JP7204226B2 - 複数エピトープ構築物 - Google Patents

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Description

本発明は、様々な抗原に由来する挿入された複数かつ異なるエピトープを提示する組換
え分子を含む複数エピトープ構築物、免疫原性およびワクチン組成物に関する。特に、本
発明は、アテローム動脈硬化症の発現に関与する抗原および病原体に対する免疫反応を引
き起こすそのような組成物に関し、本発明は、とりわけ、該疾患を治療し、かつ／または
予防する方法ならびに組換えタンパク質産物を含む。
アテローム動脈硬化症は、すべてが免疫系の関与を示す病変部における炎症性細胞、活
性化免疫細胞およびサイトカインの存在によって明らかなように、動脈壁の複雑な慢性炎
症性疾患としての認識が高まっている。樹状細胞（ＤＣｓ）は、先天および適応免疫の誘
導に極めて重要な役割を果たし得る。生得的反応の主要な構成要素は、単球の初期病変へ
の侵入とそれに続く単球のマクロファージおよびＤＣ様特性を有するＣＤ１１ｃ＋細胞へ
の分化を含む。動脈硬化プラークは、マクロファージがＴ細胞と相互作用して、炎症誘発
および抗炎症作用の両方をもたらし得る多様なサイトカインを産生する、マクロファージ
由来の泡沫細胞を含むことが公知である。アテローム動脈硬化症の発現の原因となる分子
機序は完全には理解されていないが、免疫系が動脈硬化プラークおよびその合併症の発現
に重要な役割を果たしていることは明らかである。その結果として、酸化低密度リポタン
パク質（ｏｘＬＤＬｓ）［９，１０］、β２－糖タンパク質Ｉ（β２ＧＰ１）、ホスファ
チジルコリン（ＰＣ）［１１，１２］、熱ショックタンパク質（ＨＳＰｓ）などのこれら
の分子に由来する修飾自己分子またはペプチドに基づくアテローム動脈硬化症の病因に関
連するいくつかの抗原刺激が報告された。これらの自己抗原に由来するエピトープを用い
ること以外にも、アテローム動脈硬化症に対するワクチン接種に関連したさらに多くの研
究が、他の抗原についての動脈硬化性病変形成に対する高い有効性を示している。しかし
、アテローム動脈硬化症に対する有効なワクチン接種戦略を開発するに際しての困難の１
つは、特異抗原の選択である。
潜在的抗原の発見および開発において、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、熱ショッ
クタンパク質（ＨＳＰ）６０およびクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）
（Ｃｐｎ）のタンパク質に由来するエピトープを含む「ＡＨＨＣ」と呼ばれる組換え構築
物によるＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの免疫
処置により、高脂肪飼料（ＨＦＤ）を給餌したマウスにおける動脈硬化性病変形成が低減
した（Lu et al 2012; Atherosclerosis 225:56-68）。さらに、補体成分５ａ受容体（Ｃ
５ａＲ）のＮ末端に由来するペプチドによる免疫処置により、Ｂ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒ
ｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスにおける初期動脈硬化性病変の発現が減少
したことが従来技術から公知である（Lu et al 2012; Arterioscler Thromb Vasc Biol 3
2:2358-2371）。さらに、前臨床試験において、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）－
１の阻害が、血小板凝集の有意な減少につながる、強い抗血栓効果を示したのに対して、
一次止血機能は、維持された（Chintala et al 2010 Arterioscler Thromb Vasc Biol 30
:2143-2149）。
ヒト補体系は、侵入病原体に対する先天宿主防御の重要な構成要素である。Ｃ５ａは、
補体成分Ｃ５から放出されたタンパク質断片であり、補体活性化の古典、副およびレクチ
ン経路中のＣ５α鎖上のＣ５ａ転化酵素の切断により生成する、ヒトにおいては７４アミ
ノ酸のペプチドである。Ｃ５ａは、標的細胞の原形質膜上のそのＧタンパク質共役Ｃ５ａ
受容体（Ｃ５ａＲ／ＣＤ８８）を介してその作用を媒介し、化学走性、呼吸バーストおよ
び顆粒球からの炎症誘発性メディエーターの放出をもたらす細胞内シグナル伝達を誘発す
る。Ｃ５ａは、好中球、単球および血小板を誘引し、活性化し、反応性酸化体、タンパク
質分解酵素、ケモカイン、サイトカインを含む炎症性メディエーター、ならびに補体因子
Ｃ３およびプロペルジンの放出を刺激する。好中球によるＣ３およびプロペルジンの分泌
、ならびにアポトーシス性および壊死性脱落膜組織の存在は、副経路の活性化を加速し、
Ｃ３の活性化および沈着を増強し、さらなるＣ５ａを発生させる白血球浸潤の部位におけ
る炎症誘発性増幅ループを生じさせ得る。ヒトＣ５ａＲは、１本鎖ポリペプチドを形成す
る３５０アミノ酸からなる内在性膜糖タンパク質である。Ｃ５ａ／Ｃ５ａＲ相互作用は、
ＩＬ－１２の産生を変化させ、ひいてはＴｈ－１細胞応答を調節すること、ならびにＩＬ
－６、ＩＬ－８およびＴＮＦ－アルファなどのサイトカインの産生を増強することが示さ
れた。Ｃ５ａＲは、好中球、単球、好酸球およびリンパ球を含む、白血球上に多量に発現
する。Ｃ５ａＲはまた、糸球体メサンギウムおよび近位尿細管上皮細胞を含む、広範囲の
実質細胞により発現される。実質Ｃ５ａＲ発現は、急性炎症の部位において増強されるこ
とが示された。
アテローム動脈硬化症の破裂または脆弱性プラークは、通常、大きな脂質コアの存在、
平滑筋細胞の数の減少、薄い線維性被膜ならびにマクロファージおよびＴ細胞などの炎症
性細胞の数の増加を特徴とする。マクロファージは、プラークの不安定化および破裂にお
いて主要な役割を果たすと考えられている。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ
ｓ）の産生により、これらの細胞は、コラーゲン、プロテオグリカンおよびエラスチンな
どの細胞外マトリックスの成分を分解する能力がある。いくつかの研究で、免疫組織化学
およびｉｎ ｓｉｔｕザイモグラフィーにより、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－３およびＭＭＰ－
９が動脈硬化プラークの肩領域に存在することが示され、またａｐｏＥ欠損マウスにおけ
る活性ＭＭＰ－９の過剰発現がプラークの崩壊を誘発することが示された。異なるドナー
から単離された単球由来のマクロファージにおける、および動脈硬化プラークから単離さ
れたヒトマクロファージにおけるＭＭＰ－１およびＭＭＰ－９ ｍＲＮＡの発現に対する
Ｃ５ａの刺激作用も報告された。
アテローム動脈硬化症の病因におけるアナフィラトキシンＣ５ａの関与を示す臨床およ
び実験データが蓄積しつつある。進行アテローム動脈硬化症を有する患者における心血管
事象に関するＣ５ａ血漿レベルの予測値が存在することが最近報告された。Ｃ５ａの受容
体は、動脈硬化性病変において検出された。さらに、Ｃ５ａは、内皮細胞による接着分子
の発現を誘導する。Ｃ５ａは、マクロファージを活性化し、それらに炎症メディエーター
ＴＮＦ－アルファ、インターロイキン１を放出させる。ＴＮＦ－アルファは、他方で、こ
れらの細胞におけるＭＭＰの発現を直接誘導する。
潜在的抗原の発見および開発において、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、熱ショッ
クタンパク質（ＨＳＰ）６０およびクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）
（Ｃｐｎ）のタンパク質に由来するエピトープを含む「ＡＨＨＣ」と呼ばれる組換え構築
物によるＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの免疫
処置により、高脂肪飼料（ＨＦＤ）を給餌したマウスにおける動脈硬化性病変形成が低減
した（Lu et al 2012; Atherosclerosis 225:56-68）。さらに、補体成分５ａ受容体（Ｃ
５ａＲ）のＮ末端に由来するペプチドによる免疫処置により、Ｂ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒ
ｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスにおける初期動脈硬化性病変の発現が減少
したことが従来技術から公知である（Lu et al 2012; Arterioscler Thromb Vasc Biol 3
2:2358-2371）。さらに、前臨床試験において、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）－
１の阻害が、血小板凝集の有意な減少につながる、強い抗血栓効果を示したのに対して、
一次止血機能は、維持された（Chintala et al 2010 Arterioscler Thromb Vasc Biol 30
:2143-2149）。
動脈硬化性血管疾患の治療の改善の必要がある。
開示の概要
本発明の第１の態様によれば、
ｉ） 足場部分、およびそれに組み込まれているものと、
ｉｉ） 第１の経路を経て抗動脈硬化性血管疾患反応を引き起こすことができる第１の種
のエピトープと、
ｉｉｉ） 前記第１の経路と独立した第２の経路を経て抗動脈硬化性血管疾患反応を引き
起こすことができる第２の種のエピトープと
を含む組換え構築物を提供する。
第１および第２の経路が互いに「独立」であることへの本明細書における言及は、第１
または第２の経路を経るアテローム動脈硬化症の形成が異なる作用機序または原因となる
経路によることを示すことを目的とする。
好ましくは、足場部分は、天然デンドロアスピンであり、配列番号１（図１４Ａ）から
選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、アテローム動脈硬化症の形成への第１の経路は、Ｃ５相互作用を経由し、
より好ましくはＣ５ａまたはＣ５Ａｒ経路による。したがって、Ｃ５エピトープは、Ｃ５
ａエピトープまたはＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）エピトープである。Ｃ５エピトープは、５
～４０、例えば、８～４０アミノ酸残基または例えば、８～３５アミノ酸残基を含み得る
。Ｃ５ａエピトープは、Ｃ５ａ配列（配列番号２）（図１４Ｂ）から選択される５～４０
個の連続したアミノ酸残基、例えば、８～４０アミノ酸残基、例えば、８～３５アミノ酸
残基を含み得る。一実施形態では、Ｃ５ａエピトープは、Ｃ５ａ配列から選択される８～
２０、例えば、８～１５個の連続したアミノ酸残基を含む。
好ましくは、Ｃ５ａエピトープは、ＥＱＲＡＡＲＩＳＬＧＰＲ（配列番号３）、ＲＡＡ
ＲＩＳＬＧＰＲＣＩＫＡＦＴＥ（配列番号４）およびＣＶＮＮＤＥＴＣＥＱ（配列番号５
）を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチドまたは抗
原活性を有するその機能性断片である。例えば、該エピトープは、Ｃ５ａ配列から選択さ
れ、配列番号２、３または４を含む５～４０個の連続したアミノ酸残基の配列を含み得る
。
好ましくは、Ｃ５ａＲエピトープは、Ｃ５ａＲ配列（配列番号６；図１４Ｃ）から選択
される５～５０個の連続したアミノ酸残基、例えば、１０～４０アミノ酸残基または例え
ば、１４～３５アミノ酸残基を含む。一実施形態では、Ｃ５ａＲエピトープは、１～３１
個の連続したアミノ酸残基またはその機能性断片を含む。
好ましくは、Ｃ５ａＲエピトープは、Ｃ５ａＲアミノ酸配列のＮ末端（遊離アミノ基を
含む）またはＣ末端（遊離カルボキシル基を含む）に存在し得る。あるいはより好ましく
は、Ｃ５ａＲエピトープは、ＭＮＳＦＮＹＴＴＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬＤ（配列番号７
）、ＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴＳＮ（配列番号８）およびＭＮＳＦＮＹＴＴＰＤＹＧＨＹＤ
ＤＫＤＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴＳＮ（配列番号９）を含む群から選択されるアミノ酸配列
を含む、もしくはからなるポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である。
機能性断片への本明細書における言及は、抗原決定基を備えかつそれとしての機能を果
たし、抗原活性を有し、ひいてはエピトープとして機能するのに十分なアミノ酸を保持し
ているエピトープアミノ酸配列の一部を含む。機能性断片はまた、足場部分に組み込まれ
、提示される場合に、例えばかつ限定なしに、動脈硬化性病変によって占有される面積の
減少により判断することができるアテローム動脈硬化症に対する免疫反応を引き起こすエ
ピトープアミノ酸配列の一部を含む。
第１および第２の種のエピトープへの言及は、それらが、最終的にアテローム動脈硬化
症および関連疾患をもたらす異なる経路にそれぞれ別個かつ独立に関連することを意味す
ることを目的とする。
好ましくは、組換え構築物は、複数の第１の種のエピトープを含む。
好ましくは、第２の種のエピトープは、ヒトエピトープである。第２の種のエピトープ
は、５～４０、例えば、９～４０アミノ酸残基、例えば、９～２０アミノ酸残基を含み得
る。好ましくは、抗動脈硬化性血管疾患反応に関連する第２の種のエピトープは、アポリ
ポタンパク質（Ａｐｏ）エピトープ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）エピトープ、肺炎
クラミジア（chlamydia pneumonia）エピトープ、プロテアーゼ活性化受容体１エピトー
プ（ＰＡＲ－１）およびペリリピンエピトープを含むまたはからなる群から選択される。
より好ましくは、第２のエピトープは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）エピトープ、
肺炎クラミジアエピトープ、組織因子またはＰＡＲ－１エピトープである。
好ましくは、前記熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、ＨＳＰ６０またはＨＳＰ６５で
ある。より好ましくは、前記ＨＳＰ６０は、ヒトＨＳＰ６０またはマイコバクテリウム・
ボビス（Mycobacterium bovis）ＨＳＰである。より好ましくは、ＨＳＰ６０に対する反
応を引き起こすことができる前記エピトープは、ペプチド１（ＡＡ）１５３～１６０：Ａ
ＥＬＫＫＱＳＫ；（配列番号１０）、ペプチド１（ＡＡ）１５３～１６３：ＡＥＬＫＫＱ
ＳＫＰＶＴ；（配列番号１１）、ペプチド１（ＡＡ）３０３～３１２：ＰＧＦＧＤＮＲＫ
ＮＱ（配列番号１２）、ペプチド２：ＡＡ２７７～２８６ ＰＧＦＧＤＮＲＫＮＱ（配列
番号１３）、ペプチド（ＡＡ）５１６～５２８ ＫＧＩＩＤＰＴＫＶＶＲＴＡ（配列番号
１４）およびマイコバクテリウム（ＡＡ）２５３～２６８：ＥＧＥＡＬＳＴＬＶＶＮＫＩ
ＲＧＴ（配列番号１５）を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、もしくはからなる
ポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である。
好ましくは、前記肺炎クラミジアは、Ｃｐｎ１またはＣｐｎ２である。より好ましくは
、Ｃｐｎに対する反応を引き起こすことができる前記エピトープは、主要外膜タンパク質
（ＭＯＭＰ）（アミノ酸配列（ＡＡ）６７～７４：ＧＤＹＶＦＤＲＩ（配列番号１６））
およびＣｐｎの推定外膜タンパク質（Ｐｏｍｐ）５（アミノ酸配列（ＡＡ）２８３～２９
１：ＱＡＶＡＮＧＧＡＩ（配列番号１７））を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む
、もしくはからなるポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である。
好ましくは、組織因子エピトープは、（ＡＡ５６～６７）であり、配列ＥＷＥＰＫＰＶ
ＮＱＶＹＴ（配列番号１９）を含む。
好ましくは、ＰＡＲ－１エピトープは、（ＡＡ４２～５５）であり、アミノ酸配列ＳＦ
ＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９）を含む。
好ましくは、本発明の組換え構築物は、複数の第２のエピトープを含み、例えば、２、
３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の同じまたは異なる第２のエピトープを含み得
る。例えば、特に好ましい実施形態では、組換え構築物は、Ｃ５ａＲエピトープ、Ｃｐｎ
エピトープおよび２つの異なるＨＳＰエピトープを含み得る。または組換え構築物は、Ｃ
５ａＲエピトープ、Ｃｐｎエピトープ、ＨＳＰエピトープおよびＰＡＲ－１エピトープを
含み得る。
好ましくは、第１および／または第２のエピトープのアミノ酸配列は、デンドロアスピ
ン足場の（ａ）ループＩおよび／またはループＩＩ；（ｂ）ループＩおよび／またはルー
プＩＩＩ；（ｃ）ループＩＩおよび／またはループＩＩＩ；あるいは（ｄ）ループＩ、ル
ープＩＩおよびループＩＩＩに組み込まれる。ループＩは、アミノ酸残基４～１６を含み
、ループＩＩは、残基２３～３６を含み、ループＩＩＩは、残基４０～５０を含む。しか
し、組み込まれるさらなるアミノ酸は、非ループ領域の残基が増加するまたはさらなるア
ミノ酸配列もしくは挿入される配列の残基を置換するように、ループ外領域、すなわち、
残基１～３、１７～２２および３７～３９に延在し得るまたは置換し得る。さらなるアミ
ノ酸残基は、好ましくはループＩまたはループＩＩに組み込まれる。このように、ＲＧＤ
を含むループＩＩＩは、不変であり、したがって、デンドロアスピンのインテグリン結合
機能は、保持される。挿入されるさらなる配列の好ましい位置は、アミノ酸残基：４～１
６、１８～２１、２３～３６または５２～５９の間のデンドロアスピン足場における部位
である。各挿入されたさらなるアミノ酸配列またはさらなるアミノ酸配列の一部は、好ま
しくは３～４０アミノ酸残基、より好ましくは３～１６、さらにより好ましくは３～１４
アミノ酸残基長の範囲におけるアミノ酸配列である。挿入されるさらなるアミノ酸配列の
始まりは、デンドロアスピン足場のアミノ酸残基１～５７のいずれか１つであり得る。挿
入されるさらなるアミノ酸配列の終わりは、デンドロアスピン足場のアミノ酸残基３～５
９のいずれか１つであり得る。
２つまたはそれ超のさらなるアミノ酸配列がデンドロアスピン足場に挿入される場合、
これらの間の直線距離は、好ましくは１～３５アミノ酸、より好ましくは１～１４アミノ
酸の範囲にある。２つまたはそれ超を超えるさらなるアミノ酸配列が挿入される場合、好
ましくは各さらなるアミノ酸配列を分離する少なくとも１つの天然デンドロアスピンアミ
ノ酸残基が存在する。ＲＧＤを含むループは、１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、欠
失または置換により修飾することができ、好ましくは、デンドロアスピンのループＩＩＩ
内の最大限８個または最小限１個のアミノ酸を修飾することができる。ループＩおよび／
またはループＩＩは、１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換により修飾
することができる。デンドロアスピン足場における１つまたは複数の部位における挿入の
ために１４～３６の範囲の数の残基が好ましいが、適切な任意の数のアミノ酸をデンドロ
アスピン足場に挿入して、所望の二または多機能活性を得ることができる。
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態では、第１または第２のエピトープは、デン
ドロアスピン足場タンパク質のＣおよび／またはＮ末端のいずれかもしくは両方に結合さ
せることができる。
本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様の構築物に組み込まれたタンパク質を
コードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様によるタンパク質および抗原性疎水性
複合体を含む抗原性組成物を提供する。
本発明のさらなる態様では、注射用または経口製剤として製剤化された、本発明の免疫
原性組成物を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、適切なアジュバン
ト、賦形剤、希釈剤および／または担体をさらに含む。
本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様のタンパク質、本発明のベクターまた
は本発明の免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
本発明のさらなる態様では、医薬として用いる本発明の第１の態様のタンパク質または
本発明のベクターを提供する。
本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様による組換えタンパク質；本発明のベ
クター；本発明の免疫原性組成物；および本発明の医薬組成物から選択される製剤を投与
することを含む、哺乳動物における抗アテローム動脈硬化症反応を引き起こす方法を提供
する。
本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様による組換えタンパク質；本発明のベ
クター；本発明の免疫原性組成物；および本発明の医薬組成物から選択される製剤を個体
に投与することを含む、アテローム動脈硬化症を治療する、予防するまたは低減する方法
を提供する。製剤は、治療有効量または治療許容量で投与することができる。
本発明のさらなる態様では、早期アテローム動脈硬化症を有する個体またはアテローム
動脈硬化症を発現するリスクがあると特定された個体を治療する方法であって、本発明の
第１の態様による組換えタンパク質；本発明のベクター；本発明の免疫原性組成物；およ
び本発明の医薬組成物から選択される製剤を個体に投与することを含む方法を提供する。
製剤は、治療有効量または治療許容量で投与することができる。
本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様によるタンパク質または本発明のベク
ターを含むワクチンを提供する。
本発明のさらなる態様では、アテローム動脈硬化症形成に関連する少なくとも２つの独
立した経路に関連するエピトープに対する免疫反応を引き起こす方法であって、
（ｉ） 本明細書で前述した少なくとも１つの第１および少なくとも１つの第２のエピ
トープを含むデンドロアスピン足場タンパク質を構築し、発現させることと、
（ｉｉ） 真核細胞を前記デンドロアスピン足場タンパク質とともにインキュベートす
ることと、
（ｉｉｉ） 前記真核細胞を用いて、ミクロソームを調製することと、
（ｉｖ） 前記ミクロソームおよびデンドロアスピン足場タンパク質を１つまたは複数
の薬学的に許容される成分と混合して、経口または注射投与可能製剤を製造することと、
（ｖ） 前記製剤を哺乳動物またはヒトに投与することと
を含む方法を提供する。
データから、ＡｐｏＢ／ＰＡＲ－１／ＨＳＰ／Ｃｐｎによる免疫処置が硬化性病変にお
けるＣ５ａ発現に影響を及ぼさなかったことが示され、Ｃ５／Ｃ５ａＲが病変形成におけ
る独立した経路であることが示唆される。本発明は、早期アテローム動脈硬化症の予防お
よび低減のための改善された治療法を提供するために、独立したＣ５およびＡｐｏＢ／Ｐ
ＡＲ－１／ＨＳＰ／Ｃｐｎ関連経路の両方を有利には同時に標的とするための方法および
製剤を提供する。
本発明の第１の態様に帰せられる好ましい特徴は、変更すべきところは変更して、本発
明のそれぞれおよびすべての他の態様に適用できることは、十分に理解される。
本発明の実施形態は、添付図面を参照して下文でさらに説明する。
（１Ａ）デンドロアスピン構造の主鎖の略図を示す図である。(１Ｂ)構築物およびデンドロアスピン足場のアライメントの略図を示す図である。 最初の免疫処置の後のそれぞれ２週目および１２週目におけるＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの血清ならびに対照（ＧＳＴ－Ｄｅｎ（ＧＳＴ－ｄｅｎと呼ぶ）免疫処置マウス）における構築タンパク質誘導ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体のレベルを示す図である。Ｃｐｎペプチド（Ｃ）、ｈＨＳＰ６０１５３－１６３（Ｈ）、ｈＨＳＰ６０３０３－３１２（Ｈ）、Ｃ５ａＲ－ペプチド（Ｒ）、ＡｐｏＢペプチド（Ａ）、ＰＡＲ－１（Ｐ）被覆ＥＬＩＳＡプレート上のＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣ構築物免疫処置マウスの血漿試料から得られた平均光学濃度（ＯＤｓ）およびＳＥＭを示す図である。（２Ａ）希釈比：１：１００のＩｇＧを示す図である。（２Ｂ）希釈比：１：６２５０のＩｇＧ１を示す図である。（２Ｃ）希釈比：１：５０のＩｇＧ２ｃを示す図である。（２Ｄ）ヒトＡｐｏＢペプチド誘導抗血清とＣｐｎペプチドとの間の交差反応を示す図である。 （２Ｅ）ヒトＡｐｏＢペプチドおよびｈＨＳＰ６０３０３－３１２ペプチド誘導抗血清とそれらの抗原との間の交差反応を示す図である。（２Ｆ）ＡｐｏＢペプチド誘導抗血清とＰＡＲ－１ペプチドまたはＣ５ａＲペプチドのいずれかの抗原との間の交差反応を示す図である。（２Ｇ）Ｃ５ａＲペプチド誘導抗血清とＡｐｏＢペプチドまたはＰＡＲ－１ペプチドのいずれかの抗原との間の交差反応を示す図である。交差反応に使用した抗血清は８週で採取した。 対照（ＧＳＴ－ｄｅｎ）と対比した構築物による免疫処置後の高脂肪飼料を給餌したＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの大動脈における病変面積の検出および定量を示す図である。（３Ａ）エラスチン／ファンギーソン染色により分析したアテローム動脈硬化大動脈に認められた病変の顕微鏡写真である。（３Ｂ）対照（ＧＳＴ－ｄｅｎ）と比較した構築物により免疫処置したマウスの大動脈洞における病変面積の平均値を示す散布図である。（Ｎ＝６～９匹のマウス）。エラーバー＝ＳＥＭ（３Ｃ）大動脈洞における病変サイズの減少の百分率（対照［ＧＳＴ－ｄｅｎ］群の減少を０とした）を示す図である。（３Ｄ）個々のマウスにおけるアテローム動脈硬化大動脈におけるコラーゲン（偏光下でのシリウスレッド着色）の代表的な顕微鏡写真および定量的解析を示す図である。（３Ｅ）Ｂ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウス（Ｎ＝７匹のマウス）の大動脈における病変部におけるコラーゲン含量の定量を示す図である。ＮＳ：有意でない。 （３Ｆ）マウスの代表的なオイルレッドＯ染色正面下行大動脈を示す写真である。（３Ｇ）異なる実験群の個々のマウス（Ｎ＝６匹のマウス）における下行大動脈の総面積に対する病変占有面積の百分率を示す図である。平均病変サイズおよび実験群間の病変サイズの差を示す。（３Ｈ）下行大動脈における病変サイズの減少の百分率（対照［ＧＳＴ－ｄｅｎ］群の減少を０とした）を示す図である。 （４Ａ）対照（ＧＳＴ－ｄｅｎ）、ＧＳＴおよびミョウバンと対比した構築物による免疫処置後９週目における高脂肪飼料給餌のＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１Ｈ ｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの大動脈における病変面積の検出および定量を示す図であり、エラスチン／ファンギーソン染色により分析したアテローム動脈硬化大動脈に認められた病変の顕微鏡写真である（Ｎ＝６～８匹のマウス）。（４Ｂ）マウスの大動脈洞における病変面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６～８匹のマウス）。 ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣ構築物による免疫処置後の高脂肪飼料給餌のＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの病変における炎症関連細胞の評価を示す図である。（５Ａ）ＣＤ６８（緑）およびＣＤ１１ｃ（赤）マーカーのＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（５Ｂ）総病変面積に対する病変における抗ＣＤ６８染色面積を示す散布図である。データは、６匹のマウスの平均値として示す。（５Ｃ）総病変面積に対する病変における抗ＣＤ１１ｃ染色面積を示す散布図である。データは、６匹のマウスの平均値として示す。（５Ｄ）ＣＤ６８＋およびＣＤ１１ｃ＋面積（図３Ｂおよび３Ｃから得られた）の共局在化を示すグラフである。（５Ｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（緑）およびＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞（赤）のＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（５Ｆ）病変における抗ＣＤ４＋染色面積に対する抗Ｆｏｘｐ３染色面積を示す散布図である（Ｎ＝６）。 （５Ｇ）フローサイトメトリーを用いて評価した高脂肪飼料を給餌した構築物免疫処置マウスのリンパ節におけるＣＤ４＋Ｔ細胞によるＦｏｘｐ３発現の代表的な解析を示す図である。（５Ｈ）フローサイトメトリーにより解析したＣＤ４＋脾臓細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の百分率を示すグラフである。データは、３回の解析の平均値±ＳＥＭとして表す。群間の差を示す。 ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣ構築物による免疫処置後の高脂肪飼料給餌のＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／ＪマウスにおけるＩＬ－１０産生Ｔ細胞、病変におけるＴＮＦ－α発現およびサイトカインレベルの評価を示す図である。（６Ａ）ＩＬ－１０（赤）およびＣＤ４（緑）の二重ＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（６Ｂ）ＣＤ４＋面積と共局在化したＩＬ－１０陽性面積の平均値（％）を示す散布図である（Ｎ＝６）。（６Ｃ）病変のＴＮＦ－α（緑）のＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（６Ｄ）総病変面積に対する病変における抗ＴＮＦ－α染色面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６）。 （６Ｅ-Ｈ）血漿中で測定したサイトカインレベルを示すグラフである。 （６Ｉ-Ｌ）ＣｏｎＡにより刺激した脾細胞の上清中で測定したサイトカインレベルを示すグラフである。 （６Ｍ）フローサイトメトリーにより評価した高脂肪飼料を給餌した構築物免疫処置マウスの脾細胞におけるＣＤ４＋ＩＬ－４＋Ｔ細胞の代表的な解析を示す図である。（６Ｎ）ＩＬ－４＋発現ＣＤ４＋脾細胞の百分率を示すグラフである。データは、３回の解析の平均値±ＳＥＭとして表す。群間の差を示す。 （６Ｏ）フローサイトメトリーにより評価した高脂肪飼料を給餌した構築物免疫処置マウスの脾細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－１７Ａ発現の代表的な解析を示す図である。（６Ｐ）脾細胞におけるＩＬ－１７Ａ発現のレベルを示すグラフである。データは、３回の解析の平均値±ＳＥＭとして表す。群間の差を示す。 （６Ｑ）フローサイトメトリーにより評価した高脂肪飼料を給餌した構築物免疫処置マウスの脾細胞におけるＣＤ４＋ＩＬ－２＋Ｔ細胞の代表的な解析を示す図である。（６Ｒ）脾細胞におけるＩＬ－２＋発現ＣＤ４＋のレベルを示すグラフである。データは、３回の解析の平均値±ＳＥＭとして表す。群間の差を示す。 抗原により刺激された免疫処置マウスの脾臓からのサイトカイン（ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－１０）の測定を示すグラフである。脾細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養し、１μｇ／ｍｌ抗原（それぞれＧＳＴ－ｄｅｎ、ＧＳＴ－ＡＨＨＣ、ＧＳＴ－ＲＨＨＣ、ＧＳＴ－ＲＰＨＣ、ＡｐｏＢ１００ペプチド、Ｃ５ａＲペプチド、ＰＡＲ－１ペプチド）により４８時間誘導した。次いで培養細胞の上清中のＩＬ１０およびＩＦＮ－γをＤｕｏＳｅｔマウスＩＬ－１０キットおよびマウスＩＦＮ－γ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を用いて製造業者のプロトコールに従って測定した。 抗原免疫処置マウスにおける抗原特異的調節機能の検討を示す図である。ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣを抗原として用いた場合の対照（ＧＳＴ－ｄｅｎ免疫処置）および構築物免疫処置マウスの脾臓から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞によるＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞増殖の阻害を示す図である。（８Ａ）フローサイトメトリーによるＴｒｅｇ細胞の存在下でのＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ細胞の増殖の定量的解析を示す図である。（８Ｂ）免疫処置マウスから単離したエフェクター細胞単独の増殖を各群の最も左のバーに示す。異なる比率でＴエフェクター細胞にＴｒｅｇ細胞を加えた場合も示す。データは、３回の解析の平均値±ＳＥＭとして表す。 病変部位における平滑筋アルファアクチン、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ－１）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）の発現の評価を示す図である。（９Ａ）平滑筋アルファアクチン（赤）、血管細胞接着分子ＶＣＡＭ－１（緑）のＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（９Ｂ）抗ＳＭＣ染色面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６）。（９Ｃ）抗ＶＣＡＭ－１染色面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６）。（９Ｄ）ＭＭＰ９（緑）のＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（９Ｅ）抗ＭＭＰ９染色面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６）。 （１０Ａ）病変における抗ＡｐｏＢ抗体染色領域（赤）を示した大動脈基部の免疫組織化学的染色を示す代表的顕微鏡写真である。スケールバー：１５０μｍ（非拡大）および２５μｍ（拡大）。（１０Ｂ）病変におけるＡｐｏＢ発現の定量的解析を示すグラフである。Ｎ＝６匹のマウス。ＮＳ：有意でない。（１０Ｃ）病変における抗ＨＳＰ抗体染色領域（赤）を示した大動脈基部の免疫組織化学的染色を示す代表的顕微鏡写真である。スケールバー：１５０μｍ（非拡大）および２５μｍ（拡大）。（１０Ｄ）病変におけるＨＳｐ６０発現の定量的解析を示すグラフである。Ｎ＝６匹のマウス。ＮＳ：有意でない。 マクロファージへの単球の分化の評価を示す図である。（１１Ａ）フローサイトメトリーによるＣＤ２０６発現の解析により評価した組換え構築物（１μｇ／ｍｌ）により刺激されたＰＢＭＣｓの分化および各構築物誘導抗体の存在下での分化の阻害を示す図である。（１１Ｂ）フローサイトメトリーによるＣＤ２０６発現の解析により評価した組換え構築物（１μｇ／ｍｌ）により刺激されたＰＢＭＣｓの分化および各構築物誘導抗体の存在下での分化の阻害を示すグラフである。 （１１Ｃ）各構築物および他の構築物誘導抗体による分化の阻害を示す図である（１１Ｄ）各構築物および他の構築物誘導抗体による分化の阻害を示すグラフである。 （１１Ｅ）ＣＤ２０６発現により解析した単球分化の刺激物（１μｇ／ｍｌ）としての個々のペプチドを示す図である。 （１１Ｆ）ＣＤ２０６発現により解析した単球分化の刺激物（１μｇ／ｍｌ）としての個々のペプチドを示すグラフである。データは、３回の解析の平均値として表す。 病変部位におけるＴＬＲ４の含量およびＭｙＤ８８含量の評価を示す図である。（１２Ａ）ＴＬＲ４のＩＨＣ染色（赤）を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（１２Ｂ）抗ＴＬＲ４染色面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６）。（１２Ｃ）ＭｙＤ８８のＩＨＣ染色（赤）を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１００μｍおよび拡大されたものについて１２．５μｍ）。（１２Ｄ）抗ＭｙＤ８８染色面積の平均値を示す散布図である（Ｎ＝６）。 （１３Ａ）病変（黄）における抗ＴＬＲ４抗体染色面積（赤）と重複した抗ＣＤ１１ｃ抗体染色面積（緑）を示した大動脈基部の免疫組織化学的染色を示す代表的顕微鏡写真である。スケールバー：１４１μｍ（非拡大）および２６μｍ（拡大）。（１３Ｂ）病変における占有されたＣＤ１１ｃおよびＴＬＲ４を合わせた面積（％）の測定を示すグラフである。 （表１）ペプチドによる免疫処置の効果の統計解析を示す表である。 （１４Ａ）天然デンドロアスピンアミノ酸配列の配列番号１を示す図である。（１４Ｂ）Ｃ５ａの配列番号２のアミノ酸配列を示す図である。（１４Ｃ）Ｃ５Ａｒの配列番号６のアミノ酸配列を示す図である。
詳細な説明
データから、アテローム動脈硬化症へのＣ５ａ／Ｃ５ａＲ経路が、免疫処置Ａｐｏｂｔ
ｍ２ＳｇｙＬＤｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊマウスの研究に基づいてＰＡＲ－１／ＨＳＰ／Ｃｐ
ｎ経路と独立であることがわかる。本発明は、デンドロアスピン足場内の複合エピトープ
を同時に用いる両経路を標的とする製剤およびワクチンを提供する。
本発明者らの以前の研究で、構築物ＡＨＨＣ［ＡｐｏＢ１００６８８－７０７＋ｈＨＳ
Ｐ６０３０３－３１２＋ｈＨＳＰ６０１５３－１６３＋Ｃｐｎ由来ペプチド（Ｃ）］が動
脈硬化性病変を著しく低減したことを示した（Lu et al. Atherosclerosis 2012, 225:56
-68）。本発明は、マウスにおけるＡが「Ｒ」（Ｃ５ａＲ１－３１）により置換されたＲ
ＨＨＣおよびさらなる「Ｈ」（ｈＨＳＰ６０３０３－３１２）の「Ｐ」（プロテアーゼ活
性化受容体１４２－５５）への転換を有するＲＰＨＣと呼ぶ逐次的エピトープ置換による
この構築物の調節ならびに誘導体を提供する。代替実施形態は、抗原性エピトープがＡと
呼ぶＡｐｏＢ（ＡＡ６８８～７０７）、Ｈｈと呼ぶヒトＨＳＰ６０（ＡＡ３０３～３１２
）（配列番号１２）、Ｈｍと呼ぶマイコバクテリウム（ＡＡ２５３～２６８）（配列番号
１５）およびＲと呼ぶ補体成分５ａ受容体（ＡＡ１～３１）（配列番号９）に由来する、
構築物ＡＨｈＨｍＲである。これらによるＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏ
ｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの免疫処置により、各エピトープに対する高レベルの抗体の産
生が誘発された（低い抗体反応を誘導したｈＨＳＰ６０１５３－１６３およびＰは別とし
て）。組織学的分析により、ＲＰＨＣまたはＲＨＨＣにより免疫処置したマウスがＡＨＨ
Ｃにより処置したマウスと比較して動脈硬化性病変のサイズの有意な低下を示したことが
示された（６９．５±１．１％対５５．７±３．４％、Ｐ＝０．０００６または６５．６
±１．３％対５５．７±３．４％、Ｐ＝０．０４５）。大動脈洞および下行大動脈におけ
るプラークサイズの減少は、対照と比較したとき細胞免疫反応の変化と相関していた。本
発明者らは、これらの新たな組換え構築物は、動脈硬化性病変の形成の有意な減少に有利
である新たな抗原性および構造の特徴を備えている可能性があると結論する。本発明は、
抗アテローム動脈硬化剤を開発するための新規戦略を提供する。
動脈硬化性病変の低減に対するＣ５ａＲおよびＰＡＲ－１に由来するペプチドの効果に
基づいて、本発明者らは、動脈硬化性病変の低減に対する複数エピトープ構築物の効果は
、ワクチン接種にＣ５ａＲおよびＰＡＲ－１を含めることによって好ましいプラークの表
現型および病変の低減の増大を目指して調節することができるという仮説を立てた。本研
究では、本発明者らは、動脈硬化性病変の低減に対する逐次的置換：ＡＨＨＣ→ＲＨＨＣ
（ＲはＣ５ａＲに由来するエピトープを意味する）とＲＨＨＣ→ＲＰＨＣ（ＰはＰＡＲ－
１に由来するエピトープを意味する）によるＣ５ａＲおよびＰＡＲ－１を含む構築物の効
果を検討した。誘発された免疫反応は、速度がＲＰＨＣ≧ＲＨＨＣ≧ＡＨＨＣの順序の、
大動脈洞および下行大動脈の両方におけるアテローム病変部のサイズの有意な低下として
検出される、抗動脈硬化性作用を伴う。
天然デンドロアスピンは、５９アミノ酸のペプチドであり、デンドロアスピン足場は、
修飾に適する。さらなる機能性アミノ酸配列、例えば、凝固カスケードにおける因子のア
ゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の活性部分もしくはモチーフを組み込むためにデ
ンドロアスピン（ＲＧＤモチーフを含む）を修飾する場合、得られる分子は、抗凝固剤と
してとりわけ有用であり、既存の抗凝固剤に関連する欠点がない（国際公開第０１／５７
２１０号パンフレット参照）。そのようなハイブリッドポリペプチドは、ＲＧＤモチーフ
を含み、デンドロアスピン活性を付与する第１のアミノ酸配列およびデンドロアスピン活
性以外の活性を付与するさらなるアミノ酸配列を含み得る。このようにハイブリッドデン
ドロアスピンベースの分子は、多機能性となり得る。
Ｃ５ａは、補体成分Ｃ５から放出されるタンパク質断片である。ヒトにおけるこの、７
４アミノ酸のペプチドは、補体活性化の古典、副およびレクチン経路中のＣ５α鎖上のＣ
５ａ転化酵素の切断により生成する。
Ｃ５ａ受容体は、成分５ａ受容体（Ｃ５ＡＲ１）またはＣＤ８８（分化抗原群８８）と
しても公知であり、ＣａのＧタンパク質共役受容体である。ヒトＣ５ａＲは、１本鎖ポリ
ペプチドを形成する３５０アミノ酸からなる内在性膜糖タンパク質である。Ｃ５ａＲは、
可溶性受容体として放出されず、循環しない。Ｃ５ａＲは、Ｕ９３７およびＨＬ－６０な
どの、分化骨髄細胞上に発現する。Ｃ５ａＲは、肝実質細胞、肺血管平滑筋、肺および臍
血管内皮細胞、気管支および肺胞上皮細胞、ＨｅｐＧ２細胞、肝がん細胞株、メサンギウ
ム細胞、星状細胞および小グリア細胞上に、培養ヒト胎児星状細胞および星状細胞株上に
発現する。
本明細書の説明およびクレームを通して、「含む（comprise）」および「含む（contai
n）」という語ならびにそれらの変形形態は、「含むが、それらに限定されない」ことを
意味し、それらは、他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図
するものでない（かつ除外しない）。本明細書の説明およびクレームを通して、単数形は
、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、複数形の語を含む。特に、不定冠詞を用い
る場合、本明細書は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、複数状態ならびに単数
状態を企図するものと理解すべきである。
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と関連して述べた特徴、整数、特性、成分
、化学部分または基は、それと不適合性でない限り、本明細書で述べた他の態様、実施形
態または実施例に適用されると理解すべきである。本明細書（添付のクレーム、要約書お
よび図面）で開示した特徴のすべて、および／またはそのように開示した方法（method）
もしくは方法（process）のステップのすべては、そのような特徴および／またはステッ
プの少なくとも一部が相互排他的である組合せを除いて、あらゆる組合せで組み合わせる
ことができる。本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（
添付のクレーム、要約書および図面）で開示した特徴の、新規のもの、もしくは新規の組
合せに、またはそのように開示した方法もしくは方法のステップの、新規のもの、もしく
は新規の組合せにおよぶ。
読者の注意は、本出願と関連する本明細書と同時または前に提出され、本明細書に関す
る公衆の便覧に公開されるすべての論文および文書に向けられ、すべてのそのような論文
および文書の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
組換えグルタチオンＳトランスフェラーゼ構築物の発現および精製
グルタチオンＳトランスフェラーゼ－デンドロアスピン（ＧＳＴタグ付きｄｅｎ、ここ
で対照と呼ぶ、図１Ａ）ならびにＧＳＴ－組換え構築物ＡＨＨＣ［ＡｐｏＢ１００ペプチ
ド、アミノ酸（ａａ）６８８～７０７（シグナルペプチドを含む番号付け）、ヒト熱ショ
ックタンパク質（ｈＨＳＰ）６０ペプチド、それぞれａａ３０３～３１２およびａａ１５
３～１６３；ならびにクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）（Ｃｐｎ）由
来エピトープ（「Ｃ」は、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）に由来するａａ６６～７３お
よびＣｐｎの外膜５に由来するａａ２８３～２９１の組合せを意味する）］は、以前に記
載し、構築物ＲＨＨＣ（「Ｒ」は、Ｃ５ａＲペプチド、ａａ１～３１を意味する）および
ＲＰＨＣ（「Ｐ」は、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ－１）ペプチド、ａａ４２～
５５を意味する）は、作製した。デンドロアスピンを足場として用いるこれらの構築物の
略図を図１Ｂに示す。これらの組換え分子は、大腸菌（Escherichia coli）（ＢＬ－２１
株）において発現させ、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製
し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したが、これら
の処置のすべてがＡＨＨＣについて以前に記載したものと同様であった［Lu et al 2012;
Atherosclerosis 225:56-68］。
動物実験
Ｂ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスを用いたが、
マウスの各群は、５～６週齢の雄からなっていた。デンドロアスピンが足場として用いら
れ、以前のデータから、マウスにおける皮下免疫処置に用いた場合に病変の低減に対する
デンドロアスピンの効果は示されなかったことから、デンドロアスピンを対照抗原とした
。
用いた免疫抗原は、それぞれ構築物ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣであった。反復
免疫処置複数部位戦略（repetitive immunization multiple sites strategy）（ＲＩＭ
ＭＳ）を採用し［１］、１２週目の終了時にマウスを屠殺した（高脂肪飼料を２週目の終
了時に開始し、１０週間継続した）。対照群は、ＧＳＴタグ付きＤｅｎおよびミョウバン
（アジュバント）による免疫処置の後に飼料プログラムに従った。
組織の準備および抗体反応の測定
最初の免疫処置の１２週後に、大動脈組織を採取し、それぞれ免疫組織化学（ＩＨＣ）
分析および病変測定のために凍結切片作製用包埋剤（optimal cutting temperature comp
ound）（ＯＣＴ）およびパラフィンにマウントした。大動脈基部における動脈硬化性病変
をＯｌｙｍｐｕｓ ＵＵＬＨ光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔ
ｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）により検査し、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ＴＭソ
フトウエア、ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．
、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて解析した。縦方向に切開した下行大動脈を
オイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色の後にアテローム動脈硬化症の程度について評価した。血
漿試料中のペプチド特異抗体レベルを製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡにより測定した
。脾臓の３分の１をＯＣＴに包埋し、残りの部分を７０μｍセルストレーナーに通すこと
によりホモジナイズし、さらなる分析のために凍結した。
アテローム動脈硬化症のＩＨＣおよび形態計測解析、定量的測定、ならびにＣＤ４＋脾細
胞におけるフォークヘッドボックスタンパク質３（Ｆｏｘｐ３）発現のＩＨＣ解析
ＯＣＴ包埋試料は、ＩＨＣ解析によるＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、インターロイキン（ＩＬ
）－１０および腫瘍壊死因子（ＩＮＦ）－α、Ｆｏｘｐ３、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ
）１、アルファ平滑筋細胞（アルファ－ＳＭＣ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９
（ＭＭＰ９）の検出のために用いた。パラフィン包埋組織の切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｕ
－ＵＬＨ光学顕微鏡による組織学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）
ならびにエラスチン／ファンギーソン（Ｓｉｇｍａ）で染色した。
脾細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－１
７Ａ発現のフローサイトメトリー解析ならびにマクロファージ（ＣＤ２０６）へのＰＢＭ
Ｃの分化
脾臓細胞をアロフィコシアニン－抗マウスＦｏｘｐ３、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ
－１７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いた染色のために処
理した（４℃で３０分）。細胞分化アッセイのために、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）ＰＢＭ
Ｃｓを種々の抗原により刺激または抗原の抗血清とともにプレインキュベートした（抗血
清の拮抗作用を確認するために）。単球のマクロファージへの抗原誘導分化は、フローサ
イトメトリーにより測定し、これを非誘導細胞または対照抗原（ＧＳＴ－Ｄｅｎ）誘導細
胞の細胞集団と比較した。
サイトカインの測定
病変におけるＩＬ－１０およびＴＮＦ－αレベルをＩＨＣ解析により定量化した（ラッ
ト抗マウスＴＮＦ－αおよびＩＬ－１０は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡから購入
した）。サイトカイン、ＩＬ－１０、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β
）、ＴＮＦ－αおよびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の血漿レベルは、製造業者
の指示に従ってＥＬＩＳＡにより測定した（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ
、ＵＫ）。脾細胞培養におけるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘導ＩＬ－１０、ＴＧＦ－
β、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのレベルも測定した。
抗原特異的制御性Ｔ細胞機能アッセイ
抗原特異的制御性Ｔ細胞機能を評価するために、それぞれ構築物により皮下に免疫処置
したＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの脾臓ＣＤ
４＋Ｔ細胞からＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃの制御性Ｔ細胞単離キット（Ｂｅｒｇｉ
ｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることによりＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ
ｒｅｇ細胞を単離した。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔエフェクター細胞は、それぞれ同じ構築物
免疫処置マウスの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞から単離した（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞に結合する
ビーズに非結合、ＣＤ４＋細胞の９９．５％）。ＣＤ４＋ＣＤ２５－細胞（２×１０５）
をＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（２×１０５）と共培養し、１μＭ関連構築物またはＧＳＴ－
Ｄｅｎ対照により刺激した。２日間の培養の後、Ｔエフェクター細胞の増殖を、平均蛍光
強度（ＭＦＩ）として表したフローサイトメトリーによる細胞の集団の経口強度の変化と
して測定した。
統計解析
データは、特に示さない限り、平均値±平均値の標準誤差（±ＳＥＭ）として報告する
。図は、ｇｒａｐｈ－ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０１およびＳｉｇｍａ ｐｌｏｔ ９．
０を用いてプロットした。動脈硬化性病変サイズについては、多重比較のための一元配置
ＡＮＯＶＡおよび事後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を用いて、データを比較し、群間の差を
解析した。他のデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側解析）を用いて解析した。ノン
パラメトリック分布は、対比較のためのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定および多重比
較のためのＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて解析した。群間の差は、０．０５
未満のＰ値で有意とみなした。
免疫処置マウスの血清中のペプチド特異的免疫グロブリンＧを評価した。最初の免疫処
置の後のそれぞれ２週目および１２週目にデンドロアスピン（ＧＳＴタグ付き）またはデ
ンドロアスピン足場内の構築物（ＧＳＴタグ付き）により免疫処置したマウスの血清中の
抗体レベルをＥＬＩＳＡ試験により測定した。ＡＨＨＣ免疫処置マウスでは、ペプチドを
ＥＬＩＳＡ抗原として用いた場合、ＡｐｏＢペプチド、ｈＨＳＰ６０３０３－３１２およ
びＣｐｎペプチド特異抗体が認められた（図２Ａ）。同様に、ＲＨＨＣにより免疫処置し
たマウスでは、認められたｈＨＳＰ６０３０３－３１２およびＣｐｎペプチド特異抗体に
加えてＣ５ａＲペプチド特異抗体が検出された（図２Ａ）。ＣｐｎペプチドおよびＣ５ａ
Ｒペプチドに対する高い抗体レベルが、一方では、ＰＡＲ－１ペプチドに対する低い抗体
レベルがＲＰＨＣにより免疫処置したマウスで検出された（図２Ａ）。ｈＨＳＰ６０１５
３－１６３に対する低い抗体レベルがいずれの構築物により免疫処置したマウスにも認め
られた（図２Ａ）。１００倍希釈での全般的な観測光学濃度（ＯＤ）値は、１２週目に２
週目の値と比較して低下した。
興味深いことに、ＧＳＴ－Ｄｅｎ対照と比較した場合、ｈＨＳＰ６０１５３－１６３お
よびＰＡＲ－１ペプチドに対するものを除いて、高い希釈度のすべてのペプチド抗原エピ
トープに対するペプチド免疫処置マウスの血清中のペプチド誘導特異的免疫グロブリン（
Ｉｇ）Ｇ１反応が認められた（図２Ｂ）。さらに、対照と比較した場合、ＩｇＧ２ｃ反応
について同様のパターンも検出されたが、低い血清希釈度においてであった（図２Ｃ）。
しかし、試料の異なる希釈度（１：５０対１：６２５０）で測定された光学濃度に基づい
て、検出されたＩｇＧ２ｃのレベルは、ＩｇＧ１のレベルよりはるかに低かった。さらに
、８週目の抗血清を用いた場合、ＡｐｏＢペプチド誘導抗血清とＣｐｎペプチドとの間（
図２Ｄ）、ＡｐｏＢペプチドおよびｈＨＳＰ６０３０３－３１２ペプチド誘導抗血清とそ
れらの抗原との間（図２Ｅ）、ＡｐｏＢペプチド誘導抗血清とＰＡＲ－１ペプチドまたは
Ｃ５ａＲペプチドのいずれかの抗原との間（図２Ｆ）ならびにＣ５ａＲペプチド誘導抗血
清とＡｐｏＢペプチドまたはＰＡＲ－１ペプチドのいずれかの抗原との間（図２Ｇ）の特
定のレベルの交差反応が認められた。プールした血清を試験したのでＳＤ値が計算されな
かった場合（図２Ｄ）のＣｐｎペプチドとＡｐｏＢペプチド抗血清との間の交差反応は別
として、他の交差反応は、対照と比較して有意な差を示した（図Ｅ～Ｇ；Ｐ＜０．０５～
＜０．００１）。
大動脈洞における動脈硬化性病変サイズの低下を評価した。ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣ、ＲＰ
ＨＣによる免疫処置の後、および１０週間の高脂肪飼料の後、マウスの大動脈洞をアテロ
ーム動脈硬化症の程度について評価した。免疫処置動物の計算によるプラークサイズを対
照のそれと比較した。実験群の病変を有する切片の代表的な顕微鏡写真を図３Ａに示す。
プラーク面積を図３Ｂに示す。病変サイズは、対照（７０２００±５７１８μｍ２）と比
較して３１０７１±９９８．７μｍ２、２４１２３±１９６７μｍ２および２１３８６±
２４８２μｍ２（Ｐ＜０．００１）を示した３種の構築物のすべてにより免疫処置したマ
ウスでより小さかった。より小さい病変面積が、ＡＨＨＣにより免疫処置したマウスと比
較してＲＨＨＣまたはＲＰＨＣにより免疫処置したマウスで認められた（Ｐ＝０．００７
～０．００２）（図２Ｂ）。病変サイズの減少の百分率を図３Ｃに示すが、対照動物の病
変の減少をゼロパーセントと仮定した場合、５５．７±３．４％、６５．６±１．３％お
よび６９．５±１．１％を示した。ＧＳＴ－Ｄｅｎにより免疫処置した対照マウスは、Ｇ
ＳＴタグまたはミョウバン（アジュバント）免疫処置対照と同様の病変形成を示した（図
４Ａおよび４Ｂ）。したがって、ＧＳＴ－Ｄｅｎを実験を通して対照として用いた。
これらの病変におけるコラーゲン含量に対するこれらの組換え構築物による処理の影響
も検討した。これらの構築物により処理したマウスにおけるアテローム動脈硬化症の低減
は、それぞれ対照マウスと比べてＡＨＨＣ免疫処置マウスまたはＲＨＨＣ免疫処置マウス
で約３倍のコラーゲン含量の増加を随伴していた（１８．６±１．２％または１９．４±
０．９％対、対照５．９±０．３％；Ｐ＜０．００１）（図３Ｄおよび３Ｅ）。ＲＰＨＣ
により免疫処置したマウスは、ＡＨＨＣまたはＲＨＨＣにより免疫処置したマウスと比較
して有意なコラーゲンの増加（２４．４±０．９％）を示した（それぞれＰ＝０．００３
およびＰ＝０．００７）。
縦方向に切開した下行大動脈を正面でオイルレッドＯ（ＯＲＯ）で染色し、陽染された
プラークの面積を測定した。実験群の代表的な正面染色下行大動脈を図３Ｆに示す。病変
サイズは、対照（１９．５±１．７％、Ｐ＜０．００１）と比較してそれぞれＡＨＨＣ、
ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣについて８．４±０．３％、６．６±０．３％および６．４±０
．４％を示したすべての構築物で免疫処置したマウスで有意に小さかった（図３Ｇ）。Ｒ
ＨＨＣおよびＲＰＨＣ免疫処置マウスの両方がＡＨＨＣ免疫処置マウスより有意に小さい
病変を示した（Ｐ＝０．０１１～０．００８）。百分率として表した病変の減少を図２Ｈ
に示すが、それぞれＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣについて５７．３±１．７％、６
６．１±１．６％および６７．３±１．９％であった。最も小さい病変面積はＲＰＨＣに
より免疫処置したマウスで認められた。
局所（大動脈の病変）ならびに遠隔臓器：脾細胞およびリンパ球における炎症性細胞お
よびＦｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の量を評価した。病変における抗ＣＤ６８染色
面積の百分率は、ＧＳＴ－Ｄｅｎにより免疫処置した対照マウスにおける４３．７±３．
２％と比較してそれぞれＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免疫処置したマウスに
おいて１４．９±１．６％、１３．６±１．３％および１０．３±０．８％を示した（Ｐ
＜０．００１）。ＡＨＨＣ免疫処置マウスと比較してより小さい抗ＣＤ６８染色面積がＲ
ＰＨＣ免疫処置マウスに認められた（Ｐ＝０．０３４）（図５Ａおよび５Ｂ）。同様に、
抗ＣＤ１１ｃ染色病変面積の測定で、対照マウスにおける３８．４±１．９％と比較して
それぞれＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免疫処置したマウスにおいて１３．３
±２．１％、１０．５±１．５％および７．９±０．８％が示された（Ｐ＜０．００１）
（図５Ａおよび５Ｃ）。ＲＰＨＣ免疫処置マウスにおける抗ＣＤ１１ｃ染色病変面積は、
ＡＨＨＣ免疫処置マウスにおけるものと比較した場合、有意に小さかった（Ｐ＝０．０３
９）（図５Ａおよび５Ｃ）。ＣＤ６８およびＣＤ１１ｃの二重免疫染色により、百分率と
して表したＣＤ６８＋面積と共局在化したＣＤ１１ｃ＋面積が対照マウスにおける６８．
６±４．７％と比較してそれぞれＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣについて５４．７±
３．７％、５５．２±２．６％および５０．３±３．３％を示したように、マクロファー
ジの半数以上がＣＤ６８＋ＣＤ１１ｃ＋であることが明確に示されたこと（図５Ａ～３Ｄ
；Ｐ＝０．０４６～０．０１１）から、病変におけるこの細胞型が骨髄由来であることが
わかる。大動脈切片のＩＨＣ染色により解析したＦｏｘｐ３を発現するＣＤ４＋細胞の割
合は、対照マウスにおける１．２±０．２％（Ｐ＜０．００１）と比較してそれぞれＡＨ
ＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免疫処置したマウスにおいて約６～８倍高かった（
８．２±１．４％、Ｐ＜０．００１；９．４±１．１％、Ｐ＜０．００１；９．９±１．
６％、Ｐ＜０．００１）（図５Ｅおよび５Ｆ）。さらに、これらの３種の構築物により免
疫処置したマウスのＣＤ４＋脾臓細胞におけるＦｏｘｐ３の発現は、対照におけるものよ
り高く（Ｐ＜０．００１）、対照における４．０±０．５％に対してそれぞれＡＨＨＣ、
ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣについて１３．３±０．６％、１５．３±１．５％および１８．
０±１．１％を示した（図５Ｇおよび５Ｈ）。しかし、ＲＨＨＣ免疫処置マウスにおける
それと比較した場合、Ｆｏｘｐ３発現の有意な増加を示さなかったＲＰＨＣ免疫処置マウ
スを除いて、ＡＨＨＣ免疫処置マウスにおけるそれと比較して有意により高いレベルのＦ
ｏｘｐ３発現が認められた（Ｐ＝０．００２）。
病変部位における抗炎症性サイトカインおよび炎症誘発性サイトカインの発現ならびに
血漿中および刺激脾細胞の上清中のサイトカインのレベルを評価した。ＩＨＣ解析により
検出された、ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免疫処置したマウスの大動脈病変
におけるＩＬ－１０発現を図６Ａに示す。病変におけるＩＬ－１０を発現するＣＤ４＋細
胞の割合は、これらの構築物により免疫処置したマウスにおいて約６倍より高く、図６Ａ
および６Ｂに示すように対照群におけるそれ（０．９±０．２％）と比較した場合、それ
ぞれＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣについて４．８±０．７％、５．２±０．８％お
よび５．９±０．７％（Ｐ＜０．００１）を示した。ＴＮＦ－α発現のＩＨＣ解析により
、対照と比較して構築物により免疫処置したマウスの病変における有意に小さいＴＮＦ－
α占有面積が示された（ＡＨＨＣで２５．７±３．１％；ＲＨＨＣで１５．２±０．９％
；ＲＰＨＣで１５．５±１．５％および対照で４１．３±３．１％）（図６Ｃおよび６Ｄ
）。これらのデータは、対照（総病変面積を１００％、減少を０％と定義）と比較して、
それぞれ３７．８％、６３．２％および６２．５％の減少百分率を示す。さらに、ＡＨＨ
Ｃと比較してＲＨＨＣまたはＲＰＨＣによって減少の向上がもたらされた（Ｐ＝０．００
８～０．０１４）。
アテローム防御性（atheroprotective）サイトカインＩＬ－１０の血漿レベルは、対照
と比較してこれらの３種の構築物により免疫処置したマウスにおいて有意に増加した（図
６Ｅおよび６Ｆ）。ＲＰＨＣによる免疫処置は、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－βの分泌を促
進することに関して他の２種の構築物による免疫処置より大きい効果を有していた（Ｐ＜
０．０５～＜０．００１）。アテローム促進性（atherogenic）サイトカインＴＮＦ－α
の血漿レベルは、これらの３種の構築物による免疫処置により有意に低下した（図６Ｇ）
。同様な傾向が、ＩＦＮ－γの血漿レベルに関してこれらの構築物について得られた（図
６Ｈ）。特に、ＲＰＨＣによる免疫処置は、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γの分泌の低減（
Ｐ≦０．００２）に関してＡＨＨＣによるよりも大きい効果を、ＴＮＦ－αの分泌の低減
（Ｐ＝０．００４）に関してＲＨＨＣによるよりも大きい効果を有していた。ＡＨＨＣに
より免疫処置したマウスについて対照マウスと比較してＩＦＮ－γのわずかにより高い血
漿レベルが認められた（２４対２０．８ｐｇ／ｍｌ）が、この差は、統計的有意性を示さ
なかった。
これらの構築物により免疫処置したマウスの脾細胞の上清は、対照と比較した場合、１
０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡにより刺激されたＩＬ－１０（図６Ｉ）およびＴＧＦ－β（図６
Ｊ）の有意に高い分泌を個々に示した（Ｐ＜０．０５～０．００１）。さらに、ＡＨＨＣ
免疫処置マウスの脾細胞よりも高いレベルのＩＬ－１０またはＴＧＦ－βがＲＰＨＣ免疫
処置マウスの脾細胞によって産生された（Ｐ＜０．０５～０．０１）。これに対して、Ｔ
ＮＦ－α（図４Ｋ）およびＩＦＮ－γレベル（図６Ｌ）は、１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡに
より刺激した場合、対照と比較してこれらの構築物により免疫処置したマウスの脾細胞の
上清中で有意に低下した。特に、ＲＰＨＣ免疫処置マウスにおけるＴＮＦ－αおよびＩＦ
Ｎ－γのレベルは、それぞれ１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡにより刺激した場合、ＡＨＨＣ免
疫処置マウスにおけるそれより低かった（Ｐ＜０．０５～０．０１）。興味深いことに、
免疫処置マウスの脾細胞の上清は、ペプチドまたはペプチドを含む構築物で刺激した場合
に高い量の防御性サイトカインＩＬ－１０および低い量の炎症誘発性サイトカインＩＦＮ
－γを含むことも示されたが、異なるタンパク質であるＫＬＨを用いて刺激を行った場合
には、それが当てはまらなかった（図７Ａ～Ｄ）。ほとんどの場合、ＡｐｏＢ、Ｃ５ａＲ
およびＣｐｎペプチドをＧＳＴ－ｄｅｎ免疫処置マウスにおけるＩＬ－１０の産生のため
の刺激物として用いた場合、ならびにＲＰＨＣ免疫処置マウスにおけるＰＡＲ－１ペプチ
ドを除いて、種々の刺激物に反応してのサイトカイン産生の変化は有意であった。
これらの３種の構築物により免疫処置したマウスのＩＬ－４（Ｔｈ２関連）、ＩＬ－１
７Ａ（Ｔｈ１７関連）およびＩＬ－２（Ｔｈ１関連）発現ＣＤ４＋脾臓細胞の割合は、有
意により低く（それぞれＩＬ－４＋についてＰ＜０．００１およびＩＬ－１７Ａ＋につい
てＰ≦０．００１）、８．４４±０．２１％（対照）と比較した場合ＩＬ－４＋について
２．７４±０．１１％（ＡＨＨＣ）、２．８５±０．１２％（ＲＨＨＣ）および２．８７
±０．０２％（ＲＰＨＣ）（図４Ｍおよび４Ｎ）を、４．１±０．３％（対照）と比較し
た場合ＩＬ－１７Ａ＋について２．０±０．１％（ＡＨＨＣ）、１．７±０．１％（ＲＨ
ＨＣ）および０．９±０．１％（ＲＰＨＣ）（図６Ｏおよび６Ｐ）を示した。さらに、Ａ
ＨＨＣまたはＲＨＨＣ免疫処置マウスにおける値と比較して小さい百分率のＣＤ４＋ＩＬ
－１７Ａ＋発現脾臓細胞がＲＰＨＣ免疫処置マウスに認められた（Ｐ≦０．００６）（図
６Ｏ～Ｐ）。興味深いことに、ＲＰＨＣ免疫処置マウスにおける値と比較して高い百分率
のＣＤ４＋ＩＬ－１７Ａ＋発現脾臓細胞がＲＨＨＣ免疫処置マウスに認められた（Ｐ＝０
．０２１）（図６Ｐ）。さらに、対照における値と比較した場合、有意により低い百分率
のＣＤ４＋ＩＬ－２＋発現脾臓細胞が３種の構築物免疫処置マウスに認められた（Ｐ＜０
．００１；図６Ｑおよび６Ｒ）。さらに、ＡＨＨＣまたはＲＨＨＣ免疫処置マウスにおけ
る値と比較して小さい百分率のＣＤ４＋ＩＬ－２＋発現脾臓細胞がＲＰＨＣ免疫処置マウ
スに認められた（Ｐ＝０．０１９～０．００７）。
抗原誘導性特異的Ｔｒｅｇ細胞機能を検討した。機能性のＴｒｅｇ細胞が免疫処置によ
り誘導されたかどうかを評価するために、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋
Ｔ細胞）をＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）と共培養した。１
μＭのＧＳＴ－Ｄｅｎによる刺激に反応した、ＧＳＴ－Ｄｅｎ免疫処置対照マウスのエフ
ェクターＴ細胞の増殖は、ＧＳＴ－Ｄｅｎ免疫処置マウスのＴｒｅｇ細胞の存在下で抑制
を示さなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。これに対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクター
Ｔ細胞をこれらのマウスから単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞と共培養した場合
、それぞれ関連抗原による刺激に反応して、ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免
疫処置したサンプリングマウスのエフェクターＴ細胞の増殖は、抑制された（図８Ａおよ
び８Ｂ）。Ｔｒｅｇ細胞を４：１～１６：１の比率でエフェクター細胞に加えた場合、Ｔ
ｒｅｇ細胞の添加のない場合と比較して、差は有意であった（Ｐ＜０．０５～＜０．００
１）。
病変における平滑筋アルファアクチン、ＶＣＡＭ１、ＭＭＰ９ならびに特異抗原Ａｐｏ
ＢおよびＨＳＰ６０の発現の評価を行った。本発明の構築物による免疫処置が血管ＳＭＣ
挙動および血管リモデリングに影響を及ぼすかどうかを評価するために、病変のＳＭＣ含
量ならびに病変部位におけるＶＣＡＭ１およびＭＭＰ９の発現をＩＨＣ解析により解析し
た。抗ＳＭＣ染色面積は、ＧＳＴ－Ｄｅｎにより免疫処置した対照におけるそれと比較し
た場合、ＡＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免疫処置したマウスのプラークにおいて有意に小
さく、それぞれ５．２±０．７％および４．９±０．８％を示したが、ＲＨＨＣにより免
疫処置したマウスにおいては有意に低下しなかった（図９Ａおよび９Ｂ）。さらに、ＶＣ
ＡＭ１の発現は、デンドロアスピンにより免疫処置した対照におけるそれ（１８．０±２
．３％）と比較した場合、有意に下方制御され、それぞれＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰ
ＨＣで４．５±０．９％、７．８±０．９％および４．８±０．９％を示した（図９Ａお
よび９Ｃ）。ＡＨＨＣまたはＲＰＨＣ免疫処置マウスと比較して有意に増加する影響がＲ
ＨＨＣ免疫処置マウスに認められた（図９Ａおよび９Ｃ）。同様な傾向が、３種の構築物
のすべてにより免疫処置したマウスにおけるＭＭＰ９発現について認められ、７．９±１
．０％、１０．１±１．０％および７．６±１．０％の染色面積がそれぞれＡＨＨＣ、Ｒ
ＨＨＣおよびＲＰＨＣ免疫処置マウスで、１８．１±２．５％がＧＳＴ－Ｄｅｎにより免
疫処置した対照マウスで示された（図９Ｄおよび９Ｅ）。ただし、ＡＨＨＣまたはＲＰＨ
Ｃ免疫処置マウスとＲＨＨＣ免疫処置マウスとの間にこの点において得られた有意な差は
存在しない（図６Ｄおよび６Ｅ）ことを除く。興味深いことに、サンプリングマウスと対
照マウスとの間にマウスＡｐｏＢ（図１０Ａおよび１０Ｂ）ならびにマウスＨＳＰ６０タ
ンパク質（図１０Ｃおよび１０Ｄ）抗原の差が病変部位でほとんど検出されなかったので
、ヒトＡｐｏＢおよびＨＳＰ６０ペプチドを含む組換え構築物の注射は、それらのカウン
ターパート（ＡｐｏＢおよびＨＳＰ６０）の発現に影響を及ぼさなかった。
組換え構築物による処理に反応する、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドナイーブマウス
のＰＢＭＣにおけるマクロファージへの単球分化の評価および分化に対する構築物特異的
免疫血清の影響を検討した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ
－ＣＳＦ）またはアテローム促進性抗原による刺激により、単球は、マクロファージ（ま
たはサブセット）に分化し得る。単一ドメイン置換によりＲＨＨＣに転換したＡＨＨＣが
単球（同じバックグラウンドを有するナイーブマウスＣ５７ＢＬ／６からの）の刺激に対
する同じ効果を維持し得るかどうかを評価するために、ＰＢＭＣｓをＲＨＨＣまたはＡＨ
ＨＣにより刺激した。３日後に、細胞表面マーカーＣＤ２０６（マンノース受容体、マク
ロファージマーカー）の発現を評価した。非刺激細胞と比較した場合、ＲＨＨＣおよびＡ
ＨＨＣの両方がマクロファージへの単球分化を誘発した（細胞数の変化に基づく）（図１
１Ａおよび１１Ｂ）。さらに、これらの２種の構築物によって誘発されるＰＢＭＣの分化
は、これら２種の抗原により免疫処置したマウスからの抗血清とともに細胞をプレインキ
ュベートすることによって起こらなくなった。興味深いことに、抑制は、細胞と互いの抗
血清とのプレインキュベーションによって達成することができる（図１１Ａ～７Ｄ）。刺
激物としての個々のエピトープまたはドメインによる分化の観察により、異なる比率の分
化が示された（図１１Ｅ～１１Ｆ）。
病変部位におけるトル様受容体４（ＴＬＲ４）およびアテローム動脈硬化症に関連する
ＴＬＲ４シグナル経路に関与する骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）の含量の評価を検討し
た。病変におけるＴＬＲ４およびＭｙＤ８８含量に対するこれらの組換え構築物による処
理の影響を検討した。これらの構築物により処理したマウスにおけるアテローム動脈硬化
症の低減は、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８含量の両方の減少を随伴していた。抗ＴＬＲ４染
色面積は、デンドロアスピンにより免疫処置した対照における値（８．１±１．１％）と
比較して、ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣおよびＲＰＨＣにより免疫処置したマウスのプラークにお
いて有意に小さく、それぞれ４．６±１．０％、３．４±０．５％および４．２±０．６
％を示した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。同様に、抗ＭｙＤ８８染色面積は、対照における
値（１８．６±２．４％）と比較して、これらの３種の構築物により免疫処置したマウス
の病変において有意に小さく、それぞれ９．７±１．２％、９．６±１．６％および１０
．２±１．９％を示した（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。さらに、抗ＣＤ１１ｃおよび抗ＴＬ
Ｒ４染色面積のオーバーラップは、対照（６．６±０．８％）と比較して、３種構築物の
すべてにより免疫処置したマウスの病変において有意に小さいことを示し、それぞれ３．
４±０．６％、２．９±０．７％および２．７±０．８％を示した（図１３Ａおよび１３
Ｂ）。
それぞれヒトおよびマイコバクテリウムに由来する２種のＨＳＰ６０ペプチドを、Ａｐ
ｏｂｔｍ２ＳｇｙＬｄｌｒｔｍ１Ｈｅｒ／Ｊマウスにおける免疫処置により動脈硬化性病
変を低減するそれらの能力について比較するために実験を行った。マウスは、それぞれ、
ｍＨＳＰ６０２５３－２６８と呼ぶマイコバクテリウム熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）
６０（ＡＡ２５３～２６８）（配列番号１５）、ｈＨＳＰ６０５１６－５２８と呼ぶヒト
ＨＳＰ６０（ＡＡ５１６～５２８）（配列番号１４）に由来する２種のスカシガイヘモシ
アニン（ＫＬＨ）結合ペプチドにより免疫処置した。マウスをこれらの２種のペプチドに
より免疫処置し、最初の免疫処置の２週後に、マウスに高脂肪飼料を与えて飼育した。結
果は、ｍＨＳＰ６０ペプチドが、ｈＨＳＰ６０ペプチドよりもＩｇＧおよびＩｇＧ１に対
して低い力価を有し、ＩｇＧ２ｃに対してほとんど力価を有さないことは別として、２種
のペプチドが同様な機能を示したことを示すものであった。同様な機能は、誘導された特
異的免疫反応；病変の低減；Ｔｒｅｇ発現の増大；アテローム防御性サイトカイン：ＩＬ
－１０およびＴＧＦ－βの濃度の増大ならびに炎症誘発性サイトカイン：ＴＮＦ－αおよ
びＩＮＦ－γの濃度の低下；Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞増殖の抑制お
よびＴＬＲ４／ＭｙＤ８８経路の下方制御（データは示さず）を含む。結論として、ｍＨ
ＳＰ６０およびｈＨＳＰ６０ペプチドによるＢ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐ
ｏｂｔｍ２Ｓｇｙ／Ｊマウスの免疫処置の後に、２種のペプチドの間の低い配列相同性（
３１％）およびｍＨＳＰ６０ペプチドにより得られたより低い免疫反応にもかかわらず、
両ペプチドは、早期動脈硬化性病変の有意な低減に対する同様の効果を有する。このデー
タから、本発明の構築物によるそのような免疫処置は、アテローム動脈硬化症に対するペ
プチドベースのワクチンの設計および開発の魅力的な機会を提供するものであることが確
認される。
転写制御因子ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）は、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５
＋Ｔｒｅｇ機能を調節するものであり（Fontenot et al., Nat Immunol. 2003;4:330-336
; Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Science. 2003;299:1057-1061）、天然ＣＤ４＋ＣＤ
２５＋Ｔｒｅｇの移入がＡｐｏＥ－ＫＯマウスモデルにおけるプラークの進行を有意に低
減することが示された（Ait-Oufella et al., Nat Med. 2006;12:178-180; Mor et al Ar
terioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27:893-900）。それに基づいて、天然に存在するＴ
ｒｅｇが動脈硬化性病変のサイズと組成に影響を及ぼすことができることが公知であり、
いくつかの報告で、抗原特異的反応が進展しつつあるアテロームプラークにおいて作動可
能であり得るという理論が裏付けられている。本発明者らは、アテローム促進性抗原誘導
性Ｔｒｅｇが病変の低減に関する特異的機能を有し得るという仮説を立てた。本発明者ら
は、液性免疫反応、動脈硬化性病変サイズに対する効果ならびに局所および全身性細胞応
答を試験することによって、Ｂ６；１２９Ｓ－Ｌｄｌｒｔｍ１ＨｅｒＡｐｏｂｔｍ２Ｓｇ
ｙ／Ｊマウスにおける動脈硬化性病変形成に対する抗原免疫処置マウスの血液から単離さ
れた養子移入Ｔｒｅｇ細胞の効果を評価するための実験を行った。
ＫＯマウスにおける免疫反応および養子移入を検討するための、第１の方法は、ＡＨｈ
ＨｍＲ構築物をデンドロアスピン足場に組み込んで、組換え構築物を作製することを含ん
でいた。ＡｐｏＢ（ＡＡ６８８～７０７）の抗原エピトープをＡと呼び、ヒトＨＳＰ６０
（ＡＡ３０３～３１２）（配列番号１２）をＨｈと呼び、マイコバクテリウム（ＡＡ２５
３～２６８）（配列番号１５）をＨｍと呼び、補体成分５ａ受容体（ＡＡ１～３１）（配
列番号９）をＲと呼んだ。マウスをＲＩＭＭ（反復複数部位免疫処置戦略）プロトコール
によりＡＨｈＨｍＲにより免疫処置した。Ｔｒｅｇ細胞は、ＡＨｈＨｍＲ（それぞれＴｒ
ｅｇＳ）およびデンドロアスピン（ＴｒｅｇＣ）による）による免疫処置マウスの血液か
ら精製した。養子移入は、マウスの後眼窩静脈叢を介して達成された。
動脈硬化性病変形成に対するＴｒｅｇ細胞の効果を評価するための、第２の方法は、そ
れぞれＡＧＤ－ｄｅｎ（対照）およびＡＨｈＨｍＲ免疫処置マウスの血液からのＴｒｅｇ
細胞の養子移入を含んでいた。レシピエントは、同じ系統の非免疫処置ナイーブマウスで
あり、高脂肪飼料（ＨＦＤ）を１０週間給餌し、その後屠殺した。病変の発現の組織学的
および免疫組織化学的評価、サイトカインレベルの解析、Ｔｒｅｇ活性および泡沫細胞形
成の評価を評価した。
データ（示さず）から、アテローム促進性抗原免疫処置マウスの血液から単離されたＴ
ｅｇＳは、非免疫処置マウスの静脈に養子移入した後に、非アテローム促進性抗原免疫処
置マウスの血液からのＴｒｅｇと比較した場合、より少ない病変形成を示したことが示さ
れた。天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの移入は、ＡｐｏＥ－ＫＯマウスモデルにおける
プラークの進行を有意に低減させた。より少ない病変形成に加えて、それらは、病変部位
におけるコラーゲン含量の増大、病変部位におけるＴｒｅｇ発現の増大、血漿中のアテロ
ーム防御性サイトカイン（ＩＬ－１０およびＴＧＦ－β）のより高い濃度ならびに炎症誘
発性サイトカイン（ＴＮＦ－αおよびＩＮＦ－γ）のより低い濃度も示した。病変部位に
おけるαＳＭＣおよびＰＥＣＡＭの発現の下方制御も認められた。
これらの結果は、本発明の構築物がアテローム動脈硬化症の治療のための細胞療法における魅力的な機会を提供することを示すものである。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
（ｉ） 足場部分と、
（ｉｉ） 第１の経路を経て抗動脈硬化性血管疾患反応を引き起こすことができる第１の種のエピトープと、
（ｉｉｉ） 前記第１の経路と独立した第２の経路を経て抗動脈硬化性血管疾患を引き起こすことができる第２の種のエピトープと
を含む組換え構築物。
［２］
複数の第１および／または第２の種のエピトープを含む、［１］に記載の構築物。
［３］
アテローム動脈硬化症の形成に関連する前記第１の経路がＣ５ａまたはＣ５ａＲ相互作用を経由する、［１］または［２］に記載の構築物。
［４］
前記第１の種のエピトープがＣ５ａまたはＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）タンパク質である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の構築物。
［５］
前記Ｃ５ａエピトープが、配列番号２における５～４０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、［４］に記載の構築物。
［６］
前記Ｃ５ａエピトープが、ＥＱＲＡＡＲＩＳＬＧＰＲ（配列番号３）、ＲＡＡＲＩＳＬＧＰＲＣＩＫＡＦＴＥ（配列番号４）およびＣＶＮＮＤＥＴＣＥＱ（配列番号５）を含む、もしくはからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である、［４］または［５］に記載の構築物。
［７］
前記Ｃ５ａエピトープが、配列番号６における５～４５個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、［４］に記載の構築物。
［８］
Ｃ５ａＲエピトープがＣまたはＮ末端配列であり、任意選択で前記エピトープが、ＭＮＳＦＮＹＴＴＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬＤ（配列番号７）、ＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴＳＮ（配列番号８）およびＭＮＳＦＮＹＴＴＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴＳＮ（配列番号９）を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である、［４］または［５］に記載の構築物。
［９］
抗動脈硬化性血管疾患反応に関連する前記第２の種のエピトープが、アポリポタンパク質（Ａｐｏ）エピトープ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）エピトープ、肺炎クラミジア（chlamydia pneumonia）エピトープ、ＰＡＲ－１エピトープおよびペリリピンエピトープを含むまたはからなる群から選択される、［１］から［８］のいずれか一項に記載の構築物。
［１０］
前記ＨＳＰがＨＳＰ６０またはＨＳＰ６５であり、任意選択で、前記ＨＳＰがＨＳＰ６０である場合、ヒトＨＳＰ６０またはマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）ＨＳＰである、［９］に記載の構築物。
［１１］
前記ＨＳＰ６０エピトープが、ペプチド１（ＡＡ）１５３～１６０：ＡＥＬＫＫＱＳＫ；（配列番号１０）、ペプチド１（ＡＡ）１５３～１６３：ＡＥＬＫＫＱＳＫＰＶＴ；（配列番号１１）、ペプチド１（ＡＡ）３０３～３１２：ＰＧＦＧＤＮＲＫＮＱ（配列番号１２）、ペプチド２：ＡＡ２７７～２８６ ＰＧＦＧＤＮＲＫＮＱ（配列番号１３）、ペプチド（ＡＡ）５１６～５２８：ＫＧＩＩＤＰＴＫＶＶＲＴＡ（配列番号１４）およびマイコバクテリウム（ＡＡ）２５３～２６８：ＥＧＥＡＬＳＴＬＶＶＮＫＩＲＧＴ（配列番号１５）を含む、もしくはからなる群から選択されるアミノ酸配列または抗原活性を有するその機能性断片を含む、［１０］に記載の構築物。
［１２］
前記肺炎クラミジア（chlamydia pneumonia）がＣｐｎ１またはＣｐｎ２であり、任意選択で、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）（アミノ酸配列（ＡＡ）６７～７４：ＧＤＹＶＦＤＲＩ（配列番号１６））およびＣｐｎの推定外膜タンパク質（Ｐｏｍｐ）５（アミノ酸配列（ＡＡ）２８３～２９１：ＱＡＶＡＮＧＧＡＩ（配列番号１７））を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である、［９］に記載の構築物。
［１３］
前記ＰＡＲ－１エピトープが、ＥＷＥＰＫＰＶＮＱＶＹＴ（配列番号１８）およびＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９）から選択されるアミノ酸を含む、［９］に記載の構築物。
［１４］
前記足場部分が配列番号１に示すデンドロアスピン足場タンパク質またはその断片もしくは変異体である、［１］から［１３］のいずれか一項に記載の構築物。
［１５］
前記第１および／または第２の種のエピトープが、前記デンドロアスピン足場の（ａ）ループＩおよび／またはループＩＩ；（ｂ）ループＩおよび／またはループＩＩＩ；（ｃ）ループＩＩおよび／またはループＩＩＩ；（ｄ）ループＩ、ループＩＩおよびループＩＩＩ；（ｅ）ＮまたはＣ末端のいずれか１つまたは複数の位置に組み込まれる、［１４］に記載の構築物。
［１６］
（ｉ）足場部分と、
（ｉｉ）Ｃｐｎエピトープと、
（ｉｉｉ）同じまたは異なるタンパク質に由来する１つまたは複数のさらなるエピトープと
を含む、［１］に記載の構築物。
［１７］
前記さらなるエピトープがＨＳＰ、ＰＡＲ－１およびＣ５ａＲに由来する、［１６］に記載の構築物。
［１８］
ＡＨＨＣ、ＲＨＨＣ、ＲＰＨＣおよびＡＨＨＲを含む群から選択される、［１６］または［１７］に記載の構築物。
［１９］
（ｉ）足場部分と、
（ｉｉ）２つのＨＳＰエピトープと、
（ｉｉｉ）異なるタンパク質に由来する１つまたは複数のさらなるエピトープと
を含む、［１］に記載の構築物。
［２０］
前記１つまたは複数のさらなるエピトープがＡｐｏＢおよび／またはＣａ５Ｒである、［１９］に記載の構築物。
［２１］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物に組み込まれる前記エピトープをコードする核酸を含む発現ベクター。
［２２］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物を含む抗原性組成物であって、任意選択で（ｉ）任意選択で反転ミクロソームである単離ミクロソームまたは（ｉｉ）ＭＨＣタンパク質または（ｉｉｉ）逆ミセルまたは（ｉｖ）合成産物を含む疎水性複合体である、前記組成物。。
［２３］
注射用または経口製剤として製剤化された、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含み、任意選択で、適切なアジュバント、賦形剤、希釈剤および／または担体をさらに含む医薬組成物。
［２４］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物または［２１］に記載のベクターまたは［２２］に記載の免疫原性組成物を含む医薬組成物。
［２５］
医薬として用いる［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物または［２１］に記載のベクター。
［２６］
医薬の製造に用いる［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物または［２１］に記載のベクター。
［２７］
アテローム動脈硬化症を治療するのに用いる［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物または［２１］に記載のベクター。
［２８］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載の構築物または［２１］に記載のベクターを含むワクチン。
［２９］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載のタンパク質；［２１］に記載のベクター；［２２］に記載の免疫原性組成物および［２３］または［２４］に記載の医薬組成物から選択される製剤を個体に投与することを含む、哺乳動物における抗アテローム動脈硬化症反応を引き起こす方法。
［３０］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載のタンパク質；［２１］に記載のベクター；［２２］に記載の免疫原性組成物および［２３］または［２４］に記載の医薬組成物から選択される製剤を個体に投与することを含む、アテローム動脈硬化症を治療する、予防するまたは低減する方法。
［３１］
［１］から［２０］のいずれか一項に記載のタンパク質；［２１］に記載のベクター；［２２］に記載の免疫原性組成物および［２３］または［２４］に記載の医薬組成物から選択される製剤を個体に投与することを含む、早期アテローム動脈硬化症を有する個体またはアテローム動脈硬化症を発現するリスクがあると特定された個体を治療する方法。
［３２］
アテローム動脈硬化症形成に関連する２つの独立した経路に関連するエピトープに対する免疫反応を引き起こす方法であって、
１． ［１］から［２０］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの第１および少なくとも１つの第２のエピトープを含むデンドロアスピン足場タンパク質を構築し、発現させることと、
２． 真核細胞を前記デンドロアスピン足場タンパク質とともにインキュベートすることと、
３． 前記真核細胞を用いて、ミクロソームを調製することと、
４． 前記ミクロソームおよびデンドロアスピン足場タンパク質を１つまたは複数の薬学的に許容される成分と混合して、経口または注射投与可能製剤を製造することと、
５． 前記製剤を哺乳動物またはヒトに投与することと
を含む方法。

Claims (23)

  1. （ｉ） 足場部分と、
    （ｉｉ） Ｃ５ａＲ相互作用を経て抗動脈硬化性血管疾患反応を引き起こすことができる第１の種のエピトープと、
    （ｉｉｉ） 前記Ｃ５ａＲ相互作用と独立した第２の経路を経て抗動脈硬化性血管疾患反応を引き起こすことができる第２の種のエピトープであって、アポリポタンパク質（Ａｐｏ）エピトープ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）エピトープ、および肺炎クラミジア（chlamydia pneumonia）エピトープからなる群から選択されるものと
    を含み、
    前記第１の種のエピトープは、アミノ酸配列ＭＮＳＦＮＹＴＴＰＤＹＧＨＹＤＤＫＤＴＬＤＬＮＴＰＶＤＫＴＳＮ（配列番号９）を含む、もしくはからなるＣ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）タンパク質エピトープまたは抗原活性を有するその機能性断片である、組換え構築物。
  2. 複数の第１および／または第２の種のエピトープを含む、請求項１に記載の構築物。
  3. Ｃ５ａＲエピトープがＣまたはＮ末端にある、請求項１または２に記載の構築物。
  4. 前記ＨＳＰがＨＳＰ６０またはＨＳＰ６５である、請求項１～３のいずれか一項に記載の構築物。
  5. 前記ＨＳＰがＨＳＰ６０である場合、ヒトＨＳＰ６０またはマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）ＨＳＰである、請求項４に記載の構築物。
  6. 前記ＨＳＰ６０エピトープが、ペプチド１（ＡＡ）１５３～１６０：ＡＥＬＫＫＱＳＫ；（配列番号１０）、ペプチド１（ＡＡ）１５３～１６３：ＡＥＬＫＫＱＳＫＰＶＴ；（配列番号１１）、ペプチド１（ＡＡ）３０３～３１２：ＰＧＦＧＤＮＲＫＮＱ（配列番号１２）、ペプチド２：ＡＡ２７７～２８６ ＰＧＦＧＤＮＲＫＮＱ（配列番号１３）、ペプチド（ＡＡ）５１６～５２８：ＫＧＩＩＤＰＴＫＶＶＲＴＡ（配列番号１４）およびマイコバクテリウム（ＡＡ）２５３～２６８：ＥＧＥＡＬＳＴＬＶＶＮＫＩＲＧＴ（配列番号１５）を含む、もしくはからなる群から選択されるアミノ酸配列または抗原活性を有するその機能性断片を含む、請求項４または５に記載の構築物。
  7. 前記肺炎クラミジア（chlamydia pneumonia）エピトープがＣｐｎ１またはＣｐｎ２である、請求項１～６のいずれか一項に記載の構築物。
  8. 前記肺炎クラミジア（chlamydia pneumonia）エピトープが、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）（アミノ酸配列（ＡＡ）６７～７４：ＧＤＹＶＦＤＲＩ（配列番号１６））およびＣｐｎの推定外膜タンパク質（Ｐｏｍｐ）５（アミノ酸配列（ＡＡ）２８３～２９１：ＱＡＶＡＮＧＧＡＩ（配列番号１７））を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチドまたは抗原活性を有するその機能性断片である、請求項７に記載の構築物。
  9. 前記足場部分が配列番号１に示すデンドロアスピン足場タンパク質またはその断片もしくは変異体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の構築物。
  10. 前記第１および／または第２の種のエピトープが、前記デンドロアスピン足場の（ａ）ループＩおよび／またはループＩＩ；（ｂ）ループＩおよび／またはループＩＩＩ；（ｃ）ループＩＩおよび／またはループＩＩＩ；（ｄ）ループＩ、ループＩＩおよびループＩＩＩ；（ｅ）ＮまたはＣ末端のいずれか１つまたは複数の位置に組み込まれる、請求項９に記載の構築物。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の構築物をコードする核酸を含む発現ベクター。
  12. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物と、疎水性複合体とを含む、抗原性組成物。
  13. 前記疎水性複合体が、（ｉ）単離ミクロソームまたは（ｉｉ）ＭＨＣタンパク質または（ｉｉｉ）逆ミセルを含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記単離ミクロソームが反転ミクロソームである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 注射用または経口製剤として製剤化された、請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物を含み、適切なアジュバント、賦形剤、希釈剤および／または担体をさらに含む医薬組成物。
  16. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物または請求項１１に記載のベクターまたは請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗原性組成物を含む医薬組成物。
  17. 医薬として用いる、医薬の製造に用いる、または、アテローム動脈硬化症を治療するのに用いる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物。
  18. 医薬として用いる、医薬の製造に用いる、または、アテローム動脈硬化症を治療するのに用いる、請求項１１に記載のベクター。
  19. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物または請求項１１に記載のベクターを含むワクチン。
  20. 哺乳動物における抗アテローム動脈硬化症反応を引き起こすための、アテローム動脈硬化症を治療する、予防するもしくは低減するための、または、早期アテローム動脈硬化症を有する個体もしくはアテローム動脈硬化症を発現するリスクがあると特定された個体を治療するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物。
  21. 哺乳動物における抗アテローム動脈硬化症反応を引き起こすための、アテローム動脈硬化症を治療する、予防するもしくは低減するための、または、早期アテローム動脈硬化症を有する個体もしくはアテローム動脈硬化症を発現するリスクがあると特定された個体を治療するための、請求項１１に記載のベクター。
  22. 哺乳動物における抗アテローム動脈硬化症反応を引き起こすための、アテローム動脈硬化症を治療する、予防するもしくは低減するための、または、早期アテローム動脈硬化症を有する個体もしくはアテローム動脈硬化症を発現するリスクがあると特定された個体を治療するための、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  23. アテローム動脈硬化症形成に関連する２つの独立した経路に関連するエピトープに対する免疫反応を引き起こすための製剤の製造方法であって、
    １． 請求項１～１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの第１の種のエピトープおよび少なくとも１つの第２の種のエピトープを含むデンドロアスピン足場タンパク質を構築し、発現させることと、
    ２． 真核細胞を前記デンドロアスピン足場タンパク質とともにインキュベートすることと、
    ３． 前記真核細胞を用いて、ミクロソームを調製することと、
    ４． 前記ミクロソームおよびデンドロアスピン足場タンパク質を１つまたは複数の薬学的に許容される成分と混合して、経口または注射投与可能製剤を製造すること
    を含む方法。
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