素原子を結合させる２又は３原子架橋を含む、修飾リボヌクレオチドを指す。例えば、架橋は、構造２’－Ｏ－ＣＨ２－４’、２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－４’、２’－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）－４’、又はＯがＳ若しくはＮＨによって置換されている対応する構造を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの架橋ヌクレオチド基本構造単位は、２’－Ｏ－ＣＨ２－４’架橋を有するロックド核酸（ＬＮＡ）基本構造単位である。モルホリノヌクレオチド基本構造単位とは、リボース又はデオキシリボースがモルホリノ部分によって置換されている、修飾ヌクレオチドを指す。
式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６基本構造単位の長さ、例えば、１６～２０基本構造単位の長さを有する。特定の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのオリゴヌクレオチドは、１６基本構造単位の長さを有する。
いくつかの実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのオリゴヌクレオチドは、５～１０個、例えば、６～８個、特に７個の架橋ヌクレオチド基本構造単位、例えば、ＬＮＡ基本構造単位及び／又はモルホリノヌクレオチド基本構造単位を含む。
幾つかの実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩのオリゴヌクレオチドは、ネイキッドオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの異種部分、例えば、オリゴヌクレオチドのｍｉＲ－１３２への結合には寄与しない部分にコンジュゲートし得る。異種部分は、ターゲティング及び／又は細胞取り込みを改善する部分、例えば、コレステロール若しくは脂肪酸等の脂質部分、Ｎ－ガラクトサミン含有部分等の糖若しくはアミノ糖部分、ペプチド若しくはポリペプチド部分、又はアプタマー等のヌクレオチド若しくはヌクレオチド部分であってよい。異種部分は、共有結合又はスペーサを用いてオリゴヌクレオチドアナログの５’及び／又は３’末端とコンジュゲートし得る。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒト及び動物の医学を含む医学において使用するのに好適である。特定の実施形態では、化合物は、ｍｉＲ－１３２の病的発現、例えば過剰発現に関連する、それを伴う、及び／又はそれによって引き起こされる障害の予防又は治療において有用である。化合物の投与は、インビトロ及びインビボにおけるｍｉＲ－１３２発現を著しく低減することが見出された。
いくつかの実施形態では、化合物は、健常被験体と比べてｍｉＲ－１３２の過剰発現を示す患者に投与してよい。いくつかの実施形態では、化合物は、健常被験体と比べてｍｉＲ－１３２の過剰発現を示してはいないが、ｍｉＲ－１３２のレベルを低下させる必要がある患者に投与してよい。
用語「予防」は、本発明の状況において、特定の障害を発症するリスクが増大していることが分かっている患者に化合物を投与することに関する。用語「治療」は、本発明の状況において、特定の障害の徴候及び／又は症状を既に発症している患者に化合物を投与することに関する。用語「患者」は、ヒト又は動物の医学の分野における、本発明の化合物の投与を必要としている被験体に関する。具体的な実施態様では、患者は、ヒト患者である。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、心臓障害、特に、心肥大関連障害の予防又は治療において有用である。例えば、化合物は、収縮不全、心代償不全、心不全の予防若しくは治療において、又は心筋梗塞、心筋炎、弁膜心疾患、例えば、大動脈狭窄若しくは僧帽弁閉鎖不全、心肥大を伴う遺伝性心臓障害、例えば、肥大性非閉塞性及び閉塞性心筋症若しくはファブリー病の後の心臓リモデリングを予防若しくは治療するために有用である。
化合物は、
（ｉ）心不全を発症するリスクが増大している患者、
（ｉｉ）（うっ血性）心不全に罹患している患者、例えば、心不全が進行するリスクが増大している患者、
（ｉｉｉ）心筋梗塞後の患者、及び／又は
（ｉｖ）心肥大に関連する先天性心疾患、例えば、肺静脈狭窄症、心房若しくは心室の中隔欠損の患者
から選択される患者に投与するために有用である。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、線維化障害、特に、病的線維症に関連する、それを伴う、及び／又はそれによって引き起こされる障害の予防又は治療において有用である。
病的線維症は、特に、病的状態に関連する、それを伴う、及び／又はそれによって引き起こされる、臓器又は組織における過剰な線維性結合組織の形成である。病的線維症は、典型的には炎症又は損傷の結果として、体内の多くの異なる臓器及び組織で発生し得る。
特定の実施形態では、線維症は、心線維症、例えば、心臓において病的線維症に侵されている病態である。例示的な心線維症の種類は、心房線維症、心内膜心筋線維症、又は既往の心筋梗塞から生じた線維症を含む。
更なる実施形態では、線維症は、肺線維症、例えば、肺において病的線維症に侵されている病態である。例示的な肺線維症の種類は、職業性又は環境性の要因によって、例えば毒素及び汚染物質、例えば珪石の粉塵、石綿繊維、金属粉塵、炭塵、穀物粉塵、鳥及び動物の糞への曝露によって引き起こされる線維化障害を含む。他の種類の肺線維化障害は、放射線治療及び／又は医薬、例えば、化学療法薬、心臓病の薬、抗生物質、又は抗炎症薬による治療によって引き起こされる。更に他の種類の肺線維化障害は、特発性肺線維症、皮膚炎、多発性筋炎、混合結合組織病、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群若しくは全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、肺炎、ウイルス感染、又は胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）を含む障害によって引き起こされる。
更なる実施形態では、線維症は、肝線維症、例えば、肝臓において病的線維症に侵されている病態である。例示的な肝線維症の種類は、ウイルス感染、例えばＢ型及び／又はＣ型の肝炎ウイルス、遺伝性代謝障害、自己免疫性肝炎、胆道閉塞、鉄過剰、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む非アルコール性脂肪性肝疾患、並びにアルコール性肝疾患によって引き起こされる。
より更なる実施形態では、線維症は、血管線維症、例えば動脈硬化、皮膚線維症、例えばケロイド形成若しくは腎性全身線維症、関節線維症、いくつかの形態の癒着性関節包炎、軟組織線維症、例えば縦隔線維症若しくは後腹膜線維症、又は骨髄線維症、例えば骨髄線維症であってもよい。
特定の実施態様では、本発明は、本発明の化合物の投与前、投与の間、及び／又は投与後に、治療される被験体における特定の生理学的パラメータの量及び／又は活性を測定することを包含する。この同時診断手順は、上記の医学的使用を支援することができる。例えば、診断手順は、リスク評価、患者の層別化、治療経過のモニタリング、及び／又は治療後管理において支援することができる。
特定の実施態様では、本発明は、本発明の化合物の投与前、投与の間、及び／又は投与後に、治療される被験体におけるｍｉＲ－１３２の量及び／又は活性を測定することを包含する。更なる実施形態では、本発明は、ＢＮＰ、ＡＮＰ等の心臓マーカー、又はミオシン重変化（ｍｙｏｓｉｎｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｎｇｅ）アイソフォーム、例えばＭＹＨ７／６比、並びに／又はＦｏｘＯ３及び／若しくはＳＥＲＣＡ２のレベルの量及び／又は活性を測定することを包含する。より更なる実施形態では、本発明は、線維化マーカー、例えばコラーゲン、例えばコラーゲン沈着、及び／又はコラーゲン１Ａ１、コラーゲン１Ａ２、コラーゲン３Ａ１等の線維化マーカー遺伝子の発現、及び／又はマトリクスメタロペプチダーゼ、例えばマトリクスメタロペプチダーゼ２の量及び／又は活性を測定することを包含する。
上記パラメータの測定は、核酸及び／若しくはタンパク質のレベルで公知の方法に従って、血液、血漿、若しくは血清等の体液サンプル中又は組織サンプル中で実施してよく、そして、例えば治療の経過及び／又は成功に関する有用な診断情報を提供することができる。
本発明の化合物は、薬理学的に許容し得る担体を含む医薬組成物として投与され得る。投与は、治療される被験体の所望の標的細胞又は臓器の中に化合物を導入する、公知の方法によって実施され得る。
化合物は、そのまま、又は上記異種部分とのコンジュゲートとして投与され得る。
医薬用途の場合、組成物は、注射液等の溶液、エマルション、吸入物、懸濁液等の形態であってよい。
組成物は、任意の好適な経路で、例えば非経口的に、具体的には、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは動脈内の注射等の注射又は注入によって、経口若しくは吸入の摂取によって、及び／又は皮膚塗布によって投与され得る。担体は、任意の好適な医薬担体であってよい。好ましくは、オリゴヌクレオチド分子が標的細胞に入る効率を高めることができる担体が使用される。このような担体の好適な例は、カチオン性リポソーム等のリポソーム又は予め設計されたエキソソームである。
化合物は、投与経路及び疾患の種類又は重篤度に応じて、薬学的に有効な投薬量で投与される。
化合物は、単剤療法として、又は更なる異なる医薬、特に、上記心臓障害若しくは線維化障害の予防若しくは治療に好適な医薬と組み合わせて投与してよい。
心臓障害の予防又は治療に好適な更なる医薬の例は、アンジオテンシン調節剤、β－ブロッカー、利尿剤、アルドステロンアンタゴニスト、血管拡張剤、強心剤、スタチン、若しくはネプリライシン阻害剤、又はこれらの組み合わせ、例えば、サクビトリル等のネプリライシン阻害剤とバルサルタン等のアンジオテンシン－ＩＩ－受容体ブロッカーとの合剤である。
線維化障害の治療の予防に好適な更なる医薬の例は、心線維症を予防又は治療するための医薬、例えばＡＣＥ阻害剤、例えばリシノプリル、アンジオテンシンＩＩ受容体ブロッカー、例えばカンデサルタン、ロサルタン、若しくはオルメサルタン、アルドステロンアンタゴニスト、例えばスピロノラクトン、及び／又はＴＧＦβ阻害剤、例えばピルフェニドン若しくはトラニラスト、肺線維症を予防又は治療するための医薬、例えば抗線維化剤、例えばニンテダニブ若しくはピルフェニドン、抗炎症剤、例えばコルチコステロイド、アザチオプリン、シクロホスファミド及びミコフェノール酸モフェチル、抗逆流剤、例えばタンパク質ポンプ阻害剤若しくはＨ２ブロッカー、及び／又は抗咳剤、並びに肝線維症を予防及び／又は治療するための医薬、例えばＡＣＥ阻害剤、例えばベナゼプリル、リシノプリル、若しくはラミプリル、抗ウイルス剤、又はＰＰＡＲαアゴニストである。
より更に、本発明は、心臓障害を予防又は治療するための医薬を製造するための、本明細書に上記した本発明の化合物の使用に関する。
より更に、本発明は、線維化障害を予防又は治療するための医薬を製造するための、本明細書に上記した本発明の化合物の使用に関する。
より更に、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、それを必要としている被験体に投与することを含む、心臓障害を予防又は治療する方法に関する。
より更に、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、それを必要としている被験体に投与することを含む、線維化障害を予防又は治療する方法に関する。
更に、本発明は、以下の図面及び実施例によってより詳細に説明されるものとする。
実施例１－心筋細胞におけるｍｉＲ－１３２発現のサイレンシング
抗ｍｉＲ－１３２ライブラリに由来する多数の構造アナログ化合物のｍｉＲＮＡ阻害活性についての定量インビトロアッセイを実施した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ及び定量リアルタイムＰＣＲによってｍｉＲＮＡ発現のサイレンシングを定量した。
１０μＭの濃度のフェニレフリン／イソプロテレノールで処理することによる肥大性刺激後の単離ラット心筋細胞において試験を実施した。標準的な細胞培養培地中で細胞を４８時間インキュベートした。試験化合物を１００ｎＭの濃度で個々に投与した。試験はトリプリケートで実施した。
抗ｍｉＲ－１３２構造アナログライブラリから、ホスホロチオエート骨格を有するＬＮＡ－ＤＮＡ混合物である化合物ＣＤＲ１３２Ｌが最も強力な化合物として同定された。
ＣＤＲ１３２Ｌの構造は、以下の通りである：
５’－ｄＡ＊＋Ｔ＊ｄＧ＊＋Ｇ＊ｄＣ＊＋Ｔ＊ｄＧ＊＋Ｔ＊ｄＡ＊＋Ｇ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊＋Ｔ＊＋Ｔ－３’
（式中、ｄＡは、２’デオキシアデノシンであり、ｄＧは、２’デオキシグアノシンであり、ｄＣは、２’デオキシシチジンであり、Ｔは、チミジンであり、
＋Ｔは、ＬＮＡ－Ｔ基本構造単位であり、＋Ｇは、ＬＮＡ－Ｇ基本構造単位であり、＊は、ホスホロチオエート結合である）。
実施例２－毒性学プロファイリング
２．１試験の目的：ＣＤＲ１３２Ｌの毒性学プロファイリング
２．２試験の概要：
ヒト肝細胞細胞（ＨｅｐＧ２）及び単離新生児心筋細胞（ＮＲＣＭ）においてインビトロ細胞毒性アッセイを実施した。商業的ＭＴＴ比色アッセイを使用して、細胞毒性を評価した。個々の化合物の添加後、細胞をＤＭＥＭ培地中で４８時間インキュベートした。０．０１～１００μＭの用量範囲で、ＣＤＲ１３２Ｌの効果（赤）を、対照として使用したスクランブルＬＮＡオリゴヌクレオチド（青）と比較した。治療用量範囲を灰色でマークする。
２．３結果：治療用量の範囲にわたってＨｅｐＧ２細胞及びＮＲＣＭにおいてＣＤＲ１３２Ｌの著しい毒性はみられなかった（図１Ａ及び１Ｂ参照）。
実施例３－トランスジェニックマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与による心不全の左心室逆リモデリング
３．１試験の目的：心不全のマウスモデルにおける心不全の回復におけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。
３．２試験の概要：
心肥大のモデル：心臓でｍｉＲ－１３２が過剰発現しているトランスジェニック（ＴＧ）マウス（Ｕｃａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２）。
処理：週１回２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ。ＣＤＲ１３２Ｌ又はプラセボ（図２Ａを参照）。
群：野生型（ＷＴ）同腹仔＋プラセボ、ＷＴ＋ＣＤＲ１３２Ｌ、ＴＧ＋プラセボ、ＴＧ＋ＣＤＲ１３２Ｌ。ｎ＝６／群。
ｍｉＲ－１３２の発現レベルは、ｑＰＣＲを介して検出した。統計検定：対応のないｔ検定。（図２Ｂ）。
＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝６／群。
３．３結果：
代表的な心エコー画像（図３Ａ）。
ＣＤＲ１３２Ｌは、心筋重量及び拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）によって測定されるように肥大を回復させる（図３Ｂ）。
ＣＤＲ１３２Ｌは、左心室のほとんどのセグメントにおいて局所収縮機能を改善する（ＡＢ、基部前壁；ＡＭ、中部前壁；ＡＡ、心尖部前壁；ＰＡ 心尖部後壁；ＰＭ、中部後壁、及びＰＢ、基部後壁）（図３Ｃ）。
実施例４－ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの投与
４．１試験の目的：ＭＩ後の心不全のマウスモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの有効性を試験する。
４．２試験の概要
心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデル：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおける冠動脈（ＬＡＤ）の永久結紮（Ｋｏｌｋ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
群：ＭＩ又はシャム、ＣＤＲ１３２Ｌ又はプラセボで処理
処理：２０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ、ＭＩ後の７及び１４日目
エンドポイント：ＭＩ後の２８日目のＬＶ機能。ｎ＝６～７／群（図４）。
４．３結果：
ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＭＩ後の左心室機能不全を改善する（図５Ａ）。
収縮期の収縮機能の負荷非依存性パラメータも改善された（図５Ｂ）（＊ｐ＜０．０５）。
ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、長軸ストレインレート（ＬＳＲ）も改善し、従って、心臓の遠隔領域の個々の心臓セグメントにおいてＭＩ後の収縮不全を回復させる。（＊ｐ＜０．０５）（図６）。
ＣＤＲ１２３Ｌ処理は、心臓組織、例えば、遠隔（非梗塞）領域及び梗塞周囲ゾーンにおいてｍｉＲ－１３２発現を有効にサイレンシングする（図７Ａ）。
組織学的レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌは、ＭＩ後の心臓の遠隔領域において心筋細胞サイズを減少させる（図７Ｂ）。
組織レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌは、ＭＩ後の心臓において心臓ストレスシグナルＡＮＰの発現を減少させる（図７Ｃ）。
実施例５－ＭＩ後の心不全のブタモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの試験
５．１試験の目的：心筋梗塞後の臨床的に関連するモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌのインビボ有効性を証明する。
５．２試験の設定：
・ ９０分間の虚血（ＬＡＤ閉塞）及びその後の再灌流によって惹起される心筋梗塞のブタモデル。
・ 群：プラセボ又はＣＤＲ１３２Ｌ、ｎ＝６／群。
・ 処理：２回、ＭＩ後の３及び２８日目、それぞれ０．３ｍｇ／ｋｇ冠内及び０．５ｍｇ／ｋｇ静脈内（図８）。
・ エンドポイント：ＭＩ後の８週間。主要評価項目：ＥＦ及びＬＶリモデリング。
５．３結果：
・ ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率、及び左心室機能の測定によって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、機能を改善する（図９Ａ～Ｄ）。
・ ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、生存／遠隔心筋に対応するセグメントにおいてセグメントの収縮力を改善する；エンドポイントにおける心臓ＭＲＩ：ｎ＝６／群、赤色の領域：ｐ＜０．０５（図９Ｅ）。
・ ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＮＯＧＡ、エンドポイントにおける電気解剖マッピングによって決定されるように、不適応なリモデリングを防ぎ、そして、心尖領域におけるＬＶバイアビリティを改善する、：ｎ＝６／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５（図１０）。
・ ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ＡＮＰ及びＢＮＰにおける病的心不全マーカーの組織発現を正常化し、そして、ミオシン重変化（ｍｙｏｓｉｎｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｎｇｅ）アイソフォーム、すなわち、ＭＹＨ７／６比シフトさせる（図１１）。
・ 組織学的レベルでは、ＣＤＲ１３２Ｌ処理は、遠隔ＬＶ領域における心筋細胞肥大を有効に減少させる、ＬＶ領域の代表的な顕微鏡写真（ＷＧＡ／ＤＡＰＩ染色２０×）（図１２Ａ）及びグラフ表示（図１２Ｂ）、ｎ＝６／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５。
実施例６－ブタにおけるＣＤＲ１３２ＬのＰＤプロファイル／ターゲットエンゲージメント
６．１試験設定：
処理：１×、０日目、０．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ冠内灌流、ｎ＝３ブタ／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５。
・ エンドポイント（処理２４時間後）におけるｑＰＣＲ組織ｍｉＲＮＡアッセイ。
６．２結果：
・ ＣＤＲ１３２Ｌ処理の単回投与は、心臓のｍｉＲ－１３２レベルを用量依存的にサイレンシングする（図１３）。
実施例７－臓器毒性学プロファイリング
７．１試験の設定：
・ 処理：２回、ＭＩ後の３及び２８日目、それぞれ０．３ｍｇ／ｋｇ冠内及び０．５ｍｇ／ｋｇ静脈内。
・ 連続血液サンプリング：エンドポイント：処理の７２時間後、ｎ＝６ブタ／群、プラセボ対ＣＤＲ１３２Ｌ：ｐ＜０．０５。
７．２結果：
・ 生体内投与におけるＣＤＲ１３２Ｌ処理は、ブタにおいて臓器毒性を全く惹起しない（図１４）。
実施例８－心不全のマウスモデルでの心臓におけるＦｏｘＯ３及びＳＥＲＣＡ２のｍＲＮＡレベル
・ 対照であるスクランブルオリゴヌクレオチド又はＣＤＲ１３２Ｌのいずれかの腹腔内注射で毎週４回処理した対照及びｍｉＲ－１３２ ＴＧマウスにおいて心臓のＦｏｘＯ３及びＳｅｒｃａ２ ｍＲＮＡレベルを測定した。全ての値は、平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
実施例９－さまざまなオリゴヌクレオチドの比較
この試験の目的は、２つの比較オリゴヌクレオチドと共に、本発明にかかる新規ｍｉＲ－１３２－３ｐ阻害剤ＣＤＲ１３２Ｌの治療効果を評価することであった。２つの比較オリゴヌクレオチドは、ＣＤＲ１３２Ｌと同じオリゴヌクレオチド配列及びホスホロチオエート骨格を有するが、分子内のＬＮＡ基本構造単位の分布が異なる。ＣＤＲ２ｕ１は、５’及び３’末端に２つのＬＮＡ基本構造単位を有するが、ＣＤＲ３０１では、各ヌクレオチドがＬＮＡ基本構造単位を有する。
効率を試験するために、さまざまなオリゴヌクレオチドを新生仔ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）に投与した。ｍｉＲ－１３２－３ｐ及びその公知の標的遺伝子であるＦｏｘＯ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｏ３）の発現の変化を受けて、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によってこの処理の効果をモニタリングした。
実験デザイン及び結果を図１６に示す：（Ａ）実験設定の概要。０日目に新生仔ラット心筋細胞を播種し、そして、１日目にオリゴヌクレオチドＣＤＲ１３２Ｌ、ＣＤＲ２ｕ１、又はＣＤＲ３０１（各１００ｎＭ）で処理した。エンドポイントにおいて、遺伝子発現解析のために細胞を収集した。（Ｂ）ＣＤＲ１３２Ｌ、ＣＤＲ２ｕ１、又はＣＤＲ３０１で処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの発現レベル。（Ｃ）ＣＤＲ１３２Ｌ、ＣＤＲ２ｕ１、又はＣＤＲ３０１で処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの標的遺伝子であるＦｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｏ３（ＦｏｘＯ３）の発現レベル。データは、平均±ＳＤである。両側スチューデントｔ検定によってオリゴヌクレオチド対プラセボのＰ値を決定した。
ＣＤＲ１３２Ｌ及びＣＤＲ３０１によりＮＲＣＭを処理したところ、ｍｉＲ－１３２－３ｐレベルが９６％と著しく低下し、一方、ＣＤＲ２ｕ１はｍｉＲＮＡ発現を３０％低下させた（図１６Ａ～Ｂ）。更に、ＣＤＲ１３２Ｌによる処理は、ｍｉＲ－１３２－３ｐの標的遺伝子であるＦｏｘｏ３を著しく低下させたが、これはＣＤＲ２ｕ１及びＣＤＲ３０１では達成されなかった（図１６Ｃ）。
まとめると、本発明者らのデータは、ＣＤＲ２ｕ１及びＣＤＲ３０１と比べて、ｍｉＲ－１３２－３ｐの著しく低下した発現レベル又は及びその標的遺伝子であるＦｏｘＯ３の著しい抑制によって示される、ＣＤＲ１３２Ｌの優れた阻害効果を証明する。
実施例１０－心線維症におけるＣＤＲ１３２Ｌの効果
この試験の目的は、線維症のインビボモデルにおけるＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化治療効果を評価することであった。
抗線維化活性をインビボにおいて証明するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおける左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）の永久結紮による心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデルを使用した。ＣＤＲ１３２Ｌ処理を７及び１４日目に、プラセボ（ＣＤＲ１３２Ｌのスクランブルオリゴアナログ、２０ｍｇ／ｋｇ）及びＣＤＲ１３２Ｌ（２０ｍｇ／ｋｇ）を適用した。群は、プラセボ又はＣＤＲ１３２Ｌのいずれかを投与した、対照手術群（シャム手術マウス）及びＬＡＤ結紮マウス（ＭＩ、心筋梗塞）を含んでいた：シャム＋プラセボ、シャム＋ＣＤＲ１３２Ｌ、ＭＩ＋プラセボ、ＭＩ＋ＣＤＲ１３２Ｌ。ｎ＝６～７／群。実験計画を図１７で説明する。
ＭＩ後の心不全におけるインビボのＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化効果の評価を図１８に示す。線維症（ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色によって検出されるコラーゲン沈着及びβ－アクチンに対するＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ３ａ１）遺伝子発現の％として示される）は、ＭＩの後にＣＤＲ１３２Ｌによる処理によって減弱した。群は、プラセボ（黒色カラム）又はＣＤＲ１３２Ｌ（白色カラム）のいずれかを投与した対照手術群（シャム手術マウス）及びＬＡＤ結紮マウス（ＭＩ、心筋梗塞）を含んでいた：シャム＋プラセボ、シャム＋ＣＤＲ１３２Ｌ、ＭＩ＋プラセボ、ＭＩ＋ＣＤＲ１３２Ｌ。プラセボ又はＣＤＲ１３２Ｌで処理したＭＩマウス間で統計検定（独立ｔ検定）を実施した。＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝６～７／群。
組織学的結果によれば、ＣＤＲ１３２Ｌ処理後に線維症が減弱した（図１８Ａ）。これは、分子レベルで確認され、ＩＩＩ型コラーゲンアルファ１鎖（Ｃｏｌ３ａ１）のような線維化マーカーの遺伝子発現が減少した（図１８Ｂ）。
実施例１１－肺及び肝臓の線維症におけるＣＤＲ１３２Ｌの効果
ＣＤＲ１３２Ｌの抗線維化効果を肺及び肝臓の線維症についてインビトロモデルで試験した。そのために、肝臓（ヒト初代肝線維芽細胞、ＨＰＬＦ、ＰｅｌｏＢｉｏｔｅｃｈ）及び肺（正常ヒト初代肺線維芽細胞、ＮＨＬＦ、Ｌｏｎｚａ）由来のヒト初代線維芽細胞を、線維化促進剤で刺激し、ＣＤＲ１３２Ｌで処理した。増殖速度及びエンドポイントにおける線維化マーカー遺伝子の発現の変化を含む線維化経路内の重要なプロセスに追従することによって、ＣＤＲＬ１３２Ｌの治療効果をモニタリングした。更に、有効なＣＤＲ１３２Ｌ処理を証明するために、ｍｉＲ－１３２－３ｐの発現を評価した。
細胞増殖を測定するために、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅによって提供）を使用した。この比色アッセイによって、増殖している細胞の新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるＢｒｄＵ（ブロムデスオキシウリジン（Ｂｒｏｍｄｅｓｏｘｙｕｒｉｄｉｎ））の測定に基づいて細胞増殖を定量することができる。組み込まれたＢｒｄＵの量を検出し、そして、定量した。吸光度値はＤＮＡ合成の量に直接相関し、その結果、それぞれのミクロ培養物中で増殖している細胞の数に相関する。ｍｉＲ－１３２－３ｐ、並びにコラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）、コラーゲン１Ａ２（ＣＯＬ１Ａ２）、及びマトリクスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２）を含む線維化マーカーの発現レベルを測定する定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、遺伝子発現を評価した。
図１９は、肝線維症のインビトロモデルを示す：（Ａ）実験設定の概要。０日目にヒト初代肝線維芽細胞（ＰｅｌｏＢｉｏｔｅｃｈによって提供）を播種し、１日目に線維化刺激（正常成長培地（１０％ＦＢＳを補給した完全線維芽細胞培地）中の１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β）及びＣＤＲ１３２Ｌ（１００ｎＭ）で処理した。エンドポイントにおいて、細胞増殖及び線維化マーカーの遺伝子発現を評価した。（Ｂ）ＣＤＲ１３２Ｌで処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの発現レベル。（Ｃ）ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ（ブロムデスオキシウリジン）の取り込みをモニタリングすることによって評価した増殖。エンドポイントの２０時間前にＢｒｄＵ試薬を培地に添加した。（Ｄ）線維化マーカー遺伝子（コラーゲン１Ａ１（ＣＯＬ１Ａ１）、コラーゲン１Ａ２（ＣＯＬ１Ａ２）、及びマトリクスメタロペプチダーゼ２（ＭＭＰ２））の発現レベル。（Ｂ）及び（Ｄ）において、点線は未刺激対照細胞の発現レベルを示す。データは、平均±ＳＤである。両側スチューデントｔ検定によってＣＤＲ１３２Ｌ対対照のＰ値を決定した。
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）によってＨＰＬＦを刺激すると（図１９Ａ）、ｍｉＲ－１３２－３ｐがわずかに誘導され、これは、ＣＤＲ１３２Ｌ処理によって著しく減少した（図１９Ｂ）。更に、この化合物は、線維芽細胞の増殖（図１９Ｃ）、並びにＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、及びＭＭＰ２を含む線維化遺伝子発現（図１９Ｄ）を減少させた。
図２０は、肺線維症のインビトロモデルを示す：（Ａ）実験設定の概要。０日目に正常ヒト肺線維芽細胞（Ｌｏｎｚａによって提供）を播種し、そして、１日目に線維化刺激（線維芽細胞成長培地中の高ＦＢＳ（５％）及びＣＤＲ１３２Ｌ（１００ｎＭ）で処理した。エンドポイントにおいて、細胞増殖及び遺伝子発現を評価した。（Ｂ）ＣＤＲ１３２Ｌで処理した後のｍｉＲ－１３２－３ｐの発現レベル。（Ｃ）ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ（ブロムデスオキシウリジン）の取り込みをモニタリングすることによって評価した増殖。エンドポイントの２０時間前にＢｒｄＵ試薬を培地に添加した。（Ｂ）において、点線は未刺激対照細胞の発現レベルを示す。データは、平均±ＳＤである。両側スチューデントｔ検定によってＣＤＲ１３２Ｌ対対照のＰ値を決定した。
ＮＨＬＦ細胞では、高ＦＢＳ（正常成長条件の２％ＦＢＳに比べて５％）による線維化刺激後（図２０Ａ）、ｍｉＲ－１３２－３ｐの上昇は観察されなかった（図２０Ｂ）。それにもかかわらず、ＣＤＲ１３２Ｌによる処理は、標的となったマイクロＲＮＡを著しく減少させ（図２０Ｂ）、線維芽細胞を増殖させた（図２０Ｃ）。
まとめると、本発明者らのデータは、肝臓又は肺に由来する線維芽細胞、及び心臓組織における、オリゴヌクレオチドアナログＣＤＲ１３２Ｌの著しい抗線維化効果を実証する。本発明者らは、この効果が、薬物の抗増殖能及び／又は細胞外マトリクスタンパク質発現に対するその効果に基づいている可能性があると考える。
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１１． Ｓｋｕｒｋ，Ｃ．；Ｉｚｕｍｉｙａ，Ｙ．；Ｍａａｔｚ，Ｈ．；Ｒａｚｅｇｈｉ，Ｐ．；Ｓｈｉｏｊｉｍａ，Ｉ．；Ｓａｎｄｒｉ，Ｍ．；Ｓａｔｏ，Ｋ．；Ｚｅｎｇ，Ｌ．；Ｓｃｈｉｅｋｏｆｅｒ，Ｓ．；Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｔｈｅ ＦＯＸＯ３ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ ｓｉｚｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０，２０８１４－２３．
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Claims (18)

  1. 式ＩＩ：
    ５’－Ａ＋ＴＧ＋ＧＣ＋ＴＧ＋ＴＡ＋ＧＡＣＴＧ＋Ｔ＋Ｔ－３’
    （式中、Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣは、デオキシリボヌクレオチド基本構造単位であり、
    ＋Ｇ及び＋Ｔは、架橋ヌクレオチド基本構造単位である）
    の配列を含むオリゴヌクレオチドであって、ｍｉＲ－１３２の発現に対して阻害活性を有する、オリゴヌクレオチド。
  2. ＋Ｇ及び＋Ｔが、２’－Ｏ－ＣＨ２－４’架橋を有するロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）基本構造単位である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. １６基本構造単位の長さを有する、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、特に、少なくとも１つのホスホロチオエート又はホスホロジアミデートのヌクレオシド間結合を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１～４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 式ＩＩＩ：
    ５’－ｄＡ＊＋Ｔ＊ｄＧ＊＋Ｇ＊ｄＣ＊＋Ｔ＊ｄＧ＊＋Ｔ＊ｄＡ＊＋Ｇ＊ｄＡ＊ｄＣ＊ｄＴ＊ｄＧ＊＋Ｔ＊＋Ｔ－３’
    （式中、ｄＡは、２’デオキシアデノシンであり、ｄＧは、２’デオキシグアノシンであり、ｄＣは、２’デオキシシチジンであり、Ｔは、チミジンであり、
    ＋Ｔは、ロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）－Ｔ基本構造単位であり、＋Ｇは、ロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）－Ｇ基本構造単位であり、＊は、ホスホロチオエート結合である）の配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 異種部分にコンジュゲートしている、請求項１～６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物。
  9. 医学において使用するための、特に、ヒト医学において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  10. ｍｉＲ－１３２の病的発現に関連する、それを伴う、及び／又はそれによって引き起こされる障害の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 心臓障害、特に、心肥大関連障害の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  12. 収縮不全、心代償不全、又は心不全の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  13. 心臓障害の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物であって、化合物が、
    （ｉ）心不全を発症するリスクが増大している患者、
    （ｉｉ）（うっ血性）心不全に罹患している患者、若しくは、心不全が進行するリスクが増大している患者、
    （ｉｉｉ）心筋梗塞後の患者、及び／又は
    （ｉｖ）心肥大に関連する先天性心疾患、例えば、肺静脈狭窄症、心房若しくは心室の中隔欠損の患者
    から選択される患者に投与されるオリゴヌクレオチド又は医薬組成物。
  14. 単剤療法として又は、特に、アンジオテンシン調節剤、β－ブロッカー、利尿剤、アルドステロンアンタゴニスト、血管拡張剤、強心剤、若しくはこれらの組み合わせから選択される更なる医薬と組み合わせて、心臓障害の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  15. 線維化障害の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  16. 心線維化障害、特に、心房線維症、心内膜心筋線維症、又は既往の心筋梗塞から生じた線維症、肺線維化障害、特に、職業性又は環境性の要因によって引き起こされる肺線維症、放射線治療及び／若しくは医薬による治療によって引き起こされる肺線維症、又は特発性肺線維症、あるいは肝線維化障害、特に、アルコール性肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  17. 単剤療法として又は更なる医薬と組み合わせて、線維化障害の予防又は治療において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項８に記載の医薬組成物。
  18. 予防又は治療が、前記オリゴヌクレオチド又は前記医薬組成物の投与前、投与の間、及び／又は投与後に、治療される患者における：
    （ｉ）ｍｉＲ－１３２；
    （ｉｉ）少なくとも１つの心臓マーカー；及び／若しくは
    （ｉｉｉ）少なくとも１つの線維化マーカー
    の量及び／又は活性を測定する工程を包含する、請求項１０～１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物。
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