JP7179494B2

JP7179494B2 - カートリッジ

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Publication number: JP7179494B2
Application number: JP2018105479A
Authority: JP
Inventors: 裕司前原
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Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2022-11-29
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Description

本明細書の開示は、カートリッジに関する。

従来、サンプル中に含まれる化合物や粒子といった分析対象物を分析する方法として、油中水型エマルジョンを反応場とした核酸試料デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ：ｄｉｇｉｔａｌＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法が提案されている。デジタルＰＣＲ法において、サンプルを含む反応液を物理的に独立した多数の反応場に分割する方法として、反応液の液滴をオイル中に形成する方法、すなわち、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成する方法がある。この方法では、油中水型エマルジョン中の１つ１つの液滴を反応場として用いる（特許文献１）。

特表２０１２－５０３７７３号公報

しかしながら、デジタルＰＣＲ法のＰＣＲ工程において連続相内で気泡が発生し、その気泡が熱サイクルに応じて移動を繰り返すことにより充填した液滴が損失してしまうという課題があった。

本明細書の開示は、液滴の損失を低減することを目的の一つとする。

なお、前記目的に限らず、後述する発明を実施するための形態に示す各構成により導かれる作用効果であって、従来の技術によっては得られない作用効果を奏することも本明細書の開示の他の目的の一つとして位置付けることができる。

本明細書の開示に係るカートリッジは、液滴を生成する生成部と、前記液滴を保持する保持部と、前記液滴が充填される液滴充填領域と、を有するカートリッジであって、前記カートリッジの底面に対して直交する方向において、前記保持部の高さは前記液滴充填領域の高さよりも高いことを特徴とする。

本明細書の開示によれば、液滴の損失を低減させることができる。

第１の実施形態に係るカートリッジの外観を示す図。第１の実施形態における全体の処理手順の一例を示すフロー図。第１の実施形態に係る一連の分析システムを示す図。第２の実施形態に係るカートリッジの外観を示す図。第２の実施形態における全体の処理手順の一例を示すフロー図。

以下に、本発明の好ましい実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、発明の範囲は図示例に限定されるものではない。また、本明細書において、カートリッジの底面をＸ軸とＹ軸で示し、Ｚ軸はカートリッジの高さ方向（カートリッジの底面に対して直交する方向）を示すものとする。すなわち、カートリッジは、第１の軸と第２の軸と、前記２つの軸で規定される底面に垂直な第３の軸とで形成される３次元空間上の前記底面に設置されたカートリッジである。

＜実施形態１＞
本実施形態に係るカートリッジは、試料の分析に用いることができるカートリッジである。ここでいう試料とは、検体そのものであってもよいし、検体に対して精製や濃縮、分析対象物の化学修飾や断片化など、分析のための前処理や調整を施したものであってもよい。分析対象物は、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素などが挙げられ、これらが共存していてもよい。分析対象物は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素の少なくともいずれかが共有結合等で結合または付着した分子、マイクロ粒子、ナノ粒子、さらにはウイルス、細菌、細胞などであってもよい。分析方法の一例としては、デジタルＰＣＲ法が知られている。デジタルＰＣＲ法では、分析の対象とする核酸を含む試料を、核酸を増幅するための増幅試薬、核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈し、物理的に独立した多数の反応場に分割する。エマルジョンに含まれるそれぞれの液滴はデジタルＰＣＲ法において反応場として用いられることがある。そして、多数の反応場（液滴）のそれぞれにおいて独立にＰＣＲが行われ、核酸が増幅される。増幅後に蛍光試薬により核酸を検出し、当該蛍光試薬のシグナルが検出された反応場の数（陽性反応場数）と、増幅後にシグナルが検出されなかった反応場の数（陰性反応場数）とに基づいて、試料中の核酸の濃度を推定することができる。

本実施形態に係るカートリッジは、ポリカーボネート等の透明性を有する樹脂あるいは、ガラスにより形成される。具体的には、予め定められた厚みの複数の樹脂フィルムもしくはガラスを積層することによりカートリッジを形成する。

例えば、それぞれ所定の厚みを有する、流路形状が打ち抜かれた複数の樹脂フィルムを積層することによりカートリッジを形成する。積層するための各フィルムの接合方法には、樹脂のガラス転移点未満の低い処理温度で接合が可能な表面活性化接合や分子接着を用いることができる。

なお、カートリッジにはＰＣＲ処理の工程で１００℃程度の温度が加わるため、これらの材質のガラス転移点は１００℃より高いことが望ましい。

なお、カートリッジの材質、流路形状および形成方法などは一例であり、これに限定されるものではない。

以下、図１から図３を用いて本実施形態に係るカートリッジの構成、及び濃度分析システムを用いたデジタルＰＣＲの一連の処理を説明する。

図１は本実施形態に係るカートリッジ１００の外観を示す図である。

図１（ａ）はカートリッジ１００の平面図である。図１（ｂ）はカートリッジ１００のＡ－Ａ断面を示す断面図である。図１（ｃ）はカートリッジ１００のＢ－Ｂ断面を示す断面図である。なお、図１において、カートリッジ１００の黒い部分は樹脂等で形成される部分を示しているが、図１（ａ）においては内部の構造を示すために上面の樹脂（図１（ｂ）の液滴充填領域１０４上面の黒い部分）を便宜的に除いて示している。

以下、図１（ｂ）を用いてカートリッジ１００の構成を説明する。

第１の部材１０１は、液滴を生成するための第１の液体（水相）が注入される部材である。第１の部材１０１に注入された第１の液体（水相）は、生成部１０２へと送液される。生成部１０２は、複数の孔を有しており、注入された第１の液体が複数の孔を透過することで互いに物理的に独立した複数の反応場、すなわち液滴が生成される。保持部１０３は、核酸増幅処理を施すために生成部１０２で生成された液滴を保持する。液滴充填領域１０４は、保持部１０３とＺ軸方向に異なる高さを有し、濃度推定のために核酸増幅処理が施された液滴が充填される。液滴充填領域１０４は、Ｚ軸方向の高さがおよそ２０～２００［μｍ］であると好ましい。液滴堰き止め部１０５は、液滴充填領域１０４の終端部に備えられており、液滴充填領域１０４に液滴が流入する入口の断面積よりも終端部の断面積を狭くすることにより液滴の流出を防ぐ。第２の部材１０６は、第２の液体（油相）が注入および排出される部材である。本実施例に係るカートリッジ１００において、第１の部材１０１と第２の部材１０６はそれぞれ保持部１０３と液滴充填領域１０４の上面（Ｚ軸方向）に重なるように備えられているが、側面や下面に備えられていてもよい。

次に、図１から図３を用いて本実施形態における全体の処理を説明する。

（Ｓ２０００）（第２の液体（油相）を注入する）
ステップＳ２０００において、図３に示す油相注入手段３０６によって第２の液体（油相）が注入されカートリッジに充填される。第２の液体（油相）は、油と界面活性剤とを含む。油相は水相と相溶せず分離する溶剤から成り、典型的には脂肪族炭化水素やシリコーンオイル等のオイルから成る。

また、油相注入手段３０６には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、油相注入手段３０６は、カートリッジ内に油相を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。

本ステップにおいて、第２の液体（油相）は第２の部材１０６の開口部から注入することにより、生成部１０２を透過せずにカートリッジ１００に充填することができるため充填時間は短くなる。なお、第２の液体（油相）は、第１の部材１０１の開口部から注入されてもよい。また、油相注入手段３０６によって注入される第２の液体（油相）は、カートリッジ１００全体を満たすように注入し、少なくとも生成部１０２が第２の液体（油相）に浸かる程度の量が注入されることが望ましい。

（Ｓ２０１０）（第１の液体（水相）を注入する）
ステップＳ２０１０において、水相注入手段３０５によって第１の液体（水相）が注入され、第１の部材１０１に充填される。第１の液体（水相）は反応液で構成され、反応液は水と試料と増幅試薬と蛍光試薬とを含有する。なお、反応液の構成はこれに限定されない。また、水相注入手段３０５には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、水相注入手段３０５は、カートリッジ内に水相を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。

（Ｓ２０２０）（第１の液体（水相）から液滴を生成する）
ステップＳ２０２０において、駆動手段が第１の部材１０１からカートリッジ１００内を加圧する、もしくは第２の部材１０６からカートリッジ１００内を減圧することにより、カートリッジ１００内に充填された第２の液体（油相）を駆動させる。または、両方を行うことによりカートリッジ１００内に充填された第２の液体（油相）を駆動させる。

なお、カートリッジ１００が樹脂の薄い層などの機械強度の低い素材で形成されている場合は、破壊や剥離が生じないように第２の部材１０６から駆動手段により減圧することで連続相を駆動させることが望ましい。一方、カートリッジ１００が機械強度の高い素材であれば第１の部材１０１から加圧して連続相を駆動させてもよい。

また、第１の部材１０１と第２の部材１０６のうち駆動手段を用いる方の部材には耐圧栓をつけることで圧力の抜け漏れを防ぐことができる。なお、耐圧栓は必ずしも必要ではない。

また、駆動手段は水相注入手段３０５もしくは油相注入手段３０６を用いてもよいし、これらとは異なる手段を新たに用いてもよい。すなわち、駆動手段は圧力を加えることで液体の駆動が可能な手段であれば種々の手段を用いることができる。

そして、第２の液体（油相）の駆動に伴い、ステップＳ２０１０において生成部１０２上面に充填された第１の液体（水相）が生成部１０２を透過し液滴が生成される。すなわち、第２の液体（油相）を連続相、第１の液体（水相）を含む液滴を分散相とするエマルジョンが形成される。

生成部１０２は例えば、膜状の部材に孔が複数２次元的に配置された部材であり、連続気泡の多孔質体や、繊維を縦横に配置したメッシュ、単一部材に貫通孔を配置したマイクロチャンネルが使用される。生成部１０２として使用される物質の孔の直径は、およそ２０［μｍ］であると望ましいが上記に限定されない。また、生成部１０２は、第１の部材１０１に備えられていることが望ましい。さらには、第１の部材１０１の開口部に略平行に備えられていることが望ましい。なお、液滴生成が可能な位置であれば生成部１０２が備えられる位置は上記に限定されない。

さらに、エマルジョンの形成方法も上記に限定されない。

例えば、従来公知の乳化方法である撹拌装置や超音波破砕装置などにより機械的エネルギーを付与することでエマルジョンを形成する機械乳化法が挙げられる。また、マイクロ流路乳化法やマイクロ流路分岐乳化法などのマイクロ流路デバイスを用いた方法、乳化膜を用いる膜乳化法などが挙げられる。これらの方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも機械的乳化法や膜乳化法は、マイクロ流路デバイスを用いた方法に比べて液滴の液滴径のばらつき（分散）が大きくなる傾向にあるものの、スループット良くエマルジョンを形成できる。

また、エマルジョンを形成する装置の装置構成を単純にできること、液滴の液滴径のばらつきが比較的低いエマルジョンを形成できることなどから、膜乳化法が特に望ましい。

すなわち、生成部１０２は、乳化膜であることが望ましい。

膜乳化法としては、直接膜乳化法やポンピング乳化法などを用いることができる。直接膜乳化法とは、乳化膜を介して分散相を一定圧力で押し出すことにより、押し出される側をゆっくり流れている連続相中に、エマルジョンを形成する方法である。ポンピング乳化法とは、連続相を採取したシリンジと分散相を採取したシリンジとで乳化膜を挟み、２つのシリンジから液体を交互に押し出して乳化膜を通過させることによって、エマルジョンを調製する方法である。

なお、ポンピング乳化法においては、２つのシリンジの一方に連続相と分散相の混合物を採取しておき、もう一方のシリンジは空にしておいてもよい。ポンピング乳化法においては、それぞれシリンジと接続可能な一対のコネクターの間に乳化膜を挟み込んだポンピング式の乳化デバイスを用いることができる。

（Ｓ２０３０）（カートリッジを傾動させ、保持部に液滴を保持する）
ステップＳ２０３０において、傾動手段（不図示）がカートリッジ１００を傾動させることで、連続相となる第２の液体（油相）を駆動し、ステップＳ２０２０で生成した液滴を保持部１０３に保持する。傾動手段には、例えばチルトステージなどを用いることができる。なお、チルトステージはカートリッジ１００を傾動させるための手段の一例であり、角度を傾けることで連続相を駆動できる手段であればこれに限定されない。さらに、連続相を駆動させるために傾ける角度も限定されない。また、本実施例ではステップＳ２０２０で液滴を生成した後にカートリッジ１００を傾動させたが、ステップＳ２０００の段階で既にカートリッジ１００を傾動させておいてもよい。すなわち、本ステップＳ２０３０で行う傾動手段によるカートリッジ１００の傾動は、Ｓ２０４０以前のステップであればいつ行われてもよい。

（Ｓ２０４０）（カートリッジに熱サイクルを付加する）
ステップＳ２０４０において、温度調整手段（不図示）によりステップＳ２０３０で保持部１０３に保持された液滴に含まれる核酸試料に対するＰＣＲ処理が行われる。具体的には、温度調整手段は、ペルチェ素子とコントローラを含み、カートリッジ１００の保持部１０３に保持された液滴内で核酸増幅反応を発生させている。温度調整手段には、例えばサーマルサイクラーを用いることができる。核酸の増幅反応としては、液滴（反応場）をサーマルサイクルに供することで反応を進行させるＰＣＲ法やＬＣＲ（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法を用いることができる。また、液滴（反応場）をサーマルサイクルに供さずに温度調整することで反応を進行させるＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（ＩｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法なども用いることができる。なお、温度調整手段として用いられる装置や核酸増幅の方法は上記に限定されない。また、サーマルサイクルをかける際に、液滴損失の原因となる気泡を液滴から遠ざけやすくするために保持部１０３のＺ軸方向の高さは高い方が好ましい。なお、保持部１０３のＺ軸方向の高さは高いほど気泡が逃げやすいが、カートリッジの熱容量が大きくなり長い処理時間が必要となるため、０．２～０．８ｍｍの寸法に収めることが望ましい。

（Ｓ２０５０）（カートリッジを傾動させ、液滴充填領域に液滴を保持する）
ステップＳ２０５０において、傾動手段がカートリッジ１００を傾動させることにより連続相となる第２の液体（油相）を駆動し、内部の核酸を増幅させた液滴を保持部１０３から保持部１０３とはＺ軸方向に異なる高さを有する液滴充填領域１０４へと駆動する。なお、液滴充填領域１０４は保持部１０３よりもＺ軸方向の高さが低いことが望ましい。これは、液滴充填領域１０４は保持部１０３と同じ高さにしてしまうと液滴観察時に分析結果の信頼度劣化の原因となる液滴の重なりが生じやすくなってしまうためである。

（Ｓ２０６０）（液滴内の核酸増幅産物有無を観察する）
ステップＳ２０６０において、カートリッジ１００は，観察ステージに移送され蛍光などの光が計測される。すなわち、Ｓ２０４０において増幅された試料中の分析対象物の分析が行われる。蛍光は照明手段（不図示）と観察手段（不図示）とで計測され、照明手段は、所定の波長の光を液滴充填領域１０４に充填された複数の液滴に照射する。照明手段としては、ＬＥＤライト、ハロゲンランプおよび蛍光灯などを用いることができる。観察手段は、光が照射された複数の液滴のそれぞれから発せられたシグナルを検出し、液滴内増幅産物の有無を観察する。また、液滴径の測定を行う。観察手段としては、フォトダイオードやラインセンサ、イメージセンサ（撮像素子）等を用いることができ、中でも、多数の液滴について一括してシグナルの検出ができる点で、イメージセンサを用いることが好ましい。イメージセンサとしては、ＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサを用いることができる。観察手段は、イメージセンサを備えたデジタルカメラであってもよい。

なお、本ステップＳ２０６０において、観察時に液滴の流動を抑制するために観察ステージは傾動する機構を有していてもよい。

（Ｓ２０７０）（核酸増幅前の試料の核酸濃度を推定する）
ステップＳ２０７０において、Ｓ２０６０で行われた観察の結果から試料の全体積に対する増幅産物を含まない液滴の体積の割合からプロセッサ（不図示）が試料内の濃度推定を行う。

（分析対象物の濃度の計算）
分析対象物の濃度の計算は、従来行われているデジタル分析における濃度計算方法を採用して実施することができる。温度調整手段における反応の前に、それぞれの反応場が含む分析対象物が１個または０個のいずれかであるとみなせる場合について説明する。この場合は、分析対象物が検出された反応場（陽性反応場）の数ｘを、観察手段が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓの反応液中に含まれていた分析対象物の数とみなすことができる。よって、下記式（１）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、観察手段が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓは、観察手段から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝ｘ／Ｖｓ・・・式（１）

また、例えば、温度調整手段における反応の前に、１つの反応場に複数個の分析対象物が入り得るとみなせる場合は、ポアソンモデルによる補正を行うことで、分析対象物の濃度を計算することができる。この場合は、温度調整手段における反応の前にそれぞれの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定することにより、分析対象物の濃度算出を行う。具体的には、観察手段が分析対象物の検出の対象とした反応場について、１つの反応場に含まれる分析対象物の平均個数をＣとすると、１つの反応場にｎ個の分析対象物が含まれる確率は、ポアソンモデルの式から、下記式（２）のように表される。
Ｐ（ｎ，Ｃ）＝（Ｃ^ｎ－ｅ^－Ｃ）／ｎ！・・・式（２）

ここで、１つの反応場が分析対象物を１つも含まない確率は、式（２）においてｎ＝０として、下記式（３）で表される。
Ｐ（０，Ｃ）＝ｅ－Ｃ・・・式（３）

温度調整手段における反応の前に１つの反応場中に少なくとも１つの分析対象物が含まれていれば、その反応場からはシグナルを検出することができるが、反応の前にその反応場に含まれていた分析対象物の数の情報までは分からない。そこで、観察手段が検出対象とした反応場の総数に対する、分析対象物が検出されなかった反応場の割合（シグナルが検出されなかった反応場の割合）に基づいて、式（３）を用いて、検出対象とした反応液中に含まれていた分析対象物の個数を推定する。

具体的には、シグナルが検出された反応場の個数またはシグナルが検出されなかった反応場の個数と、検出対象とした反応場の総数とから、シグナルが検出されなかった反応場の割合Ｆ０を算出する。そして、下記式（４）から、検出対象とした反応場に、温度調整手段における反応の前に１つの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定する。
Ｃ＝－ｌｎ（Ｆ０）・・・式（４）

ここで、観察手段が分析対象物の検出対象とした反応場の平均体積をｖとすると、下記式（５）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、観察手段が分析対象物の検出の対象とした平均体積ｖは、観察手段から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝Ｃ／ｖ・・・式（５）

なお、反応液中の分析対象物の濃度λｒは、分析対象物の平均個数Ｃと反応場の数を乗じて得られる分析対象物の総数と、反応場の平均体積ｖと反応場の数を乗じて得られる反応場の総体積と、に基づいて算出してもよい。

このようにして得られた、反応液中の分析対象物の濃度は、検体またはサンプルから反応液を調整した際の希釈倍率を用いることによって、検体またはサンプル中の分析対象物の濃度に換算することができる。

上記の処理によれば、デジタルＰＣＲの一連の処理において、ＰＣＲ工程と、試料の分析工程とでそれぞれ高さが異なる２つの領域に液滴を保持することにより分析対象となる液滴の損失を低減させることができる。

＜実施形態２＞
本実施形態に係る図４に示すカートリッジ４００は、実施形態１と同様に試料の分析に用いることができるカートリッジ４００である。本実施形態に係るカートリッジ４００は、実施形態１と比較し、保持部１０３が第１の流路４０３と液滴保持領域４０４と第２の流路４０５とがＵ字型に連通した流路形状で形成されている。これにより、ＰＣＲ工程において液滴損失の原因となる気泡を、液滴から遠ざけやすくなり液滴の損失をより防ぐことができる。

以下、図４を用いて本実施形態の構成を説明する。

本実施形態に係るカートリッジ４００の構成は、実施形態１と同様である。しかし、第１の流路４０３、液滴保持領域４０４、第２の流路４０５、液滴充填領域４０７、排出部４０９は実施形態１と構成が異なるため、以下でその構成を説明する。その他の構成については、実施形態１と構成が同じであるため、説明を省略する。

図４は本実施形態に係るカートリッジ４００の外観を示す図である。

図４（ａ）はカートリッジ４００の平面図である。図４（ｂ）はカートリッジ４００のＡ－Ａ’断面を示す断面図である。図４（ｃ）はカートリッジ４００のＢ－Ｂ’断面を示す断面図である。なお、図４において、カートリッジ４００の斜線部分は樹脂等で形成される部分を示しているが、図４（ａ）においては内部の構造を示すために上面の樹脂（図４（ｂ）の液滴充填領域４０７上面の斜線部分）を便宜的に除いて示している。

以下、図４（ｂ）を用いてカートリッジ４００の構成を説明する。

図４（ｂ）において、第１の流路４０３は、第１の部材４０１および液滴保持領域４０４と接続されている。液滴保持領域４０４は、核酸増幅処理を施すために生成部４０２で生成された液滴を保持する。第２の流路４０５は、液滴保持領域４０４、液滴充填領域４０７および第２の部材４１０と接続されている。液滴充填領域４０７は、複数の領域に分岐しており、それぞれ異なる液滴径の液滴が充填される。なお、液滴充填領域４０７は実施形態１に示すような１つの領域でもよい。排出部１０９は、第２の液体が排出される部材である。

また、第１の流路４０３、液滴保持領域４０４及び第２の流路４０５はＵ字型に連通している。

具体的には、まずカートリッジを形成するための樹脂やガラスを板状に生成する。次に、第２層～第４層のようにＵ字を含む流路形状に板を打ち抜く。このとき、各フィルムの流路形状はトムソン型等により打ち抜かれており、全ての層を積層した際に打ち抜かれた流路が全て連通するように加工されている。そして、打ち抜かれた各層を積層し、ガラス転移点未満の低い処理温度で接合が可能な表面活性化接合や分子接着を用いて接合することにより連通した流路を有するカートリッジを製造する。

なお、上記に示すカートリッジの材質、流路形状および形成方法などは一例であり、これに限定されるものではない。

図５は、カートリッジ４００を用いて行われる全体の処理手順のフローチャートを示している。ステップＳ５０００からステップＳ５０２０、ステップＳ５０４０、ステップＳ５０６０、ステップＳ５０７０は、実施形態１のステップＳ２０００からステップＳ２０２０、ステップＳ２０４０、ステップＳ２０６０、ステップＳ２０７０と同様の処理を行うため、説明を省略する。以下、図２のフローチャートとの相違部分についてのみ説明する。

（Ｓ５０３０）（カートリッジを傾動させ、液滴保持領域に液滴を保持する）
ステップＳ５０３０において、傾動手段（不図示）がカートリッジ４００を傾動させることで、連続相となる第２の液体（油相）を駆動させる。そして、連続相の駆動に伴い生成部４０２により生成された液滴は、第１の流路４０３を通り液滴保持領域４０４に保持される。これは、分散相の比重を連続相の比重よりも高く設定することにより、カートリッジ４００を傾斜させることで生成した液滴が図３に示すように傾けた側に滞留するためである。傾動手段には、例えばチルトステージなどを用いることができる。なお、チルトステージはカートリッジ４００を傾動させるための手段の一例であり、角度を傾けることで連続相を駆動できる手段であればこれに限定されない。さらに、連続相を駆動させるために傾ける角度も限定されない。また、本実施例ではステップＳ５０２０で液滴を生成した後にカートリッジ４００を傾動させたが、ステップＳ４０００の段階で既にカートリッジ４００を傾動させておいてもよい。すなわち、本ステップＳ５０３０で行う傾動手段によるカートリッジ４００の傾動は、Ｓ５０４０以前のステップであればいつ行われてもよい。

上記によれば、連続相を駆動させる場合にカートリッジ４００に対して応力を加えなくてよいので、圧力変動による液滴の損失を防ぐことができ分析の信頼性を向上することができる。

さらに、液滴保持領域４０４に液滴が流れるような角度にカートリッジ４００を傾動させることにより、比重の軽い気泡は液滴保持領域４０４から遠ざかるため生成した液滴をカートリッジ４００に混入した気泡から遠ざけて保持することができる。上記により、ステップＳ５０４０において、液滴をサーマルサイクルにかける際に気泡の膨らみによる液滴の損失を防ぐことができる。なお、上記の効果は第１の流路４０３および第２の流路４０５のＺ軸方向の高さを液滴保持領域４０４のＺ軸方向の高さよりも高くすることでより効果を奏する。具体的には、上記によれば液滴保持領域４０４から第１の流路４０３及び第２の流路４０５へと気泡が押し出される方向の圧力が、第１の流路４０３及び第２の流路４０５から液滴保持領域４０４へと気泡が入り込もうとする圧力よりも大きくなる。そのため、第１の流路４０３と第２の流路４０５の方へ気泡が逃げやすくなる。また、液滴保持領域４０４のＺ軸方向の高さは高いほど気泡が逃げやすいが、カートリッジの熱容量が大きくなり長い処理時間が必要となるため、０．２～０．８［ｍｍ］の寸法に収めることが望ましい。なお、液滴保持領域のＺ軸方向の高さは上記に限定されず、例えば、第１の流路４０３と第２の流路４０５と同じ高さであってもよい。

また第１の流路４０３のＹ軸方向の幅の長さは、第２の流路４０５のＹ軸方向の幅の長さよりも長いことが望ましい。すなわち、第１の流路４０３の幅は、第２の流路４０５の幅以上であることが望ましい。上記によれば、安定した液滴生成が可能となる。なお、第１の流路のＹ軸方向の幅の長さは長くなりすぎるとＰＣＲ工程において、長い処理時間が必要となるため１～５［ｍｍ］の寸法に収めることが望ましい。

（Ｓ５０５０）（カートリッジを傾動させ、液滴充填領域に液滴を充填する）
ステップＳ５０５０において、ＰＣＲ処理を施した液滴を液滴充填領域４０７に充填する。具体的には傾動手段がカートリッジ４００を傾動させることで、連続相となる第２の液体（油相）を駆動させる。そして、連続相の駆動に伴い液滴保持領域４０４でＰＣＲ処理を施された液滴は、第２の流路４０５を通り液滴充填領域４０７へと充填される。

本実施例では、第２の流路４０５を通り液滴が流れる液滴充填領域４０７は８本に分岐しており、図４（ｃ）のＢ－Ｂ断面図に示されるように夫々のＺ軸方向の高さは７０［μｍ］と９０［μｍ］である。液滴充填領域４０７の入口部４０６のＺ軸方向の高さは、取り扱う分散相の平均液滴径およびその分散によって、低すぎると球体である分散相形状を変形させてしまい濃度の推定精度に影響する。一方、高すぎると分散相が観察方向に重なり、観察が難しくなる。したがって、本分析システムにおいてはおおよそ２０～２００［μｍ］の値であることが望ましい。なお、液滴充填領域４０７の本数及び高さはこれに限定されず、液滴充填領域４０７の入口部４０６のＺ軸方向の高さは液滴充填領域毎に必ずしも変える必要はなく一律でもよい。

さらに、各液滴充填領域のＺ軸方向の高さは、上流側の液滴充填領域ほど低くすることが望ましい。上流側の液滴充填領域のＺ軸方向の高さを下流側の液滴充填領域より高くすると、上流側の液滴充填領域には小径の液滴も一緒に充填されてしまう。そのため、ステップＳ５０６０において液滴内の核酸増幅産物の有無を観察する際に液滴が重なって見えてしまい定量精度が落ちてしまう。

そのため、上流側の液滴充填領域のＺ軸方向の高さを低くし、小径の液滴を先に上流側の液滴充填領域に充填することで下流側の液滴充填領域には大径の液滴が充填され、液滴の重なりを防ぐことができる。

また、入口部４０６において断面のＺ軸方向の高さを変えずに、Ｘ軸方向の幅を変えることによって充填される液滴を液滴径ごとに分けてもよい。この場合、例えば高さは変えずに、Ｘ軸方向の幅を７０［μｍ］と９０［μｍ］とする。上記によれば、液滴を液滴径毎に振り分けて液滴充填領域に充填する場合に液滴充填領域４０７のＺ軸方向の高さを高くする必要がないので観察する際に液滴が重なることをより防ぐことができる。なお、入口部４０６のＺ軸方向の高さとＸ軸方向の幅の両方を変えてもよい。

また、液滴充填領域４０７は入口部４０６の断面積と、液滴充填領域内部の任意の断面の断面積とが異なる構成であってもよい。例えば、入口部４０６の断面積に対して内部の断面積を大きくする。上記によれば、入口部４０６の断面積で各液滴充填領域に流入する液滴の液滴径を絞り、かつ液滴充填領域内部により多くの液滴を充填することができる。

さらに、液滴充填領域４０７の底面の高さは液滴充填領域毎に共通している必要はない。

液滴充填領域４０７に充填された液滴は終端部の液滴堰き止め部４０８によって流動が抑制される。液滴堰き止め部４０８は液滴充填領域終端部の断面積が、充填される液滴の断面積より小さくなるような大きさで設けられる。例えば、入口部４０６の断面積の大きさが７０［μｍ］で生成部１０２が生成する液滴の平均径が６０［μｍ］である場合には、断面積が４０［μｍ］の液滴堰き止め部４０８を液滴充填領域４０７の終端部に設ける。上記のように液滴堰き止め部４０８を設けることにより、連続相は流れるが充填される液滴のカートリッジ４００外部への流動は抑制することができる。すなわち、液滴が自由に動ける範囲を狭めることによって、液滴の流出を防止できるため観察可能な液滴量が増える。また、液滴堰き止め部４０８を設けることにより観察時に妨げとなる液滴の流動によるアーチファクトを低減することができるため無駄なく液滴を観察することができる。なお、本実施例では液滴堰き止め部４０８は、液滴充填領域４０７の上面に備えられているが、下面に備えられていてもよい。

本実施形態によると、ＰＣＲ工程において液滴を保持する領域と、観察工程において液滴を充填する領域を分け、Ｚ軸方向の高さを変えることにより発生する気泡をより遠ざけながら液滴に熱サイクルを付加することができるため、液滴の損失を防ぐことができる。

１０１第１の部材
１０２生成部
１０３保持部
１０４液滴充填領域
１０５液滴堰き止め部
１０６第２の部材

Claims

核酸を含む試料の分析に用いられるカートリッジであって、
前記試料を含む液滴を生成する生成部と、
前記核酸を増幅するために前記液滴を保持する保持部と、
増幅された前記核酸を含む前記液滴が充填され、前記液滴の観察が行われる液滴充填領域と、を有し、
前記カートリッジの底面に対して直交する方向において、
前記保持部における前記カートリッジの底面から上面までの高さは、
前記液滴充填領域における前記カートリッジの底面から上面までの高さよりも高いことを特徴とするカートリッジ。
前記保持部は、第１の流路と液滴保持領域と前記液滴充填領域に連通している第２の流路とを含み、前記第１の流路と前記液滴保持領域と前記第２の流路とはＵ字型に連通していることを特徴とする請求項１に記載のカートリッジ。
前記底面に対して直交する方向において、前記液滴保持領域における前記カートリッジの底面から上面までの高さは、前記液滴充填領域における前記カートリッジの底面から上面までの高さよりも高いことを特徴とする請求項２に記載のカートリッジ。
前記底面に対して直交する方向において、前記第２の流路における前記カートリッジの底面から上面までの高さは、前記液滴保持領域における前記カートリッジの底面から上面までの高さよりも高いことを特徴とする請求項２または請求項３に記載のカートリッジ。
前記底面に対して直交する方向において、前記第１の流路における前記カートリッジの底面から上面までの高さは、前記液滴保持領域における前記カートリッジの底面から上面までの高さよりも高いことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載のカートリッジ。
前記第１の流路の幅は前記第２の流路の幅以上の長さであることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載のカートリッジ。
前記保持部は、前記液滴に熱を付加する際に前記液滴を保持することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
前記カートリッジはデジタルＰＣＲ法による分析に用いられることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のカートリッジ。