JP7044229B2 - 細胞のβカテニンの産生促進組成物 - Google Patents

Description

本発明は、アスコルビン酸リン酸MgZn(化粧品原料の成分番号：556381，化粧品原料の表示名称：アスコルビルリン酸(Mg/亜鉛)及びそれを含有することを特徴とするWNTタンパク産生促進組成物、及びこれを含有してなる発毛・育毛促進及び脱毛防止効果のある育毛組成物に関する。さらにその他の育毛組成物原料を併用することによって安全で効果の高い育毛組成物に関する。

脱毛症とは男性女性を問わず頭髪が薄くなる状態のことで日本国内だけで2000万人以上、全世界では２億人以上にのぼるとみられる。脱毛症は多くの人が抱える問題の一つとなっており、壮年性脱毛の他、先天的体質による脱毛、社会機構の複雑化に伴うストレスによる脱毛あるいは薬の副作用に基づく脱毛症が増加しつつある。脱毛の原因としては、従来から種々の説明がなされているところであるが、未だその発症メカニズムの詳細については、不明な点が多い。脱毛発症メカニズムの代表的なものをあげると、皮脂線からの皮脂の分泌が多くなり頭皮に蓄積し、これに紫外線や菌類などが間接的に産生する活性酸素の影響で細胞毒性の高い脂質過酸化物が産生し、これが毛乳頭細胞や毛母細胞などの毛髪産生関連細胞に障害をもたらす。これらの皮脂分泌は男性ホルモン(テストステロン)の過剰産生により促進される。

これらの脱毛予防組成物の有効成分として、ヒノキチオ-ル若しくはメント-ルなどのその他の育毛組成物原料、メチオニン等のアミノ酸類、ミノキシジル(2,4-ジアミノ-6-ピペリジノピリミジン-3-オキサイド)、アセチルコリン誘導体等の血管拡張組成物、紫根抽出物等の抗炎症組成物、エストラジオ-ル等の女性ホルモン組成物、セファランチン等の皮膚機能亢進組成物、5α-リダクタ-ゼ阻害組成物、ビタミンB6等のビタミン組成物、抗男性ホルモン組成物、あるいは4-ヒドロキシ-3-ヘプチルフタリド等のフタリド誘導体(特許文献1)等が知られている。これらの組成物は、場合によっては皮膚刺激を引き起こしたりするため、配合量に制限があったり、十分な育毛、脱毛防止、ふけ防止等の効果が充分でなく種々の問題点が残されているのが現状である。また、これらの作用は二次的に毛関連細胞を活性化させるものであり、より効果的な育毛組成物を開発するために、直接毛関連細胞を活性化する育毛組成物が要望されている。

毛関連細胞のうち、発毛のメカニズムを担っている毛乳頭細胞に直接作用して、該細胞の増殖を著しく促進する育毛組成物が望まれている。これまでに毛乳頭細胞を活性化するものが開示されている。即ち、柑橘類果皮由来ペプチド(特許文献2参照),オウギ,オウレン,カシュウ等(特許文献3参照)アンブレットシードの精油精製画分(特許文献4参照),アンモニウム化合物、カルシウム化合物、マグネシウム化合物、L-グルタミン酸又はその塩、L-セリン、PCA又はその塩、クロレラ、ユズ果実、エイジツ果実、イチョウ葉、ミノキシジル(特許文献５)などのように、毛乳頭細胞の増殖を促進したり、ボタンピ塩類,レイシ塩類(特許文献6参照),アオギリ科フウセンアカメガシワ属植物塩類(特許文献7参照),キク科ネコノシタ属植物塩類(特許文献8参照),トウダイグサ科ハズ属植物塩類(特許文献9参照),アロエ,アルニカ,オウゴン,カッコン等(特許文献10参照),クロウメモドキ科ナツメ属等(特許文献11参照),などのように毛乳頭活性化作用を有するものが開示されている。一方、アスコルビン酸リン酸MgZnが、化粧品などに美白組成物としての効果を持つことは、既に開示されている(特許文献12参照)が、発毛・育毛効果を有するという実験データは開示はおろか示唆すらされていない。即ち、アスコルビン酸リン酸MgZn塩類にWNTタンパク産生促進効果があり、後述するマウスとヒトにおいて育毛・発毛効果があることは、全く知られていなかった。

βカテニンとはWNTシグナル経路を活性化させる基本的なタンパク質の一つである。WNTシグナル経路とは胚の発生や癌細胞の発現に関連するタンパク質のネットワークである。WNT（ウィント）はショウジョウバエにおいて広く研究されており、この遺伝子が壊れると羽がない表現型が生まれることが知られている。WNT経路はC.elegansからヒトまで、多くの生物種において保持されている。標準的な経路では、WNTタンパク質はFrizzledファミリーの細胞表面受容体に結合し、受容体にDishevelledファミリータンパク質を放出させる。Dishevelledは、通常はβ-カテニンシグナル分子を促進するアキシン、GSK-3、APC遺伝子を含んだ分子の複合体を抑制する。この複合体が抑制されれば、βカテニンは安定化し、核へ入る事が可能となり、他の転写因子と相互作用し、特異的な遺伝子発現を促進する。ヒトの毛髪の発生や毛髪へのメラニン色素の供給にも、近年このβカテニンの産生が関与するWNTシグナル経路が重要な働きをになっていることが報告されている。

WNTタンパクとは、脂質修飾された３００－４００のアミノ酸からなるタンパク質であり、WNTシグナル経路に関与するタンパク質である。現在までに、ヒトにおいてWNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16の１８種類が報告されている。本発明ではこれ
らのシグナルタンパクの内、単体叉はその複数の産生の増加が必要とされる（非特許文献１から４）。
βカテニンとは、カドヘリンの細胞内領域に結合する複数の細胞内タンパク質であり、カドヘリン細胞接着因子としての機能に必要であるほか、転写制御因子としての機能も有ることが報告されている。さらに、アルマジロリピートを持ち、カドヘリン細胞接着因子としての機能を助ける。WNTシグナルの活性化により、GSK3βによるリン酸化が抑制されると、核へ移行し遺伝子の転写制御に関わる（非特許文献６から１０）。

毛包バルジで毛包幹細胞と色素幹細胞とが同時に活性化することにより毛髪へのメラニン供給により着色された毛髪が再生する。毛髪の再生が開始するとき毛包幹細胞、毛母細胞、毛包細胞などの毛髪産生細胞からWNTタンパク及びβカテニンが分泌され,毛包幹細胞と色素幹細胞とでWNTシグナル経路が同時に活性化することが報告されている（非特許文献１１）。この結果は,毛包の再生過程においてβカテニンの産生促進にともなうWNTシグナル経路の活性化が毛包幹細胞と色素幹細胞との協調的な挙動を可能にする分子機構としてはたらいていることを示し,多くの毛髪関連細胞だけでなく多くの細胞種が関係する器官再生を賦活化させる。さらに、毛包幹細胞のWNTシグナル経路の活性化におけるβカテニン、Edn（Endothelin）の発現が,色素幹細胞においてEdn1とEdn2を含むすべてのEdnの受容体であるEdn受容体B(EdnrB)の発現が増加し、毛包幹細胞から分泌されるEdnにより色素細胞の増殖が促進され、毛髪へのメラニン供給が維持される。

毛包幹細胞、毛母細胞、毛包細胞、毛乳頭細胞を含む毛髪産生細胞の移植により毛包が誘導されることは、古くはラットなどの頬髭毛髪産生細胞を用いた実験により明らかにされていた。例えばOliverらの実験は毛包の下半分を切除して残った上半分の直下にこれらの細胞を再移植して毛包が再生することを示したもので、これは現在の知識から言えば、バルジ領域の毛包幹細胞(上皮系幹細胞)が毛乳頭細胞のβカテニンの産生促進を伴うWintシグナル経路の活性化により毛包へと分化する現象を見ていることに他ならない。その後さらに、Jahodaらは培養したラット毛髪産生細胞によっても毛包が形成されることを実証し、このときすでにヒト毛髪産生細胞の培養技術も確立していたこともあって、ヒト毛髪産生細胞を用いた毛包再生治療の実現を予見している。確かに、毛包誘導能を維持したままヒト毛髪産生細胞を培養することができれば、少数の毛包から毛髪産生細胞を採取して大量に培養し、禿髪部に移植することで毛髪再生治療がおこなえる可能性がある。つまり、Wintリガンドやβカテニンの産生促進に伴うWintシグナル経路の活性化は、毛髪産生細胞の移植後の定着、成長、分化に極めて効果的な方法である。

特開平3-135907号公報 特開平9-202716号公報 特開平9-208431号公報 特開2005-213143号公報 特開2006-282597号公報 特開平10-226628号公報 特開平11-1416号公報 特開平11-12134号公報 特開平11-124317号公報 特開平11-240823号公報 特開2000-128741号公報 特許第4101470号

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本発明の課題は、発毛のメカニズムを担っている毛乳頭細胞に直接作用して、該細胞の増殖を促進する育毛組成物を提供するものである。これまでに毛乳頭細胞に直接作用して、該細胞の増殖を促進する発毛・育毛組成物として、1.0μM(0.3ppm)ミノキシジルを作用させると、コントロール比200%の育毛効果が認められたことが報告されている(非特許文献1)。ミノキシジルは、もともと経口用血圧降下組成物として使用されていたものであるが、副作用としての育毛効果に着目し開発されたものである。(特許文献13参照)。現在、ミノキシジルを配合した育毛組成物は、育毛効果を有する医薬品として市場で販売されている。しかしながら、ミノキシジルは、育毛組成物としての作用効果は優れているものの、連用による動悸、若干の皮膚刺激性がある等の副作用の出現など安全性の問題を有しており、配合量に制限がある。そこで、本発明の課題は、医薬品として認められているミノキシジルと同等以上の優れた毛乳頭細胞の増殖効果を有する育毛促進組成物を提供することであり、更に、既存の育毛促進組成物と血行促進組成物を併用して、より相乗的に発毛・育毛及び脱毛予防効果を有する育毛組成物を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、アスコルビン酸リン酸のMgZnに、優れたWNTタンパク産生活性を見出して、本発明を完成するに至った。また、アスコルビン酸リン酸MgZn塩類と後述するその他の育毛組成物原料とを併せて含有する組成物が、アスコルビン酸リン酸MgZn塩類の単独使用より、より優れた発毛、育毛及び脱毛予防効果を相乗的にもたらすものであり、しかも、長期にわたり高い安全性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明により、優れた効果を発揮する育毛組成物、発毛・育毛組成物、及び優れた効果を有するβカテニンの産生促進組成物の提供を可能とした。

本発明の請求項の内容を次に示す。
（請求項１）アスコルビン酸リン酸MgZnを有効成分として含有することを特徴とする,細胞のβカテニンの産生促進組成物。
（請求項２）アスコルビン酸リン酸MgZnと、以下のAグループから選択される含硫化合物群から選ばれる1種又は2種以上の組成物と、Bグループから選択される育毛促進組成物群から選ばれる1種又は2種以上の組成物とを有効成分として同時に含有することを特徴とする細胞のβカテニンの産生促進組成物。
Aグループ
硫酸、亜硫酸、ピロ亜硫酸、ラウレス硫酸、ラウリル硫酸、セチル硫酸、ミスチリル硫酸、ココグリセリル硫酸、シトステロール硫酸、ルチニル二硫酸、アスコルビン酸硫酸、システイン、メチオニン、ホモシステイン、タウリン叉はこれらのナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛から選択される一種叉はそれらの複合塩。
Bグループ
デュタステリド、フィナステリド、ミノキシジル、塩化カルプロニウム 、トランス-3,4’-ジメチル-3-ヒドロキシフラバノン、ベンジルアデニン、ケトコナゾール、アデノシン、タマサキツヅラフジアルカロイド、β－グリチルレチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、サリチル酸、ｄｌ－カンフル、Ｄ－パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ニコチン酸アミド、2-L-アスコルビン酸リン酸ジエステルカリウム塩、dl-α-トコフェロール、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、ピロクトンオラミン、トリクロサン、ミコナゾール硝酸塩、ヒノキチオール、ｌ－メントール、ショウキョウ抽出物、センブリ抽出物、クジン抽出物、トウガラシチンキ、感光素３０１号、エチニルエストラジオール、ノコギリヤシ抽出物、ビオチン、ニンニク抽出物、朝鮮人参抽出物、チョウジ抽出物、当帰抽出物、川キュウ抽出物、チンピ抽出物、薄荷葉抽出物、イチョウ葉抽出物
（請求項３）組成物が育毛組成物、発毛組成物から選択される組成物である請求項１のβカテニンの産生促進組成物。
（請求項４）組成物が医薬品、医薬部外品、化粧品、動物用医薬品から選択されるいずれかである請求項１のβカテニンの産生促進組成物。
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明に使用されるアスコルビン酸リン酸MgZn塩類は、化粧品原料として、日本化粧品工業会が登録管理する原料成分番号：556381，化粧品原料の表示名称：アスコルビルリン酸(Mg/亜鉛)として、既に２００５年から化粧品の美白組成物として本発明者等の所属する株式会社アイ・ティー・オーより製造販売されている。

本発明で使用される組成物としては、水及び/又は有機溶媒が挙げられるが、特に有機溶媒が好ましい。有機溶媒の好ましい具体例としては、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、等の多価アルコール類、これら多価アルコール類と水との混合液(好ましくは5～30%水溶液)、アニオン界面活性組成物水溶液、ノニオン界面活性組成物水溶液、両性界面活性組成物、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール類、これらアルコール類と水との混合液(10～99.5%、好ましくは20～90%水溶液)、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、石油エーテル等の炭化水素類、クロロホルム、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン類のエーテル類、酢酸エチル、イソプロピルミリステート等のエステル類、流動パラフィン、ダイズ油、ゴマ油等の各種鉱物油、動物油、植物油、及びこれらの混合物などが挙げられる。
アスコルビン酸リン酸MgZnは、そのままで本発明育毛組成物の有効成分として用いることもできるが、当該塩類を更に、適当な分離手段、例えばゲル濾過法やシリカゲルカラムクロマト法又は逆相若しくは順相の高速液体クロマト法により活性の高い画分を分画して用いることもできる。

請求項２のアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物の配合例としては、硫酸、硫酸ナトリウム，硫酸カリウム，硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム，ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、ミスチリル硫酸ナトリウム、ココグリセリル硫酸ナトリウム、シトステロール硫酸ナトリウム、ルチニル二硫酸ナトリウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウムをそれぞれ1gとり重量合計１3gとした。これをAグループ組成物とする。デュタステリド、フィナステリド、ミノキシジル、塩化カルプロニウム 、トランス-3,4’-ジメチル-3-ヒドロキシフラバノン、ベンジルアデニン、ケトコナゾール、アデノシン、タマサキツヅラフジアルカロイド、β－グリチルレチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、サリチル酸、ｄｌ－カンフル、Ｄ－パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ニコチン酸アミド、2-L-アスコルビン酸リン酸ジエステルカリウム塩、dl-α-トコフェロール、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、ピロクトンオラミン、トリクロサン、ミコナゾール硝酸塩、ヒノキチオール、ｌ－メントール、ショウキョウ抽出物、センブリ抽出物、ニンジン抽出物、トウガラシチンキ、感光素３０１号、エチニルエストラジオール、ノコギリヤシ抽出物、ビオチン、ニンニク抽出物、朝鮮人参抽出物、チョウジ抽出物、当帰抽出物、川キュウ抽出物、チンピ抽出物、薄荷葉抽出物、イチョウ葉抽出物の合計４２物質（このうち抽出物は、溶媒以外の固形物を５％含有する）をそれぞれ0.5ｇとりその混合物を２１ｇとする。これをBグループ組成物とする。上記Aグループ組成物１３ｇとBグループ組成物２１ｇとアスコルビン酸リン酸MgZn 66gを混ぜて１００ｇとし、この混合物にホホバオイル２０ｇと精製水７０ｇを添加して５０℃まで加熱し、電動ホモジナイザーで混合分散させ、褐色懸濁液とし最後に、水酸化ナトリウムでpHを7.0とし、以下、この本発明の混合物の例をアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物例という。

請求項１のアスコルビン酸リン酸MgZn及びアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物例相当の硫黄元素を含有する本発明の請求項２の組成物において、請求項３及び請求項４の組成物を製造する場合の、有効成分の配合濃度は、通常、水又は水-低級アルコール等の溶媒に溶解して使用することが好ましい。この時の有効成分の配合濃度は、アスコルビン酸リン酸MgZnの場合は、本発明の育毛組成物中に0.01～１０重量%(以下単に「%」で示す)配合するのが好ましい。アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物例相当の硫黄元素を含有する本発明の請求項２のアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物の場合は、本発明の育毛組成物中に0.01～１０重量%(以下単に「%」で示す)配合するのが好ましい。

本発明に使用されるその他の含硫化合物原料としては、硫酸、亜硫酸、ピロ亜硫酸、ラウレス硫酸、ラウリル硫酸、セチル硫酸、ミスチリル硫酸、ココグリセリル硫酸、シトステロール硫酸、ルチニル二硫酸、アスコルビン酸硫酸、システイン、メチオニン、ホモシステイン、タウリン叉はこれらのナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛から選択される一種叉はそれらの複合塩が挙げられる。
本発明に使用される育毛組成物原料としては、デュタステリド、フィナステリド、ミノキシジル、塩化カルプロニウム 、トランス-3,4’-ジメチル-3-ヒドロキシフラバノン、ベンジルアデニン、ケトコナゾール、アデノシン、タマサキツヅラフジアルカロイド、β－グリチルレチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、サリチル酸、ｄｌ－カンフル、Ｄ－パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ニコチン酸アミド、2-L-アスコルビン酸リン酸ジエステルカリウム塩、dl-α-トコフェロール、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、ピロクトンオラミン、トリクロサン、ミコナゾール硝酸塩、ヒノキチオール、ｌ－メントール、ショウキョウ抽出物、センブリ抽出物、クジン抽出物、トウガラシチンキ、感光素３０１号、エチニルエストラジオール、ノコギリヤシ抽出物、ビオチン、ニンニク抽出物、朝鮮人参抽出物、チョウジ抽出物、当帰抽出物、川キュウ抽出物、チンピ抽出物、薄荷葉抽出物、イチョウ葉抽出物などが挙げられる。上記その他の育毛組成物原料は水又は水-低級アルコール等の溶媒に溶解して使用することが好ましい。

その他の育毛組成物原料は本発明の発毛・育毛組成物中に0.01～20%配合するのが好ましい。
この範囲以下では育毛の有効率が低下し、この範囲以上では、使用感が悪化し、製組成物の安定性が悪化し、紫外線による副作用発生率が増加する。

本発明の育毛組成物には上記必須成分のほかに、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲で、通常の化粧料、医薬部外品、医薬品等に使用される油性基組成物、エモリエント組成物、ゲル化組成物、各種乳化組成物、香料、パラヒドロキシ安息香酸エステル等の酸化防止組成物、染料等の着色組成物、メントール等の清涼組成物、殺菌組成物、プロピレングリコール等の湿潤組成物を添加配合することができる。

また、本発明の育毛組成物は、前記原体から水及び/又は有機溶組成物により抽出される塩類、又は前記各種有効成分を組成物に配合して、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアブロー、ヘアムース、ヘアローション、ポマード、ヘアシャンプー、ヘアリンス、乳液等の化粧料に適用できる。また、前記化粧料の形状は、溶液、ゾル、ゲル、エマルジョン、軟膏、オイル、ワックス、スプレー等の各種化粧品形状において適用することができる。更に、本発明の育毛組成物は、他の公知の発毛・育毛組成物と併用できるのは勿論である。
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定を受けないことは、言うまでもない。

（実施例１）本実施例では、βカテニンの促進組成物として、アスコルビン酸リン酸MgZnと以下の硫黄組成物と育毛剤組成物を含むアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物を用いて効果を確認した。
硫酸、硫酸ナトリウム，硫酸カリウム，硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム，ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、ミスチリル硫酸ナトリウム、ココグリセリル硫酸ナトリウム、シトステロール硫酸ナトリウム、ルチニル二硫酸ナトリウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、システイン、メチオニン、ホモシステイン、タウリンをそれぞれ1gとり、これをAグループ組成物とする。デュタステリド、フィナステリド、ミノキシジル、塩化カルプロニウム 、トランス-3,4’-ジメチル-3-ヒドロキシフラバノン、ベンジルアデニン、ケトコナゾール、アデノシン、タマサキツヅラフジアルカロイド、β－グリチルレチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、サリチル酸、ｄｌ－カンフル、Ｄ－パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ニコチン酸アミド、2-L-アスコルビン酸リン酸ジエステルカリウム塩、dl-α-トコフェロール、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、ピロクトンオラミン、トリクロサン、ミコナゾール硝酸塩、ヒノキチオール、ｌ－メントール、ショウキョウ抽出物、センブリ抽出物、クジン抽出物、トウガラシチンキ、感光素３０１号、エチニルエストラジオール、ノコギリヤシ抽出物、ビオチン、ニンニク抽出物、朝鮮人参抽出物、チョウジ抽出物、当帰抽出物、川キュウ抽出物、チンピ抽出物、薄荷葉抽出物、イチョウ葉抽出物の合計４２物質（このうち抽出物は、溶媒以外の固形物を５％含有する）をそれぞれ0.5ｇとり、その混合物をBグループ組成物とする。上記Aグループ組成物１３ｇとBグループ組成物２１ｇとアスコルビン酸リン酸MgZn 66gを混ぜて１００ｇとし、この混合物にホホバオイル２０ｇと精製水７０ｇを添加して５０℃まで加熱し、電動ホモジナイザーで混合分散させ、褐色懸濁液とし最後に、水酸化ナトリウムでpHを7.0とした。これを試験区２に使用するアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物とした。以下の実施例では、この本発明の混合物をアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物という。

（実施例２）皮膚毛包組織におけるβカテニン産生促進効果を確認するために、豚皮膚毛包のバオプシー組織を使用してウェスタンブロットでβカテニンのタンパク質量を確認した。豚毛包組織は、摘出後無菌下でヒビテン液（5%ヒビテン液（住友製薬）を水で5～20倍に希釈）に5分～10分浸することにより消毒を行った後にD-PBSで数回洗浄した。その後、実体顕微鏡下にて洗浄し毛包部分を単離してWilliam's Medium E培地（Invitrogen）培地中に集めた。単離した毛包は、1ウェルあたり400μlのWilliam's Medium E培地（1% Penicillin-Streptomycin 溶液（Invitrogen）添加）が入った24ウェル培養プレートに1本ずつ入れた。毛包は37℃、5% CO2条件下にて8日間培養し、その間、1日または2日おきに培地の交換を行った。

上記の培地に試験区１としてアスコルビン酸リン酸MgZn（５μＭ）を添加し、更に試験区２として前記のアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物を培養液に対して0.1%重量添加し、無添加の溶媒コントロールとともに8日間培養した。対照にはアスコルビン酸リン酸MgZnの代わりに同濃度のアスコルビン酸リン酸Mgを添加した。次に、トリプシン処理により組織を細胞レベルに分離後、Nuclear/Cytosol Fractionation Kitを用いて細胞質分画と核分画とを分離した。さらに得られたそれぞれの分画をLaemmli Sample Bufferに溶解し、SDS-PAGEを行った。SDS-PAGEによって分離されたタンパクは、PVDF転写膜にブロットし、一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗β－カテニン抗体、抗β－アクチン抗体、抗ヒストンＨ３抗体を用いた。二次抗体として、抗β－カテニン抗体で反応させたあと、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrateで二次抗体が結合したバンドを検出した。この結果、試験区１のアスコルビン酸リン酸MgZnでは、β－カテニンがアスコルビン酸リン酸Mgに比較しバンド強度として、１００％に対して３７０％となり、さらに試験区２のアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物では、３９５％となり、β－カテニン量が有意に増加していることが確認できた。

（実施例３）育毛効果を示す。前記実施例と同様に採取し８日間培養した豚毛包組織に対して、培養を開始日（0日目）および8日目の実体顕微鏡画像をCCDカメラ（pixera model.No.PVC 100C）で撮影し、その画像から毛球部基底部から毛幹先端までの長さを測定した。その後、溶媒コントロール群の培養前後における毛伸長量を100%としてアスコルビン酸リン酸MgZn，アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物及びアスコルビン酸リン酸Mgの毛伸長率を算出した。その結果、毛伸長率は、溶媒コントロールを１００％とした場合、本発明のアスコルビン酸リン酸MgZnの１μMで１１０％、5μMで1１８%、１０μMで１３１％であった。アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物では、溶媒コントロールを１００％とした場合、本発明のアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物の0.1%重量（培養液中濃度）で１４５％であった。
これに対し対象区のアスコルビン酸リン酸Mgは、１μMで９８％、5μMで１０２%、１０μMで１０３％であった。アスコルビン酸リン酸MgZn添加群とアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物においては、アスコルビン酸リン酸Mg及び溶媒コントロール群と比較して有意な毛伸長が認められた。
この結果から、本発明のアスコルビン酸リン酸MgZn及びアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物は育毛効果を有することが明らかとなった。すなわち、アスコルビン酸リン酸MgZnは、育毛効果を示す活性成分であり、育毛組成物として、或いは外用組成物として使用できることが明らかとなった。

（実施例４）育毛効果を示す。本発明のアスコルビン酸リン酸MgZnとアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物及び対象区のアスコルビン酸リン酸Mg，及び溶媒コントロールについて、本発明の効果を確認するため、育毛作用として、毛包及び毛幹の成長を促進させる生理活性を調べるマウス毛包成長法（T. Jindo. J. Dermatol. 20, 756-762,1993.参照）を実施した。９日齢のF1 hybrid mice(Female、C57BL/6×Male、C3H/He)から、顕微鏡下でマウス上唇部分より髭毛包を分離した。分離したマウス髭毛包を、５００unit／ｍＬペニシリン、５００μｇ/ｍＬストレプトマイシン含有Ｈａｎｋ’ｓ液に２０分間浸漬し、ＲＰＭＩ１６４０にて洗浄後、器官培養皿(Falcon 3037)に移した。その後アスコルビン酸リン酸MgZn及びアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物を含む無血清培地で７日間、５％ＣＯ2雰囲気下、３１℃で培養した。その後、顕微鏡を用いて髭毛包伸長率（測定前の長さに対する伸長度：％）を求めた。その結果、毛伸長率は、溶媒コントロールを１００％とした場合、本発明のアスコルビン酸リン酸MgZnの１μMで１０８％、5μMで１１３%、１０μMで１２５％であった。アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物（培養液に対して0.1%重量添加）では、134％の高い毛伸長率を示した。これに対し対象区のアスコルビン酸リン酸Mgは、１μMで１０１％、5μMで１００%、１０μMで１０５％であった。アスコルビン酸リン酸MgZnとアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物添加群においては、アスコルビン酸リン酸Mg及び溶媒コントロール群と比較して有意な毛伸長が認められた。

（実施例５）発毛・育毛効果を示す。薄毛で悩む男性を２０名と女性２０名(年齢３５～６７歳)をそれぞれ被験者として男性１０名と女性１０名の２群に別け、試験区群としてアスコルビン酸リン酸MgZn、５．０％、L-メントール、０．３％、グリセリン、１．５％、フェノキシエタノール、０.７％、精製水、残量を含む育毛水溶性組成物とアスコルビン酸リン酸MgZnを除いたプラセボ区群について、1日2回、頭部に1ヶ月間使用し発毛・育毛効果臨床試験を行なった。３ヵ月後の使用実感を被験者の官能評価（大いに効果有り：４点、少し効果有り２点、変化無し０点、少し悪化－２点、大いに悪化－４点の５段階評価）を発毛効果、増毛効果、抜け毛減少効果、毛のコシ強化効果の４つの効果で行なった。その結果本発明のアスコルビン酸リン酸MgZnを５．０％を含む試験区群では、男性の場合、平均値で発毛効果３.４％、増毛効果３.６％、抜け毛減少効果３.２％、毛のコシ強化効果４.０%であり、女性の場合、平均値で発毛効果３.６％、増毛効果３.４％、抜け毛減少効果４.０％、毛のコシ強化効果３.６%であったのに対して、プラセボ群では、男性の平均値で発毛効果０％、増毛効果０.４％、抜け毛減少効果０.４％、毛のコシ強化効果0.6%であり、女性の平均値で発毛効果０.２％、増毛効果０％、抜け毛減少効果０.２％、毛のコシ強化効果０.４%であり、本発明の効果が男女共に、又男女差なく実際の育毛臨床試験でも確認された。アスコルビン酸リン酸MgZn５％重量の代わりにアスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物５％重量を配合した育毛水溶性組成物についてもこの試験と全く同様な試験を行った結果、男性の場合、平均値で発毛効果３.６％、増毛効果４.０％、抜け毛減少効果３.６％、毛のコシ強化効果３.４%であり、女性の場合、平均値で発毛効果４.０％、増毛効果３.６％、抜け毛減少効果４.０％、毛のコシ強化効果３.６%であり極めて良好な結果が得られた。本発明の組成物は、優れた発毛効果、増毛効果、抜け毛減少効果、毛のコシ強化効果を有することが上記実施例において、男女差なく証明された。また、各実施例において、使用中及び使用後に毛髪や皮膚及び体調等においてパネラーに一切異常や副作用は認められず、製組成物の安定性も保持され、高い安全性と安定性を示すことが確認された。

次に、上記実施例で得たアスコルビン酸リン酸MgZnを用いて、各種の育毛組成物を作製した。

（実施例６）組成物例としてヘアー用水溶液組成物を示す。以下の成分分量の数値は全て重量％とする。
アスコルビン酸リン酸MgZn（叉は、アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物）、５．０、
L-メントール、０．３、
エタノール、６０．５、
グリセリン、１．５、
フェノキシエタノール、０.７
精製水、残分

（実施例７）ヘアー用乳化組成物を示す。
アスコルビン酸リン酸MgZn（叉は、アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物）、０．１、
流動パラフィン、１５．０、
ワセリン、１５．０、
サラシミツロウ、２．０、
カルボキシビニルポリマー、０．１、
キサンタンガム、０．１、
グリセリン、５．０、
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、３．０、
水酸化ナトリウム、０．０５
フェノキシエタノール、０.７
精製水、残分

（実施例８）ヘアー用洗浄組成物を示す。
成分分量（重量％）
アスコルビン酸リン酸MgZn（叉は、アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物）、３．０、
ラウリルポリエキシエチレン(3E.O.)、
硫酸エステルナトリウム塩(30%水溶液)、３０．０、
ラウリル硫酸エステルナトリウム塩(30%水溶液)、１０．０、
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、４．０、
グリセリン、１．０、
フェノキシエタノール、０.７
精製水、残分

（実施例９）ヘアー用乳化組成物を示す。
成分分量（重量％）
アスコルビン酸リン酸MgZn（叉は、アスコルビン酸リン酸MgZn含有混合組成物）、１．０、
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、０．７、
グリセリン、３．０、
シリコーン油、３．０、
流動パラフィン、１．０、
セチルアルコール、１．５、
ステアリルアルコール、１．０、
フェノキシエタノール、０.７
精製水、残分

本発明によれば、男女差の性差なく、効果が高く、安全性と安定性の高い新規な育毛化粧料を提供できる。本発明のアスコルビン酸リン酸MgZn塩類を配合した育毛組成物は、優れた発毛・育毛効果及び高い安全性を有するため、広く発毛・育毛組成物に応用が期待できる。

Claims (2)

1. アスコルビン酸リン酸MgZnを有効成分として含有することを特徴とする,細胞のβカテニンの産生促進組成物。
2. アスコルビン酸リン酸MgZnと、以下のAグループから選択される含硫化合物群から選ばれる1種又は2種以上の組成物と、Bグループから選択される育毛促進組成物群から選ばれる1種又は2種以上の組成物とを有効成分として同時に含有することを特徴とする細胞のβカテニンの産生促進組成物。
   Aグループ
   硫酸、亜硫酸、ピロ亜硫酸、ラウレス硫酸、ラウリル硫酸、セチル硫酸、ミスチリル硫酸、ココグリセリル硫酸、シトステロール硫酸、ルチニル二硫酸、アスコルビン酸硫酸、システイン、メチオニン、ホモシステイン、タウリン叉はこれらのナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛から選択される一種叉はそれらの複合塩。
   Bグループ
   デュタステリド、フィナステリド、ミノキシジル、塩化カルプロニウム 、トランス-3,4’-ジメチル-3-ヒドロキシフラバノン、ベンジルアデニン、ケトコナゾール、アデノシン、タマサキツヅラフジアルカロイド、β－グリチルレチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、サリチル酸、ｄｌ－カンフル、Ｄ－パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ニコチン酸アミド、2-L-アスコルビン酸リン酸ジエステルカリウム塩、dl-α-トコフェロール、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール、イソプロピルメチルフェノール、ピロクトンオラミン、トリクロサン、ミコナゾール硝酸塩、ヒノキチオール、ｌ－メントール、ショウキョウ抽出物、センブリ抽出物、クジン抽出物、トウガラシチンキ、感光素３０１号、エチニルエストラジオール、ノコギリヤシ抽出物、ビオチン、ニンニク抽出物、朝鮮人参抽出物、チョウジ抽出物、当帰抽出物、川キュウ抽出物、チンピ抽出物、薄荷葉抽出物、イチョウ葉抽出物