JP6614773B2 - ラミニン５産生促進剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、塩化セチルピリジニウムを含有するラミニン５産生促進剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、bＦＧＦという。）産生促進剤に関する。より詳しくは、塩化セチルピリジニウムを含有する皮膚潰瘍治療剤、皮膚基底膜活性化剤、口腔用歯周組織再生剤及び歯周病予防剤に関する。

高等動物には、外界の物理的、化学的な刺激を緩和する皮膚という器官が存在し、皮膚は表皮、基底膜、真皮、皮下組織という組織で構成されている。表皮に存在する上皮細胞は、皮膚の表皮ばかりでなく全身の器官に存在する。これら上皮細胞は、上皮細胞下層にある基底膜と接着することで生体につなぎ止められている。その接着に必須の構造体は、ヘミデスモソームと呼ばれ、複数のたんぱく質で構成されている。皮膚では接着に関わる構造体は良く研究されており、基底層に存在する構造体が、表皮と真皮との組織接着や真皮細胞が産生する因子を表皮に供給するなど、皮膚全体を安定させる役割を果たしていると考えられている（特許文献１）。

接着に関わる構造体は、ケラチン、プレクチン、インテグリン、ラミニンなどのたんぱく質で構成されているが、その重要なものの一つがラミニン５である（非特許文献１）。皮膚においては、ラミニン５の産生を促進することにより、皮膚の老化現象である、しわ、たるみ、くすみ、弾力の低下などを予防・改善することができると提案されている（特許文献２）。

ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつもつヘテロ３量体のたんぱく質である。ラミニン５は、α３β３γ２のサブユニットを持ち、ヘミデスモソーム形成、上皮細胞接着、細胞移動促進、創傷の治癒、皮膚再生、表皮水疱症、ギャップジャンクション形成に関与することが明らかになっている。サブユニットのうち、γ２はラミニン５に特有で、細胞接着や細胞移動を担うと考えられている（非特許文献２）。

皮膚以外の器官でも、ラミニン５は、細胞接着や細胞移動、あるいは組織の再生に重要な働きを示し、例えば、口腔内の歯肉においても、皮膚と同様にラミニン５が上皮組織と結合組織との結合に関与している。ところが、口腔には歯肉のみではなく、歯が存在する。歯はエナメル質と象牙質から構成されているが、歯肉が歯と接着するには、皮膚などの上皮組織と同様の接着構造体が必要である。歯肉と歯の歯冠の最表層にあるエナメル質を接着する構造体は、ヘミデスモソームであり、歯科学あるいは口腔学においてもラミニン５は重要な働きを果たしている（非特許文献３）。

また、歯肉の再生において、破壊された組織を再構築するには、歯肉の上皮組織と、歯面および上皮下結合組織との再接着を起こす構造体が必要であり、そのための重要な構成要素の一つもラミニン５である（非特許文献２）。つまり、ラミニン５は、皮膚及び口腔内において、細胞や組織の接着、組織の再生に大きく関与している。

口腔の主な疾患には、う歯と歯周病がある。歯周病は、歯肉、歯根膜、歯槽骨など歯周組織に発生する疾患の総称であるが、その原因は口腔内の主に歯垢に常在する細菌や真菌などの微生物である。微生物が放出する様々な炎症誘発物質が歯肉や歯周組織に炎症を起こし、歯肉に起こる歯肉炎、歯周組織まで至る歯周炎を発症させる。歯周病を改善するには、第一に歯垢の微生物群を除去あるいはコントロールすることが重要であるが、一度、歯肉炎が発生すると、その炎症反応により歯肉が破壊され、歯周ポケットと呼ばれる歯面と歯肉の境目に溝が発生する。さらに、歯垢の微生物群が歯周ポケットを拡大させ、歯肉炎のさらなる悪化を招き、その結果、歯肉ばかりでなく歯周組織全体の退縮が生じ、歯周病の進行を促すことになる。

歯周病を予防するには、歯周ポケットと呼ばれる溝を、可能な限り浅く、狭くする、すなわち、物理的に歯周ポケットを小さくすることが歯周病の予防には重要である。そのためには、歯面と歯肉の接着を促進させることが必須であり、歯垢がたまりにくい状況を作り出すことで、歯周病を予防、改善することができると考えられる。

以上のことから、ラミニン５は、歯肉と歯面のエナメル質を接着させ、皮膚と同様に口腔内の健康維持や歯周組織の退縮を防ぐために必要不可欠であり、歯周病や歯周組織の退縮を防ぐにはラミニン５の産生を促進することが重要となる。

ｂＦＧＦは、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、成長因子ファミリーの一つで、多種の作用を持つ多機能たんぱく質であり、血管形成、傷治癒と胎児の発育に関係する成長因子であることが知られている（特許文献３）。さらに、血管内皮細胞の増殖作用、線維芽細胞増殖作用、創傷治癒、創傷治癒時の肉芽組織を作る作用などが知られている。さらに、中枢神経系の発達に重要な役割を果たし、脳（海馬）内の神経形成、シナプスの柔軟性、記憶、学習プロセスなどに関係していると考えられている。

ｂＦＧＦは、皮膚の分野において、創傷治癒を目的とした皮膚再生や皮膚潰瘍の治療に、ｂＦＧＦを有効成分として配合した治療剤が発売されている（科研製薬株式会社：フィブラストスプレー）。また、骨疾患治療剤としての利用も提案されている（特許文献４）。

また、口腔分野においては、歯周病患者に対して、手術時にｂＦＧＦを歯肉に直接投与する臨床治験が試みられ、歯周組織再生誘導薬として、その効果性が明らかになりつつある（非特許文献４）。

以上、ラミニン５やｂＦＧＦの産生を促進することは、創傷治癒、皮膚潰瘍治療、皮膚や歯肉の再生の重要なポイントとなる。ここで、ｂＦＧＦを有効成分とする皮膚化粧料（特許文献５）、骨疾患治療剤などが提案されている。しかしながら、ｂＦＧＦを直接、有効性成分として配合した治療剤は、日常的な使用が困難で、かつ、安心に安価に使用できるものとはいえないのが現状である。

塩化セチルピリジニウムは、口腔用組成物の分野では、一般的にカチオン性殺菌剤として、利用されている（特許文献６）。しかしながら、殺菌剤以外の生理活性については、知られておらず、殺菌剤以外の用途では有機合成の分野で触媒として利用されているものの、それ以外の用途、例えば、本願発明に示すラミニン５産生促進剤、ｂＦＧＦ産生促進剤、皮膚潰瘍治療剤、皮膚基底膜活性化剤、口腔用歯周組織再生剤については一切知られていない。

特開２０１２−２４０９１１号公報 特開２０１２−２１９０３１号公報 特開２０１２−１５８５７３号公報 特開平０５−１２４９７５号公報 特開平０５−０４３４４２号公報 特開２０１２−２１４４０２号公報 Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，Ｐ．,ｅｔ ａｌ．,Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．,１１４，５６７−５７６，１９９１ 正岡,Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ,４４,４８９−４９５,２００９ 衣松,Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ,４４,１３−２０,２００９ 村上,日歯周誌,５４,３８−４５,２０１２

本発明は、塩化セチルピリジニウムを含有するラミニン５産生促進剤、ｂＦＧＦ産生促進剤、より詳しくは、塩化セチルピリジニウムを含有する皮膚潰瘍治療剤、皮膚基底膜活性化剤、口腔用歯周組織再生剤、歯周病予防剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究した結果、塩化セチルピリジニウムにラミニン５産生促進作用及びｂＦＧＦ産生促進作用があることを見出した。より詳しくは、皮膚潰瘍治療剤、皮膚基底膜活性化剤、口腔用歯周組織再生剤及び歯周病予防剤として利用できることから本発明を完成するに至った。

本発明に用いる塩化セチルピリジニウムは、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリドとも呼ばれ、ピリジン環を有するカチオン性殺菌剤である。口腔用として広く使用されており、市販品を利用することができる。

本発明に用いる塩化セチルピリジニウムの含有量は、形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが、０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％、さらに好ましくは０．０１〜０．０５重量％である。上記範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて含有する必要がある場合もある。

本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品に用いることができる。その剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、ローション、ヘアクリーム、ヘアコンディショナー、ヘアジェル、ヘアミスト、ヘアフォーム、シャンプー、リンス、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などを含む）、口腔用として練歯磨剤、洗口剤、トローチ剤などが挙げられる。

本発明には、塩化セチルピリジニウムの効果を損なわない範囲内で、医薬品、医薬部外品、化粧品に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料などの成分を含有することもでき、口腔用として、研磨剤、発泡剤、湿潤剤、保湿剤、結合剤、他の薬効成分などを含有することができる。

本発明の塩化セチルピリジニウムは、ラミニン５産生促進作用及びｂＦＧＦ産生促進作用を発揮することで、皮膚潰瘍治療、皮膚基底膜活性化、口腔用歯周組織再生及び歯周病予防作用を有する。

本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されない。実施例に示す含有量の部とは重量部を示す。

化粧水
処方 含有量(部)
１．塩化セチルピリジニウム ０．０５
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

クリーム
処方 含有量(部)
１．塩化セチルピリジニウム ０．０５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

乳液
処方 含有量(部)
１．塩化セチルピリジニウム ０．０１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

パック
処方 含有量(部)
１．塩化セチルピリジニウム ０．０３
２．ポリビニルアルコール １２．０
３．エタノール ５．０
４．１，３−ブチレングリコール ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
７．クエン酸 ０．１
８．クエン酸ナトリウム ０．３
９．香料 適量
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１０を均一に溶解し製品とする。

浴用剤
処方 含有量(部)
１．塩化セチルピリジニウム ０．０１
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。

練歯磨１
処方 含有量（部）
１．リン酸水素カルシウム ４２．０
２．ラウリル硫酸ナトリウム １．２
３．塩化セチルピリジニウム ０．０５
４．グリセリン １８．０
５．カラギーナン ０．９
６．サッカリンナトリウム １．０
７．グルコン酸クロルヘキシジン ０．１
８．香料 ０．１
９．パラオキシ安息香酸エチル ０．１
１０．水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜１０をよく混合した後、成分１〜２を加えて練和し、脱泡後チューブに充填して練歯磨を得た。

練歯磨２
処方 含有量（部）
１．炭酸カルシウム ４２．０
２．ラウリル硫酸ナトリウム １．２
３．塩化セチルピリジニウム ０．０３
４．グリセリン １８．０
５．カラギーナン ０．９
６．サッカリンナトリウム １．０
７．香料 ０．１
８．パラオキシ安息香酸エチル ０．１
９．水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜９をよく混合した後、成分１〜２を加えて練和し、脱泡後チューブに充填して練歯磨を得た。

洗口液
処方 含有量（部）
１．エタノール ２０．０
２．グリセリン １０．０
３．塩化セチルピリジニウム ０．０５
４．サッカリンナトリウム ０．１
５．香料 ０．１
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） １．５
７．パラオキシ安息香酸エチル ０．１
８．水にて全量を１００とする
［製造方法］成分８に成分２〜７を溶解した後、成分１を加えて洗口液を得た。

実験例１ 皮膚表皮細胞におけるラミニン５産生促進試験
ヒト表皮角化細胞（ＨａＣａＴ、コスモバイオより購入）を２４ウエルプレートに２×１０^４細胞となる様に播種し、１０％血清を含むイーグルＭＥＭ培地にて培養した。その後、塩化セチルピリジニウムを０．０５、０．１、０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬＬＰＳ（リポポリサッカライド）を含む同培地で培養した。培養後、細胞を回収し、遺伝子発現変動をＲＴ−ＰＣＲ法で比較した。ラミニン５の遺伝子発現は、ラミニン５に特有のγ２の遺伝子発現を指標とした。１μｇ／ｍＬＬＰＳを添加し、塩化セチルピリジニウムを添加していない対照を１とした遺伝子発現量比を算出した。

結果を表１に示した。表中の数値は、平均と標準誤差を示す。塩化セチルピリジニウムは、皮膚表皮細胞のラミニン５遺伝子の発現を亢進し、ラミニン５の産生を促進する作用を示した。尚、表１のＣＰＣは塩化セチルピリジニウムを、ＬＰＳはリポポリサッカライドを示す。

実験例２ 歯肉上皮細胞におけるラミニン５産生促進試験
マウス由来の歯肉上皮細胞（ＧＥ１、理研バイオリソースセンターより購入）を２４ウエルプレートに２×１０^４細胞となる様に播種し、ＳＦＭ−１０１培地にて培養した。その後、塩化セチルピリジニウムを０．０５、０．１、０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬＬＰＳ（リポポリサッカライド）を含む同培地で培養した。培養後、細胞を回収し、遺伝子発現変動をＲＴ−ＰＣＲ法で比較した。ラミニン５の遺伝子発現は、ラミニン５に特有のγ２の遺伝子発現を指標とした。１μｇ／ｍＬＬＰＳを添加し、塩化セチルピリジニウムを添加していない対照を１とした遺伝子発現量比を算出した。

結果を表２に示した。表中の数値は、平均と標準誤差を示す。塩化セチルピリジニウムは、歯肉上皮細胞のラミニン５遺伝子の発現を亢進し、ラミニン５の産生を促進する作用を示した。尚、表２のＣＰＣは塩化セチルピリジニウムを、ＬＰＳはリポポリサッカライドを示す。

実験例３ 皮膚表皮細胞におけるｂＦＧＦ産生促進試験
ヒト表皮角化細胞（ＨａＣａＴ、コスモバイオより購入）を２４ウエルプレートに２×１０^４細胞となる様に播種し、１０％血清を含むイーグルＭＥＭ培地にて培養した。その後、塩化セチルピリジニウムを０．０５、０．１、０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬＬＰＳ（リポポリサッカライド）を含む同培地で培養した。培養後、細胞を回収し、遺伝子発現変動をＲＴ−ＰＣＲ法で比較した。１μｇ／ｍＬＬＰＳを添加し、塩化セチルピリジニウムを添加していない対照を１とした遺伝子発現量比を算出した。

結果を表３に示した。表中の数値は、平均と標準誤差を示す。塩化セチルピリジニウムは、皮膚表皮細胞のｂＦＧＦの遺伝子の発現を亢進し、ｂＦＧＦの産生を促進する作用を示した。尚、表３のＣＰＣは塩化セチルピリジニウムを、ＬＰＳはリポポリサッカライドを示す。

実験例４ 歯肉上皮細胞におけるｂＦＧＦ産生促進試験
マウス由来の歯肉上皮細胞（ＧＥ１、理研バイオリソースセンターで購入）を２４ウエルプレートに２×１０^４細胞となる様に播種し、ＳＦＭ−１０１培地にて培養した。その後、塩化セチルピリジニウムを０．０５、０．１、０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬＬＰＳ（リポポリサッカライド）を含む同培地で培養した。培養後、細胞を回収し、遺伝子発現変動をＲＴ−ＰＣＲ法で比較した。１μｇ／ｍＬＬＰＳを添加し、塩化セチルピリジニウムを添加していない対照を１とした遺伝子発現量比を算出した。

結果を表４に示した。表中の数値は、平均と標準誤差を示す。塩化セチルピリジニウムは、歯肉上皮細胞のｂＦＧＦの遺伝子の発現を亢進し、ｂＦＧＦの産生を促進する作用を示した。尚、表４のＣＰＣは塩化セチルピリジニウムを、ＬＰＳはリポポリサッカライドを示す。

以上の結果より、塩化セチルピリジニウムは、皮膚表皮細胞及び歯肉上皮細胞のラミニン５の遺伝子発現を亢進することで、ラミニン５の産生を促進し、ｂＦＧＦの遺伝子発現を亢進することで、ｂＦＧＦの産生を促進することが明らかとなった。以上の作用を有することで、塩化セチルピリジニウムを皮膚潰瘍治療剤、皮膚基底膜活性化剤、口腔用歯周組織再生剤及び歯周病予防剤に利用することができる。

本発明のラミニン５産生促進剤及びｂＦＧＦ産生促進剤は、日常的に使用可能な、安心かつ安価なラミニン産生促進作用及びｂＦＧＦ産生促進作用を有する医薬品、医薬部外品または化粧品として利用できる。

Claims (2)

1. 歯肉上皮細胞を培養し、歯肉上皮細胞のラミニン５産生を促進するための培地であって、塩化セチルピリジニウムを歯肉上皮細胞のラミニン５産生促進剤として含有することを特徴とする培地。
2. 歯肉上皮細胞を培養し、歯肉上皮細胞の塩基性線維芽細胞増殖因子産生を促進するための培地であって、塩化セチルピリジニウムを歯肉上皮細胞の塩基性線維芽細胞増殖因子産生促進剤として含有することを特徴とする培地。