JP7131830B2 - ローリングサークル増幅法を利用した標的分子の検出法 - Google Patents
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Description
また、特許文献2および非特許文献1には、一本鎖環状DNA、プライマーおよびグアニン四重鎖結合試薬を用いたポリヌクレオチドの検出方法が開示されているが、タンパク質などの非核酸分子の検出法への応用は開示されていない。
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、第1の領域と、その3’側に連結された第2の領域とを含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第1のアプタマー配列と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な配列とを含み
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第2の領域に相補的な配列と、その3'側に連結された前記標的分子に結合する第2のアプタマー配列とを含む、
方法、が提供される。
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、第1の一本鎖環状DNAとからなる第1の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第1の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第2の一本鎖環状DNAと第2のオリゴヌクレオ
チドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第2のオリゴヌクレオチドプライマーと第2の一本鎖環状DNAとからなる第2の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第2の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第1の一本鎖環状DNAは、第1の領域と、その3’側に連結された第2の領域と、第2の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第1のプライマーは、標的分子に結合する第1のアプタマー配列とその3’側に連結された、第1の一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な配列と、を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第1の一本鎖環状DNAの第2の領域に相補的な配列とその3'側に連結された標的分子に結合する第2のアプタマー配列と、を含み、
前記第2の一本鎖環状DNAは、第1の一本鎖環状DNAにおける第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の5’側に隣接した、第2のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、第1の一本鎖環状DNAにおける第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列の5’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の3’側に隣接した、第2の一本鎖環状DNAの第2のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法が提供される。
第1の領域と、その3’側に連結された第2の領域とを含む一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第1のアプタマー配列と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び
一本鎖環状DNAの第2の領域に相補的な配列と、その3'側に連結された前記標的分子に結合する第2のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含む、標的分子の検出用試薬、が提供される。
本明細書において、標的分子は、第1のアプタマー配列と第2のアプタマー配列に結合できる分子であれば特に制限されないが、非核酸分子が好ましく、タンパク質やペプチド、低分子化合物などが挙げられ、糖、ビタミン、ホルモン、補酵素なども含まれる。
例えば、ホルモンとしては、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン(prostglandin)、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどが例示される。
タンパク質としては、トロンビンなどの血液凝固因子、ウイルス由来タンパク質、サイトカインや増殖因子(上記ホルモンにも該当し得る)、腫瘍マーカーなどの疾患マーカータンパク質などが例示される。
本発明の第1の態様にかかる標的分子の検出方法は、
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含む。
<一本鎖環状DNA>
一本鎖環状DNAは、第1の領域と、その3’側に連結された第2の領域とを含み、好ましくは、さらにグアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含む。
22mer DNA(22AG:5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' (配列番号1)および
22Kit:5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'(配列番号2))、
26mer DNA(26Tel:5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'(配列番号3))、
27mer DNA(27Myc:5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'(配列番号4))、
20mer DNA(20Src:5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'(配列番号5))、
18mer RNA(18Ras:5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'(配列番号6))。
オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第1のアプタマー配列と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な配列とを含む。オリゴヌクレオチドプライマーの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、アプタマーの結合特性、ハイブリダイズ特性および伸長特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図1では、オリゴヌクレオチドプライマー12は、標的分子14に結合する第1のアプタマー配列121と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域101に相補的な配列122とを含む。第1のアプタマー配列121の長さは通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%であり、一本鎖環状DNAの第1の領域101に相補的な配列122の長さは好ましくは7~8塩基である。
なお、プライマーは担体に固定化するなどして固相化されてもよい。これにより固相での検出も可能となる。固相化法としては、ビオチンなどでプライマーを標識し、アビジン等との相互作用により固相化する方法などが挙げられる。
標的分子に結合する2種類のアプタマー配列を第1および第2のアプタマー配列として使用すればよい。
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第2の領域に相補的な配列と、
その3'側に連結された前記標的分子に結合する第2のアプタマー配列とを含む。キャプチャーオリゴヌクレオチドの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、ハイブリダイズ特性やアプタマーの結合特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図1で説明すると、キャプチャーオリゴヌクレオチド11は、一本鎖環状DNA10の第2の領域102に相補的な配列111と、その3'側に連結された前記標的タンパク質に結合する第2のアプタマー配列112とを含む。
配列111および配列112の長さは、通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%である。
なお、第2のアプタマー配列112から非特異的な伸長反応が進行しないようにするために第2のアプタマー配列112の3’末端はリン酸基などで修飾されていることが好ましい。
標的分子14が存在すると、標的分子14と、キャプチャーオリゴヌクレオチド11と、一本鎖環状DNA10と、オリゴヌクレオチドプライマー12との4者複合体が形成され、その結果、ローリングサークル増幅(RCA)法によって核酸増幅反応が行われる。
ただし、検出部分にアプタマーを用いるため、1価のアルカリ金属イオンや2価のアルカリ土類金属イオンを含有した反応液を用いることが望ましく、これら1種または2種以上の塩濃度は適宜設定できる。ただし、高塩濃度になるとローリングサークルアンプリフィケーション(RCA)の反応を阻害するため、これらの金属イオンの塩濃度は0から20mMまでが望ましい。
本発明の第2の態様にかかる遺伝子変異検出方法は、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、第1の一本鎖環状DNAとからなる第1の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第1の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第2の一本鎖環状DNAと第2のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第2のオリゴヌクレオチドプライマーと第2の一本鎖環状DNAとからなる第2の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第2の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含む。
第2の態様におけるキャプチャーオリゴヌクレオチドおよび第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、第一の態様で説明したのと同様である。
第1の一本鎖環状DNAは、第1の領域と、その3’側に連結された第2の領域と、第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列を含む。
第1の一本鎖環状DNA20は、第1の領域201(プライマー結合配列)と、第2の領域202(キャプチャーオリゴヌクレオチド21の第1の領域211に相補的な配列)と、第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列203を含む。
第1の領域201の長さは、好ましくは7塩基または8塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは30~70%である。第2の領域202の長さは通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%である。第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列203の長さは、通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%である。第1の一本鎖環状DNA20全体の長さは、好ましくは35~100塩基である。第1の一本鎖環状DNA20は上述した方法で、一本鎖DNA(ssDNA)を環状化することによって得ることができる。
第2の一本鎖環状DNA24は、第1の一本鎖環状DNA20の第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列203と同一の配列241と、
該配列の5’側に隣接した、第2のプライマー結合配列242と、
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列243と、
を含む。
配列203の長さは、通常、10~30塩基であり、好ましくは15~25塩基であり、GC含量は好ましくは30~70%である。配列242の長さは7塩基または8塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは30~70%である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列243については、第一の態様で説明したのと同様である。第2一本鎖環状DNA24全体の長さは、好ましくは35~100塩基である。第2の一本鎖環状DNA24は上述した方法で、一本鎖DNA(ssDNA)を環状化することによって得ることができる。
第2のオリゴヌクレオチドプライマー25は、第1の一本鎖環状DNA20の第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列203の5’側に隣接した領域204と同一の配列251(好ましくは8~15塩基の配列)と、該配列の3’側に隣接した、第2の一本鎖環状DNAの第2のプライマー結合配列242に相補的な配列252(好ましくは7~8塩基の配列)と、を含む。第2のオリゴヌクレオチドプライマーの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、ハイブリダイズ特性および伸長特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図2に示されるように、
標的分子27が存在すると、標的分子27と、キャプチャーオリゴヌクレオチド21と、一本鎖環状DNA20と、プライマー22との4者複合体が形成され、その結果、ローリングサークル増幅(RCA)法によって核酸増幅反応が行われる。反応条件等は第一の態様と同様である。RCAによって、標的分子27依存的に、プライマー22から第1の一本鎖環状DNA20に沿って第1増幅産物23が増幅される。
このようにしてできた、第1の増幅産物23と、第2の一本鎖環状DNAの複合体に、第2のオリゴヌクレオチドプライマー25がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
また、第2のオリゴヌクレオチドプライマー25は、配列251の3’側に、第2の一本鎖環状DNA24の第2のプライマー結合配列242に相補的な配列252を有するので、第2の一本鎖環状DNA24にも配列252を介してハイブリダイズする。
上記の通り、検出試薬結合配列と検出試薬の組み合わせは任意に決定でき、アプタマー配列とアプタマー結合性発色分子の組み合わせ、分子ビーコン結合配列と分子ビーコンの組み合わせ、特異的配列とそれにハイブリダイズする標識プローブの組み合わせなどを用いてることもできるが、好ましくはグアニン四重鎖とグアニン四重鎖結合試薬の組み合わせである。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
[1]チオフラビンT(ThT)またはその誘導体
[6]APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V .T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
XはO、SまたはNHを示し、より好ましくはOである。
上述したような、
第1の領域と、その3’側に連結された第2の領域とを含む一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第1のアプタマー配列と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び
一本鎖環状DNAの第2の領域に相補的な配列と、その3'側に連結された前記標的分子に結合する第2のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含む。
一本鎖環状DNAは、さらにグアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含んでもよい。
本発明の標的分子検出試薬は、さらに、上記第2の一本鎖環状DNAや第2のオリゴヌクレオチドプライマー、さらには、グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬を含んでもよい。
スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法
図4 a1~a5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nM Positive control Primer 2μL (最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0~1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0~50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0~1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0~50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0~1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0~50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1μMトロンビン溶液2μL (最終濃度100nM)を混合した(計20μL)。
スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法(他分子での未反応の確認)
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMトロンビン(Thr)2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMリゾチーム(Lys)2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMレクチン(Lec)2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMストレプトアビジン(SA)2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。
スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法(タンパク混合溶液での反応進行確認)
図6 a1~a4の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、ターゲット溶液(トロンビン/リゾチームLys、トロンビン/レクチンLec、トロンビン/ストレプトアビジンSAの2種類混合物、または、トロンビン/Lys,Lec,SAの四種混合物のいずれか)2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMターゲット溶液(リゾチームLys、レクチンLec、ストレプトアビジンSA、または、Lys,Lec,SAの三種混合物のいずれか)2μLを混合した(計20μL)。
スプリットアプタマーを用いたストレプトマイシン検出法
図8 a1~a2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMストレプトマイシン2μL(最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMアンピシリン2μL(最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMカナマイシン2μL(最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。
スプリットアプタマーを用いたストレプトマイシンの検出法(塩濃度の検討)
図9 a1~a5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nM Positive control Primer 2μL (最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0~1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0~50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0~1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0~50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0~1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0~50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMストレプトマイシン 2μL (最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。
ThT(チオフラビンT)誘導体
5×PBS153NM
50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4
1×PBS153NM
10 mM HPO4 2-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4
上記で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。
ポリメラーゼ反応後の溶液 8μLに5×PBS153NMバッファーを2μL加えた。
混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
実施例1.スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法
本法は、生体内に存在するタンパク質を検出する方法である。
今実験は、トロンビンをターゲットとした。また、トロンビンを検出する部分は、スプリットアプタマーを用いた。設計は、図3のようになっている。
アプタマーが高次構造を取ってトロンビンと結合するようになるため、塩濃度の検討を行った。塩濃度が低すぎると、アプタマーの高次構造が取ることができず、また、高塩濃度の場合は、RCAの反応が阻害される。
図4 a1~a5においてRCA反応の進行を検討した。結果は、塩濃度10mMまでは反応の進行に影響はなくそれ以上になると阻害されることが分かった。
また、図4 c1に示す様に塩濃度が0mMであるとき反応はしなかったが、図4 c2で示す、10mMの時は反応が進行した。また、それ以上の塩濃度(図4 c3~5)では反応の進行は確認できなかった。
図5の結果から、トロンビン以外のタンパク質では反応が進行せず、トロンビンのみに特異性があることが分かった。また、図6の結果から、多種のタンパク質が夾雑する場合でもトロンビンが存在すれば反応が進行することが分かった。
本法は、小分子を検出する方法である。
今実験では、抗生物質であるストレプトマイシンをターゲットとした。ストレプトマイシンを検出する部分は、スプリットアプタマーを用いた。設計は図7のようになる。
本実験では、ストレプトマイシンの他、アンピシリンとカナマイシンを特異的に検出できるか検討した。
結果は、ストレプトマイシンのみ特異的に検出できることが分かった(図8 b1)。
次に、反応における塩濃度の検討を行った。アプタマーが高次構造を取ってストレプトマイシンと結合するようになるため、塩濃度が低すぎると、アプタマーの高次構造が取ることができず、また、高塩濃度の場合は、RCAの反応が阻害されることが考えられる。
図9 a1~a5においてRCA反応の進行を検討した。その結果、塩濃度10mMまでは反応の進行に影響はなくそれ以上になると阻害されることが分かった。また、図9 c1に示す様に塩濃度が0mMであるとき反応はしなかったが、図9 c2で示す、10mMの時は反応が進行した。また、それ以上の塩濃度(図9 c3~5)では反応の進行は確認できなかった。
Claims (14)
- 標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合
体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、第1の領域と、その3’側に連結された10~30塩基の第2
の領域とを含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する15~25塩基の第1のアプタマー配列と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な7~
8塩基の配列とを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの前記第2の領域に相補的な
配列と、その3'側に連結された前記標的分子に結合する15~25塩基の第2のアプタ
マー配列とを含み、前記第1のアプタマー配列と前記第2のアプタマー配列はスプリットアプタマーの配列である、
方法。 - 前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項1に記載の
標的分子の検出方法。 - 標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、第1の一本鎖環状DNAとからなる第1の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第1の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第2の一本鎖環状DNAと第2のオリゴヌクレオ
チドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第2のプライマーと第2の一本鎖環状DNAとからなる第2の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第2の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第1の一本鎖環状DNAは、第1の領域と、その3’側に連結された10~30塩基
の第2の領域と、第2の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する15~25塩基の第1のアプタマー配列とその3’側に連結された、第1の一本鎖環状DNAの第1の領域に相
補的な7~8塩基の配列と、を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第1の一本鎖環状DNAの前記第2の領域に相
補的な配列とその3'側に連結された標的分子に結合する15~25塩基の第2のアプタ
マー配列と、を含み、
前記第2の一本鎖環状DNAは、第1の一本鎖環状DNAにおける第2の一本鎖環状DNA結合
配列相補配列と同一の配列と、該配列の5’側に隣接した、第2のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含み、
前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、第1の一本鎖環状DNAにおける第2の一
本鎖環状DNA結合配列相補配列の5’側に隣接した領域と同一の8~15塩基の配列と、
該配列の3’側に隣接した、第2の一本鎖環状DNAの第2のプライマー結合配列に相補的
な7~8塩基の配列とを含み、
前記第1のアプタマー配列と前記第2のアプタマー配列はスプリットアプタマーの配列である、方法。 - 前記第2の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項3に
記載の標的分子の検出方法。 - 前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項2または4に記載の標的分子の検出方法。
- グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がC3N1-10C3N1-10C3N1-10C3配列を含む、請求項5に記載の標的分子の検出方法。
- 標的分子がタンパク質、ペプチドまたは低分子化合物である、請求項1~7のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
- 第1の領域と、その3’側に連結された10~30塩基の第2の領域とを含む一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する15~25塩基の第1のアプタマー配列と、その3’側に連結された、一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な7~8塩基の配列とを含むオリゴヌクレオチ
ドプライマー、及び
一本鎖環状DNAの前記第2の領域に相補的な配列と、その3'側に連結された前記標的分子に結合する15~25塩基の第2のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含み、前記第1のアプタマー配列と前記第2のアプタマー配列はスプリットアプタマーの配列である、標的分子の検出用試薬。 - 一本鎖環状DNAは、さらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項9に記載の標
的分子の検出用試薬。 - 第1の領域と、その3’側に連結された10~30塩基の第2の領域と、
第2の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含む第1の一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する15~25塩基の第1のアプタマー配列とその3’側に連結された、第1の一本鎖環状DNAの第1の領域に相補的な7~8塩基の配列と、を含む第1のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、
第1の一本鎖環状DNAの前記第2の領域に相補的な配列とその3'側に連結された標的分子に結合する15~25塩基の第2のアプタマー配列と、を含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
第1の一本鎖環状DNAにおける第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の5’側に隣接した、第2のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む第2の一本鎖環状DNA、及び
第1の一本鎖環状DNAにおける第2の一本鎖環状DNA結合配列相補配列の5’側に隣接した領域と同一の8~15塩基の配列と、該配列の3’側に隣接した、第2の一本鎖環状DNAの第2のプライマー結合配列に相補的な7~8塩基の配列とを含む第2のオリゴヌクレ
オチドプライマー
を含み、前記第1のアプタマー配列と前記第2のアプタマー配列はスプリットアプタマーの配列である、標的分子の検出用試薬。 - 一本鎖環状DNAは、さらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項11に記載の
標的分子の検出用試薬。 - 検出試薬結合配列はグアニン四重鎖形成配列である、請求項10または12に記載の標的分子の検出用試薬。
- さらにグアニン四重鎖結合試薬を含む、請求項13に記載の標的分子の検出用試薬。
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