JP7144453B2 - 多視点撮像による三次元蛍光偏光のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Description
プロトタイプの顕微鏡システムを、この方法を実施に移すことができるように構築した。プロトタイプ顕微鏡システムは、各対物レンズを通して偏光励起を生成するための偏光光学系を装備した非対称対物レンズ(図1に示す第1及び第2の対物レンズ110及び108に対応する、ニコンNA1.1、スペシャルオプティクス社0.71NA)を有するデュアルビュー倒立SPIMを含んでいた。この方法を実証するため、Alexa Fluor(登録商標)488ファロイジンで免疫染色したアクチンフィラメントを画像化した。この標識はアクチンフィラメントに強く結合し、結合したフィラメントの相対配向及び分極励起に依存する強く分極した蛍光を生成する。8つの容積積スタックを得たが、まず、108の異なる配向(0°、45°、90°、及び135°、図5の実施例、左側)によって導入された偏光照射で試料を励起し、110を通して蛍光を収集し、次にこの過程を、110を通して偏光照射(配向0°、45°、90°、及び135°、108を通して蛍光を収集)によって繰り返すことによって得た。
Claims (15)
- 光ビームを放射するための光源と、
前記光ビームを偏光ビームに変換するための第1の偏光光学系と、
前記偏光ビームを第1の偏光ビームと第2の偏光ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第1の偏光ビームが第1の角度に沿って試料を照射することで第1の蛍光発光を生成するように、第1の軸に沿って配向された第1の対物レンズと、
前記第2の偏光ビームが、前記第1の角度に対して平行でない第2の角度で前記試料を照射することで第2の蛍光発光を生成するように、第2の軸に沿って配向された第2の対物レンズと、
前記第2の蛍光発光から画像を受け取るために前記第1の対物レンズと連通している第1の検出器と、
前記第1の蛍光発光から画像を受け取るために前記第2の対物レンズと連通している第2の検出器と、
前記第1の対物レンズからの前記第2の蛍光発光及び前記第2の対物レンズからの前記第1の蛍光発光の画像を受信するために、前記第1の検出器及び前記第2の検出器それぞれと通信し、前記第1の対物レンズ及び前記第2の対物レンズによってそれぞれ検出された前記第1の蛍光発光及び前記第2の蛍光発光に基づいて、1つ又は複数の三次元構造に結合した励起双極子の配向分布を生成するプロセッサと、を含む、
蛍光顕微鏡システム。 - 前記第1の対物レンズの前記第1の軸と、及び前記第2の対物レンズの前記第2の軸とに対して非平行の関係である第3の軸に沿って配向された第3の対物レンズと、
前記試料からの第3の蛍光発光を検出する第3の検出器と、をさらに含む、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。 - 第3の蛍光発光から画像を受け取るための第3の検出器と連通している第3の対物レンズをさらに含む、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。
- 前記第3の検出器は、前記第3の対物レンズからの前記第3の蛍光発光の画像を受信するためのプロセッサと通信する、請求項3に記載の蛍光顕微鏡システム。
- 前記試料を照射する前に前記第1の偏光ビームの偏光をさらに変更するための前記第1の対物レンズに関連する第2の偏光光学系と、
前記試料を照射する前に前記第2の偏光ビームの偏光をさらに変更するための前記第2の対物レンズに関連する第2の偏光光学系と、
をさらに含む、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。 - 前記第1の偏光光学系が、波長板、偏光子、及び液晶を含む、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。
- 前記第1の偏光ビームを前記第1の対物レンズに向け直すために前記ビームスプリッタと連通する第1のダイクロイックミラーと、
前記第2の偏光ビームを前記第2の対物レンズに向け直すために前記ビームスプリッタと連通する第2のダイクロイックミラーと、
をさらに含む、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。 - 前記第1の対物レンズ及び前記第2の対物レンズは、前記第1の偏光ビーム及び前記第2の対物レンズをそれぞれ交互に用いて前記試料を照射する、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。
- 前記第1の対物レンズ及び前記第2の対物レンズが、それぞれ前記第1及び第2の蛍光発光を交互の順序で検出する、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。
- 前記第2の対物レンズによって検出される前記第1の蛍光発光は、前記第2の対物レンズの前記第2の軸に対して非平行な関係にある第1の平面に沿って配向され、
前記第1の対物レンズによって検出される前記第2の蛍光発光は、前記第1の対物レンズの前記第1の軸に対して非平行な関係にある第2の平面に沿って配向される、請求項1に記載の蛍光顕微鏡システム。 - レーザ光ビームを放射するためのレーザ源と、
前記レーザ光ビームを偏光ビームに変換するための第1の偏光光学系と、
前記偏光ビームを第1の偏光ビームと第2の偏光ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第1の偏光ビームが第1の角度に沿って試料を照射することで第1の複数の励起双極子から第1の蛍光発光を生成するように、第1の軸に沿って配向された第1の対物レンズと、
前記第2の偏光ビームが前記第1の角度に対して平行でない第2の角度で前記試料を照射することで第2の複数の励起双極子から第2の蛍光発光を生成するように第2の軸に沿って配向された第2の対物レンズと、
前記第1の複数の励起双極子及び前記第2の複数の励起双極子のそれぞれの位置及び配向を決定するために、前記第1の蛍光発光及び前記第2の蛍光発光を受信するプロセッサと、を含み、
前記第1の対物レンズは前記第1の軸に対して垂直な角度で配向された前記第1の複数の励起双極子を検出するように配向され、前記第2の対物レンズは前記第2の軸に対して垂直な角度で配向された前記第2の複数の励起双極子を検出するように配向される、蛍光顕微鏡システム。 - 前記第1の対物レンズは前記第1の軸に対して平行な角度で配向された前記第1の複数の励起双極子を検出しないように配向され、前記第2の対物レンズは前記第2の軸に対して平行な角度で配向された前記第2の複数の励起双極子を検出しないように配向される、請求項11に記載の蛍光顕微鏡システム。
- レーザ光ビームを生成するステップと、
前記レーザ光ビームを偏光ビームに変換するステップと、
前記偏光ビームを第1の偏光ビームと第2の偏光ビームに分割するステップと、
第1の角度に沿って配向された第1の対物レンズを介して試料を照射することで第1の蛍光発光を生成するステップと、
前記第1の角度に対して平行でない第2の角度に配向された第2の対物レンズを介して前記試料を照射することで、第2の蛍光発光を生成するステップと、
第1の軸に対して非平行な関係にある平面に沿って配向された前記第2の対物レンズを介して前記第2の蛍光発光の第1の複数の励起双極子を検出し、第2の軸に対して非平行な関係にある第2の平面に沿って配向された前記第1の対物レンズを介して前記第1の蛍光発光の第2の複数の励起双極子を検出するステップと、
各偏光状態について1つ以上の検出器を介して前記第1及び第2の蛍光発光の一連の画像を収集するステップと、
前記第1及び第2の複数の励起双極子のそれぞれの位置及び配向を決定するために、前記第1及び第2の蛍光発光の前記収集された一連の画像を処理するステップと、を含む、
試料からの蛍光発光によって生成される励起双極子の位置及び配向を決定する方法。 - 前記レーザ光ビームの偏光状態が任意に変更される、請求項13に記載の方法。
- 前記第1及び第2の蛍光発光の前記収集された一連の画像を処理するときに、再構成アルゴリズムが適用される、請求項14に記載の方法。
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