JP7123414B2 - クリック官能基をもつε-ポリ-L-リジン誘導体、その製法、及びその用途 - Google Patents
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Description
Pは、アミノ基で置換されている(C1-C5)アルキレン基を表し;
Qは、下記一般式(2)
下記一般式(3)
Zは、クリック官能基を表す。)
で表される構造を有する化合物若しくはその化学的又は薬学的に許容される塩、及びそれらの化合物又はその化学的又は薬学的に許容される塩の製造方法を提供することである(以下、化学的に許容される塩と薬学的に許容される塩を総称して単に塩と称することもある)。
本発明の別の目的は、一般式(4)
mは1乃至30の整数であり;
Xは、酸素原子又はイミノ基を表し;
Yは、炭素数1乃至6のアルキレン基を表し;
Zは、クリック官能基を表す。)
で表される構造を有するε-ポリ-L-リジン(ε-PL)誘導体若しくはその化学的又は薬学的に許容される塩、及びそれらの化合物又はその化学的又は薬学的に許容される塩の製造方法を提供することである(以下、化学的に許容される塩と薬学的に許容される塩を総称して単に塩と称することもある)。
本発明の別の目的は、例えば抗菌又は抗がん性物質等の低分子化合物及び中分子化合物だけでなく、タンパク質(酵素を含む)等の高分子化合物である薬理作用物質に上記化合物(ε-PL誘導体を含む)を共有結合により導入した、生体膜透過性と水溶性が一挙に改善された薬理作用物質、及びその製造方法を提供することである。またさらに本発明の別の目的は、薬理作用物質の生体膜透過性改善のための上記化合物(ε-PL誘導体を含む)の使用を提供することである。
さらに、産業用基材の表面を共有結合で上記化合物(ε-PL誘導体を含む)を使用することによって、種々の産業用基材に上記化合物を導入し、ポリカチオン性による抗菌活性、培養細胞接着効果、防滴効果、及び帯電防止機能など様々な機能を産業用基材に付与することである。
[1]一般式(1)
Pは、アミノ基で置換されている(C1-C5)アルキレン基を表し;
Qは、下記一般式(2)
下記一般式(3)
Zは、クリック官能基を表す。)
で表される構造を有する化合物又はその塩。
[2]一般式(4)
mは1乃至30の整数であり;
Xは、酸素原子又はイミノ基を表し;
Yは、炭素数1乃至6のアルキレン基を表し;
Zは、クリック官能基を表す。)
で表される前記[1]に記載の化合物又はその塩。
[3]クリック官能基が、アジド基、アルケニル基、アルキニル基、ニトリル基、チオール基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基又はチイラン基である、前記[1]又は[2]に記載の化合物又はその塩。
[4]一般式(2a)
一般式(3a)
産生した前記[1]に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む前記[1]に記載の化合物又はその塩の製造方法。
[5]一般式(3a)
産生した前記[2]に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む前記[2]に記載の化合物又はその塩の製造方法。
[6]前記[1]に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
[7]一般式(4)
mは1乃至30の整数であり;
Xは、酸素原子又イミノ基を表し;
Yは、炭素数1乃至6のアルキレン基を表し;
Zは、クリック官能基を表す。)
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
[8]薬理作用物質が、少なくとも抗菌剤、抗バクテリア剤及び抗がん剤のいずれかである、前記[6]又は[7]に記載の物質。
[9]抗菌剤が、(A)抗真菌剤であり;
抗バクテリア剤が、(B)βラクタム系抗生物質、(C)アミノグリコシド系抗生物質、(D)テトラサイクリン系抗生物質、若しくは(E)ペプチド系抗生物質、(F)クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質であり;又は
抗がん剤が、(G)クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗がん剤である、前記[8]に記載の物質。
[10](A)抗真菌剤が、(a-1)アムフォテリシンB(以下、AmpBと記す)、ナイスタチン、トリコマイシン、及びピマリシンから選ばれるポリエン系抗生物質;(a-2)ミカファンギン;(a-3)イトラコナゾール;(a-4)ケトコナゾール;(a-5)フルコナゾール:(a-6)ミコナゾール:若しくは(a-7)フルシトシンであり、
(B)βラクタム系抗生物質が、(b-1)ペニシリン;(b-2)アンピシリン:(b-3)タランピシリン;(b-4)バカンピシリン;(b-5)セファロスポリンC;(b-6)セファレキシン;(b-7)セフラジン;(b-8)セファマイシン;若しくは(b-9)イミペネムであり、
(C)アミノグリコシド系抗生物質が、(c-1)ゲンタマイシン;(c-2)カナマイシン;(c-3)トブラマイシン;(c-4)アミカシン;(c-5)アルベカシン;若しくは(c-6)リボスタマイシンであり、
(D)テトラサイクリン系抗生物質が、(d-1)オキシテラザイクリン;又は(d-2)テトラサイクリンであり、
(E)ペプチド系抗生物質が、(e-1)バシトラシン;(e-2)グラミシジン;(e-3)ポリミキシンB;(e-4)バンコマイシン;若しくは(e-5)テイコプラニンであり、
(F)クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗菌抗生物質、又は
(G)クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗がん剤としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗がん剤であり、例えば、(f-1)アクチノマイシンD;(f-2)マイトマイシン;(f-3)ドキソルビシン(以下、Doxと記す)、ダウノルビシン、及びアクラルビシンから選ばれるアントラサイクリン系抗腫瘍薬;(f-4)ブレオマイシン;若しくは(f-5)シスプラチンである、前記[9]に記載の物質。
[11]薬理作用物質が、少なくとも、例えば酵素若しくは抗体等のタンパク質及び遺伝子のいずれかである、前記[6]又は[7]に記載の物質。
[12]タンパク質及び遺伝子が、クリック官能基を有機化学的又は生化学的に導入可能である、前記[11]に記載の物質。
[13]前記[7]に記載の一般式(4)で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を化学結合によって薬理作用物質に導入することを特徴とする、前記[7]に記載の薬理作用物質の製造方法。
[14]一般式(5)
[15]一般式(5-2)
[16]一般式(5-3)
[17]一般式(2a)又は(3a)で表される化合物又はその塩の前記[1]に記載された一般式(1)で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
[18]一般式(3a)
[19]一般式(1)で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の生体膜透過性改善方法、又は一般式(1)で表される化合物又はその塩の生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
[20]前記[7]に記載された一般式(4)で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の生体膜透過性改善方法、又は一般式(4)で表される化合物又はその塩の、生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
[21]一般式(1)で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の水溶性向上方法。
[22]一般式(1)で表される化合物又はその塩の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
[23]前記[7]に記載された一般式(4)で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の水溶性向上方法、又は一般式(4)で表される化合物の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
タンパク質(酵素を含む)のような高分子化合物は、通常、細胞膜を透過しない。細胞の恒常性維持においてこの性質は重要であるが、一方で、機能解析や制御あるいは医療目的で、これらの分子を細胞外から内に直接導入することも困難と言える。これまでに、マイクロインジェクションやエレクトロポレーションなど細胞膜を一過的に破壊し導入する方法や、リポソームを用いて導入する方法などが用いられてきた。しかし、導入効率や細胞に与える損傷の大きさから、必ずしも満足のいく結果は得られていない。一方で、塩基性(ポリカチオン性)ペプチドの優れた細胞膜透過性が注目され、タンパク質(酵素を含む)をポリカチオン性ペプチドで修飾し、細胞内に直接導入する方法が盛んに試みられるようになってきた(非特許文献、S.R., Schwarze, et al., Science, 285, 1569, 1999)。実際に、ポリカチオン性ペプチドとの化学的架橋体あるいは融合タンパク質としてポリカチオン修飾したタンパク質を調製し、細胞培養液に加えるだけで細胞機能が制御できた例も数多く報告され、細胞生化学的手法の一つとして認知されるとともに、バイオ医薬品(抗体医薬など)の新しい送達法としても注目されている。
また、例えば、γ-ポリ-L-ジアミノブタン酸、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸、β-ポリ-L-ジアミノプロピオン酸等のε-PL以外の天然ポリカチオン類縁体等においても同様の効果を奏し得る。
本発明者らは、一般式(1)によって表されるε-PL誘導体を含む上記[1]に記載されている化合物は、クリックケミストリーによって様々な薬理作用物質に容易に安定な共有結合を介して結合することを見出した。通常、水溶性が高い化合物は生体膜透過性が低いが、ε-PLを含むポリカチオン体が共有結合によって導入された薬理作用物質は、水溶性が非常に高いにも関わらず、ε-PLを含むポリカチオン体のポリカチオン性のため生体膜透過性も非常に高い。このように、薬理作用物質の生体膜透過性と水溶性を一挙に改善させる簡便なε-PLを含むポリカチオン体修飾法に必要な化合物の簡便かつ効果的な新規製造方法が本発明の重要な特徴の一つである。
また、タンパク質(酵素を含む)のような高分子化合物においてもクリックケミストリーによってポリカチオン化することで生体膜透過性を付与させることが可能になる。本開示により、細胞内に高分子化合物を直接送達させるための新規製造方法を提供することができる。なお、クリックケミストリーは従来充分に確立されており、本発明においてもそれに従ってよい。
Y、Y1又はY2で表される炭素数1乃至6のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンテン基、ヘキセン基などが挙げられる。中でも、Yは炭素数2乃至6のアルキレン基が好ましい。当該アルキレン基は、通常の置換基で置換されていてもよく、そのような置換基としては、ハロゲン原子(例えば、臭素原子、塩素原子、フッ素原子など)、水酸基、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、スルホ基などが例示される。アルキレン基には、例えば、―O―、―S―、―S―S―、シリル基など介在基が含まれていてもよい。
一般式(1)又は(4)において、mは1乃至30のいずれであってもよいが、好ましくは2乃至20程度である。mが2以上であることにより、一般式(1)で表される化合物又はその塩が導入された薬理作用物質の生体膜透過性改善効果又は水溶性向上効果がさらに高まり得るとともに、化学的に高い安定性を有し得る。
また、一般式(4)で表される化合物又はその塩は、一般式(7)
で表されるε-PLと、一般式(3a)
で表される化合物又はその塩を縮合反応に付することにより製造できる。
縮合反応前、原料物質の反応に関与するアミノ基は、保護基によって予め保護しておき、縮合反応後に除去することによって、目的物である一般式(1)で表される化合物又はその塩を得ることができる。縮合反応の仕方は、従来この分野で充分に確立されているので、本発明でもそれに従ってよい。目的物の合成反応液の濃縮、転溶、クロマトグラフィーなどの常套手段によって、一般式(1)で表される化合物を取得することができる。このような技術はペプチド合成の分野で充分確立されているから、本発明もそれに従ってよい。
また、一般式(7)で表される化合物ε-PLの類縁体を含むポリカチオン体は、いずれの方法によって得られたものであってもよく、次の非特許文献に記載の方法でも得ることが可能である。
例えば、γ-ポリ-L-ジアミノブタン酸は、例えば論文(Takehara, M., Saimura, M., Inaba, H. & Hirohara, H. Poly(gamma-L-diaminobutanoic acid), a novel poly(amino acid), coproduced with poly(epsilon-L-lysine) by two strains of Streptomyces celluloflavus. FEMS Microbiol Lett 286, 110-7 (2008).)を参照することにより製造され得る。
また、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸は、例えば論文(Ohkuma, H., Tenmyo, O., Konishi, M., Oki, T. & Kawaguchi, H. BMY-28190, a novel antiviral antibiotic complex. J Antibiot (Tokyo) 41, 849-54 (1988). )を参照することにより製造され得る。
また、β-ポリ-L-ジアミノプロピオン酸は、例えば論文(Xia, J., Xu, H., Feng, X., Xu, Z. & Chi, B. Poly(L-diaminopropionic acid), a novel non-proteinic amino acid oligomer co-produced with poly(epsilon-L-lysine) by Streptomyces albulus PD-1. Appl Microbiol Biotechnol 97, 7597-605 (2013).又はXu, Z. et al. Systematic unravelling of the biosynthesis of poly (L-diaminopropionic acid) in Streptomyces albulus PD-1. Sci Rep 5, 17400 (2015). )を参照することにより製造され得る。
キタサトスポラ属細菌としては、例えば、Interenational Journal of Systematic Bacteriology、47巻、1048-1054頁、1997年に記載されているものが挙げられるが、その中でもキタサトスポラ・キフネンセ(Kitasatosporakifunense)が好ましく、キタサトスポラ・キフネンセMN-1株(FERM P-19712)がより好ましい。
ストレプトマイセス属としては、例えば、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)No.346-D株(IFO14147、特公昭59-20359号公報)、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス11011A株(特公平3-42070公報)、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラスB21021株(特開平09-173057号公報)、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラスB15208株(特開平10-290688号公報)、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズSP-25株(特開2002-095467号公報)、ストレプトマイセスsp.SP-72株(特開2000-069988号公報)、ストレプトマイセスsp.SP-66株(特開2001-017159号公報)、ストレプトマイセス・ヘルバリカラーSP-13株(特開2002-095466号公報)、ストレプトマイセス・ラベンデュラエU SE-53株(特開2003-052358号公報)、ストレプトマイセス・ノールセイ(特開平1-187090号公報)などを挙げることができる。この中でも、ストレプトマイセス アルブラスに分類される微生物が好ましく、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラスNo.346-D株(Streptomyces albulus NBRC14147株と同一株)がより好ましい。
また、本発明で用いる微生物は、上記γ-ポリ-L-ジアミノブタン酸、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸、β-ポリ-L-ジアミノプロピオン酸等のε-PLの類縁体の生産菌であってもよい。
微生物による一般式(1)で表される化合物の生産方法
ε-PL生産菌としてStreptomyces albulus NBRC1417を用い、短鎖ε-PL生産菌として、pls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003(非特許文献:Y. Hamanoら, Appl. Environ. Microbiol., 80, 4993-5000, 2014)を用いた。また、その培養には滅菌したSLB培地(スクロース、10.3 g; トリプトン、10 g; 酵母エキス、5 gの各成分を1Lの蒸留水に溶解したもの)、及びM3G培地(グルコース、50 g; 硫酸アンモニウム、10 g; 酵母エキス、5 g; リン酸二水素カリウム、1.36 g; リン酸水素二ナトリウム・12水、1.58 g; 硫酸亜鉛七水和物、0.04 g; 硫酸鉄(II)七水和物、0.03 g; 硫酸マグネシウム七水和物、0.5 gの各成分を1Lの蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液にてpHを7.0に調整したもの)を使用した。
Streptomyces albulus NBRC14147、又はpls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003の胞子懸濁液をSLB培地3 mLに植菌し、28 ℃で36時間振盪培養した。なお、pls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003の培養においては、選択薬剤として抗生物質ネオマイシンを50 μg/mLの濃度で培地に加え培養した。この培養液500μLをM3G培地50 mLに加え、28℃で8時間培養し、一般式(2a)又は(3a)で表される化合物として、2-[2-[2-(2-Propyn-1-yloxy)ethoxy]ethoxy]ethanol(以下、PEG-アルキンと記す)、あるいは、2-[2-[2-(2-Azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethanol(以下、PEG-アジドと記す)を0.2%(w/v)になるように培養液に添加し、28 ℃でさらに2~4日間振盪培養した。培養液を遠心分離し、培養上清を得た。
実施例1で得たStreptomyces albulus NBRC14147の培養上清をエレクトロイオンスプレーイオン化型-飛行時間計測型質量分析/高速液体クロマトグラフィー(以下、ESI-TOF-MS/HPLCと記す)で分析し、精密分子量を測定した(図1A及び1B)。ESI-TOF-MS/HPLCのESI-TOF-MSはブルカーダルトニクス社製のmaXis plusを用い、HPLCはアジレントテクノロジー社のAgilent 1290 Infinity LC システムを用いた。HPLCの条件は、カラムはSunShell RP-AQUA(クロマニックテクノロジー社製、2.6μm、内径2.1 mm、長さ50 mm)、カラム温度は40℃、移動相Aは0.05%ギ酸と0.05%ヘプタフルオロ酪酸を含む水溶液、移動相Bは0.05%ギ酸と0.05%ヘプタフルオロ酪酸を含むアセトニトリルを用いた。移動相流速は0.3 mL/分とし、分析開始の3分までは移動相Bの10%~25%のリニアグラジエント、3分から12分は移動相Bの25%~90%のリニアグラジエント、12分から16分は移動相Bの90%~100%のリニアグラジエント、16分から18分は移動相B100%で分析した。溶出物のモニタリングはESI-TOF-MSの計測により行った。
ε-PLのカルボキシル基とPEG-アジドがエステル結合で連結した一般式(1)で表される化合物であり一般式(10)(但し、式中nは17乃至26の整数である)で表されるε-PL-PEG-アジド、及びε-PLのカルボキシル基とPEG-アルキンがエステル結合で連結した一般式(1)で表される化合物であり一般式(11)(但し、式中nは17乃至26の整数である)で表されるε-PL-PEG-アルキンの生産が確認された。さらに、培養液からε-PL-PEG-アジド及びε-PL-PEG-アルキンをテトラフェニルボレイト法で単離精製し(非特許文献、H. Katanoら、Anal. Sci., 28, 1153-1157, 2012)、核磁気共鳴スペクトル(1H-NMR)によりその化学構造を確認した(図2A及び2B)。これらの結果から、ε-PL生産菌であるStreptomyces albulus NBRC14147を利用することで17~26 merのε-PLからなるε-PL-PEG-アジド、及びε-PL-PEG-アルキンが生産されることが判明した。他方、短鎖ε-PL生産菌であるpls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003を利用することで、短鎖長のε-PL-PEG-アジドとε-PL-PEG-アルキンの生産が可能である。
化合物のε-PL修飾による水溶性及び生体膜透過性の一挙改善
ε-PL修飾が化合物の水溶性及び生体膜透過性を一挙改善するモデル実験として、式(12)で表される水難溶性の蛍光色素(DBCO-PEG4-5/6-FAM)のε-PL修飾を行った。
一般式(1)で表される化合物であり一般式(10)(但し、式中nは9乃至18の整数である)で表されるε-PL-PEG-アジドの有用性をさらに評価するために、式(8)で表される抗真菌抗生物質AmpBのε-PL修飾を行った。AmpBは、真菌に強力な抗菌活性を示すため深在性真菌症を初めとする様々な真菌感染症の治療薬として利用されている臨床上重要な抗生物質である。しかし、水にほとんど溶けない水難溶性のため製剤調整の複雑化や腎毒性などの副作用が問題になっている。現在、その水難溶性を改善するリポソーム製剤など様々な製剤技術が検討されているが、十分満足できる結果は得られていない。AmpBは、経口投与においてほとんど腸管吸収されることなく、最新の製剤技術においても腸管吸収の問題点は克服できていない。他方、ε-PL修飾されたAmpBが強力な抗真菌活性を維持できれば、水に容易に溶けるAmpBの開発につながり、上記の諸問題を一挙に改善できると期待された。
AmpB(ナカライテスク社製)100 mgとN-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyloxy] succinimide(Fmoc-OSu)73 mgを無水ジメチルホルムアミド30 mLに溶解した。28℃で4時間攪拌し、AmpBのアミノ糖のアミノ基をFmoc基で保護した化合物(AmpB-Fmoc)を合成した。反応液に25 mM塩酸水溶液を420 mL加え、遠心分離により白色の沈殿として得られたAmpB-FmocをDMSOに溶解し凍結乾燥しAmpB-Fmocの粉末を得た。AmpB-Fmoc 24.8 mg、N,N-diisopropylethylamine 8.88 μL、4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride 9.0mgを無水ジメチルホルムアミド4.5 mLに溶解した。反応液を室温にて30分攪拌しながら反応させた後、市販のDBCO-PEG4-amine 12.5 mgを加え、28℃で5時間攪拌し、ピペリジンを1.2 mL加えることでFmoc基を脱保護し、一般式(9)で表されるAmpB-DBCOを合成した。反応液にジエチルエーテルを120 mL加え、遠心分離により黄色の沈殿として得られたAmpB-DBCOをDMSOに溶解し逆相カラム(Sunniest RP-AQUA, 5μm, 250 × 10 mm, ChromaNik Technologies)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて精製した。HPLCの諸条件は次の通りである。カラム温度、30℃;検出、UV405 nmの吸収;移動相A、0.1 %(v/v)ギ酸水溶液;移動相B、アセトニトリル;移動相のグラジエント、30分間におけるB液40%~100%のリニアグラジエント。一般式(9)で表されるAmpB-DBCOを含む溶出画分からアセトニトリルを留去し、凍結乾燥し黄色の粉末として一般式(6)で表されるAmpB-DBCOを得た。一般式(9)で表されるAmpB-DBCO 366μg、及び一般式(7)で表される9~18 merのε-PLからなるε-PL-PEG-アジド 689μgを86%DMSO水溶液に溶解し、30℃で5時間攪拌しながらクリックケミストリー反応を行った。反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、一般式(5)(但し、式中nは9乃至17の整数である)で表されるε-PL-DBCO-AmpBの合成を確認した(図6A及び6B)。
一般式(5)(但し、式中nは9乃至17の整数である)で表されるε-PL-DBCO-AmpB及び式(8)で表されるAmpBを水に溶解したところ、AmpBは、1.08 mMの濃度において全く水に不溶であったが、一般式(5)(但し、式中nは9乃至17の整数である)で表されるε-PL-DBCO-AmpBは、5.63 mMの濃度においても水に容易に溶け、高い水溶性を示した(図7)。よって、水難溶性であるAmpBをε-PL修飾することで高い水溶性を付加できることを明らかにするとともに、一般式(10)(但し、式中nは9乃至18の整数である)で表されるε-PL-PEG-アジドを利用することで医薬品などの薬物を効果的かつ簡便にε-PL修飾できることを示し、その有用性を明らかにした。
真菌の被検菌としてAspergillus brasiliensis NBRC9455を用い、一般式(5)(但し、式中nは9乃至17の整数である)で表されるε-PL-DBCO-AmpB、式(8)で表されるAmpB、一般式(10)(但し、式中nは9乃至18の整数である)で表される9~18 merのε-PLからなるε-PL-PEG-アジドの最少生育阻止濃度(MIC)を測定した。培地は市販のRPMI-1640培地を用い、30℃にて5日間培養したところ、一般式(5)で表されるε-PL-DBCO-AmpBのMICは1.9μg/mL、式(8)で表されるAmpBのMICは0.3μg/mL、一般式(10)で表される9~18 merのε-PLからなるε-PL-PEG-アジドのMICは72μg/mLであった。以上の結果から、ε-PL修飾したAmpB、すなわち一般式(5)で表されるε-PL-DBCO-AmpBは水溶性であるとともに、十分な抗真菌活性を維持していることを明らかにした。式(8)で表される水難溶性のAmpBは、経口投与において腸管吸収されないことから、口腔や食道などの消化管の真菌感染症にのみ適応されていた。しかし、一般式(5)で表される水溶性のε-PL-DBCO-AmpBはε-PL修飾(ポリカチオン修飾)により生体膜透過性も改善されていることを知ることができ、経口投与においても深在性真菌症へ適応され得る。
抗がん剤Doxのε-PL修飾
Dox(塩酸塩、フナコシ社製)17.4 mg、DBCO-PEG4-NHS Ester 19.4 mg 及びN,N-dimethyl-4-aminopyridine 4.9 mgをDMSO 3 mLで溶解した。室温で4時間攪拌し、Doxのアミノ糖のアミノ基にDBCO-PEG4が結合した化合物(DBCO-Dox)を合成した。合成したDBCO-Doxを逆相カラム(Sunniest RP-AQUA, 5μm, 250 × 10 mm, ChromaNik Technologies)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて精製した。HPLCの諸条件は次の通りである。カラム温度、35 ℃;検出、UV254 nmの吸収;移動相A、0.05 %(v/v)ギ酸水溶液及び0.05 %(v/v)HFBA水溶液;移動相B、0.05 %(v/v)ギ酸アセトニトリル溶液及び0.05 %(v/v)HFBAアセトニトリル溶液;移動相のグラジエント、18分間におけるB液50 %のアイソクラティック。DBCO-Doxを含む溶出画分からアセトニトリルを留去し、酢酸エチルで、DBCO-Doxを抽出し、乾固させた。DBCO-Doxを、クロロホルム1 mLで完全に溶解し、再度乾固させた。DBCO-Dox 10 μmolとε-PL-PEG-アジド 11 μmolを80%DMSO水溶液に溶解し、室温で3時間攪拌しながらクリックケミストリー反応を行った。反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、一般式(5-2)(但し、式中nは18乃至29の整数である)で表されるε-PL-DBCO-Doxの合成を確認した(図8A及びB)。
高分子薬理作用物質のε-PL修飾
高分子薬理作用物質の例として蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーン(mAG)のε-PL修飾を行った。mAGをC末端ヒスタグ融合タンパク質として高発現するプラスミド(mAG/pET21a)を大腸菌BL21(DE3)に導入した。この大腸菌をLB培地(100μg/mLのアンピシリンを含む)に植菌し、37℃で2.5時間培養し、0.1 mM IPTGでmAGの発現誘導を行なった後、18℃にて終夜培養した。菌体を回収し、緩衝液(50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール、pH7.0)で懸濁した後、超音波で菌体破砕した。破砕液を遠心分離して無細胞抽出液を回収し、Niアフィニティーカラムを用いてmAGを精製した。精製したmAGを透析外液 100 mM重炭酸ナトリウムバッファー(pH9.0)用いて終夜透析した。mAGに対して1当量のDBCO-sulfo-NHSを4℃にて撹拌しながら1時間おきに3回に分けて添加し、合計3時間反応させることでDBCO化されたmAG(DBCO-mAG)を調製した。透析外液 100 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)で終夜透析した後、DBCO-mAGに対して1.1当量の一般式(10)(但し、式中nは20乃至30の整数である)で表される20~30 merのε-PLからなるε-PL-PEG-アジドを加え、4℃にて1時間反応した。反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、一般式(5-3)(但し、式中nは23乃至29の整数である)で表されるε-PL-DBCO-mAGの合成を確認した(図9A、9B及び9C)。
通常、タンパク質は細胞膜などの生体膜を透過できない。そこで、ε-PL修飾したmAG、すなわち一般式(5-3)(但し、式中nは23乃至29の整数である)で表されるε-PL-DBCO-mAGが生体膜を透過するか動物細胞であるHeLa細胞を用いて確認した。HeLa細胞の培養には、10%のウシ胎児血清(FBS)を含むDulbecco’s modified Eagle’s 培地(DMEM)を用い、5%の二酸化炭素を含む大気中にて37℃で培養した。この培養条件にて、HeLa細胞を70~80%コンフルエントになるまで12ウェルプレートで培養し、FBSを含まないDMEM(DMEM w/o FBS)で細胞を2回洗浄した。細胞にDMEM w/o FBSを加え、4℃に冷却した後、mAG、又は一般式(5-3)で表されるε-PL-DBCO-mAGをそれぞれ50μMになるように加え、4℃にて30分間保温した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、ヘパリン(100μg/mL)を含むPBSで洗浄した後、さらにPBSで2回洗浄した。300μLの1%トリトンX-100を含む100 mMトリス-塩酸緩衝液(pH8.0)を加え、細胞内に取り込まれた化合物を抽出し、遠心分離により不溶性画分を除いた後、蛍光強度を測定した。その結果、一般式(5-3)’’で表されるmAGと比較し、一般式(5-3)で表されるε-PL-DBCO-mAGの方が約10倍生体膜の透過性が高いことを確認した(図10)。また、実際に、共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ、一般式(5-3)で表されるε-PL-DBCO-mAGが細胞内に存在し、またその一部は核内にも存在することを視覚的に確認した(図11)。
一般式(11)で表されるε-PL-PEG-アルキンの化学的安定性試験
実施例1で得た一般式(11)(但し、式中nは17乃至26の整数である)で表されるε-PL-PEG-アルキン及び実施例1と同様の手法によって得た一般式(15)(但し、式中nは17乃至26の整数である)で表されるε-PL-アルキンのエステル結合の化学的安定性について検証した。ε-PL-PEG-アルキンとε-PL-アルキンをTris-HCl緩衝液(pH8.0)に1mMの濃度で溶解し、60℃で5分間加熱後、ESI-TOF-MS/HPLCで分析した。その結果、ε-PL-アルキンと比較し、ε-PL-PEG-アルキンのエステル結合は加水分解されにくく化学的安定性が高いことが判明した(図12A及びB)。
Claims (21)
- 一般式(1)
Pは、CH2CH2CH2CH2CHNH2を表し;
Qは、下記一般式(2)
下記一般式(3)
Zは、アジド基、アルケニル基、ニトリル基、チオール基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基又はチイラン基であるクリック官能基を表す。)
で表される構造を有する化合物又はその塩。 - クリック官能基が、アジド基、アルケニル基又はチオール基である、請求項1又は2に記載の化合物又はその塩。
- nは9乃至29の整数であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の化合物又はその塩。
- 請求項5に記載の一般式(2a)又は請求項5に記載の一般式(3a)で表される化合物又はその塩の、請求項1に記載された一般式(1)で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
- 請求項1に記載の一般式(1)で表される化合物又はその塩の、生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
- 薬理作用物質が、抗菌剤、抗バクテリア剤又は抗がん剤のいずれかである、請求項15に記載の使用。
- 薬理作用物質が、タンパク質又は遺伝子である、請求項15に記載の使用。
- 請求項1に記載の一般式(1)で表される化合物又はその塩の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
- 薬理作用物質が、抗菌剤、抗バクテリア剤又は抗がん剤のいずれかである、請求項19に記載の使用。
- 薬理作用物質が、タンパク質又は遺伝子である、請求項19に記載の使用。
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