JP2022535997A - ヒト対象者における心不全の治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、マイクロRNAであるmiR-132の有効な阻害剤であるオリゴヌクレオチド、および医学におけるその使用、特にヒト対象者の心臓および／または線維性障害の予防または治療におけるその使用について関する。【選択図】なし

Description

明細書
本発明は、マイクロRNAであるmiR-132の有効な阻害剤であるオリゴヌクレオチド、および医学におけるその使用、特にヒト対象者における心臓障害および／または線維性障害の予防または治療におけるその使用に関する。

心不全は、世界における主要な病的死亡原因の一つである。心筋梗塞（ＭＩ）はその後心臓の有害なリモデリングを進行させ、予後不良の心不全を引き起こすので、ＭＩは心不全の最も重要な原因である。ＭＩ心不全のために現在使用されている治療的薬理学的選択肢としては、アンジオテンシン調節薬、βブロッカー、利尿剤、アルドステロン拮抗薬、アンジオテンシンＩＩ受容体ブロッカーとネプリライシン阻害薬の組み合わせ、血管拡張薬、強心薬、またはＳＧＬＴ－２阻害薬などが挙げられる。いくつかの臨床試験で、これらすべての薬剤が心不全による死亡率を有意に減少させることが示されているが、５年後の死亡率は約５０％と依然として容認しがたいほど高い。したがって、心不全のための新規かつより効率的な治療上のアプローチを開発することが強く望まれている。

心筋細胞の病的肥大型成長は、心臓リモデリング、心不全および心臓突然死の発症につながる可能性がある。心筋細胞の肥大型成長は、心臓の容積および/または圧力の過負荷によって引き起こされる心臓の壁応力の増加に対する反応である。最初は、心肥大は、壁応力を減少させ、心拍出量を増加させることを目的とした代償機構である。しかし、心肥大が長期化すると、収縮機能障害、心臓代償不全、そして最終的には心不全へと進行する (Hill and Olson, 2008; Barry and Townsend, 2010)。生理的肥大から病的肥大への移行は、アポトーシスや壊死による心筋細胞の消失、オートファジーの変化、収縮反応の異常、カルシウムのホメオスタシス異常、アドレナリン受容体の脱感作、心筋線維化など多くの要因によって起こり得る（Hill and Olson、2008；Barry and Townsend、2010）。肥大化シグナルは、主にインスリンシグナル伝達経路によって媒介される（Debosch and Muslin、2008；Barry and Townsend、2010）。インスリンとインスリン様成長因子-1（IGF-1）の両方が、IGF-1受容体を介して心筋細胞の肥大促進経路を活性化し、これがホスホイノシチン3キナーゼ（PI3K）を活性化する（McMullen et al.、2004年）。PI3K活性は、セリン・スレオニンキナーゼAktのリン酸化による活性化をもたらし、活性化Aktは、抗肥大性FoxO転写因子をリン酸化し、その安定化を解除し核局在化を防ぐ（Dattaら、1999； Skurk al., 2005； Ronnebaum and Patterson、2010）。一方、サーチュイン-1（Sirt-1）によるFoxO因子のアセチル化は、その安定化と核内移行をもたらす（Frescas et al.、2005）。安定化されたFoxO転写因子は、抗肥大遺伝子の発現を制御するために核内に局在する。FoxOタンパク質の抗肥大機能は、アトロジン-1などのFoxO因子の抗肥大遺伝子標的の発現を介した肥大促進カルシニューリンシグナル伝達経路の抑制によって主に担われている(Ni et al., 2006; Ronnebaum and Patterson, 2010; Glas, 2010)。さらに、FoxO転写因子は、心筋細胞においてアポトーシスを誘導し、オートファジーも制御する（Ronnebaum and Patterson、2010年）。

マイクロRNAは、心臓の有害なリモデリングに重要な役割を持つことが示されている。WO 2013/034653には、miR-132および／またはmiR-212が心肥大を誘導するので、心不全治療のための潜在的な治療標的を構成する可能性があることが記載されている。

WO2016／042561は、ヒトmiR-132のヌクレオチド配列に実質的に相補的であるポリヌクレオチド剤の治療有効量を対象に投与することによって、脂質関連障害を治療する方法を記載する。

本発明者らは、心筋細胞におけるmiR-132発現の効果的な阻害剤である新規オリゴヌクレオチドアナログを同定した。このオリゴヌクレオチドアナログ（以下、CDR132Lと記す）は、DNAとLNAのビルディングブロックからなるミクスマー（mixmer）で、ヌクレオシド間ホスホロチオエート結合を有するものである。

CDR132Lの前臨床薬理試験は、マウスとブタを用いて実施された。トランスジェニックマウスの心肥大モデルにおいて、CDR132LはmiR 132の発現低下に関連した心臓リバースリモデリングを引き起こした。MI後の心不全のマウスモデルでは、CDR132L治療によりMI後の左心室機能障害と収縮期収縮機能の負荷に独立するパラメータが減少することが明らかになった。さらに、CDR132Lの投与は、心機能の改善、ならびにmiR-132の発現、心臓のストレスシグナル伝達およびMI後の肥大化の低減をもたらした。

MI後心不全のブタモデルにおいて、CDR132L治療は不適応リモデリングを回避し、左心室機能を改善することが判明した。さらに、CDR132Lは、BNP、ANPなどの心不全病態マーカーの組織発現を正常化し、ミオシンヘビーチェンジアイソフォームのシフト（MYH7/6比）を提供する。MI後心不全のブタモデルでは、CDR132Lは亜急性および慢性心不全を治癒することがわかった。

また、CDR132Lは、ヒト肝細胞株および単離ラット新生仔心筋細胞において、有意な毒性を示さない。ラットおよびミニブタで行ったin vivo毒性試験により、活性剤は、それぞれ２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇの高用量でも忍容性があることが判明した。

健康なラットおよびブタにCDR132Lを静脈内または皮下投与する薬物動態試験により、CDR132Lの組織内濃度の用量依存性が確認された。

さらに、CDR132Lは、同じヌクレオチド配列を有するがLNAビルディングブロックの分布が異なる他のオリゴヌクレオチドアナログと比較して、優れた効果を示すことが示された。

さらなる研究において、本発明者らは、心筋梗塞のin vivoマウスモデルおよび肝線維症および肺線維症のin vitroモデルにおいて、オリゴヌクレオチドアナログCDR132Lの抗線維症治療効果を確認した。

さらに、循環体液中のmiR-132の量とCDR132Lの治療上の薬効との間に有意な関係があることがわかった。したがって、体液中のmiR-132の量は、療法のモニタリングに関連するバイオマーカーである。

以上の結果に基づいて、CDR132Lを慢性心不全に罹患するヒト患者に投与する第Ib相臨床試験のプロトコルが開発されている。この第Ib相臨床試験は成功裏に終了している。

このように、オリゴヌクレオチドCDR132Lは、医薬、特に心臓障害および／または線維性障害の予防または治療における活性剤として有用である。

したがって、本発明の第１の態様は、式I：
5’-ATGGCTGTAGACTGTT-3’
（式中、A、T、GおよびCは、デオキシリボヌクレオチドビルディングブロックであり、少なくとも1つのGまたはTのビルディングブロックが架橋ヌクレオチドビルディングブロックである）の配列を含む、オリゴヌクレオチドアナログを提供する。このオリゴヌクレオチドは、障害、より詳細にはヒト対象者における心臓障害の予防および／または治療において特に好適である。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式II：
5’-A+TG+GC+TG+TA+GACTG+T+T-3’
（式中、A、T、GおよびCは、デオキシリボヌクレオチドビルディングブロックであり、＋Gおよび＋Tは、架橋ヌクレオチドビルディングブロックおよび／またはモルフォリノヌクレオチドビルディングブロックであり、特に＋Gおよび＋Tは、LNAビルディングブロックである）の配列からなるか、またはそれを有する。このオリゴヌクレオチドは、ヒト対象者における障害、より詳細には心臓障害または線維性障害の予防または治療に特に適している。

式Iまたは式IIのオリゴヌクレオチドアナログは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合、例えばヌクレアーゼ消化に対して安定化されているヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジアミデート結合を含んでいてよい。具体的な実施形態では、すべてのインターヌクレオシド結合は修飾された結合、特にホスホロチオエート結合である。

より具体的な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドCDR132Lに関連する。

オリゴヌクレオチドCDR132Lは、式III:
5’-dA^*+T^*dG^*+G^*dC^*+T^*dG^*+T^*dA^*+G^*dA^*dC^*dT^*dG^*+T^*+T-3’
（式中、dAは2'デオキシアデノシン、dGは2'デオキシグアノシン、dCは2'デオキシシチジンおよびTはチミジンであり、
+TはLNA-Tビルディングブロックおよび+GはLNA-Gビルディングブロックであり、^*はホスホロチオエート結合である）の配列を有する。このオリゴヌクレオチドは、ヒト対象者における障害、より詳細には心臓障害または線維性障害の予防または治療に特に適している。

本発明のさらなる態様は、活性剤として、式I、IIまたはIIIの配列を含むオリゴヌクレオチドアナログおよび医薬上許容される担体を含む、特にヒト対象者における障害、より詳細には心臓または線維性障害の予防または治療に使用するための医薬組成物に関する。

上記のように、式I、IIまたはIIIの配列を含むオリゴヌクレオチドアナログは、医療用途に適している。

特定の実施形態では、医療用途は、miR-132の病的発現に関連する、それに伴う、および／またはそれに起因する障害の治療または予防のための使用に関する。特定の実施形態では、医療用途は、心臓障害、特に心肥大に関連する障害の治療または予防に関する。特定の実施形態では、医療用途は、線維性障害、例えば、病的線維症に関連する、それに伴う、および／またはそれに起因する障害、特に心臓線維性障害、肺線維性障害または肝線維性障害の治療に関する。

式I、IIまたはIIIのオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドDNAビルディングブロックおよび架橋ヌクレオチドビルディングブロックから構成されていてもよい。「架橋ヌクレオチド」とは、リボース部分が2'-および4'-炭素原子を接続する２または３原子架橋を含んでいる修飾リボヌクレオチドをいう。例えば、架橋は、構造2’-O-CH₂-4’、2’-O-CH₂-CH₂-4’、2’-O-CH(CH₃)-4’またはOがSもしくはNHで置換された対応する構造を含んでもよい。特定の実施形態では、少なくとも1つの架橋ヌクレオチドビルディングブロックは、2’-O-CH₂-4’-ブリッジを有するロックされた核酸（LNA）ビルディングブロックである。

式I、IIまたはIIIのオリゴヌクレオチドは、少なくとも長さ16のビルディングブロック、例えば、長さ16から20のビルディングブロックを有する。特定の実施形態では、式I、IIまたはIIIのオリゴヌクレオチドは、長さ16のビルディングブロックを有する。

いくつかの実施形態では、式I、IIまたはIIIのオリゴヌクレオチドは、5から10、例えば、6から8、特に、7の架橋ヌクレオチドビルディングブロック、例えば、LNAビルディングブロックを含む。

いくつかの実施形態では、式I、IIまたはIIIのオリゴヌクレオチドは、ネイキッドオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの異種部位、例えば、オリゴヌクレオチドのmiR-132への結合に寄与しない部位にコンジュゲートされてもよい。異種部位は、例えば、コレステロールまたは脂肪酸などの脂質部位、N-ガラクトサミン含有部位などの糖またはアミノ糖部位、ペプチドまたはポリペプチド部位、またはアプタマーなどのヌクレオシドまたはヌクレオチド部位など、標的化および／または細胞への取り込みを改善する部位であり得る。異種部位は、共有結合またはスペーサーによってオリゴヌクレオチドアナログの5'-および／または3'末端とコンジュゲートされてもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび獣医薬などの医薬において使用するのに適している。特定の実施形態では、本化合物は、病的発現、例えばmiR 132の過剰発現に関連する、それに伴う、および／またはそれに起因する障害の予防または治療に有用である。本化合物の投与は、in vitroおよびin vivoでmiR-132の発現を有意に減少させることが見出された。

いくつかの実施形態では、化合物は、健常者と比較してmiR-132の過剰発現を示す患者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、化合物は、健常者と比較してmiR-132の過剰発現を示さないが、依然としてmiR-132のレベルの減少を必要とする患者に投与されてもよい。

本発明の文脈における用語「予防」は、特定の障害を発症するリスクが高いことが知られている患者への本化合物の投与に関する。本発明の文脈における「治療」という用語は、特定の障害の徴候および/または症状を既に発症している患者への本化合物の投与に関する。用語「患者」は、ヒトまたは獣医薬の分野において、本発明の化合物の投与を必要とする対象に関するものである。特定の実施形態において、患者は、ヒトの患者である。

特定の実施形態では、本発明の化合物は、心臓障害、特に心肥大関連障害の予防または治療に有用である。例えば、本発明の化合物は、収縮機能障害、心臓減弱、心不全の予防または治療において、あるいは心筋梗塞後の心臓リモデリング、心筋炎、大動脈狭窄症または僧帽弁閉鎖不全症などの心臓弁膜症、例えば肥大性非閉塞性および閉塞性心筋症などの心肥大を伴う遺伝性心臓障害、あるいはファブリ病の予防または治療のために有用である。さらに、本化合物は、心臓線維症の予防または治療に有用である。

本化合物は以下：
(i）心不全を発症するリスクが高い患者、
(ii）（うっ血性）心不全に罹患している患者、例えば、心不全進行のリスクが増大している患者
(iii)心筋梗塞後の患者、および/または
(iv)大動脈および/または肺静脈狭窄症、心房または心室中隔欠損症など、心肥大を伴う先天性心臓疾患を有する患者
から選択される患者への投与に有用である。

特定の実施形態において、化合物、特にCDR132Lは、急性心不全に罹患しているヒト患者、亜急性心不全に罹患しているヒト患者、または慢性心不全および／もしくは悪化した慢性心不全に罹患しているヒト患者への投与のために有用である。

特定の実施形態では、化合物、特にCDR132Lは、安定型心不全、例えば、非虚血性および／または虚血性起源の安定型心不全に罹患しているヒト患者への投与に有用である。

特定の実施形態では、化合物、特にCDR132Lは、非虚血性および／または虚血性起源の心不全に罹患しているヒト患者への投与に有用である。

特定の実施形態では、化合物、特にCDR132Lは、あまり進行していないステージの心不全に罹患しているヒト患者または進行したステージの心不全に罹患しているヒト患者への投与に有用である。

特定の実施形態では、化合物、特にCDR132Lは、ニューヨーク心臓協会（NYHA）の分類による心不全ステージI、II、IIIおよび／またはIVに罹患しているヒト患者、例えば、NYHAステージIおよび／またはIIの心不全に罹患している患者、NYHAステージI、IIおよび／またはIIIの心不全に罹患している患者またはNYHAステージIIIおよび／またはIVの心不全に罹患している患者に投与するのに有用である。

特定の実施形態では、化合物、特にCDR132Lは、心不全に罹患し、移植ポンプ、例えば左心室補助装置（LVAD）を有するヒト患者への投与に有用である。

特定の実施形態において、本化合物は、収縮期心不全、拡張期心不全、および収縮期心不全および／または拡張期心不全に関連する状態などの左側心不全を予防および／または治療するのに有用である。

収縮期心不全は、左心室が正常に収縮する能力を失う、駆出率の低下、特に40％以下の駆出率に関連する心不全の一種である。収縮期心不全の治療における本発明の化合物の投与は、駆出率の安定化、増加および／または正常化をもたらす可能性がある。本発明の化合物は、収縮期機能不全を発症するリスクのある患者、例えば、高血圧、または冠動脈の閉塞に罹患している患者への投与に適している。

拡張期心不全は、充満圧力の上昇を伴う、あるいは伴わない左心室弛緩障害に関連する心不全の一種である。多くの場合、拡張期心不全は、保存された駆出率に関連している。拡張期心不全の治療における本発明の化合物の投与は、左心室弛緩の安定化、改善および／または正常化をもたらす可能性がある。本発明の化合物は、拡張期機能不全を発症するリスクのある患者、例えば、高血圧、高脂血症、糖尿病、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、心臓貯留疾患、遺伝性心不全（例えば、タイチンまたは他の構造遺伝子における変異）に罹患している患者への投与に適している。

さらなる特定の実施形態において、本化合物は、右側心不全、特に左側心不全の結果として生じる右側心不全を予防および／または治療するのに有用である。

特定の実施形態において、本発明の化合物は、線維性障害、特に、病的線維症に関連する、それに伴う、および／またはそれに起因する障害の予防または治療において有用である。

病的線維症とは、特に病的状態に関連する、それに伴う、および／またはそれに起因する、臓器および組織に過剰な線維性結合組織の形成である。病的線維症は、典型的には炎症または損傷の結果として、体内の多くの異なる臓器および組織で起こり得る。

ある実施形態では、線維症は、心臓線維症、例えば、心臓の病的線維症を伴う状態である。心臓線維症の例示的なタイプとしては、心房線維症、心内膜線維症、または以前の心筋梗塞に起因する線維症が挙げられる。

さらなる実施形態では、線維症は、肺線維症、例えば、肺の病的線維症を伴う状態である。肺線維症の例示的なタイプとしては、職業的または環境的要因、例えばシリカ粉塵、アスベスト繊維、金属粉塵、石炭粉、穀物粉、鳥および動物の糞などの毒素および汚染物質への曝露によって引き起こされる線維性障害が挙げられる。他のタイプの肺線維性障害は、放射線治療および／または化学療法薬、心臓病薬、抗生物質または抗炎症薬などの医薬品による治療によって引き起こされる。さらに他のタイプの肺線維性障害は、特発性肺線維症、皮膚炎、多発性筋炎、混合結合組織病、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群または全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、サルコイドーシス、肺炎、ウイルス感染症または胃食道逆流症（GERD）などの障害によって引き起こされる。

さらなる実施形態では、線維症は、肝線維症、例えば、肝臓の病的線維症を伴う状態であってもよい。肝線維症の例示的なタイプは、ウイルス感染症、例えばB型および／またはC型肝炎ウイルスによるもの、遺伝性代謝障害、自己免疫性肝炎、胆道閉塞、鉄過剰症、非アルコール性脂肪肝（NAFL）および非アルコール性脂肪肝炎（NASH）などの非アルコール性脂肪肝疾患、ならびにアルコール肝疾患によって引き起こされる。

さらにさらなる実施形態において、線維症はまた、血管線維症、例えば動脈硬化、皮膚線維症、例えばケロイド形成または腎原性全身線維症、関節線維症、いくつかの形態の癒着性被膜炎、縦隔線維症または後腹膜線維症などの軟組織線維症または骨髄線維症などの骨髄の線維症であってもよい。

特定の実施形態において、本発明は、本発明の化合物の投与前、投与中、および／または投与後に、治療される対象における特定の生理学的パラメータの量および／または活性を判定することを包含する。この付随する診断手順は、上記のような医療用途のための支援を提供し得る。例えば、この診断手順は、リスク評価、患者層別化、治療経過のモニタリング、および／または治療後のコントロールにおける支援を提供し得る。

特定の実施形態において、本発明は、本発明の化合物の投与前、投与中、および／または投与後に、治療される対象におけるmiR-132の量および／または活性を判定することを包含する。さらなる実施形態において、本発明は、心臓マーカーおよび／または線維性マーカーから特に選択される少なくとも1つのマーカーの量および／または活性を判定することを包含する。特定の実施形態において、本発明は、BNP（例えばNT-proBNP）、ANPまたはミオシンヘビーチェンジアイソフォーム（例えばMYH7／6比）、および／またはFoxO3および／またはSERCA2のレベルなどの心臓マーカーの量および／または活性を判定することを包含する。特定の実施形態において、本発明は、NT-proBNPの量を判定することを包含する。さらにさらなる実施形態では、本発明は、コラーゲン（例えばコラーゲン沈着および／または線維性マーカー遺伝子（コラーゲン1A1、コラーゲン1A2、コラーゲン3A1、プロコラーゲンI型C末端プロペプチド（PICP））の発現））、および／またはガレクチン3（Gal-3）、および／またはマトリクスメタロプロテイナーゼ（メタロタンパク質酵素）（マトリクスメタロプロテイナーゼ1（MMP-1）および／またはマトリクスメタロプロテイナーゼ2（MMP-2）など）などの線維性マーカーの量および／または活性を判定することを包含する。

上記パラメータの判定は、血液、血漿、血清などの体液試料または組織試料において、核酸レベルおよび／またはタンパク質レベルで公知の方法に従って行うことができ、例えば、疾患の経過および／または療法の経過および／または成功について有用な診断情報を提供し得る。

さらに、本発明者らは、PCRに基づく検出方法により、心臓組織中のmiR132の量が、循環体液、例えば全血、血漿または血清中のmiR132の量と正の相関を示すことを見出した。したがって、体液試料、例えば全血、血漿または血清試料中のmiR132の量の測定は、標的組織、特に心臓組織中のmiR132の量の指標を提供する。

特定の実施形態において、本発明は、治療される対象、例えばヒトの対象におけるmiR-132の量および／または活性を、療法の経過中に判定することを包含する。この文脈における「療法の経過」という用語は、ある期間、例えば少なくとも1日、少なくとも1週間、少なくとも2週間または少なくとも1ヶ月の期間にわたって、それを必要とする対象、特にヒトの対象に、本発明の化合物の投与、特にCDR132Lの投与として理解されるものである。この判定は、療法の経過中に1回または数回実施することができる。特定の実施形態では、miR-132の量は、体液からの試料、例えば、血液、血漿または血清試料などの循環体液からの試料において定量的に判定される。特に、試料は、血漿試料である。miR-132の量および／または活性は、目的とする標的臓器、特に心臓における化合物の濃度に逆相関または負相関するが、その活性および／または治療上の薬効にも相関する。したがって、この判定により、投与される用量の調整および／または個々の投与間の間隔の調整が可能となる。

さらに、この判定により、治療反応に関する患者の層別化、例えば、レスポンダーと非レスポンダーの区別が可能となる。特に、判定は、慢性疾患の患者、例えば慢性心疾患の患者において、療法の経過中に数回実施される。例えば、判定は、毎週、隔週および／または毎月の間隔で実施され得る。

特定の実施形態では、本発明は、療法の経過中にECGパラメータの変化を判定することを包含する。心不全患者に関連するECGパラメータとしては、限定されないが、QRS、T波、左脚ブロック（LBBB）および／または右脚ブロック（RBBB）；および／またはR進行の測定が挙げられる。特に関連するのは、QRSの測定である。

本発明のさらなる態様によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、体液試料中のmiR132の測定量に応じて用量および／または個々の用量間の時間間隔を調整することにより、需要に基づく投与計画で投与することができる。例えば、体液試料中のmiR132の量が所定の値を超えることが判明した場合、オリゴヌクレオチドの新たな用量が投与される。

したがって、本発明は、ヒト対象者の心臓障害の予防または治療に使用するための上記のようなオリゴヌクレオチドに関し、ここで、オリゴヌクレオチドは、特に以下の工程を含む、需要に基づく投与計画によって投与される；
(i）オリゴヌクレオチドで治療される対象の体液試料、例えば全血、血清または血漿試料中のmiR132の量を測定する工程、
(ii）工程（i）におけるmiR132の測定量に従って決定される用量および／または個々の用量間の時間間隔でオリゴヌクレオチドを投与する工程であって、特に、体液試料中のmiR132の量が所定の値、例えば基準値を超えることが判明した場合に、オリゴヌクレオチドの新たな用量が投与される工程。

本発明の化合物は、薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物として投与してもよい。投与は、公知の方法によって実施することができ、化合物は、治療される対象の所望の標的細胞または臓器に導入される。

化合物は、そのままで、または上記のような異種部位とのコンジュゲートとして投与されてもよい。

医薬適用の場合、組成物は、溶液、例えば、注射液、乳剤、懸濁液等の形態であってもよい。

組成物は、任意の適切な方法で、例えば非経口的に、特に皮下、筋肉内、静脈内または動脈内注射、または点滴などの注射によって、経口または吸入摂取によって、および／または皮膚適用によって、または標的臓器への局所適用、例えば冠動脈内灌流によって投与してもよい。担体は、任意の適切な医薬担体であってよい。好ましくは、標的細胞に入るオリゴヌクレオチド分子の効力を増大させることができる担体が使用される。そのような担体の好適な例は、リポソーム、例えばカチオン性リポソーム、または予め設計されたエクソソームである。

特定の実施形態では、化合物、特にCDR132Lは、静脈内注射によって、または皮下注射によって投与される。

化合物は、投与経路および疾患の種類または重症度に応じて、薬学的に有効な用量で投与される。

特定の実施形態では、化合物は、例えば、非経口適用、特に注射または点滴、例えば静脈内注射または皮下注射によって、１回当たり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１回当たり約０．２～５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８～２０ｍｇ／ｋｇ体重、または１回当たり約３～１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でヒト対象者に投与される。

薬物動態試験において、化合物は、心臓組織において約３週間の長い半減期時間を有し、血漿において短い二相性半減期時間を有することが見いだされた。これらの結果は、本化合物が様々な異なる治療投与計画、例えば、１週間未満の時間間隔での適用を含む治療投与計画および１週間以上の時間間隔での適用を含む治療投与計画に適していることを実証している。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、毎日投与、２日ごとの投与、３日ごとの投与、および４日ごとの投与から選択される投与計画でヒト対象者に投与され、特にオリゴヌクレオチドは非経口投与、より詳細には静脈内または皮下注射、例えば患者による皮下自己注射によって投与される。

これらの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、体重依存的用量および／または固定用量で投与され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、１回の適用につき０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、または０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、１回の適用につき１ｍｇから５０００ｍｇの固定用量、２ｍｇから１０００ｍｇの固定用量、または５ｍｇから５００ｍｇの固定用量で投与することができる。

さらにさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、毎週投与、２週ごとの投与、３週ごとの投与、４週ごとの投与または毎月投与、６週ごとの投与、２月ごとの投与、３月ごとの投与、６月ごとの投与、および１年ごとの投与から選ばれる投与計画でヒト対象者に投与され、特にオリゴヌクレオチドは非経口投与、より特には静脈内または皮下注射、たとえば患者による皮下自己注射によって投与される。

これらの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、体重依存的用量で、または固定用量で投与され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、１回の適用につき０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、１回の適用につき１ｍｇから５０００ｍｇの固定用量、５ｍｇから２０００ｍｇの固定用量、または１０ｍｇから１０００ｍｇの固定用量で投与することができる。

さらにさらなる実施形態では、化合物は、開始用量、例えば１つまたは２つの開始用量でヒト患者に投与され、その後、開始用量とは異なる少なくとも１つの維持用量で投与されてもよい。例えば、開始用量は、維持用量よりも高くてもよく、例えば、維持用量の約１．５～３倍、例えば、約２倍である。開始用量および／または維持用量は、体重依存的用量として、または固定用量で投与されてもよい。具体的な実施形態では、開始用量は約３～１０ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は約１～７，５ｍｇ／ｋｇである。さらに、維持用量は、血液、血漿または血清などの体液中のmiR132の量に基づいて、例えば滴定により調整されてもよい。

ヒト第Ib相臨床試験において、本化合物は、ヒト心不全患者を対象に標準治療に加えて単回および反復投与で用量漸増において、優れた忍容性と安全性を示すことが確認された。また、薬物動態プロファイルでは、蓄積の兆候は見られず、高い用量直線性を示す。心不全に対する独自の作用機序は、関連する薬力学的パラメータおよびターゲットエンゲージメントにおいて確認された。重篤な有害事象および注射部位反応は認められず、有害事象を理由に試験を中止した患者もいなかった。また、化合物は、忍容性が高く、１０ｍｇ／ｋｇまでの投与では、いかなる毒性の兆候も示さなかった。

本化合物は、単剤で投与してもよいし、さらに別の医薬、特に上記のような心臓障害または線維性障害の予防または治療に適した医薬と組み合わせて投与してもよい。

心臓障害の予防または治療に適した更なる医薬の例は、アンジオテンシン調節剤、βブロッカー、利尿剤、アルドステロン拮抗薬、血管拡張剤、イオン栄養剤、スタチン、ネプリライシン阻害剤、またはSGLT-2阻害剤またはそれらの組み合わせ（例えばネプリライシン阻害剤の組み合わせ、例えばサクビトリルとアンジオテンシンII受容体ブロッカー（例えばバルサルタン）の組み合わせ）である。

特定の実施形態では、化合物は、（ｉ）少なくとも１つの利尿剤、（ｉｉ）少なくとも１つのアンジオテンシン変換酵素阻害剤、（ｉｉｉ）少なくとも１つのβブロッカー、任意に（ｉｖ）アンジオテンシンＩＩ受容体ブロッカーおよび／または（ｖ）任意にイバブラジンなどのＩｆチャネル阻害剤および任意に（ｖｉ）アンジオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤、および任意に（ｖｉｉ）エンパグリフロジンおよびダパグリフロジンなどのグルコース共輸送体２阻害剤、および／または任意に（ｖｉｉｉ）幹細胞治療薬および／または任意に（ｉｘ）異なる経路を標的とする抗miRNA、および／または任意に（ｘ）ＳＧＬＴ－２阻害剤、とともに投与される。適切な阻害剤、幹細胞治療薬、および／または異なる経路を標的とするmi-RNAは、当業者によって選択され得る。（ｉ）～（ｘ）による化合物および阻害剤は、独立して選択することができ、任意の適切な方法で組み合わせることができる。

線維性障害の治療の予防に適したさらなる医薬の例は、心臓線維症の予防または治療のための医薬（ACE阻害剤（例えばリシノプリル）、アンジオテンシンII受容体ブロッカー（例えば、カンデサルタン、ロサルタンまたはオルメサルタン）、アルドステロン拮抗薬（例えばスピロノラクトン）および／またはTGFβ阻害剤（例えばピルフェニドンまたはトラニラスト））、肺線維症の予防または治療のための医薬（抗線維化剤（例えばニンテダニブまたはピルフェニドン）、抗炎症剤（例えばコルチコステロイド、アザチオプリン、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸モフェチル）、抗逆流剤（例えばプロテインポンプ阻害剤またはH₂ブロッカー）、および／または抗咳止め剤）、ならびに肝繊維症の予防および／または治療のための医薬（例えばACE阻害剤（例えばベナゼプリル、リシノプリルまたはラミプリル）、抗ウイルス剤またはPPARα-アゴニスト）である。

さらに、本発明は、心臓障害の予防または治療のための医薬の製造のための、本明細書中上記のように記載された本発明の化合物の使用に関する。

さらに、本発明は、線維性障害の予防または治療のための医薬の製造のための、本明細書中上記のように記載された本発明の化合物の使用に関する。

さらに、本発明は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の少なくとも1つの化合物の治療有効量を投与することを含む、心臓障害の予防または治療のための方法に関する。

さらに、本発明は、本明細書に記載の少なくとも1つの化合物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、線維性障害の予防または治療のための方法に関する。

さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドが投与された対象からmiR-132の量および／または活性を判定することを含む、上記のようなオリゴヌクレオチドによる療法をモニターリングするためのキットに関する。キットは、miR-132をコードするDNAまたはそれに相補的なDNAに結合するプライマー、好ましくは、miR-39をコードするDNAまたはそれに相補的なDNAに結合するプライマーであるhas-miR-132、好ましくはプライマーcel-miR-39、および任意に陽性コントロールhsa-miR-132および任意に陽性コントロールcel-miR-39を含んでもよい。好ましい実施形態によれば、プライマーhsa-miR-132およびmiR-39は一緒に使用される。さらに、キットは、追加の化合物、例えば、qPCRマスターミックスおよびヌクレアーゼフリーウォーターを含むことができる。好ましい実施形態では、キットは、プライマーhsa-miR-132、プライマーcel-miR-39、上記で引用した陽性コントロール、およびqPCRマスターミックスとヌクレアーゼフリーウォーターを含む。適切なプライマーは、当業者によって選択され得る。

さらに、以下の図および実施例により、本発明をより詳細に説明する。

HepG2細胞およびNRCM中のCDR132Lの有意な毒性は、治療用量範囲において認められなかった（図１Ａおよび１Ｂを参照）。 処置：CDR132Lまたはプラセボを毎週20mg/kg ip(図2A参照)。miR-132の発現量はqPCRで検出した。統計学的検定：独立t検定(図2B)。 心臓の代表的な心エコー画像（図3A）。CDR132Lは、心筋量および拡張期容積（LVEDV）で測定される肥大を逆転させた（図3B）。 CDR132Lは、左心室のほとんどのセグメント（AB、前方心基部；AM、前方中部；AA、前方心尖部；PA後方心尖部；PM、公報中部およびPB、後方心基部）において局所収縮機能を改善する。 心筋梗塞（MI）モデルマウス：C57BL/6Nマウスの冠動脈（LAD）を永久結紮した。 CDR132L処置により、MI後の左心室機能障害が改善される（図5A）。収縮機能の負荷に依存しないパラメータも改善された（図5B）（*p<0.05）。 CDR132L投与は、縦ひずみ速度（LSR）も改善するため、心臓の遠隔部の個々の心筋セグメントにおけるMI後の収縮機能障害をリバースさせることができる。(*p<0.05)。 CDR123L処置は、例えば遠隔（非梗塞）領域および梗塞周囲ゾーンの心臓組織において、miR-132発現を効果的にサイレンシングする（図7A）。組織学的レベルでは、CDR132Lは、MI後の心臓の遠隔領域において心筋細胞のサイズを減少させる（図7B）。組織レベルでは、CDR132Lは、MI後の心臓における心臓ストレスシグナルANPの発現を減少させる（図7C）。 90分間の虚血（LAD閉塞）とその後の再灌流により誘発されたブタの心筋梗塞モデル。 CDR132L処置は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率および左心室機能の測定により決定されるように、不適応リモデリングを回避し、機能を改善する（図9A-D）。CDR132L処置は、生存／遠隔心筋に対応するセグメント中のセグメント収縮力を改善する；終点での心臓MRI：n＝6／群、赤色部分：p＜0.05（図9E）。 CDR132L処置は、終点における電気解剖学的マッピングであるNOGAによって決定されるように、不適応リモデリングを回避し、遠位部領域におけるLV生存率を改善する：n＝6／群、プラセボ対CDR132L：p＜0.05。 CDR132Lは、ANPおよびBNPにおける病的な心不全マーカーの組織発現を正常化し、ミオシンヘビーチェンジアイソフォームのシフト、すなわちMYH7/6比を提供する。 組織学的レベルでは、CDR132L治療は、遠隔LV領域の代表的な写真撮影画像（WGA／DAPI染色20x）（図12A）およびグラフィック描写（図12B）、n＝6／群、プラセボ対CDR132L：p＜0.05において、心筋細胞の肥大を効果的に低減する。 CDR132Lの単回投与は、心臓のmiR-132レベルを用量依存的にサイレンシングする。 CDR132Lのin vivo処置は、ブタの臓器毒性を惹起しない。 コントロールスクランブルオリゴヌクレオチドまたはCDR132Lのいずれかの腹腔内注射で処置したコントロールおよびmiR-132TGマウスにおいて、心臓FoxO3およびSerca2 mRNAレベルを、毎週、4回、測定した。すべての値は、平均値±SEMを表す。*P < 0.05（図15Aおよび図15B）。 実験デザインと結果を図16に示す。NRCMをCDR132LおよびCDR301で処理すると、miR-132-3pレベルが96％有意に減少し、一方CDR2u1は、miRNA発現を30％減少させた（図16A-B）。さらに、CDR132Lによる処理は、CDR2u1およびCDR301では達成できなかったmiR-132-3p標的遺伝子Foxo3の有意な抑制をもたらした（図16C）。 実験デザインは、図17に記載されている。 MI後心不全におけるCDR132Lの抗線維化効果のin vivoでの評価を図18に示す。組織学的な結果によると、CDR132L処理後に線維化が減弱した（図18A）。これは分子レベルでも確認され、コラーゲンIII型アルファー1鎖(Col3a1)などの線維症マーカーの遺伝子発現が減少していた（図18B）。 図19は、肝線維症のin vitroモデルである。形質転換成長因子ベータ（TGF-β）によるHPLFの刺激（図19A）は、miR-132-3pのわずかな誘導をもたらし、それはCDR132L処理によって有意に減少した（図19B）。さらに、この化合物は、線維芽細胞の増殖（図19C）およびCOL1A1、COL1A2、およびMMP2（図19D）などの線維症遺伝子の発現を減少させた。 図20は、in vitroの肺線維症モデルを表す。NHLF細胞では、高FBS（2％FBSの正常な増殖条件と比較して5％）で線維化刺激した後（図20A）、miR-132-3pの上昇は観察されなかった（図20B）。それにもかかわらず、CDR132Lで処理すると、標的マイクロRNA（図20B）および線維芽細胞増殖（図20C）の有意な減少をもたらした。 心筋梗塞（MI）誘発心不全（HF）のプラセボ対照ブタモデルから血漿試料中の循環miR-132-3pを測定した。 図22は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）の心臓組織（LV MI遠隔領域）におけるCDR132L濃度と、cel-miR-39に正規化したmiR-132-3pの循環レベルとの相関解析を示す。 図23は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）の心臓組織（LV MI遠隔領域）におけるCDR132L濃度と、NT-proBNP（N末端プロb型ナトリウム利尿ペプチド）の血漿レベルとの相関解析を示す。 図24は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）の心臓組織（LV MI遠隔領域）における機能的miR-132-3pレベルと、cel-miR-39に正規化されたこのマイクロRNAの循環レベルとの相関解析を示す。 図25は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）のデルタEF（3日目から2ヶ月目までのEFの改善）と、cel-miR-39に正規化したこのマイクロRNAの循環レベルとの相関解析を示す。 図26は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）のNT-proBNPの血漿レベルとデルタEF（3日目から2ヶ月目までのEFの改善）の相関解析を示す。 図27は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）のNT-proBNPの血漿レベルと、cel-miR-39に正規化したmiR-132-3pの循環レベルとの相関解析を示す。 心筋梗塞後のHFモデル（135匹、56日間の追跡調査）。 MI後3日目から56日目までのEFの有意な変化（デルタEF）は、中用量および高用量IV/IV群およびIC/IV群で認められ、機能改善を示した。 中高用量群では、線維化の進展に有意な変化が認められ、機能改善に寄与した。 レスポンダー解析により、EF改善における用量依存的な反応が解明された。IVIV高用量群の85.7％が7％を超えるデルタEFを示したのに対し、すべてのプラセボ動物では4.6％しか7％を超える回復を示さなかった。 MI後の慢性心不全（HF）ブタモデルにおけるCDR132Lの有効性の検証 6ヶ月の追跡調査を行うMI後HFの慢性モデル。 MI後1ヶ月目から6ヶ月目までの7％を超えるEFの有意な変化は、プラセボと比較してすべての治療群で認められた。治療量とEF改善度（デルタEF M6-M1）の間には強い相関が認められた。 CDR132Lの心臓組織分布（LV MI 遠隔領域）は、用量依存的に観察された。CDR132Lの組織濃度は、miR-132-3pの機能レベルが低いことに対応する。 CDR132Lは、ブタの慢性心不全モデルにおいて、心機能を強く改善する。 我々は、CDR132LのＩＶ投与とIC投与の両方に相当する心臓組織試料において用量依存的な組織曝露を見出した（図36a,b）。CDR132Lの活性は、未処置の対照動物に比べ、標的miR-132レベルの相互用量依存的な減少によって確認された。心臓の抗miR-132濃度と機能的miR-132レベルの間には、投与経路とは無関係に強い逆相関があった（図36c）。心筋組織における化合物の半減期は約3週間と計算され（図36d）、血漿中では急速なアルファ相と長いベータ相を持つ二相性の消失が認められた（図36e）。

実施例1－心筋細胞におけるmiR-132の発現のサイレンシング
抗miR-132ライブラリから得られた多数の構造類似化合物のmiRNA阻害活性の定量的in vitroアッセイを実施した。miRNAの発現のサイレンシングは、TaqMan（登録商標）アッセイおよび定量リアルタイムPCRにより定量化した。

本研究は、フェニレフリン／イソプロテレノールの濃度１０μＭ処理による肥大刺激後のラット単離心筋細胞中で行った。細胞を標準細胞培養液で４８時間インキュベートした。試験化合物は１００ｎＭの濃度で個別に投与した。試験はトリプリケートで実施した。

化合物CDR132Lは、ホスホロチオエート骨格を持つLNA-DNA ミキシマー（mixmer）であり、抗miR-132構造類似ライブラリから最も強力な化合物として同定された。

CDR132Lの構造は以下の通りである：
5’-dA^*+T^*dG^*+G^*dC^*+T^*dG^*+T^*dA^*+G^*dA^*dC^*dT^*dG^*+T^*+T-3’
（式中、dAは2'デオキシアデノシン、dGは2'デオキシグアノシン、dCは2'デオキシシチジンおよびTはチミジン、
+TはLNA-Tビルディングブロックおよび+GはLNA-Gビルディングブロック、
ならびに^*はホスホロチオエート結合である）。

実施例2－毒性プロファイリング
2.1 研究目的：CDR132Lの毒性プロファイリング

2.2 試験の概要
ヒト肝細胞（HepG2）および単離新生仔心筋細胞（NRCM）において、in vitro細胞毒性アッセイを行った。細胞毒性評価には，市販の比色性MTTアッセイを使用した。個々の化合物を添加した後、細胞をDMEM培地中で48時間インキュベートした。CDR132L（赤）の効果は、０．０１－１００μＭの用量範囲で、コントロールとして使用したスクランブルLNAオリゴヌクレオチド（青）と比較された。治療用量範囲は、グレーで表示されている。

2.3 結果：HepG2細胞およびNRCM中のCDR132Lの有意な毒性は、治療用量範囲において認められなかった（図１Ａおよび１Ｂを参照）。

実施例3－トランスジェニックマウスモデルにおけるCDR132L投与による不全心の左心室リバースリモデリング
3.1 試験目的：心不全モデルマウスにおけるCDR132Lの心不全リバースの有効性の試験。

3.2 試験の概要
心肥大のモデル：心臓miR-132を過剰発現させたトランスジェニック(TG)マウス(Ucar et al. 2012)。
処置：CDR132Lまたはプラセボを毎週20mg/kg ip(図2A参照)
群：野生型（WT）同腹子＋プラセボ、WT＋CDR132L、TG＋プラセボ、TG＋CDR132L。n=6/群
miR-132の発現量はqPCRで検出した。統計学的検定：独立t検定。(図2B)。
**p<0.01、n=6/群。

3.3 結果
心臓の代表的な心エコー画像（図3A）。
CDR132Lは、心筋量および拡張期容積（LVEDV）で測定される肥大を逆転させた（図3B）。
CDR132Lは、左心室のほとんどのセグメント（AB、前方心基部；AM、前方中部；AA、前方心尖部；PA後方心尖部；PM、公報中部およびPB、後方心基部）において局所収縮機能を改善する（図3C）。

実施例４－MI後心不全のマウスモデルにおけるCDR132Lの投与
4.1 試験目的：MI後心不全モデルマウスにおけるCDR132Lの有効性の試験

4.2 試験の概要
心筋梗塞（MI）モデルマウス：C57BL/6Nマウスの冠動脈（LAD）を永久結紮した（Kolkら、2009）。
群：CDR132Lまたはプラセボで処置した、MIまたはsham。
処置：MI後7日目と14日目に20mg/kg ip.
エンドポイント：MI後28日目のLV機能。ｎ＝６－７／群（図４）。

4.3 結果
CDR132L処置により、MI後の左心室機能障害が改善される（図5A）。
収縮機能の負荷に依存しないパラメータも改善された（図5B）（*p<0.05）。
CDR132L投与は、縦ひずみ速度（LSR）も改善するため、心臓の遠隔部の個々の心筋セグメントにおけるMI後の収縮機能障害をリバースさせることができる。(*p<0.05)（図6）。
CDR123L処置は、例えば遠隔（非梗塞）領域および梗塞周囲ゾーンの心臓組織において、miR-132発現を効果的にサイレンシングする（図7A）。
組織学的レベルでは、CDR132Lは、MI後の心臓の遠隔領域において心筋細胞のサイズを減少させる（図7B）。
組織レベルでは、CDR132Lは、MI後の心臓における心臓ストレスシグナルANPの発現を減少させる（図7C）。

実施例 5－MI後心不全のブタモデルでのCDR132Lの試験
5.1 試験目的：臨床に関連した心筋梗塞後モデルにおけるin vivoでのCDR132Lの有効性の証明。

5.2 試験の設定
・90分間の虚血（LAD閉塞）とその後の再灌流により誘発されたブタの心筋梗塞モデル。
・群：プラセボまたはCDR132L、各群n=6.
・処置：MI後3日目と28日目の2回、それぞれ0.3mg/kgを冠動脈内、0.5mg/kgを静脈内投与（図8）。
・エンドポイント：MI後8週目。主要結果測定：EFおよびLVリモデリング。

5.3 結果
・CDR132L処置は、拡張末期容積、収縮末期容積、駆出率および左心室機能の測定により判定されるように、不適応リモデリングを回避し、機能を改善する（図9A-D）。
・CDR132L処置は、生存／遠隔心筋に対応するセグメント中のセグメント収縮力を改善する；終点での心臓MRI：n＝6／群、赤色部分：p＜0.05（図9E）。
・CDR132L処置は、エンドポイントにおける電気解剖学的マッピングであるNOGAによって判定されるように、不適応リモデリングを回避し、遠位部領域におけるLV生存率を改善する：n＝6／群、プラセボ対CDR132L：p＜0.05（図10）。
・CDR132Lは、ANPおよびBNPにおける病的な心不全マーカーの組織発現を正常化し、ミオシンヘビーチェンジアイソフォームのシフト、すなわちMYH7/6比を提供する（図11）。
・組織学的レベルでは、CDR132L治療は、遠隔LV領域の代表的な写真撮影画像（WGA／DAPI染色20x）（図12A）およびグラフィック描写（図12B）、n＝6／群、プラセボ対CDR132L：p＜0.05において、心筋細胞の肥大を効果的に低減する。

実施例6-ブタにおけるCDR132Lの薬力学的プロファイル/ターゲットエンゲージメント
6.1 試験の設定
処置：1x、0日目、0.5mg/kgまたは5mg/kgの冠動脈内灌流、n=3ブタ/群、プラセボ対CDR132L：p<0.05。
・エンドポイント（治療後24時間）でのqPCR組織miRNAアッセイ。

6.2 結果
・CDR132Lの単回投与は、心臓のmiR-132レベルを用量依存的にサイレンシングする（図13）。

実施例7－臓器毒性プロファイリング
7.1 試験の設定
・処置：MI後3日目と28日目の2回、それぞれ0.3mg/kgを冠動脈内および0.5mg/kgを静脈内。
・連続採血、エンドポイント：処置72時間後、n=6ブタ/群、プラセボ対CDR132L:p<0.05.

7.2 結果
・CDR132Lのin vivo処置は、ブタの臓器毒性を惹起しない（図14）。

その後、ラットおよびミニブタにおいて反復投与による毒性試験を実施した。

ＣＤＲ１３２Ｌの４、２０および１００ｍｇ／ｋｇを１日目と２８日目に静脈内ボーラス注射し、４週間の回復期間を置いたラットの４週間の毒性試験によると，ラットの「無毒性量」（ＮＯＡＥＬ）は２０ｍｇ／ｋｇと考えられた。これはヒトの等価用量である３．２３ｍｇ／ｋｇ体重に相当する。
ＣＤＲ１３２Ｌの４、２０、４０ｍｇ／ｋｇを１日目と２８日目に静脈内注射し、４週間の回復期間を置いたミニブタの４週間の毒性試験によると、ミニブタの「無作用量」（ＮＯＥＬ）は４０ｍｇ／ｋｇと考えられた。これはヒトの等価用量である３６．３６ｍｇ／ｋｇ体重に相当する。

実施例８－心不全モデルマウスにおけるFoxO3およびSERCA2 mRNAの心臓レベル
コントロールスクランブルオリゴヌクレオチドまたはCDR132Lのいずれかの腹腔内注射で処置したコントロールおよびmiR-132TGマウスにおいて、心臓FoxO3およびSerca2 mRNAレベルを、毎週、4回、測定した。すべての値は、平均値±SEMを表す。*P < 0.05（図15Aおよび図15B）。

実施例９－異なるオリゴヌクレオチドの比較
この研究の目的は、本発明による新規miR-132-3p阻害剤CDR132Lの治療効果を、2つの比較オリゴヌクレオチドで評価することであった。２つの比較オリゴヌクレオチドは、CDR132Lと同じオリゴヌクレオチド配列とホスホロチオエート骨格を示すが、分子内のLNAビルディングブロックの分布が異なっている。CDR2u1は5'末端と3'末端に2つのLNAビルディングブロックを持ち、CDR301は各ヌクレオチドが1つのLNAビルディングブロックを持っている。

効率を調べるために、異なるオリゴヌクレオチドを新生仔ラット心筋細胞（NRCM）に投与した。この処置の効果は、miR-132-3pとその公知の標的遺伝子FoxO3(Forkhead box O3)の発現の変化を、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)によってモニターされた。

実験デザインと結果を図16に示す：（A）実験セットアップの概要。新生仔ラット心筋細胞を0日目に播種し、1日目にオリゴヌクレオチドCDR132L、CDR2u1またはCDR301（各100nM）で処理した。エンドポイントで、遺伝子発現解析のために細胞を採取する。(B)CDR132L、CDR2u1、またはCDR301で処理した後のmiR-132-3pの発現レベル。(C)CDR132L、CDR2u1またはCDR301で処理した後のmiR-132-3p標的遺伝子Forkhead box O3（FoxO3）の発現レベル。データは平均値±SD。P値オリゴヌクレオチド対プラセボは、両側スチューデントt検定により決定した。

NRCMをCDR132LおよびCDR301で処理すると、miR-132-3pレベルが96％有意に減少し、一方CDR2u1は、miRNA発現を30％減少させた（図16A-B）。さらに、CDR132Lによる処理は、CDR2u1およびCDR301では達成できなかったmiR-132-3p標的遺伝子Foxo3の有意な抑制をもたらした（図16C）。

要約すると、我々のデータは、CDR2u1およびCDR301と比較して、有意に低下したmiR-132-3pの発現レベルおよびその標的遺伝子FoxO3の有意な抑制によって示されるCDR132Lの優れた阻害効果を実証した。

実施例１０－CDR132Lの心臓線維症に対する効果
本研究の目的は、in vivoの線維症モデルにおいて、CDR132Lの抗線維化治療効果を評価することであった。

in vivoでの抗線維化活性の証明には、C57BL/6Nマウスの左前下行冠動脈（LAD）永久結紮による心筋梗塞（MI）モデルを使用した。CDR132L処置は、7日目と14日目にプラセボ（CDR132Lに対するスクランブルオリゴアナログ、20mg/kg）とCDR132L（20mg/kg）を適用した。群には、プラセボまたはCDR132Lのいずれかを処置した対照手術群（Sham手術マウス）およびLAD結紮マウス（MI、心筋梗塞）を含む：Sham+プラセボ、Sham+CDR132L、MI+プラセボ、MI+CDR132L。n=6-7/群。実験デザインは、図17に記載されている。
MI後心不全におけるCDR132Lの抗線維化効果のin vivoでの評価を図18に示す。線維化（ピクロシリウスレッド（PSR）染色により検出されたコラーゲン沈着の％およびβ－アクチンに対するコラーゲンIII型アルファ1鎖（Col3a1）遺伝子発現として示す）は、CDR132Lによる処置によりMI後に減弱された。群には、対照手術群（Sham手術マウス）とLAD結紮マウス（MI）が含まれ、プラセボ（黒色カラム）またはCDR132L（白色カラム）のいずれかを処置した：Sham+プラセボ、Sham+CDR132L、MI+プラセボ、MI+CDR132L。プラセボまたはCDR132Lを投与したMIマウス間で統計検定（独立t検定）を行った。**p<0.01、n=6-7/群。

組織学的な結果によると、CDR132L処理後に線維化が減弱した（図18A）。これは分子レベルでも確認され、コラーゲンIII型アルファー1鎖(Col3a1)などの線維症マーカーの遺伝子発現が減少していた（図18B）。

実施例11-肺線維症および肝線維症におけるCDR132Lの効果
CDR132Lの抗線維化効果は、肺線維症および肝線維症のin vitroモデルで試験された。そのために、肝臓（ヒト初代肝線維芽細胞、HPLF、PeloBiotech）および肺（正常ヒト初代肺線維芽細胞、NHLF、Lonza）由来のヒト初代線維芽細胞を線維化促進剤で刺激し、CDR132Lで処理した。CDRL132Lの治療効果は、エンドポイントにおける増殖率や線維症マーカー遺伝子の発現変化など、線維化経路内の主要なプロセスを追跡することでモニターされた。さらに、有効なCDRL132L治療を証明するために、miR-132-3pの発現が評価された。

細胞増殖の判定には、細胞増殖ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)キット（Rocheにより提供）を使用した。この比色測定法は、増殖中の細胞の新たに合成されたDNAに取り込まれたBrdU（ブロモデオキシウリジン）の測定に基づいて、細胞増殖を定量化することができる。取り込まれたBrdUの量が検出され、定量化されている。吸光度の値は、DNA合成量と直接相関しており、これにより、それぞれの微小培養における増殖細胞数に相関する。遺伝子発現は、miR-132-3pならびにコラーゲン1A1（COL1A1）、コラーゲン1A2（COL1A2）、マトリックスメタロペプチダーゼ2（MMP2）などの線維症マーカーの発現レベルを測定する定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）を使用して評価された。

図19は、肝線維症のin vitroモデルである：(A)実験セットアップの概要。ヒト初代肝繊維芽細胞（PeloBiotechにより提供）を0日目に播種し、1日目に線維化刺激（正常成長培地（10％FBSを添加した完全線維芽細胞培地）中10ng／ml TGF-β）およびCDR132L（100nM）で処理した。終点では、細胞増殖と線維症マーカーの遺伝子発現が評価された。(B)CDR132Lで処理した後のmiR-132-3pの発現レベル。(C)DNA合成中のBrdU取り込みのモニタリングによって評価した増殖。BrdU試薬は、終点の20時間前に培地に添加されている。(D）線維化マーカー遺伝子（コラーゲン1A1（COL1A1）、コラーゲン1A2（COL1A2）およびマトリクスメタロペプチダーゼ2（MMP2））の発現レベル。（B）および（D）の破線は、刺激していない対照細胞の発現レベルを示す。データは平均値±SD。CDR132L対対照のP値は、両側スチューデントt検定により決定した。

形質転換成長因子ベータ（TGF-β）によるHPLFの刺激（図19A）は、miR-132-3pのわずかな誘導をもたらし、それはCDR132L処理によって有意に減少した（図19B）。さらに、この化合物は、線維芽細胞の増殖（図19C）およびCOL1A1、COL1A2、およびMMP2（図19D）などの線維症遺伝子の発現を減少させた。

図20は、in vitroの肺線維症モデルを表す：(A)実験セットアップの概要。正常ヒト肺線維芽細胞（Lonzaにより提供）を0日目に播種し、1日目に線維化刺激（線維芽細胞増殖培地中の高FBS（5％）およびCDR132L（100nM）で処理した。エンドポイントでは、細胞増殖と遺伝子発現が評価されている。(B)CDR132Lで処理した後のmiR-132-3pの発現レベル。(C)DNA合成中のBrdU取り込みのモニタリングによる増殖の評価。BrdU試薬は、エンドポイントの20時間前に培地に添加されている。(B)の破線は、刺激していない対照細胞の発現レベルを示す。データは平均値±SD。CDR132L対対照のP値は、両側スチューデントt検定によって決定された。

NHLF細胞では、高FBS（2％FBSの正常な増殖条件と比較して5％）で線維化刺激した後（図20A）、miR-132-3pの上昇は観察されなかった（図20B）。それにもかかわらず、CDR132Lで処理すると、標的マイクロRNA（図20B）および線維芽細胞増殖（図20C）の有意な減少をもたらした。

要約すると、我々のデータは、肝または肺由来の線維芽細胞および心臓組織において、オリゴヌクレオチドアナログCDR132Lの有意な抗線維化効果を実証している。この効果は、薬剤の抗増殖能、および／または細胞外マトリックスタンパク質の発現に対する効果に基づくと推測される。

実施例１２－ヒト臨床試験のプロトコールおよび結果
12.1 プロトコル：
理論的根拠
現在の最新の心不全薬物療法は、主に進行度の低い病期（ニューヨーク心臓協会ステージIおよびII；NYHA I/II）に限定されている。しかしながら、薬物では進行のステージ（NYHA IIIおよびIV）への移行を防ぐことはできず、頻繁な入院と70％を超える1年死亡率を伴う(13)。最後の手段として、植え込み型ポンプ（左心室補助循環装置、LVAD）、最終的には心臓移植が、ごく少数の末期心不全患者にとって唯一の救命選択肢となるかもしれない。

このように、死亡率や入院日数を減らすことができる、新規で効率的な、病気と闘う治療薬が、患者に治癒の希望を与えるために、緊急に必要とされている。本発明者らのアプローチは、医療行為に革命を起こし、患者ケアを改善し、心不全ケアのコストを削減する新しい機会を提供する。

CDR132Lの作用機序は、次のような重要な要素を持っており、心不全の次世代治療薬としての役割の基礎を形成している：
a)異常な心臓のmiR-132レベルの正常化、
b)カルシウムシグナル伝達と収縮力、および心機能の正常化、
c)心臓のオートファジーとホメオスタシスの改善、および
d）不適応心臓リモデリングの減弱。

前臨床試験の結果、CDR132Lの安全性プロファイルは、臨床開発を進めるのにて適切であることが実証された。

そこで、本試験では、虚血性起源の安定型心不全患者（NYHA I-III）において、臨床的に関連する大動物試験で示された有意な治療効果に基づき、安全性、薬物動態および一部の薬力学的パラメータを評価することを計画している。本試験では、用量漸増法を適用するすることを計画している。

第１の目的
・虚血性起源の安定型心不全患者（NYHAステージI、IIおよびIII）におけるCDR132Lの単回投与および反復投与の安全性を評価すること。

第２の目的
・虚血性起源の安定型心不全患者におけるCDR132Lの薬物動態（PK）プロファイルを明らかにすること。

探索的目的
・CDR132Lが薬力学的（PD）パラメータに及ぼす影響を判定すること。

第１のエンドポイント
・第１のエンドポイントは、CDR132Lの安全性であり、以下で測定される：
・治療上問題となる有害事象（TEAE）の発生率および重症度、
・実験的安全性試験（血液学、化学、凝固および尿検査）において臨床的に有意な変化を認めた対象者の割合、
・心電図(ECG)上の形態および/またはリズムの異常を認めた対象者の割合、
・ECG時間間隔（PR、QRS、QTおよびQTc間隔）に臨床的に有意な変化を認めた対象者の割合。
・バイタルサイン（収縮期血圧、拡張期血圧および脈拍数）に臨床的に有意な変化を認めた対象者の割合、
・心臓（高感度心筋トロポニンT）、腎臓（クレアチニン）および肝臓（アスパラギン酸トランスアミナーゼおよびアラニントランスアミナーゼ）障害、ならびに血管内のうっ血改善（decongestion）（N末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド）の臓器障害マーカーにおける臨床的に有意な変化を認めた対象者の割合。

第２のエンドポイント
最大観察血漿中濃度（C_max）、最大血漿中濃度までの時間（t_max）、時間ゼロから最終検出血漿中濃度までの血漿中濃度時間曲線下面積(AUC_0-t）、時間ゼロから無限大に外挿した血漿中濃度時間曲線下面積（AUC_0-inf）、血液クリアランス（CL）、最終消失速度定数（λz）、最終消失半減期（t_1/2）、分配量（Vdss）などのPKパラメータを非区画法で得た。

探索的エンドポイント
・PDパラメータには、以下のバイオマーカー：ターゲットエンゲージメントのためのmicroRNA 132（miR-132）、うっ血を解くためのN末端プロb型ナトリウム利尿ペプチド（NT-pro-BNP）、心臓リモデリングのマーカーとしての好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（NGAL）、が含まれるが、これらに限定されない。追加のパラメータが必要な場合もある。
・(1)CDR132Lの治療に対する反応を予測、(2)薬物のPK/PDの変動を説明、(3)薬物間相互作用に対する感受性を予測、または(4)安全性の問題の発生を予測しうるバイオマーカーを特定すること。このような探索的研究の目的は、ヒト対象者のCDR132Lの薬物動態を障害する可能性のある内在的および外在的な要因について、より深い理解を進展させることである。これには、患者のいかなるゲノム（DNA）配列は含まれていない。

試験デザイン
本試験は、虚血性起源の安定型心不全患者（NYHAステージI-III）において、CDR132Lの安全性、薬物動態および薬力学的パラメータを評価する第I相無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。

最大で28名の患者が登録される予定である。最大のコホートサイズで計画されている4つのコホートは以下にリスト化される。これらの各コホートは最大7名の患者で構成される予定である。患者は、CDR132Lまたはプラセボを最大5：2の割合で15分間点滴静注されるよう無作為に割り付けられる。
・治療1 (n=最大7)－0.32 mg/kg CDR132L；プラセボ
・治療2 (n=最大7)－1.00 mg/kg CDR132L；プラセボ
・治療3 (n=最大7)－3.00 mg/kg CDR132L；プラセボ
・治療4 (n=最大7)－10.00 mg/kg CDR132L；プラセボ。

患者は、試験開始前の41日以内に、1日目にスクリーニングされる。各対象者は、口頭および書面での情報を受け、スクリーニングが行われる前にインフォームド・コンセント用紙(ICF)にサインをする。対象者は第1日目に試験室に入院し、第4日目に退院、第27日目に再入院、第31日目に退院となる予定である。1日目にボランティアはCDR132Lまたはプラセボを投与され、２回目の投与のため27日目に再入院し、28日目に２回目の適合する用量を受ける。すべての患者は、虚血性起源の心不全に対して、最新の欧州ガイドライン（14）に準拠した標準治療（SoC）を受けているはずである。CDR132Lまたはプラセボは、SoC治療のアドオン治療として投与される予定である。

すべての対象者は、10～14日目、56日目、84日目および112日目に計画されている外来受診のため、試験室に通院する。試験中に実施されるすべての評価は、試験評価スケジュール（表2および表3）に詳述されている。試験デザインの特徴は、Adaptive Features（表4）に従って適応されるかもしれない。本試験では、センチネル投与法を使用する。詳細については、セクション3.3.5を参照。

対象者数
虚血性起源の安定型心不全の患者28名が投与コホート1、2、3および4に組み入れられた。

主な入院基準
C18036_CDR132L-FIH01_Clinical Study Protocol_v1.0_17Apr2019
Clinical Study Protocol Template (Version 6) 14 MAR 2019 Page 16 of 85
体重指数（BMI）18.0～28.0kg/m²の年齢30～80歳で、虚血性起源の安定型心不全が確認された場合に対象者に入れられる。
主な除外基準は以下の通り：非虚血性起源の心不全（高血圧性心疾患、心筋炎、アルコール性心筋症、急速な心房細動による心機能障害）、現在または再発中の疾患；CDR132Lの作用、吸収、生体内分布に影響を与え、臨床評価または臨床検査評価に影響を与える可能性のある安定した心不全（血液学的、神経学的、内分泌、免疫学的、腎臓、肝臓または胃腸またはその他の状態など）を含まない。

試験治療と投与方法
コホート1：1日目と28日目に0.32mg/kg CDR132L点滴静注（15分、20ml）（n=5)
コホート2：1日目と28日目に1.00mg/kg CDR132L点滴静注（15分、20ml）（n=5）
コホート3：1日目と28日目に3.00mg/kg CDR132L点滴静注（15分、20ml）（n=5）
コホート4：1日目と28日目に10.00mg/kg CDR132L点滴静注（15分、20ml）（n=5）

参照治療と投与方法
CDR132Lに合わせたプラセボの点滴静注（15分；20ml）（n=8）。

評価基準
－安全性解析
安全性評価には、標準的検査安全性試験（血液学、凝固、生化学および尿検査）、バイタルサイン（収縮期血圧［SBP］、拡張期血圧［DBP］、呼吸数、脈拍、鼓膜温）、身体検査、12誘導ECG（RR、PR、QRS、QT、QTcF間隔および心拍［HR］）、遠隔測定、バイオマーカー評価および有害事象モニタリングが挙げられるだろう。

－薬物動態解析
CDR132Lの血漿中濃度測定値から、以下の薬物動態パラメータを算出する予定である：最大観察血漿中濃度（C_max）、最大血漿中濃度までの時間（t_max）、時間ゼロから最終検出血漿中濃度までの血漿中濃度時間曲線下面積（AUC_0-t）、時間ゼロから無限大に外挿した血漿中濃度時間曲線下面積（AUC_0-inf）、血液クリアランス（CL）、最終消失速度定数（λz）、最終消失半減期（t1/2）、分配量（Vdss）。

－薬力学的解析
薬力学的評価は探索的に行われ、採血により以下のバイオマーカーの濃度を判定することで評価される：ターゲットエンゲージメントのためのマイクロRNA 132（miR-132）、血管内のうっ血改善（decongestion）ためのN末端プロb型ナトリウム利尿ペプチド（NT-pro-BNP）、心臓リモデリングのマーカーとしての好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（NGAL）。その他のパラメータが必要な場合もある。

統計方法
詳細な統計手法を含む統計解析計画書（SAP）は、データベースのハードロック前に作成され、署名される。この計画は、適宜、研究の適応する特徴を反映するために更新されることがある。

－安全性パラメータの統計解析
有害事象（AE）、バイタルサイン、ECGパラメータおよび臨床検査データをリスト化し、記述統計学を用いて要約する。

AEを発現した対象者の数（および％）は、各投与量について要約される。すべてのAEは、Medical Dictionary for Regulatory Activities（MedDRA）を用いてその事象に割り当てられた、臓器別大分類(SOC)および優先使用語（preferred term）(PT)によってリスト化される。さらに、これらの事象は、最大強度によって要約される。また、薬剤関連AEを発現した対象者の人数も要約される。重篤な有害事象（SAE）および/または休薬に至った有害事象はすべてリスト化される。

－薬物動態パラメータの統計解析
血漿中濃度は、タイムポイントごとに記載し、要約する。PKパラメータは、各対象者についてリスト化し、記述統計学を用いて各治療群について要約する。C_maxおよびAUCの用量比を予備的に評価するため、用量正規化血漿中C_max、AUC_0-tおよびAUC_0-infを算出し、記述的に要約する。さらに、血漿中C_max、AUC_0-tおよびAUC_0-infのデータに対して、応答変数としてlog（PKパラメータ）、予測変数としてlog（用量）を用いたパワーモデルを適合させる。このモデルの傾きが1であれば、用量比例に相当する。この傾きは、両側90％および95％CIを用いて推定する。

－薬力学的パラメータの統計解析
PDパラメータのデータは、記述統計学を用いて、ベースラインからの変化に伴う絶対値をリスト化し、要約する。

各投与群について、血漿中濃度とPDパラメータの関係を、血漿中濃度に対する各PDパラメータのグラフ表示により検討する。この関係は、PKと関連するPD集団との交点を用いて調査される。要約統計とグラフ表示が血漿中濃度とPDパラメータの関係を示している場合、この関係をさらに説明するために適切な統計モデルを開発することができる。

12.2 患者の特徴
虚血性起源の安定型心不全（NYHA1-3）の患者28名は、無作為化二重盲検プラセボ対照試験に算入された。さらに患者の特徴としては、2型糖尿病、心筋梗塞の既往、心房細動、動脈性高血圧、経皮的インターベンションおよび／または冠動脈バイパス術などが挙げられた。左心室駆出率は31％から56％の範囲であった。

患者は医師の判断で併存疾患のバックグラウンド治療を受けており、個々のHFの状態に対して安定した治療を受けていた。ほとんどの患者は、二重/三重治療（ベータブロッカーと、ACE阻害剤もしくはアンジオテンシン受容体ブロッカーのいずれか、およびミネラルコルチコイド拮抗剤との併用）を受けていた。プラセボ群2例とVerum群2例の患者には両室ペースメーカーが、Verum群3例の患者には植え込み型除細動器（ICD）が装着されていた。

12.3 予備的な結果
薬物動態（PK）プロファイル
CDR132LのヒトでのPKプロファイルは、蓄積の兆候のない安全なプロファイルであることを確認した。また、ブタからヒトへのPKプロファイルおよび翻訳可能性（translatability）も確認された。C_maxおよびAUCにおける高い用量直線性により、他の用量（例：5mg/kg）でのPKパラメータの予測が可能であった。第Ib相試験の予備的結果に基づき、臨床試験第II相の開始用量は3～10mg/kgの間、その後の維持用量は3～5mg/kgの間が示唆された。

ターゲットエンゲージメント
Verum患者における循環miR-132濃度は、用量依存的に有意に低下し、経時的に（試験エンドポイントである112日目まで）低い値を維持した。

ECG結果
Verum患者のほとんどは、スクリーニング時にECGに異常があった。その多くは、CDR132L治療により正常化または用量依存的な大幅な改善（例：T波の正常化、QRS狭小化または左脚ブロック（LBBB）および／または右脚ブロック（RBBB）の欠如、R進行の正常化）を示した。CDR132L治療下では、ベースラインからECGが悪化した者はいなかった。QTおよびQTcのデータに基づくと、不整脈誘発の可能性を示唆するものは見つからなかった。

薬力学的（PD）パラメータ
駆出率（EF）に対する正の影響は、ほとんどの治療患者で認められた。心臓安全性マーカーであるNT-proBNPは、CDR132L治療により悪影響を受けなかった。最高用量群（10mg/kg）の患者では、28日目および122日目のNT-proBNP値がベースラインと比較して著明に低下していた。CDR132Lの2回治療（用量1～10mg/kg）は、全患者の50％を超える患者においてEFの改善および/またはNT-proBNP値の減少をもたらした。左心室弛緩の重要なマーカーである等容弛緩時間（IVRT）の減少は、EFが45％を超える患者で認められ、拡張機能障害を有する患者における有益性が示唆された。

バイオマーカー
CDR132L治療のHF患者では、心臓線維症マーカーであるプロコラーゲンI型C末端プロペプチド（PICP）とガレクチン-3（Gal-3）の値が低下しており、抗線維化作用が示された。さらに、線維症バイオマーカーのマトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）は、miR-132の循環レベルと正の相関を示し、高用量群（コホート3および4）の患者において減少していた。なお、本試験のエンドポイントにおいて、コホート4ではMMP-1濃度は検出限界以下であった。

安全性と忍容性
重篤な有害事象（SAE）は認められなかった。また、生化学的・血液学的パラメータ、バイタルサインおよびECGにおいて、病的な影響や安全性に関するシグナルは特定されなかった。

12.4 結論
CDR132Lは、ヒト心不全患者の忍容性が高く、10mg/kgまでの用量で毒性の兆候を示さなかった。

実施例13－血漿中の循環miR-132-3pの定量によるCDR132L療法モニタリング
本研究の目的は、CDR132L療法モニタリングのためのバイオマーカーとして、血漿中のmiR-132-3pのレベルを評価することであった。

心筋梗塞（MI）誘発心不全（HF）のプラセボ対照ブタモデルから血漿試料中の循環miR-132-3pを測定した（図21）。動物はMIを受け、3日目および1ヶ月目の2つの適用（冠動脈内／静脈内（ICIV）対静脈内／静脈内（IVIV））およびCDR132Lの3つの用量レベル（低：1mg／kg、中：5mg／kgまたは高：10mg／kg）などのCDR132Lの異なる治療スキームに供された。

この研究では、2ヶ月目まで連続採血を行った。エンドポイントからの血漿試料では、miR-132-3pのためのTaqManプローブを用いた定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）で循環miR-132-3pレベルをモニタリングした。データは、RNA抽出手順中に添加した合成マイクロRNA（cel-miR-39）スパイクインで正規化した。

CDR132Lによる処理は、標的臓器である心臓における薬物物質の用量依存的な増加をもたらし、血漿試料中の機能的なmiR-132-3pの有意な減少を引き起こした。図22は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）の心臓組織（LV MI遠隔領域）におけるCDR132L濃度と、cel-miR-39に正規化したmiR-132-3pの循環レベルとの相関解析を示す。データは平均値±SEMとして個々の動物である。P値は、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニーのU検定によって評価した（左パネル）。相関は、ピアソン積率相関およびスピアマン順位相関によって行った（右パネル）。従って、循環miR-132-3pは、治療した動物の心臓組織におけるCDR132Lの濃度と強く相関していた。これらのデータは、循環miR-132-3pが心臓組織におけるCDR132Lの存在を示す指標マーカーとなることを示している。

さらに、我々は、他の規定のバイオマーカーが心臓組織中CDR132Lの存在を示すかどうかを評価した。N末端プロB型ナトリウム利尿ペプチド（NT proBNP）は、心臓ストレスのマーカーとしてよく知られており、心不全の重症度と相関している。miR-132-3pのレベルと一致する。

図23は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）の心臓組織（LV MI遠隔領域）におけるCDR132L濃度と、NT-proBNP（N末端プロb型ナトリウム利尿ペプチド）の血漿レベルとの相関解析を示す。データは平均値±SEMとして個々の動物である。P値は、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニーのU検定により評価した（左パネル）。相関は、ピアソン積率相関とスピアマン順位相関によって行った（右パネル）。CDR132L処理動物の血漿中では、NT-proBNPの減少が観察された（図23）。それにもかかわらず、用量依存性はあまり明らかでなく、心臓CDR132Lとの相関はあまり有意でなかった。

血漿中の循環miR-132と心臓のCDR132Lの関係は別にして、我々は、本薬剤物質がその標的マイクロRNAであるmiR-132-3pを効率的に阻害するかどうかを評価した。心臓組織（LV MI 遠隔領域）において機能的なmiR-132-3pレベルが有意に減少し、この減少は、高用量であるほど強かった。

図24は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）の心臓組織（LV MI遠隔領域）における機能的miR-132-3pレベルと、cel-miR-39に正規化されたこのマイクロRNAの循環レベルとの相関解析を示す。データは平均値±SEMとして個々の動物である。P値はノンパラメトリック両側マン・ホイットニーのU検定によって評価した（左パネル）。相関は、ピアソン積率相関とスピアマン順位相関によって行った（右パネル）。血漿と心臓のmiR-132-3pの相関は、両パラメータの間に有意な負の関連を示さず、血漿レベルのmiR-132-3pレベルが、CDR132Lの標的miR-132-3pに対する活性の指標となることが示された。

CDR132L治療はMI後の心機能を改善することが示されている。したがって、この機能的改善である、心筋梗塞後3日目と2ヶ月目を比較した左心室駆出率（EF）の変化（デルタEF）が、循環miR-132-3pと対応するかどうかを検証した。両パラメータに有意な負の相関が観察され、循環miR-132-3pレベルが心機能の改善の指標となることが示された。

図25は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）のデルタEF（3日目から2ヶ月目までのEFの改善）と、cel-miR-39に正規化したこのマイクロRNAの循環レベルとの相関解析を示す。データは平均値±SEMとして個々の動物である。P値は、ノンパラメトリックな両側マン・ホイットニーのU検定で評価した（左パネル）。相関は、ピアソン積率相関とスピアマン順位相関によって行った（右パネル）。

負の相関は、機能改善と心臓ストレスマーカーNT-proBNPの相関と同じくらい強かった。

図26は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）のNT-proBNPの血漿レベルとデルタEF（3日目から2ヶ月目までのEFの改善）の相関解析を示す。データは、平均値±SEMとしての個々の動物である。P値は、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニーのU検定によって評価した（左パネル）。相関は、ピアソン積率相関とスピアマン順位相関によって行った（右パネル）。

さらに、循環NT-proBNPの低レベルは、循環miR-132-3pの低レベルと線形的に対応する。

図27は、含まれるすべての動物（IVIVおよびICIV）のNT-proBNPの血漿レベルと、cel-miR-39に正規化したmiR-132-3pの循環レベルとの相関解析を示す。データは、平均±SEMとしての個々の動物である。P値は、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニーのU検定により評価した（左パネル）。相関は、ピアソン積率相関およびスピアマン順位相関によって行った（右パネル）。

実施例 14－亜急性心不全におけるCDR132L
14.1 試験目的：MI後亜急性心不全（HF）のブタモデルにおけるCDR132Lの有効性の試験

14.2 試験の概要：
・心筋梗塞後のHFモデル（135匹、56日間の追跡調査）
・体重増加の遅い家畜豚（「マンガリッツァ種」）
・プラセボ対照群および3つの投与群
1、5、10mg/kg b.w.を3日目と28日目に2回処置（図28）。
・冠動脈内/静脈内投与の比較
(IC/IV)と静脈内/静脈内(IV/IV)の適用。
・データ解析のために考慮した動物：79匹。

14.3 結果
駆出率デルタEFの変化（EF56日目－EF3日目）
注：包括基準は、3日目のEFが40％未満
MI後3日目から56日目までのEFの有意な変化（デルタEF）は、中用量および高用量IV/IV群およびIC/IV群で認められ、機能改善を示した（図29）。

循環NT-proBNPとデルタEFの相関（56日目－3日目）
MI後のHFに関連するNT-proBNPの増加は、56日目には中用量群と高用量群で逆転した。循環NT-proBNP濃度が低レベルであることは、デルタEFの増加によって示される心機能の改善と対応している。NT-proBNPは、標的の関与を示すための潜在的なバイオマーカーとして役立つ（実施例13を参照）。

エンドポイント（56日目）におけるLV MI遠隔領域での線維化（%）
注：包括基準は、3日目のEFが40％未満
中高用量群では、線維化の進展に有意な変化が認められ、機能改善に寄与した（図30）。

治療の反応(56日目)
注：包含基準、3日目のEFが40％未満
レスポンダー解析により、EF改善における用量依存的な反応が解明された。IVIV高用量群の85.7％が7％を超えるデルタEFを示したのに対し、すべてのプラセボ動物では4.6％しか7％を超える回復を示さなかった（図31）。

14.4 結論：
CDR132Lは、MI後HFの臨床的に関連があり認められた大動物モデルでのゴールドスタンダードの心臓MRI測定に基づき、心機能を効果的に改善する。心機能の改善には、線形的用量関係が観察された。IVIV高用量投与群では、3日目と比較して56日目のEFが10.38％増加した（プラセボ補正後）。CDR132Lの有効性が実証されたことは、臨床的意義が高い（比較として、心臓細胞移植ではせいぜい3～4％のEFが増加する）。

実施例 15－慢性心不全の治療のためのCDR132L
15.1 試験目的：MI後慢性心不全（HF）のブタモデルにおけるCDR132Lの有効性の試験

15.2 試験の概要
MI後の慢性心不全（HF）ブタモデルにおけるCDR132Lの有効性の検証
・6ヶ月の追跡調査を行うMI後HFの慢性モデル（図32）
・体重増加の遅い家畜豚（「マンガリッツァ種」）
・3つの治療アーム
毎月プラセボ×５回
毎月CDR132L×５回
毎月CDR132L×３回
・投与量：5mg/kg
・投与経路：IV
・データ解析に考慮した動物：29匹

15.3. 結果：
駆出率(EF)
注：包含基準、1ヶ月目のEFが40％未満
MI後1ヶ月目から6ヶ月目までの7％を超えるEFの有意な変化は、プラセボと比較してすべての治療群で認められた（図33）。

レスポンダー解析
注：包含基準、1ヶ月目のEFが40％未満
治療量とEF改善度（デルタEF M6-M1）の間には強い相関が認められた（図33）。5回治療群の87.5%が7%を超えるデルタEFを示したのに対し、プラセボ動物では11頭中2頭のみが3%を超える回復を示した。

6ヶ月後のCDR132LとmiR-132-3pのレベル
注：包含基準、１ヶ月日のEFが40％未満
CDR132Lの心臓組織分布（LV MI 遠隔領域）は、用量依存的に観察された。CDR132Lの組織濃度は、miR-132-3pの機能レベルが低いことに対応する（図34）。

左心室収縮末期容積(LVESV)
CDR132L治療は、有害な左心室のリモデリングに対して有益な効果を示し、プラセボと比較して両治療群においては6ヶ月間の追跡調査期間中にMI後のLVESVの拡大を有意に減弱した。

左心房（LA）
CDR132L治療により、MI後の慢性心房リモデリングは画像による評価では減少した。LA体積とLA指数（LA体積を体表面積で正規化したもの）は、両治療群でプラセボと比較して有意に減少した。

収縮機能および収縮率
CDR132L治療により、6ヶ月のエンドポイントにおいて侵襲的血行動態測定により評価したMI後の不全心臓における収縮機能と収縮力は有意に改善された。負荷に依存しないパラメータの解析では、CDR132L治療による心筋収縮力の改善（収縮末期圧－容積関係および前負荷動員一回仕事量（preload recruitable stroke work））が明らかになり、全体的な収縮機能の改善と明確に結びついた。

拡張機能
CDR132L治療により、拡張機能が有意に改善された。グローバル拡張期パラメータ（心室内の圧力変化の最小速度）と、心臓の硬さと静電容量の感度の高いマーカーである負荷に依存しないパラメータEDPVR（拡張末期圧力容積関係）は、CDR321L治療により共に改善された。

15.4 結論：
CDR132Lは、ブタの慢性心不全モデルにおいて、心機能を強く改善する。５回のCDR132Lを毎月処置した動物では、6ヶ月目にEFが7.14%増加することが実証された（プラセボ補正済み）。87.5%の動物でEFが7%を超えて改善し、治療に反応した。治療に関連する有害事象や血液学的および臨床化学的な変化は観察されなかった。CDR132Lの有効性が実証されたことは、慢性心不全の治療選択肢として臨床的に非常に重要性をもつ。

さらに、CDR132Lで毎月治療することにより、MI後の慢性心不全モデルにおいて、リモデリング、収縮機能（例：心筋収縮力）および拡張機能（例：心筋弛緩力）を効果的に改善する。

実施例16－薬物動態試験
CDR132Lの治療可能性をさらに評価するために、我々は、我々の化合物の標的組織における組織曝露および分布を評価する、ブタでの大動物薬物動態（PK）試験を計画した。静脈内投与（IV）は臨床的に好ましい投与経路であるが、多くの新規治療法では、心臓遺伝子治療研究でよく行われるように、冠動脈内（IC）灌流などの代替投与経路に依存している。我々は、CDR132LのＩＶ投与とIC投与の両方に相当する心臓組織試料において用量依存的な組織曝露を見出した（図36a,b）。CDR132Lの活性は、未処置の対照動物に比べ、標的miR-132レベルの相互用量依存的な減少によって確認された。心臓の抗miR-132濃度と機能的miR-132レベルの間には、投与経路とは無関係に強い逆相関があった（図36c）。心筋組織における化合物の半減期は約3週間と計算され（図36d）、血漿中では急速なアルファ相と長いベータ相を持つ二相性の消失が認められた（図36e）。
参考文献
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14. Ponikoskwi, P. et al. (2016), Eur. Heart J. 37: 2129-2200.

Claims (33)

1. ヒト対象者における心臓障害の予防または治療に使用するための式III：
   5’-dA^*+T^*dG^*+G^*dC^*+T^*dG^*+T^*dA^*+G^*dA^*dC^*dT^*dG^*+T^*+T-3’
   （式中、dAは2'デオキシアデノシン、dGは2'デオキシグアノシン、dCは2'デオキシシチジンおよびTはチミジンであり、
   +TはLNA-Tビルディングブロック、および+GはLNA-Gビルディングブロック、および^*はホスホロチオエート結合である）の配列を含むオリゴヌクレオチド。
2. オリゴヌクレオチドがそのまま投与される、またはオリゴヌクレオチドが異種部位にコンジュゲートされて投与される、請求項1の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
3. オリゴヌクレオチドが、（i）少なくとも1つの利尿剤、（ii）少なくとも1つのアンジオテンシン変換酵素阻害剤、(iii）少なくとも1つのβブロッカー、および任意に（iv）アンジオテンシンII受容体ブロッカー、および（v）任意にイバブラジンなどのIfチャネル阻害剤、および任意に（vi）アンジオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤、および任意に（vii）エンパグリフロジンおよびダパグリフロジンなどのグルコース共輸送体2阻害剤、および任意に（viii）幹細胞治療薬、および任意に（ix）異なる経路を標的とする抗miRNA、および／または任意に（x）SGLT-2阻害剤、と組み合わせて投与される、請求項1または2の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
4. 急性または亜急性心不全に罹患しているヒト対象者の予防または治療に使用するための、請求項1のオリゴヌクレオチド。
5. 慢性および／または悪化した慢性心不全に罹患しているヒト対象者の予防または治療に使用するための、請求項1のオリゴヌクレオチド。
6. 安定型心不全、例えば非虚血性および／または虚血性起源の安定型心不全に罹患しているヒト対象者の予防または治療に使用するための、請求項1のオリゴヌクレオチド。
7. あまり進行していない心不全状態または進行した心不全状態に罹患しているヒト対象者の予防または治療に使用するための請求項1のオリゴヌクレオチド。
8. NYHAステージIおよび/またはII、NYHAステージI、IIおよび/またはIII、またはNYHAステージIIIおよび/またはIVの心不全に罹患しているヒト対象者、あるいは心不全に罹患し移植ポンプ、例えば左心室補助装置を有するヒト対象者の予防または治療に使用するための、請求項1のオリゴヌクレオチド。
9. 収縮期心不全もしくは拡張期心不全、または収縮期心不全および/もしくは拡張期心不全に関連する状態から選択される左側心不全に罹患しているヒト対象者の予防または治療に使用するための、請求項1のオリゴヌクレオチド。
10. 右側心不全に罹患しているヒト対象者の予防または治療に使用するための、請求項1のオリゴヌクレオチド。
11. オリゴヌクレオチドが、1回の適用につき約0.1～100 mg/kg体重、特に1回の適用につき約3～10 mg/kg体重の用量でヒト対象者に投与される、請求項1～10のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
12. オリゴヌクレオチドが非経口的に、例えば注射または点滴により、特に静脈内または皮下注射により投与される、請求項1～11のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
13. オリゴヌクレオチドが局所的に投与される、請求項1～11のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
14. オリゴヌクレオチドが投与された対象者からの試料中のmiR-132の量および／または活性を判定することを含み、該判定が治療の経過中に1回または数回行われる、請求項1に定義されるオリゴヌクレオチドによる治療をモニタリングする方法。
15. 循環体液からの試料、例えば血液、血漿、血清またはそれらの分画から選択される試料中のmiR-132の量が定量的に判定される、請求項14の方法。
16. 判定の結果に基づいて、以下の工程のうちの少なくとも1つを実施する、請求項14～15のいずれか1項の方法：
    (i）治療される対象者が療法に対するレスポンダーであるか否かを判定する工程。
    (ii）投与するオリゴヌクレオチドの用量を調整する工程、および
    (iii) 投与するオリゴヌクレオチドの時間間隔を調整する工程。
17. 以下を含む請求項14～16のいずれか1項に記載の請求項1に定義されるオリゴヌクレオチドによる療法をモニタリングするためのキットの使用：
    ・miR-132をコードするDNAまたはそれに相補的なDNAに結合するプライマー、好ましくはプライマーhsa-miR-132、
    ・miR-39をコードするDNAまたはそれに相補的なDNAに結合するプライマー、好ましくはプライマーcel-miR 39、
    ・任意で陽性コントロールhsa-miR-132、および
    ・任意で陽性コントロールmiR-39。
18. オリゴヌクレオチドが、以下：
    －毎日投与
    －2日ごとの投与
    －3日ごとの投与、および
    －4日ごとの投与、
    から選択される投与計画でヒト対象者に投与され、オリゴヌクレオチドは非経口的に、特に静脈内または皮下注射により投与される、請求項1～13のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
19. オリゴヌクレオチドが体重依存的用量で投与される、請求項18に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
20. オリゴヌクレオチドが、1回の適用につき0.01mg/kg体重から50mg/kg体重の用量、0.02mg/kg体重から10mg/kg体重の用量または0.05mg/kg体重から5mg/kg体重の用量で投与される、請求項18に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
21. オリゴヌクレオチドが固定用量で投与される、請求項18に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
22. オリゴヌクレオチドが、1回の適用につき1mgから5000mgの固定用量で、2mgから1000mgの固定用量で、または5mgから500mgの固定用量で投与される、請求項21に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
23. オリゴヌクレオチドが、以下：
    －毎週投与
    －2週ごとの投与
    －3週ごとの投与
    －4週ごとまたは1ヶ月ごとの投与
    －6週ごとの投与
    －2ヶ月ごとの投与
    －3ヶ月ごとに投与
    －6ヶ月ごとの投与、および
    －年に1回の投与、
    から選択される投与計画で、非経口的に投与され、特に静脈内または皮下注射によって、ヒト対象者に投与される請求項1～13のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
24. オリゴヌクレオチドが体重依存的用量で投与される、請求項23に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
25. オリゴヌクレオチドは、1回の適用につき0.01mg/kg体重から50mg/kg体重の用量、0.05mg/kg体重から20mg/kg体重の用量、0.1mg/kg体重から10mg/kg体重または3mg/kg体重から10mg/kg体重の用量で投与される、請求項24に記載の使用のための請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
26. オリゴヌクレオチドが固定用量で投与される、請求項23に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
27. オリゴヌクレオチドが、1回の適用につき1mgから5000mgの固定用量、5mgから2000mgの固定用量、または10mgから1000mgの固定用量で投与される、請求項26に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
28. オリゴヌクレオチドが、開始用量、例えば1つまたは2つの開始用量で投与され、その後、開始用量とは異なる少なくとも1つの維持用量で投与される、請求項1～27のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
29. オリゴヌクレオチドが、特に以下：
    (i）オリゴヌクレオチドで治療される対象者の体液試料、例えば全血、血清もしくは血漿試料または尿中のmiR132の量を測定する工程、
    (ii）工程（i）におけるmiR132の測定量に応じて決定される用量および／または個々の用量間の時間間隔でオリゴヌクレオチドを投与し、特に、体液試料中のmiR132の量が所定の値を超えることが判明した場合に、オリゴヌクレオチドの新たな用量を投与する工程、
    を含む、需要に基づく投与計画によって投与される、請求項1～13のいずれか1項に記載の使用のための、請求項1のオリゴヌクレオチド
30. オリゴヌクレオチドの投与前、投与中および／または投与後に、マーカー、特に心臓マーカーおよび／または線維性マーカーの量および／または活性を判定することをさらに含む、請求項1～29のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
31. マーカーが、BNP（例えばNT-proBNP）、ANP、ミオシンヘビーチェンジアイソフォーム（例えばMYH7／6比）、FoxO3 SERCA2、コラーゲン沈着および／または線維性マーカー（コラーゲン1A1、コラーゲン1A2、コラーゲン3A1、プロコラーゲンI型C末端プロペプチド（PICP）、および／またはガレクチン3（Gal-3）、および／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）および／またはマトリックスメタロプロテアーゼ2（MMP-2）など）など）から選択される、請求項30に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
32. マーカーが、NT-proBNP、プロコラーゲンI型C末端プロペプチド（PICP）、および／またはガレクチン-3（Gal-3）、および／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ1（MMP-1）から選択される、請求項31に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
33. オリゴヌクレオチドの投与前、投与中、および／または投与後に、QRS、T波、左脚ブロック（LBBB）および／または右脚ブロック（RBBB）；および／またはR進行の測定から特に選ばれる治療経過中のECGパラメータを判定する工程をさらに含む、請求項1～32のいずれか1項に記載の使用のための請求項1のオリゴヌクレオチド。
    

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