CN110859845B - 丹参酮类化合物的应用 - Google Patents

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Abstract

丹参酮类化合物的应用，所述的丹参酮类化合物，尤其是二氢丹参酮I、二氢异丹参酮I对标准敏感幽门螺杆菌、临床敏感及耐药幽门螺杆菌等均具有较好的抑菌作用，最低抑菌浓度范围为0.125～1μg/mL。二氢丹参酮I在抗幽门螺杆菌过程中不易产生耐药，对小鼠胃内定植幽门螺杆菌有很强的杀灭作用，给药前后对小鼠体重无影响，对肝、肾、脾组织无损伤作用，和三联疗法相比安全性高，二氢丹参酮I对肠道菌群的影响更小。所述的多种丹参酮类化合物为临床治疗幽门螺杆菌感染提供候选药物。

Description

丹参酮类化合物的应用
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及丹参酮类化合物的医药用途，尤其涉及其在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性菌，螺旋形、微需氧，为胃癌的I级致癌因子，同时也可以引起糜烂性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡、胃淋巴瘤等多种疾病。2017年全球流行病统计幽门螺杆菌感染率为18.9％至87.7％，中国人群中有超过一半的感染幽门螺杆菌，根除幽门螺杆菌是全世界人民共同目标。目前，幽门螺杆菌感染的一线治疗方案主要是以包含两种抗生素(阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑等选二种)为主的三联或四联疗法，但近十年来幽门螺杆菌对抗生素的耐药性却逐年增加，2016年统计我国幽门螺杆菌对左氧氟沙星及克拉霉素耐药率约50％，甲硝唑耐药率超过60％，因此寻找一种新型、安全、高效抗幽门螺杆菌药物的意义重大。
丹参属唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎，是我国应用最广泛的活血、化瘀中药之一，其中从中药丹参中提取的丹参酮类化合是丹参的主要有效成份，已研究显示其具有多种药理学作用，如抗癌、抗炎、雌激素样活性、心血管保护、抗某些阳性菌等作用。目前分离出的丹参酮类化合物主要有二氢丹参酮、隐丹参酮、异隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB等10余种丹参酮单体。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种丹参酮类化合物的应用，具体涉及在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，并且其针对标准幽门螺杆菌株、临床敏感及耐药幽门螺杆菌菌株都有较好的抑制作用。
技术方案：丹参酮类化合物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
优选的，上述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I、二氢异丹参酮I、隐丹参酮、异隐丹参酮、丹参酮I、异丹参酮I、丹参酮ⅡA、异丹参酮IIA、新隐丹参酮、丹参酮甲酯、四氢丹参酮I、丹参酮IIB、羟基丹参酮IIA和丹参新酮中的至少一种。
优选的，上述二氢丹参酮I和二氢异丹参酮I的最小抑菌浓度范围为0.125-1μg/mL。
丹参酮类化合物与奥美拉唑组合物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
二氢丹参酮I与奥美拉唑组合物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
一种抗幽门螺杆菌药物，有效成分为丹参酮类化合物与奥美拉唑的组合物。
优选的，上述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I。
有益效果：1、本发明发现了多种丹参酮类化合物的新用途，可以有效的杀灭幽门螺杆菌；2，本发明发现可用于治疗耐药性或敏感性幽门螺杆菌感染，其中二氢丹参酮I抗幽门螺杆菌活性强，不易产生耐药，对小鼠体重无明显影响，肝、肾、脾组织无明显损伤作用，对肠道菌群影响小，安全性高。
附图说明
图1为体外分别诱导G27对二氢丹参酮耐药试验。DHT为二氢丹参酮I，MTZ为甲硝唑。
图2为二氢丹参酮I在小鼠体内对幽门螺杆菌的抑制作用。A.幽门螺杆菌感染小鼠构建急性胃炎动物模型和药物治疗流程图；B.不同治疗组治疗后幽门螺杆菌在小鼠胃粘膜定植量检测结果。
图3为二氢丹参酮I对小鼠胃粘膜炎症的修复作用。a、b、c、d为HE染色，×100倍，e、f、g、h为TUNEL染色，×100倍。
图4为二氢丹参酮I治疗后对小鼠肠道细菌影响的检测。a为小鼠粪便细菌定量检测结果，b为小鼠回肠内容物细菌定量检测结果。
图5为二氢丹参酮I对小鼠肝、肾、脾细胞的损伤情况。
图6为二氢丹参酮I为10倍治疗剂量前后小鼠体重变化。
注：MIC为最低抑菌浓度缩写，OPZ为奥美拉唑英文缩写，AC为阿莫西林+克拉霉素缩写，DHT为二氢丹参酮I的缩写。
具体实施方式
实施例1
1.材料
1.1样品
MCE公司购买部分纯度为＞98％的丹参酮类化合物，ChemFaces公司购买部分纯度为≥98％的丹参酮类化合物。
1.2菌株
(1)幽门螺杆菌菌株:菌株MSD132、菌株NSH57、菌株26695、菌株G27；临床敏感菌株及耐药菌株(由本实验室从临床患者胃粘膜样本分离培养获得)；
(2)非幽门螺杆菌：大肠杆菌(MG1655)、铜绿假单胞菌(PAO1)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC35657)、奇异变形杆菌(ATCC29906)、屎肠球菌(FA2-2)、乳酸乳球菌(MG1363)、蜡状芽孢杆菌(ATCC 14579)、嗜麦芽寡养单胞菌(ATCC51331)、阴沟肠杆菌(ATCC13047)、摩根菌(ATCC 25830)、李斯特菌(EGDe)、耻垢分枝杆菌(MC2 155)，粪肠球菌(ATCC19434)，枯草芽孢杆菌(168)，空肠弯曲菌(NCTC11168)，伴放线放线杆菌(VT1169)，卡他莫拉菌(ATCC25238)，痢疾志贺菌(sd197)。
1.3培养基和主要试剂：LB培养液、LB培养基、MH培养液、MH培养基、脑心浸液培养液、哥伦比亚培养基、选择性抗生素(万古霉素、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶)、小牛血清、奥美拉唑、甲硝唑、阿莫西林、100％二甲基亚砜(DMSO)。
1.4实验动物：C57BL/6小鼠。
1.5主要仪器：BINDER CB160三气培养箱、组织破碎仪、离心机、电子天平、剪刀等。
1.6耗材：EP管、离心管、Tip头等。
2.方法与结果
2.1微量稀释法检测多种丹参酮类化合物对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC 100μL体系)
(1)配备1.6mg/mL的丹参酮类化合物溶液，配备1.6mg/mL的甲硝唑(MTZ)溶液，溶剂均为100％DMSO。
(2)MIC板制备：第一孔先加培养基172μL，再加8μL的丹参酮类化合物，倍比稀释至第12孔；其旁边一纵排孔以同样方法加甲硝唑，并保留一纵排孔加90μL培养基和10μL菌液，作为阳性组，一纵排孔加100μL培养基，做无菌对照组。
(3)菌液制备：取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用BHI培养液制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(约1×108CFU/mL)，稀释10倍，为1×107CFU/mL，备用。
(4)接种菌液取10μL加入初无菌对照的每孔(每孔菌液浓度约为1.0×106CFU/mL)内。培养48或72h判断结果。
(5)结果判断：48或72h判读结果，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。重复3次试验。
(6)结果：结果见表1。
表1多种丹参酮类化合物对幽门螺杆菌最低抑菌浓度(μg/mL)
Figure BDA0002310981920000041
注：DHT，二氢丹参酮I；DHIT，二氢异丹参酮I；TI，丹参酮I；ITI，异丹参酮I；TIIA，丹参酮IIA；ITIIA，异丹参酮IIA；CT，隐丹参酮；ICT，异隐丹参酮；NCT，新隐丹参酮；MET，丹参酮甲酯；THT，四氢丹参酮I；TIIB，丹参酮IIB；HTIIA,羟基丹参酮IIA；MIT，丹参新酮；MTZ，甲硝唑。
2.2微量稀释法检测二氢丹参酮I对非幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)，除所用培养基、培养液为MH培养基、培养液外，余均与检测对幽门螺杆菌MIC一致。
结果：见表2。
表2二氢丹参酮I对非幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(μg/mL)
Figure BDA0002310981920000051
2.3用二氢丹参酮I诱导G27产生耐药实验
2.3.1 1/2倍二氢丹参酮I对幽门螺杆菌MIC量为起始浓度诱导耐药。
菌株：G27。
药物加入：起按照1/2的MIC药物浓度乘以5mL为加药量，48小时观察结果，如生长良好，则倍增药物浓度，如不生长，则维持现有药物浓度。
传代：培养48h观察细菌生长情况，并取菌液继续上述方法诱导耐药，两代检测MIC一次。
对照组为甲硝唑，方法相同。
结果：结果见图1。
2.4二氢丹参酮I对小鼠胃内定植幽门螺杆菌抑制效果检测。
2.4.1小鼠感染幽门螺杆菌模型构建。
小鼠模型构建参考文章(Huang Y，Hang X，Jiang X，Zeng L，Jia J，Xie Y，Li F，Bi H.In Vitro and In Vivo Activities of Zinc Linolenate，a SelectiveAntibacterial Agent against Helicobacter pylori.Antimicrob Agents Chemother[J].2019 May 24；63(6))。
模型构建判断：取10％小鼠胃组织检测幽门螺杆菌定植，定植量范围为1×105～1×106CFU/g方认为定植成功，检测结果均有幽门螺杆菌定植。
2.4.2二氢丹参酮I效果检测：
(1)分组：实验组将造模成功的感染组平均分成3组，分别为奥美拉唑加二氢丹参酮I组、奥美拉唑加阿莫西林和克拉霉素组、PBS组，每组8只；未感染幽门螺杆菌的8只小鼠为阴性对照组。
(2)给药：采取灌胃给药法，奥美拉唑先于其他药物前30分钟给药，给药后禁食禁水4小时；小鼠体重按照平均20g/只计算，给药量为奥美拉唑138.2mg/kg、阿莫西林28.5mg/kg、克拉霉素14.3mg/kg、二氢丹参酮I 28.5mg/kg，每天给药1次，连续3次；阴性对照组给PBS液，容量、次数与上相同。
(3)停药后第3天感染组的小鼠称重并计算平均体重，行断颈处死，取胃组织进行幽门螺杆菌的分离培养和鉴定，并对小鼠胃组织行病理切片染色。奥美拉唑+二氢丹参酮I28.5mg/kg组对幽门螺杆菌的抑制优于三联治疗组(奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素)(P<0.05)，结果如图2。
2.4.3小鼠胃组织HE染色及TUNEL染色结果如图3(×100倍)。
2.4.4小鼠肠内容物及粪便细菌qPCR定量监测。
收及小鼠新鲜粪便和末端回肠组织，以细菌16S rRNA通用引物，通过qPCR检测方法对样品内所含菌进行定量检测。结果如图4。
2.4.5并对小鼠肝、脾、肾组织HE染色结果如图5(×100倍)。
2.5二氢丹参酮I的安全性检测。
10倍二氢丹参酮治疗量给药，即每只小鼠285mg/kg给药，连续5天，每天给药1次；阴性对照组为体内抗菌试验中未感染组(Conrol组)，未感染组同样给PBS液，次数和量同给药组。
二氢丹参酮I对小鼠体重影响检测，对小鼠给药前及给药后每天称取体重，连续7天，结果如图6所示。

Claims (4)

1.二氢丹参酮I在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述二氢丹参酮I的最小抑菌浓度范围为0.125-0.5μg/mL。
3.二氢丹参酮I与奥美拉唑组合物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
4.一种抗幽门螺杆菌药物，其特征在于有效成分为二氢丹参酮I与奥美拉唑的组合物。
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