JP7036461B2

JP7036461B2 - タンシノン類化合物の使用

Info

Publication number: JP7036461B2
Application number: JP2020201803A
Authority: JP
Inventors: 洪凱畢; 培培羅; 衍強黄
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: CN110859845B; JP2021091681A; CN110859845A

Description

本発明は、生物医学分野に属し、具体的には、タンシノン類化合物の医薬用途に関し、特にその抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造における使用に関する。

ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）は、グラム陰性菌であり、螺旋状、微好気性で、胃癌のクラスＩ発癌物質であり、びらん性胃炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃リンパ腫などの多くの疾患を引き起こす可能性がある。世界的な流行病統計によると、２０１７年にヘリコバクター・ピロリの感染率は１８．９％－８７．７％であり、中国人口の半分以上がヘリコバクター・ピロリに感染した。そこで、ヘリコバクター・ピロリの根絶は、世界中の人々の共通の目標となっている。現在、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する主な治療方法は、２種類の抗生物質（アモキシシリン、クラリスロマイシン、レボフロキサシン、メトロニダゾールなどから２種類を選択する）を主とする３剤または４剤併用療法である。しかし、過去１０年間で、ヘリコバクター・ピロリの抗生物質に対する耐性は年々増加している。２０１６年の統計によると、中国では、ヘリコバクター・ピロリのレボフロキサシンおよび及クラリスロマイシンに対する耐性率は約５０％であり、メトロニダゾールに対する耐性率は６０％を超えた。そのため、安全で効果的で新しい抗ヘリコバクター・ピロリ薬の開発は非常に重要である。

シソ科アキギリ属の植物である丹参（ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＢｇｅ）の乾燥した根と根茎は、中国において最も使用されている活血化淤用漢方薬の一つである。丹参から抽出されたタンシノン類化合物は丹参の主な有効成分である。研究により、タンシノン類化合物は抗がん、抗炎症、エストロゲン様活性、心血管保護、抗特定の陽性細菌などの多くの薬理作用を有する。現在分離されたタンシノン類化合物には、主にジヒドロタンシノン、クリプトタンシノン、イソクリプトタンシノン、タンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、タンシノンＩＩＢなどの１０種類以上のタンシノンが含まれる。

本発明は、タンシノン類化合物の使用を提供し、具体的には、抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造における使用に関する。本発明の抗ヘリコバクター・ピロリ薬は、標準ヘリコバクター・ピロリ株、臨床的に敏感で薬剤耐性のあるヘリコバクター・ピロリ菌株に対して良好な抑制作用を有する。

抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造におけるタンシノン類化合物の使用。

好ましくは、上記タンシノン類化合物は、ジヒドロタンシノンＩ、ジヒドロイソタンシノンＩ、クリプトタンシノン、イソクリプトタンシノン、タンシノンＩ、イソタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、イソタンシノンＩＩＡ、ネオクリプトタンシノン、メチルタンシノナート、テトラヒドロタンシノンＩ、タンシノンＩＩＢ、ヒドロキシタンシノンＩＩＡおよびミルチロンのうちの少なくとも１種である。

好ましくは、上記ジヒドロタンシノンＩおよびジヒドロイソタンシノンＩの最小発育阻止濃度の範囲は０．１２５－１μｇ／ｍＬである。

抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造におけるタンシノン類化合物とオメプラゾールの組成物の使用。

抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造におけるジヒドロタンシノンＩとオメプラゾールの組成物の使用。

有効成分はタンシノン類化合物とオメプラゾールの組成物である抗ヘリコバクター・ピロリ薬。

好ましくは、上記タンシノン類化合物はジヒドロタンシノンＩである。

１、本発明では、複数種類のタンシノン類化合物の新しい用途が発見された。これらのタンシノン類化合物は、ヘリコバクター・ピロリを効果的に死滅することができる。
２、本発明では、薬剤耐性または感受性のヘリコバクター・ピロリ感染の治療に適用できる。ジヒドロタンシノンＩは、抗ヘリコバクター・ピロリ活性が高く、薬剤耐性が発生しにくく、マウスの体重に明らかな影響を与えず、肝臓、腎臓、脾臓組織に明らかな損傷作用がなく、腸内細菌叢への影響が少なく、安全性が高い。

注：ＭＩＣは最小発育阻止濃度の略語である。ＯＰＺはオメプラゾールの略語である。ＡＣはアモキシシリン＋クラリスロマイシンの略語である。ＤＨＴはジヒドロタンシノンＩの略語である。

インビトロでそれぞれ誘導されたジヒドロタンシノンに対するＧ２７の耐薬性試験である。ＤＨＴはジヒドロタンシノンＩであり、ＭＴＺはメトロニダゾールである。マウス体内におけるヘリコバクター・ピロリに対するジヒドロタンシノンＩの抑制作用である。図２Ａは、ヘリコバクター・ピロリ感染マウスを用いる急性胃炎動物モデルの構築および薬物治療のフローチャートである。図２Ｂは、異なる治療群を治療した後のマウス胃粘膜におけるヘリコバクター・ピロリの定着量の測定結果である。マウス胃粘膜炎症に対するジヒドロタンシノンＩの修復作用を示す。ａ、ｂ、ｃ、ｄはＨＥ染色（×１００倍）である。ｅ、ｆ、ｇ、ｈはＴＵＮＥＬ染色（×１００倍）である。ジヒドロタンシノンＩで治療した後のマウス腸内細菌に対する影響の検出を示す。図４Ａはマウス糞便細菌の定量検出結果である。図４Ｂはマウス回腸内容物細菌の定量検出結果である。マウス肝臓、腎臓、脾臓細胞に対するジヒドロタンシノンＩの損傷状況を示す。１０倍治療用量のジヒドロタンシノンＩによる治療前後のマウスの体重変化を示す。

［実施例１］
１．材料
１．１サンプル
ＭＣＥ社から純度が９８％を超えたタンシノン類化合物を購入し、ＣｈｅｍＦａｃｅｓ社から純度が９８％以上のタンシノン類化合物を購入した。

１．２菌株
（１）ヘリコバクター・ピロリ菌株：菌株ＭＳＤ１３２、菌株ＮＳＨ５７、菌株２６６９５、菌株Ｇ２７、臨床的感受性菌株および薬剤耐性菌株（本実験室で臨床患者の胃粘膜サンプルから分離して培養することにより得られた）。
（２）非ヘリコバクター・ピロリ：大腸菌（ＭＧ１６５５）、緑膿菌（ＰＡＯ１）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ６５３８）、サルモネラ菌（ＡＴＣＣ１４０２８）、アシネトバクター・バウマンニー（ＡＴＣＣ１９６０６）、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ３５６５７）、プロテウス・ミラビリス（ＡＴＣＣ２９９０６）、エンテロコッカス・フェシウム（ＦＡ２－２）、ラクトコッカス・ラクティス（ＭＧ１３６３）、セレウス菌（ＡＴＣＣ１４５７９）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（ＡＴＣＣ５１３３１）、エンテロバクター・クロアカ（ＡＴＣＣ１３０４７）、モーガネラ・モーガニイ（ＡＴＣＣ２５８３０）、リステリア菌（ＥＧＤｅ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（ＭＣ^２１５５）、エンテロコッカス・フェカリス菌（ＡＴＣＣ１９４３４）、枯草菌（１６８）、カンピロバクター・ジェジュニ（ＮＣＴＣ１１１６８）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（ＶＴ１１６９）、モラクセラ・カタラーリス（ＡＴＣＣ２５２３８）、志賀赤痢菌（ｓｄ１９７）。

１．３培地および主な試薬
ＬＢ培養液、ＬＢ培地、ＭＨ培養液、ＭＨ培地、脳心臓浸出液培養液、コロンビア培地、選択的抗生物質（バンコマイシン、ポリミキシンＢ、トリメトプリム）、ウシ胎児血清、オメプラゾール、メトロニダゾール、アモキシシリン、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。

１．４実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス。

１．５機器：ＢＩＮＤＥＲＣＢ１６０トリガスインキュベーター、組織破砕機、遠心分離器、電子天秤、ハサミなど。

１．６消耗材料：ＥＰ管、遠沈管、Ｔｉｐヘッドなど。

２．方法および結果
２．１微量希釈法により複数種類のタンシノン類化合物のヘリコバクター・ピロリに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ１００μＬ系）を測定した。
（１）１．６ｍｇ／ｍＬのタンシノン類化合物溶液を調製し、１．６ｍｇ／ｍＬのメトロニダゾール（ＭＴＺ）溶液を調製した。溶媒はいずれも１００％ＤＭＳＯであった。

（２）ＭＩＣプレートの作製
１番目のウェルに培地１７２μＬを加えた後、８μＬのタンシノン類化合物を加え、１２番目のウェルまで倍加希釈し、隣り合う列のウェルについは同様な方法でメトロニダゾールを加えた。もう１列のウェルに９０μＬ培地および１０μＬ菌液を加え、陽性群とした。さらにもう１列のウェルに１００μＬ培地を加え、無菌対照群とした。

（３）菌液の調製
固体プレートでの対数増殖期にあるヘリコバクター・ピロリを取り、ＢＨＩ培養液を用いて菌懸濁液を調製し、濃度ＯＤ６００を０．３（約１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）まで調整し、１０倍希釈して１×１０^７ＣＦＵ／ｍＬにした。

（４）菌液接種
菌液を１０μＬ取り、無菌対照群の各ウェルに加えた（各ウェルの菌液濃度は約１．０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）。４８または７２時間培養した後、結果を分析した。

（５）結果判断
４８または７２時間培養した後、結果を分析し、細菌増殖が完全に抑制されたウェルの最小薬物濃度をＭＩＣとした。試験を３回繰り返した。

（６）結果：表１

ＤＨＴ：ジヒドロタンシノンＩ、ＤＨＩＴ：ジヒドロイソタンシノンＩ、ＴＩ：タンシノンＩ、ＩＴＩ：イソタンシノンＩ、ＴＩＩＡ：タンシノンＩＩＡ、ＩＴＩＩＡ：イソタンシノンＩＩＡ、ＣＴ：クリプトタンシノン、ＩＣＴ：イソクリプトタンシノン、ＮＣＴ：ネオクリプトタンシノン、ＭＥＴ：メチルタンシノナート、ＴＨＴ：テトラヒドロタンシノンＩ、ＴＩＩＢ：タンシノンＩＩＢ、ＨＴＩＩＡ：ヒドロキシタンシノンＩＩＡ、ＭＩＴ：ミルチロン、ＭＴＺ：メトロニダゾール。

２．２微量希釈法によりジヒドロタンシノンＩの非ヘリコバクター・ピロリに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ，１００μＬ系）を測定した。用いた培地、培養液がＭＨ培地、培養液である以外、ヘリコバクター・ピロリに対するＭＩＣの測定と同様であった。

結果：表２

２．３ジヒドロタンシノンＩを用いてＧ２７に薬剤耐性を誘導する実験
２．３．１ジヒドロタンシノンＩのヘリコバクター・ピロリに対するＭＩＣ量の１／２倍を初期濃度として薬剤耐性を誘導した。

菌株：Ｇ２７

薬物の投与：１／２のＭＩＣ薬物濃度に５ｍＬを掛けた値を投与量とし、４８時間後に結果を観察した。増殖状況が良好であった場合、薬物濃度を倍増し、増殖しなかった場合、現在の薬物濃度を維持した。

継代：４８時間培養した後、細菌増殖状況を観察し、菌液を取り、上記方法により引き続き薬剤耐性を誘導し、２世代ごとにＭＩＣを測定した。
対照群はメトロニダゾールである以外、方法は同様であった。
結果：図１。

２．４マウス胃内定着ヘリコバクター・ピロリに対するジヒドロタンシノンＩの抑制効果の検出
２．４．１マウスヘリコバクター・ピロリ感染モデルの構築
マウスモデルの構築：（ＨｕａｎｇＹ，ＨａｎｇＸ，ＪｉａｎｇＸ，ＺｅｎｇＬ，ＪｉａＪ，ＸｉｅＹ，ＬｉＦ，ＢｉＨ．ＩｎＶｉｔｒｏａｎｄＩｎＶｉｖｏＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＺｉｎｃＬｉｎｏｌｅｎａｔｅ，ａＳｅｌｅｃｔｉｖｅＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌＡｇｅｎｔａｇａｉｎｓｔＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ．ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ［Ｊ］．２０１９Ｍａｙ２４；６３（６））を参照。

＜モデル構築の判断＞
１０％のマウス胃組織を取り、ヘリコバクター・ピロリの定着を検出し、定着量が１×１０^５～１×１０^６ＣＦＵ／ｇである場合、定着成功と評価された。検出した結果、いずれもヘリコバクター・ピロリが定着した。

２．４．２ジヒドロタンシノンＩ効果の検出
（１）群分け
実験群について、構築が成功した感染群を８匹／群で３群に分け、それぞれはオメプラゾール＋ジヒドロタンシノンＩ群、オメプラゾール＋アモキシシリン＋クラリスロマイシン群、およびＰＢＳ群であった。ヘリコバクター・ピロリに感染していない８匹のマウスを陰性対照群とした。

（２）投与
胃内投与を採用した。オメプラゾールは、他の薬物よりも３０分前に投与され、投与後に４時間断食断水した。マウスの体重を平均２０ｇ／匹とし、投与量はオメプラゾール１３８．２ｍｇ／ｋｇ、アモキシシリン２８．５ｍｇ／ｋｇ、クラリスロマイシン１４．３ｍｇ／ｋｇ、ジヒドロタンシノンＩ２８．５ｍｇ／ｋｇであり、日に１回で３回連続投与した。陰性対照群では、ＰＢＳ液を投与し、用量、回数は上記と同様であった。

（３）投与停止後の３日目に、感染群のマウスに対して体重を測り、平均体重を計算し、安楽死させ、胃組織を取り、ヘリコバクター・ピロリの分離培養および同定を行い、マウスの胃組織に対して病理切片を作製して染色した。オメプラゾール＋ジヒドロタンシノンＩ２８．５ｍｇ／ｋｇ群のヘリコバクター・ピロリに対する抑制効果は、３剤併用群（オメプラゾール＋アモキシシリン＋クラリスロマイシン）よりも優れた（Ｐ＜０．０５）。結果を図２に示す。

２．４．３マウス胃組織ＨＥ染色およびＴＵＮＥＬ染色結果（図３（×１００倍））

２．４．４マウス腸管内容物および糞便細菌ｑＰＣＲの定量的モニタリング
新鮮なマウス糞便および末端回腸組織を収集し、細菌１６ＳｒＲＮＡユニバーサルプライマーを用い、ｑＰＣＲ検出方法によりサンプルに含まれる細菌を定量的に検出した。結果を図４に示す。

２．４．５マウスの肝臓、脾臓、腎臓組織のＨＥ染色結果（図５（×１００倍））

２．５ジヒドロタンシノンＩの安全性評価
１０倍のジヒドロタンシノン治療量で投与し、すなわち、各マウスに２８５ｍｇ／ｋｇで投与し、日に１回で５日間投与した。陰性対照群は、インビボ抗菌試験において感染していない群（Ｃｏｎｒｏｌ群）であった。感染していない群にＰＢＳ液を投与し、回数と要領は投与群と同様であった。
ジヒドロタンシノンＩのマウス体重に対する影響の評価
マウスへの投与前後に、７日間連続して毎日体重を測った。結果を図６に示す。

Claims

抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造におけるタンシノン類化合物の使用であって、
前記タンシノン類化合物は、ジヒドロタンシノンＩ、ジヒドロイソタンシノンＩ、クリプトタンシノン、イソクリプトタンシノン、タンシノンＩ、イソタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、イソタンシノンＩＩＡ、ネオクリプトタンシノン、メチルタンシノナート、テトラヒドロタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、ミルチロンおよびヒドロキシタンシノンＩＩＡのうちの少なくとも１種である、使用。
前記ジヒドロタンシノンＩおよびジヒドロイソタンシノンＩの最小発育阻止濃度の範囲は０．１２５－１μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の使用。
抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造におけるタンシノン類化合物とオメプラゾールの組成物の使用であって、
前記タンシノン類化合物は、ジヒドロタンシノンＩ、ジヒドロイソタンシノンＩ、クリプトタンシノン、イソクリプトタンシノン、タンシノンＩ、イソタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、イソタンシノンＩＩＡ、ネオクリプトタンシノン、メチルタンシノナート、テトラヒドロタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、ミルチロンおよびヒドロキシタンシノンＩＩＡのうちの少なくとも１種である、使用。
抗ヘリコバクター・ピロリ薬の製造におけるジヒドロタンシノンＩとオメプラゾールの組成物の使用。
有効成分はタンシノン類化合物とオメプラゾールの組成物である抗ヘリコバクター・ピロリ薬であって、
前記タンシノン類化合物は、ジヒドロタンシノンＩ、ジヒドロイソタンシノンＩ、クリプトタンシノン、イソクリプトタンシノン、タンシノンＩ、イソタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、イソタンシノンＩＩＡ、ネオクリプトタンシノン、メチルタンシノナート、テトラヒドロタンシノンＩ、タンシノンＩＩＡ、ミルチロンおよびヒドロキシタンシノンＩＩＡのうちの少なくとも１種である、抗ヘリコバクター・ピロリ薬。
前記タンシノン類化合物はジヒドロタンシノンＩである請求項５に記載の抗ヘリコバクター・ピロリ薬。