JP7021851B2

JP7021851B2 - ｉｎｖｉｔｒｏで成長させた感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト

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Publication number: JP7021851B2
Application number: JP2016565490A
Authority: JP
Inventors: アブラハムジー．イーペン，; スティーブンエル．ホフマン，
Original assignee: サナリア，インコーポレイテッド
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2015-05-01
Publication date: 2022-02-17
Anticipated expiration: 2035-05-01
Also published as: AU2015252843A1; US11207395B2; US20160287688A1; US20240173393A1; JP2017514490A; CA2947595A1; WO2015168620A1; IL248500B; EP3137106A1; US9878026B2; US10441646B2; KR20160147985A; EP3137106B1; EP3137106A4; AP2016009590A0; JP2020141691A; KR102467128B1; IL248500A0; US11883475B2; BR112016025199A8

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１４年５月２日に出願された米国仮出願第６１／９８７，８３４号および２０１４年６月２５日に出願された米国仮出願第６２／０１６，９８１号（各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。

本発明は、一般に、寄生虫学、マラリア研究およびマラリアワクチン開発の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトと、ヒト宿主域の感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の蚊体内発育期（ｍｏｓｑｕｉｔｏｓｔａｇｅ）、特に、スポロゾイト期までのｉｎｖｉｔｒｏ培養と、ワクチンおよび他の試薬の免疫原性成分としてのｉｎｖｉｔｒｏ培養されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの使用に関する。

毎年、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆ）マラリアは、＞２億件の臨床症例、６００，０００名を超える死亡を引き起こし、アフリカにおける１２Ｂドルを超える国内総生産の損失の原因となる［１～３］。マラリアは、旅行者および軍事要員に対する深刻な懸念でもある。２０１０～２０１１年の間に、英国からの旅行者におけるマラリアの症例数は、３０％増加した［４］。２０１１年に、米国は、過去４０年間におけるどの年よりも多くのマラリア症例を有した［５、６］。過去１５０年間の高度マラリア流行地域におけるあらゆる米国軍事行動において、米軍は、敵の砲火よりも多くのマラリアによる死傷者を有した［７］。高度に有効なワクチンは、国際保健市場におけるおよそ２５億人の「リスクがある」個体に劇的な影響を有するであろう。

国際社会は現在、殺虫剤を浸透させた蚊帳、殺虫剤および抗マラリア薬の使用によりマラリアを管理するために、毎年およそ２０億ドルを費やしている。これは、アフリカに生まれる子供毎に年間およそ８０ドルに達し、一部の区域では、この量の５～１０倍が費やされている。これらのアプローチは、多くの地域で優れた効果を有している。しかし、薬物および殺虫剤抵抗性は依然として発生しており、このような努力を維持する財政支援者および地方自治体の能力は限られている。高度伝染地域からのマラリアの排除が、新たなツールを必要とすることが明らかである。２０１０年の論説に記載されている通り、高度に有効なワクチンは、世界中でマラリアの予防、管理および排除のための理想的なツールとなるであろう：
「いずれかの感染性疾患を真に克服したことがある唯一のツール：有効で…手頃なワクチンが、依然として必要とされている…そこで、世界的なマラリア共同体は、あまりにも現状に甘んじていた…ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅの…ＲＴＳ，ＳプラスアジュバントＡＳ０１は、中程度かつ期限付きの有効性を有する第一世代の前赤内期（ｐｒｅ－ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ－ｓｔａｇｅ）ワクチンである…我々は、次世代…ワクチンをさらに２０年間待つ余裕がない…。」
－匿名、ＴｈｅＬａｎｃｅｔ、２０１０年４月２４日

また、２０１１年のｍａｌＥＲＡ発議報告に記載されている通り、理想的なワクチンは、寄生生物が肝臓から血流へと出ることを予防し、これにより疾患および伝播を予防する前赤内期ワクチンとなるであろう［８］。これは、「マラリア伝播を中断するワクチン」（「ＶＩＭＴ」）と命名された。

ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅは、組換えタンパク質（Ｂ型肝炎表面抗原とＰｆスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）の一部とを融合）と強力なアジュバント（ＡＳ０１）を使用する、ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１と命名されたワクチン候補を開発した。５～２７月齢のヒトにおける近年の第３相治験［９～１２］は、１年間のマラリアの発生率の３６％低下と、最初の１年間にマラリアに感染した比率の５６％低下と、最初の１年間の重篤マラリアの４７％低下を実証した。残念ながら、乳児における結果はそれほど強くなかった。６～１２週齢のヒトにおいて、ワクチンは、１年間のマラリアの発生率の１６％低下と、最初の１年間にマラリアに感染した比率の３１％低下と、最初の１年間の重篤マラリアの３６％低下（処置する意図による２６％）を実証した。これらの結果は、期待外れと呼ばれ、このワクチンを高度に有効またはＶＩＭＴとは認定しないであろう。

ここ１０年間、高度に有効なＶＩＭＴマラリアワクチンの開発の焦点は、一部には、ワクチン免疫原としてのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの寄生生物全体、スポロゾイト（ＳＰＺ）期の利用へとシフトした。国立アレルギー感染病研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ）（ＮＩＡＩＤ）のワクチン研究センター（ＶａｃｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）（ＶＲＣ）で近年完了した試験において、放射線弱毒化されたＰｆＳＰＺで構成されたＳａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺワクチンを静脈内（ＩＶ）注射により投与したところ、最高用量を与えた６名のボランティアのうち６名（１００％）を保護した。保護有効性（次に高い総用量で６／９名を保護）に関して用量応答があり、ＰｆＳＰＺに対する抗体の力価および保護の間に有意な相関があった。したがってＳａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺワクチンは、ヒトにおいて証明できるほどに強力かつ高度に保護性である。これらの歴史的な結果は、２０１３年８月にＳｃｉｅｎｃｅにオンラインで、２０１３年９月に印刷物で発表された［１３］。

ＳＰＺは、クロロキン等の無性赤血球期抗マラリア薬の存在下で生きた感染性ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍＳＰＺが投与される、Ｓａｎａｒｉａ（登録商標）ＰｆＳＰＺ－ＣＶａｃと呼ばれるワクチン接種のための感染および処置アプローチの寄生生物成分としても使用されている［１４］。

最後に、生きた感染性ＰｆＳＰＺは、マラリアワクチンおよび他の治療法を検査するための手段として、管理されたヒトマラリア感染（ＣＨＭＩ）のために使用されている［１５、１６］。

蚊から抽出された唾液腺から調製されたおよび培養で成長した、実質的に精製されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０４３，６２５号に記載されている。
現在、上述のワクチンおよび試薬に使用される寄生生物ＰｆＳＰＺ全体は、無菌的Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を飼育し、これに無菌的Ｐｆ生殖母細胞を感染させ、Ｐｆ寄生生物を、蚊の中でｉｎｖｉｖｏでスポロゴニーを経てスポロゾイト期へと進行させ、続いて蚊から唾液腺を手作業で解剖し、無菌的スポロゾイトを単離および精製することにより得られた（米国特許第７，２２９，６２７号；米国特許第８，３６７，８１０号）［１７］。この製造アプローチは、これらの産物の全臨床治験における使用のために十分な量の生きた無菌的精製ＰｆＳＰＺを産生することができるが、この方法論は、労働集約的であり、昆虫飼育管理および寄生生物解剖のために相当な資源を必要とする。特に、蚊の唾液腺からの解剖は、ヒト宿主域のＰｆＳＰＺおよび他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種ＳＰＺの産生における技術的で時間のかかるステップである。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物発達の蚊宿主期を図１に示す。ｉｎｖｉｔｒｏでＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生活環の無性部分（脊椎動物宿主期）を樹立するための努力は成功したが［１８］、有性（蚊宿主期）およびスポロゴニー部分でこれを達成するための相当な努力が為されたものの、ヒト宿主域の臨床的に関連した感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト、特に、ＰｆＳＰＺを産生するためのこのような努力は不成功であった。Ｐ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ（鳥類宿主域）およびＰｆオーキネートのｉｎｖｉｔｒｏ変態は、少数のオーシストおよびＳＰＺをもたらしたが、これらのスポロゾイトの感染性は実証されなかった［１９～２０］。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ（齧歯類宿主域）のｉｎｖｉｔｒｏ変態は、オーシストおよびＳＰＺを産生したが、ＳＰＺは、蚊由来のＳＰＺよりもはるかに低い感染性であった［２１］。

米国特許第７，２２９，６２７号明細書米国特許第８，３６７，８１０号明細書

ＳａｃｈｓＪら、Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１５：６８０～６８５ＭｕｒｒａｙＣＪら、Ｌａｎｃｅｔ（２０１２）３７９：４１３～４３１

生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト（ＳＰＺ）、特に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆ）ＳＰＺが本明細書で提供される。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、いかなる付随する蚊材料もない。

ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物、特に、Ｐｆ寄生生物であって、ｉｎｖｉｔｒｏでスポロゴニー発達を起こした前記寄生生物の培養物がさらに提供される。一部の実施形態では、培養物は、いかなる付随する蚊材料もない。

ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを前記スポロゾイトのスポロゴニー発達の間にｉｎｖｉｔｒｏで培養する方法であって、赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、レクチンを使用して赤血球細胞を凝集させるステップと、接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物（例えば、ペレット）を収集するステップと、収集された混合物（例えば、ペレット）を、マトリックスを含む担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上でオーキネート培養培地において培養するステップと、培地を交換し、オーシスト培地において培養を続けるステップと、これにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを回収するステップとを含む方法がさらに提供される。

蚊における等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞からのオーシスト産生と比べて、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生を増加させるための方法であって、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物（例えば、ペレット）を収集するステップと、収集された混合物（例えば、ペレット）を、マトリックスを含む担体上でオーキネート培養培地において培養するステップと、培地を交換し、オーシスト培地において培養を続けるステップと、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの数を定量化するステップとを含み、等しい数のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から蚊において発達した同じ種のオーシストと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで発達したより多くのオーシストを産生する前記方法も提供される。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種特異的抗原に対する被験体における免疫応答を誘導する方法であって、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ飼育されたスポロゾイトを被験体に投与するステップを含む方法も提供される。

ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含むワクチン組成物も提供される。一部の実施形態では、ワクチンは、いかなる付随する蚊材料もない。

本明細書に開示されている本発明は、例えば、次の新機軸を提供する：ｉ）蚊において発達し、かつ等しい数のステージＶ生殖母細胞に由来する同じＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のオーシストと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで発達した平均３９倍多いオーシストの達成；ｉｉ）ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性ＰｆＳＰＺの産生；およびｉｉｉ）蚊で産生されたＰｆＳＰＺと少なくとも同じほど効率的な、ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺによるヒト肝臓細胞の感染性の到達。

本研究は、所定の数の生殖母細胞からｉｎｖｉｔｒｏで産生されたＰｆＳＰＺの量と、ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺの完全に機能的な感染活性の実証とにおいて固有であるように際立つ。例えば、本明細書において、ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺが、ヒト肝細胞細胞株ＨＣ－０４への侵入［２４、２５］および感染性を実証するタンパク質であるメロゾイト表面タンパク質１（ＰｆＭＳＰ１）を発現するシゾントへの発達に成功したことが記載されており；このｉｎｖｉｔｒｏ感染性が、蚊で産生されたＰｆＳＰＺと少なくとも同じほど効率的であったことが実証された。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目２）
いかなる付随する蚊材料もない、項目１に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目３）
蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％のヒト肝細胞感染性である、項目１または２に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目４）
無菌的である、項目１～３のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目５）
薬学的使用に適する、項目４に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目６）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目１～５のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
（項目７）
ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の培養物であって、前記寄生生物が、ｉｎｖｉｔｒｏでスポロゴニー発達を起こした培養物。
（項目８）
前記寄生生物が、発達のスポロゾイト期に達した、項目７に記載の培養物。
（項目９）
前記スポロゾイト期寄生生物が、蚊において飼育された同じ種のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％のヒト肝細胞感染性である、項目８に記載の培養物。
（項目１０）
無菌的である、項目７～９のいずれかに記載の培養物。
（項目１１）
前記スポロゾイト期寄生生物が、薬学的使用に適する、項目１０に記載の培養物。
（項目１２）
ヒト宿主域の前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目７～１１のいずれかに記載の培養物。
（項目１３）
等しい数のステージＶ生殖母細胞から蚊において発達した同じＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のオーシストと比較して、少なくとも１０～２０、１０～３０、１０～３９または１０～４０倍多いオーシストが、ｉｎｖｉｔｒｏで発達する、項目７～１２のいずれかに記載の培養物。
（項目１４）
ヒト宿主域の感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物であって、いかなる付随する蚊材料もない培養物。
（項目１５）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、蚊において飼育された同じ種のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％のヒト肝細胞感染性である、項目１４に記載の培養物。
（項目１６）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、無菌的である、項目１４または１５に記載の培養物。
（項目１７）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、薬学的使用に適する、項目１６に記載の培養物。
（項目１８）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目１４～１７のいずれかに記載の培養物。
（項目１９）
ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを前記スポロゾイトのスポロゴニー発達の間にｉｎｖｉｔｒｏで培養する方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンにより前記赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集した赤血球細胞を含む混合物を収集するステップと、
ｄ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培養培地において前記混合物を培養するステップであって、オーキネート期寄生生物が、前記マトリックスに浸透するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培地に交換するステップと、
ｆ．これにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト期寄生生物を回収するステップと
を含む、方法。
（項目２０）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
蚊における同じ種の等しい数のヒトＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞からのオーシスト産生と比べて、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生を増加させるための方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンにより前記赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集した赤血球細胞を含む混合物を収集するステップと、
ｄ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培地においてステップｃの前記混合物を培養するステップであって、前記寄生生物が、オーキネートへと分化し、前記オーキネートが、前記マトリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｆ．ヒト宿主域のオーシスト期Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を定量化するステップと
を含み、
ｇ．等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から、蚊において発達した同じ種のオーシストと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで発達したヒト宿主域のより多くのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストを産生する、方法。
（項目２２）
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
項目１～６のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含むワクチン組成物。
（項目２４）
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原に対する被験体における免疫応答を誘導する方法であって、項目１～６のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトまたは項目２３に記載のワクチンを前記被験体に投与するステップを含む、方法。

図１は、蚊におけるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゴニー発達を図解する。

図２Ａ～図２Ｂは、ｉｎｖｉｔｒｏで産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍの接合子後期発達の試料画像を提示する。（Ａ）は、初期レトルト（ｒｅｔｏｒｔ）、中期レトルトおよび後期レトルト（左から右）を示し、（Ｂ）は、成熟オーキネートを示す。寄生生物は、誘導１８日後の生殖母細胞培養物から採取した。初期レトルトが先ずオーキネート培養開始後約１４時間で、オーキネートが２４時間目から観察される。培養物のギムザ染色されたスメアを示した。

図３Ａ～図３Ｂは、グリコホリンＡおよびＰｆｓ２５に対する抗体を使用した、（Ａ）生殖母細胞および（Ｂ）オーキネートの免疫染色を示す。グリコホリンＡ（白矢印は赤色染色を指す）およびＰｆｓ２５（黒矢印は緑色染色を指す）に対する抗体。

図４は、ｉｎｖｉｔｒｏで発達するＰｆオーシストのＩＦＡおよび明視野像を示す。抗Ｐｆｓ２５および抗ＰｆＣＳＰｍＡｂを使用したＩＦＡによって検出される３日目（上パネル）および８日目（下パネル）のオーシストを示す。８日間培養物をＩＦＡのために透過処理した。８日目のオーシストにおける点状染色は、出芽ＰｆＳＰＺを示唆する。中央パネルは、培養において発達する７～８日目のオーシストを示す。矢印は、オーシストを示す。

図５Ａ～図５Ｂは、（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏおよび（Ｂ）マーキュロクロム染色された蚊中腸における７日目のオーシストを示す。

図６Ａ～図６Ｂは、ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺを示す：（Ａ）ウェルの固定後に検出された、培養ウェルにおいて発達したＰｆＳＰＺおよび（Ｂ）抽出されたＰｆＳＰＺ。両者共に、蛍光標識された抗ＰｆＣＳＰｍＡｂを使用したＩＦＡによって検出された。

図７は、ｉｎｖｉｔｒｏ３Ｄ培養系の例を図解する。

図８Ａ～図８Ｃは、遠心分離によって抽出された、トランズウェルインサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｓｅｒｔ）改変３Ｄマトリックス由来のオーシストの試料画像を示す：（ＡおよびＢ）定量化に使用されるセロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）におけるオーシストの位相差像および（Ｃ）蛍光標識された抗ＰｆＣＳＰｍＡｂを使用した、懸濁液（透過処理なし）における抽出されたオーシストのＩＦＡ。

図９Ａ～図９Ｂは、ＨＣ－０４細胞におけるｉｎｖｉｔｒｏ産生されたおよび蚊で産生されたＰｆＳＰＺの発達を示す。（Ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺ（上部パネル）または（Ｂ）蚊で産生された、無菌的、精製、凍結保存されたＰｆＳＰＺ（下部パネル）感染後の、ＨＣ－０４細胞における６日肝臓期（６ｄａｙｌｉｖｅｒｓｔａｇｅ）の共焦点顕微鏡像。

定義
本明細書において、寄生生物発達に関する「ｉｎｖｉｔｒｏ」とは、インタクトな宿主生物（宿主生物全体とも称される）に依存せず、かつそれに対して外側を意味する。例えば、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物のｉｎｖｉｔｒｏ発達は、生きた動物宿主、例えば、蚊に対して外側かつそれに依存しない発達ステージを経て進む寄生生物の培養を含む。

本明細書において、「飼育する」または「飼育された」は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ成長および発達の整然とした個体発生的進行の促進および支持を意味する。

本明細書において、「スポロゴニー」（またはスポロゴニー発達）は、生殖母細胞からスポロゾイトへの特徴的な有性期を経た、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ発達の整然とした個体発生的進行を意味する。

本明細書において、「ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種」（ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物およびヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物と互換的に使用）は、次の種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍを含む：Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅおよびＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ。

本明細書において、「培養」は、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の文脈において、培地およびヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を含む、生きた動物宿主（例えば、蚊）に対して外側の系を意味する。ある特定の実施形態では、培養は、担体をさらに含む。

「担体」は、本明細書において、成長表面を意味する。一部の実施形態では、担体は、例えば、ポリスチレンマトリックスおよび／またはマトリゲルを含む細胞培養マトリックスを含む［２７、２８］。

「培地」は、本明細書において、栄養素組成物を意味する。ある特定の実施形態では、培地は、例えば、血液摂取後の蚊の管腔条件を模倣することにより、生殖母細胞からの配偶子の出現を容易にする鞭毛放出培地であり、これは続いて、受精を起こして接合子となる。ある特定の実施形態では、培地は、接合子からオーキネートへの分化を容易にするオーキネート培地である。ある特定の実施形態では、培地は、スポロゾイト期へのｉｎｖｉｔｒｏスポロゴニーのための栄養素を提供するオーシスト培地である。

「ヒトの薬学的使用に適した」は、本明細書において、例えば、ＦＤＡまたはＵＳＰ標準に従って許容できる、ヒトにおける認可された臨床使用に十分な量、滅菌性（無菌性）および純度を有することを指す。

「無菌的」は、本明細書において、細菌、真菌、病理学的ウイルスその他等、検出可能な微生物汚染の導入または存在がないことを意味する。スポロゾイト調製の無菌的方法は、スポロゾイトの滅菌調製をもたらす－いかなる他の種類の微生物または感染病原体も含まない。滅菌組成物の無菌的調製は、臨床および薬学的使用に必要とされる。無菌的方法論のモニターに使用される微生物学的アッセイは、汚染の存在または非存在を評価する。そのようなものとして、参照により本明細書に組み込まれる、微生物限度試験、現行のＵＳＰ＜６１＞および滅菌性検査、現行のＵＳＰ＜７１＞が挙げられるがこれらに限定されない。

「付随する材料」は、本明細書において、培地もしくは培地成分またはキャリアもしくは賦形剤ではない、それ自体スポロゾイトに特異的ではない、スポロゾイトの培養物または調製物における材料を指す。ある特定の実施形態では、付随する材料は、例えば、生物学的残渣を含む。一部の実施形態では、付随する材料は、スポロゾイトが産生される手段の結果である。

「付随する蚊材料」は、本明細書において、蚊に由来し、これに特異的な、生物学的材料または残渣である。

「防御免疫を付与する」は、本明細書において、攻撃後に、宿主における疾患の臨床的症状発現、病理学または症状が、無処置宿主と比較して低下されるような、あるいは感染または疾患の臨床的症状発現、病理学もしくは症状が集団内に現れる比率が、無処置集団と比較して低下されるような、集団または宿主（すなわち、個体）に、病原体（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に起因する疾患（例えば、マラリア）に対し防御的な免疫応答を生じる能力を与えることを指す。

本明細書における「免疫応答」は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原の文脈において、抗体および／または細胞性免疫応答の産生によって一般に特徴付けられるがこれらに限定されない、レシピエントにおけるスポロゾイトの導入に対する応答を意味する。一般に、免疫応答は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種エピトープに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導または活性化等の細胞性応答、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗体の産生増加の液性応答、または細胞性および液性応答の両方となり得る。マラリアワクチンに関して、スポロゾイトを含むワクチンによって確立される免疫応答として、寄生生物が宿主細胞、特に、肝細胞および樹状細胞等の単核細胞に進入した後の、細胞外スポロゾイトもしくは他のステージの寄生生物によって発現されるタンパク質に対するおよび／または前記寄生生物の成分に対する応答が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施形態では、免疫応答は、スポロゾイト特異的抗原に対する測定可能な抗体および／または細胞性応答である。他の実施形態では、感染性生物によるその後の攻撃後に、免疫応答は、疾患を引き起こす赤血球期への病原性寄生生物の発達を予防する。

「ワクチン」は、本明細書において、賦形剤、アジュバントおよび／または添加物または保護剤と組み合わせる可能性がある、免疫原性作用物質および薬学的に許容される希釈剤を含む調製物である。免疫原は、感染病原体全体または感染病原体の分子サブセット（感染病原体によって、合成によりまたは組換えにより産生）で構成されていてよい。ワクチンが被験体に投与されると、免疫原は、免疫応答を刺激し、これは、感染病原体によるその後の攻撃後に、疾病から被験体を保護する、または該病原体によって引き起こされる病理学、症状もしくは臨床的症状発現を軽減する。治療（処置）ワクチンは、感染後に与えられ、疾患進行の低下または抑止が企図される。予防（予防法的）ワクチンは、初期感染の予防または感染の比率もしくは負荷の低下が企図される。マラリア等の寄生虫病に対するワクチンにおいて使用される因子は、死滅した（不活性）寄生生物全体、生きた寄生生物、生きた弱毒化された寄生生物（その生活環を十分に進行することができない）または寄生生物に関連する精製もしくは人工的に製造された分子－例えば、組換えタンパク質、合成ペプチド、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍタンパク質を発現するＤＮＡプラスミドおよび組換えウイルスまたは細菌となり得る。ワクチンは、当業者であれば容易に理解できる通り、賦形剤、希釈剤、キャリア、保存料、アジュバントもしくは他の免疫強化薬またはこれらの組合せ等、他の成分と共にスポロゾイトを含むことができる。

「弱毒化」は、本明細書において、その正常な生活環を完了する能力を失うような、むしろ、発達の特定のステージで停止するような、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物等、生物の遺伝子変更または突然変異を意味する。本発明のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物において、弱毒化された突然変異体が、宿主に感染し、肝臓内の肝細胞に侵入する能力を保持するが、肝臓期において発達を停止するように、放射線弱毒化または遺伝的に弱毒化された寄生生物（ＧＡＰ）の１種または複数の遺伝子の機能が破壊される。

「肝細胞侵入」は、本明細書において、宿主の循環器系への初期導入後に、特定の標的細胞、この場合は、培養における肝細胞［２４、２５］またはｉｎｖｉｖｏの肝性細胞のいずれかの宿主肝細胞を探し出し、これに進入する、スポロゾイト期のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の能力を指す。続いて、非弱毒化寄生生物は、さらなるステージ特異的発達を起こすであろう。

「代謝的に活性」は、本明細書において、生きており、維持的機能およびいくつかの生活環過程を行うことができることを意味する。弱毒化スポロゾイトに関して、このようなものとして、肝臓内でいくつかの発達ステージを経て分裂および進行する限定的な能力を潜在的に有する、培養およびｉｎｖｉｖｏの肝細胞に侵入することができ、そしてステージ特異的タンパク質のｄｅｎｏｖｏ発現ができるスポロゾイトが挙げられるがこれらに限定されない。

ｉｎｖｉｔｒｏスポロゾイト
ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された生きた感染性スポロゾイト、特に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト－弱毒化されたスポロゾイトおよび病原性スポロゾイトの組成物が開示されている。ある特定の実施形態では、本願は、生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊に対して外側にある、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物を対象とする。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、いかなる付随する蚊材料もない。ある特定の実施形態では、生殖母細胞期からスポロゾイト期までのスポロゴニーは、蚊に対して外側で発生した。

一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト肝細胞に対して、蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％の感染性である。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト肝細胞に対して、蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの７０～１００％、８０～１００％または９０～１００％の間の感染性である。一部の実施形態では、感染性は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで測定される。

一部の実施形態では、感染性は、ＨＣ－０４（１Ｆ９）細胞（ヒト肝性細胞株）に感染し［２４、２５］、ＰｆＭＳＰ－１を発現する後期肝臓期寄生生物へと発達する［１５］ｉｎｖｉｔｒｏＰｆＳＰＺの能力の決定に使用される、ｉｎｖｉｔｒｏＰｆ６日間肝細胞効力アッセイを使用して測定される。斯かる方法の例として、次のものを挙げることができる：
ａ．ＥＣＬコーティングされたＬａｂ－Ｔｅｋスライドの細胞培養および播種。８ウェルＰｅｒｍａｎｏｘＬａｂ－Ｔｅｋチャンバースライドを、ＥＣＬ細胞付着マトリックスで１～２時間、３７±２℃でコーティングする。ＨＣ－０４（１Ｆ９）細胞を完全ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＣＭ）で希釈して、ウェル当たり０．３ｍＬにおける４×１０^４の生存可能な細胞で播種する。洗浄し、２４±４時間、３７±２ｂ℃および５±２％ＣＯ_２でインキュベートする；
ｂ．感染およびウェル当たりの添加したＳＰＺの数の計算：ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆスポロゾイトを２分間、１３，２００ｒｐｍ（相対遠心力１６，１００）、２２±２℃で、固定角ローターを使用して遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットをＣＭに再懸濁する。ＬａｂＴｅｋスライドの各ウェルから培地を吸引し廃棄する。５０μＬのｉｎｖｉｔｒｏＳＰＺ懸濁液／ウェルを３連で添加する。感染スポロゾイト懸濁液をＣＭにおいて１：１０希釈し、セロメーターおよび位相差顕微鏡を使用して、スポロゾイトの数を計数し、ウェル当たりの添加したＳＰＺの数を計算する。チャンバースライドを３７±２℃および５±２％ＣＯ_２で３時間±１０分間インキュベートする。対照ウェルをＰｆＳＰＺで汚染しないように慎重に、１０００μＬピペットチップを使用して、各ウェルからスポロゾイトを含有する過剰な培養培地を穏やかに吸引することにより、単層を０．３ｍＬＤＭＥＭ／Ｆ－１２完全培地で３回洗浄する。最終洗浄後に、各ウェルに０．３ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ－１２完全培地を添加する；
ｃ．培養物の維持：培養培地を毎日交換して、肝臓期の成功裏の発達および培養物の維持を確実にする。感染６日後にチャンバースライド培養物を氷冷メタノールで固定する。４±２℃で貯蔵する；
ｄ．間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のための染色：スライドからＰＢＳを廃棄し、続いて各ウェルに２～３滴のイメージｉＴ－ＦＸシグナルエンハンサーを添加し、３７±２℃で３０±３分間インキュベートする。イメージエンハンサー溶液を廃棄し、培養物をＰＢＳで３回洗浄する。１００μＬの希釈された抗ＰｆＭＳＰ－１モノクローナルマウス抗体を３連のウェルに添加し、３７±２℃で６０～７０分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりに、抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳで洗浄する。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧを、０．０２％エバンスブルー入りのＰＢＳにおいて１：２００希釈する。１００μＬの希釈されたＡｌｅｘａ４８８抗マウスＩｇＧを３連のウェルに添加する。スライドを３７±２℃で６０～７０分間インキュベートする。ＤＡＰＩ入りのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント用媒体を使用して、カバーガラスをマウントし、観察時まで光を避けて２～８℃で貯蔵する；および
ｅ．Ｐｆ肝臓期の評価および数え上げ：４００×倍率の落射蛍光顕微鏡を使用して、抗体反応性を示すＰｆ肝臓期／ウェルの数を評価および記録する。全３個のウェルにおける肝臓期寄生生物の数を計数し、平均を報告する。

一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、無菌的である。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、宿主生物、例えば、蚊（宿主蚊の唾液腺から解剖されたスポロゾイトによる場合のように）由来の付随する材料による汚染のリスクが低下している。

一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト宿主域のものである。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。

一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、薬学的使用に適する。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ワクチンにおいて使用される。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化される。

ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺは、培養物におけるヒト肝細胞に侵入し、そこで発達するその能力に関して検査される。ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺは、Ｐｆ生活環を完了する能力に関してｉｎｖｉｖｏで検査することもできる。これは、ヒト血液を輸血したヒト肝臓キメラマウスを使用することにより行うことができる。

培養物
ある特定の実施形態では、本願は、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の培養物を対象とし、前記寄生生物は、ｉｎｖｉｔｒｏでスポロゴニー発達を起こしているか、またはそれを起こした。

ある特定の実施形態では、培養物は、スポロゴニー発達の等価なステージにおけるヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を含む。ある特定の実施形態では、培養物は、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の継続的なスポロゴニー発達を維持することができる。

一部の実施形態では、寄生生物は、発達のスポロゾイト期に達した。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、蚊において飼育された同じ種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％の肝細胞感染性である。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、蚊において飼育された同じ種のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの７０～１００％、８０～１００％または９０～１００％の間のヒト肝細胞感染性である。一部の実施形態では、感染性は、ＨＣ－０４細胞の培養物において測定され、一部の実施形態では、感染性は、ｉｎｖｉｖｏの肝臓感染により測定される。

一部の実施形態は、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物を対象とし、前記培養物は、いかなる付随する蚊材料もなく、前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト宿主域の同じ種の、蚊において飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％、８０％または９０％のヒト肝細胞感染性である。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト宿主域の同じ種の、蚊において飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの７０～１００％、８０～１００％または９０～１００％の間のヒト肝細胞感染性である。

一部の実施形態では、培養物は、例えば、血液摂取後の蚊の管腔条件を模倣することにより、生殖母細胞からの配偶子の出現を容易にする、第１の（鞭毛放出と称される）培地を含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、グルコース、重炭酸ナトリウムおよびキサンツレン酸（ｘａｎｔｈｒｕｅｎｉｃａｃｉｄ）を含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、１０～３０％、１５～２５％または１８～２２％ＦＢＳを含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、０．０５％～０．５％、０．０７５％～０．５％または０．０７５％～０．２５％グルコースを含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、０．０５％～０．５％、０．０７５％～０．５％または０．０７５％～０．２５％重炭酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、０．０１％～０．０５％、０．０１％～０．０４％または０．０２％～０．０４％キサンツレン酸を含む。一部の実施形態では、鞭毛放出培地は、ＦＢＳ、０．０５％～０．５％グルコース（例えば、０．１％）、０．０５％～０．５％重炭酸ナトリウム（例えば、０．１％）および０．０１％～０．０５％キサンツレン酸（例えば、０．０２２％）を含む。

一部の実施形態では、第１の培地が除去され、培養は、接合子からオーキネートへの分化および３Ｄマトリックス担体へのオーキネートの侵入を容易にする、第２の（オーキネートと称される）培地を含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、ＦＢＳ、ＲＰＭＩおよびトレハロースを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１０～３０％、１５～２５％または１８～２２％ＦＢＳを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、０．１％～０．５％、０．１５％～０．３％または０．２％～０．３％トレハロースを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、０．１％～０．５％、０．１５％～０．３％または０．２％～０．３％デキストロースを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、０．０１％～０．０８％、０．０２％～０．０６％、０．０３％～０．０５％重炭酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、抗生物質をさらに含む。一部の実施形態では、抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはこれらの組合せである。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１～５０ユニット／ｍＬ、１～４０ユニット／ｍＬ、５～３０ユニット／ｍＬまたは１０～２０ユニット／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１～５０μｇ／ｍＬ、１～４０μｇ／ｍＬ、５～３０μｇ／ｍＬまたは１０～２０μｇ／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オーキネート培地は、１０～３０％ＦＢＳ（例えば、２０％）、０．１％～０．５％トレハロース（例えば、０．２５％）、０．１％～０．５％デキストロース（例えば、０．２５％）、０．０１％～０．０８％重炭酸ナトリウム（例えば、０．０４％）、１～５０ユニット／ｍＬペニシリン（例えば、１０ユニット／ｍＬ）および１～５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（例えば、１０μｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ培地を含む。

一部の実施形態では、第２の培地が除去され、培養は、スポロゾイト期へのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物のｉｎｖｉｔｒｏスポロゴニーのための栄養素を提供する、第３の（オーシストと称される）培地を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地［２６］、ＦＢＳ、重炭酸ナトリウム、トレハロース、ヒポキサンチン、ＨＥＰＥＳ、必須アミノ酸、パラ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、リポタンパク質、コレステロールおよびビタミンを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、１０～３０％、１５～２５％または１８～２２％ＦＢＳを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０１％～０．０８％、０．０２％～０．０６％、０．０３％～０．０５％重炭酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．１％～０．５％、０．１５％～０．３％または０．２％～０．３％トレハロースを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、１０～１００μｇ／ｍＬ、２０～１００μｇ／ｍＬ、２５～７５μｇ／ｍＬまたは４０～６０μｇ／ｍＬヒポキサンチンを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０５Ｍ～０．２５Ｍ、０．０７５Ｍ～０．２Ｍまたは０．０７５Ｍ～１．５ＭＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０１％～０．０８％、０．０２％～０．０６％、０．０３％～０．０５％ＰＡＢＡを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、抗生物質をさらに含む。一部の実施形態では、抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはこれらの組合せである。一部の実施形態では、オーシスト培地は、１～５０ユニット／ｍＬ、１～４０ユニット／ｍＬ、５～３０ユニット／ｍＬまたは１０～２０ユニット／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、１～５０μｇ／ｍＬ、１～４０μｇ／ｍＬ、５～３０μｇ／ｍＬまたは１０～２０μｇ／ｍＬの抗生物質を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０５％～０．５％、０．０７５％～０．５％または０．０７５％～０．２５％リポタンパク質を含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、０．０５％～０．５％、０．０７５％～０．５％または０．０７５％～０．２５％コレステロールを含む。一部の実施形態では、オーシスト培地は、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、１０～３０％ＦＢＳ（例えば、２０％）、０．０１％～０．０８％重炭酸ナトリウム（例えば、０．０４％）、０．１％～０．５％トレハロース（例えば、０．２５％）、１０～１００μｇ／ｍＬヒポキサンチン（例えば、５０μｇ／ｍＬ）、０．０５Ｍ～０．２５ＭＨＥＰＥＳ（例えば、０．１Ｍ）、必須アミノ酸（例えば、１×、ＧＩＢＣＯ）、０．０１％～０．０８％パラ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ、例えば、０．０４μｇ／ｍＬ）、１～５０ユニット／ｍＬペニシリン（例えば、１０ユニット／ｍＬ）および１～５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（例えば、１０μｇ／ｍＬ）、０．０５％～０．５％リポタンパク質（例えば、１．５％）、０．０５％～０．５％コレステロール（例えば、０．１％）およびビタミン（例えば、１×、ＧＩＢＣＯ）を含む。

一部の実施形態では、培養担体は、３Ｄ培養マトリックスを含む。一部の実施形態では、３Ｄ培養マトリックスは、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒＳ２細胞を予め播種される［２６］。一部の実施形態では、培養マトリックスは、マトリゲルでコーティングされたポリスチレンマトリックス（例えば、ＡＭＳＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ、ＵＫ）を含む［２７、２８］。例えば、１ｍｇ／ｍＬのマトリゲルをポリスチレンマトリックスの上に慎重に重層し、続いて３７℃でインキュベーションすることにより、ポリスチレンマトリックスをマトリゲルでコーティングすることができる。一部の実施形態では、培養マトリックスは、ポリスチレンマトリックス、マトリゲルおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒＳ２細胞を含む。一部の実施形態では、マトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニン、コラーゲンまたはこれらの組合せでコーティングされる。

一部の実施形態では、培養物は、無菌的である。一部の実施形態では、培養物に由来するスポロゾイトは、薬学的使用に適する。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を培養する方法
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を培養するおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏ飼育された生きた感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの培養物を作製する方法、ならびにｉｎｖｉｔｒｏ飼育された弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを培養および／またはその組成物を作製する方法が開示されている。

ある特定の実施形態では、本願は、ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を前記寄生生物のスポロゴニー発達の間にｉｎｖｉｔｒｏで培養する方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンを使用して赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物を収集するステップと（一部の実施形態では、これは、遠心分離およびペレットの収集によって達成される）、
ｄ．マトリックスを含む担体上でオーキネート培地において前記混合物を培養するステップであって、前記寄生生物が、オーキネートへと分化し、前記オーキネートが、前記マトリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｆ．これにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト期寄生生物を回収するステップと
を含む方法を対象とする。

例えば、培養するための方法は、（ａ）鞭毛放出培地にステージＶ生殖母細胞を懸濁するステップと（１時間）（このステップにおいて、雄性配偶子および雌性配偶子が、小生殖母細胞および大生殖母細胞から出現し、相互作用（受精）して接合子を形成する）；（ｂ）レクチン、例えば、コムギ胚芽凝集素、コムギから精製されたレクチンを添加することにより、赤血球を凝集させるステップと（１時間）；（ｃ）培養懸濁液を遠心分離して、接合子、赤血球残渣ならびに分化を起こさなかったあらゆる生殖母細胞および配偶子を含有するペレットを収集するステップと；（ｄ）オーキネート培地にペレットを懸濁し、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒＳ２細胞を予め播種した３Ｄ細胞培養マトリックス［２６］に播種するステップとを含むことができる。８ウェル培養プレートまたは他の組織培養バイアルもしくはトランズウェル培養インサートにおけるマトリゲル［２７、２８］を使用して、３Ｄ培養マトリックスを開発した。次に、発達したオーキネートは、運動能力があるため（運動能力がない生殖母細胞、配偶子および接合子とは異なり）、続く２０～２４時間にマトリックスに侵入する；（ｅ）２０～２４時間後、トランズウェルインサートまたは８ウェル培養プレートを洗浄して、マトリックスに侵入しなかったあらゆるオーキネートならびに残る生殖母細胞、配偶子および接合子（オーキネートに発達しなかった）を除去し、培養培地をオーシスト培地と置き換える。マトリックス中のオーキネートは、侵入１２～２４時間後にオーシストへと変態する。（ｆ）２～３日間に１回オーシスト培地を交換する；（ｇ）培養開始後７、８および１１日目に、７、８および１１日目のオーシストを決定する；（ｈ）培養開始後１５、１８および２１日目に、８ウェルまたはトランズウェル培養プレートから培地を収集し、続いて研和することにより、培地からＳＰＺを回収する。セロメーターを使用して、ＰｆＳＰＺを計数する；次に、６日間肝細胞効力アッセイを使用して効力を決定するために、回収されたＳＰＺをＨＣ－０４細胞に播種することができる。

ある特定の実施形態では、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴｒａｇｅｒＷ、およびＪｅｎｓｅｎＪＢ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９３巻：６７３～６７５頁、１９７６年に開示されている通り、赤血球細胞（赤血球）におけるヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの培養物に由来する。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生増加方法
ある特定の実施形態では、本願は、同じ種の、等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から蚊において発達したオーシストと比較して、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生を増加させるためのｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞を培養するステップと、
ｂ．レクチンを使用して前記赤血球細胞を凝集させるステップと、
ｃ．接合子、配偶子、生殖母細胞および凝集細胞を含む混合物を収集するステップと（一部の実施形態では、これは、遠心分離およびペレットの収集により達成される）、
ｄ．マトリックスを含む担体上でオーキネート培地において、前記混合物を培養するステップであって、前記寄生生物が、オーキネートに分化し、前記オーキネートが、前記マトリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｅ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｆ．オーシスト培地を、Ｓ２細胞を含有するオーシスト培地（Ｓ２細胞は、培地交換の際の細胞損失を補充するために添加される）に４０～８０（好ましくは、４８～７２時間）毎に置き換えることにより、寄生生物培養を続けるステップと、
ｇ．ヒト宿主域のオーシスト期Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を定量化するステップと
を含み、
ｈ．等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から蚊において発達した同じ種のオーシストと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで発達したヒト宿主域のより多くのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストを産生する方法を対象とする。

ある特定の実施形態では、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞は、例えば、Ｔｒａｇｅｒ（１９７６年）に開示されている通り、赤血球細胞（赤血球）におけるヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの培養物に由来する。

一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるステージＶ生殖母細胞からオーキネートへの変態の効率は、１～２５％、５～２５％、５～２１％または８～２１％の範囲内である。

一部の実施形態では、ステージＶ生殖母細胞から７、８または１１日目のオーシストへの変態の効率は、１～１５％、２～１４％、２～２５％または２．４～１２．５％の範囲内である。

一部の実施形態では、等しい数のステージＶ生殖母細胞から蚊において発達したオーシストと比較して、少なくとも１０～２０、１０～３０、１０～３９または１０～６０倍多いオーシストが、ｉｎｖｉｔｒｏで発達する。一部の実施形態では、等しい数のステージＶ生殖母細胞から蚊において発達したオーシストと比較して、１０～２０、１０～３０、１０～３９または１０～６０倍多いオーシストが、ｉｎｖｉｔｒｏで発達する。

使用方法
マラリアを予防するためのワクチンにおける免疫原として、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトおよび弱毒化されたｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト（例えば：両者共に参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．７，２２９，６２７；ＵＳＳＮ６１／７８３，３２６を参照）を使用する方法が開示されている。抗マラリア薬およびワクチンの有効性の評価に有用な、また、抗マラリア剤、特に、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染の無性赤血球期を標的とするクロロキン等の抗マラリア薬と併せて、防御免疫を付与するためのワクチンレジメンにおいて有用な、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された病原性寄生生物を使用する方法も開示されている。

ある特定の実施形態では、本願のヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ワクチン組成物において使用される。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化される。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化されない。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、弱毒化されず、抗マラリア剤、例えば、クロロキンと共に使用される。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト被験体における免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、相当するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトに対する免疫応答を生じ、一部の実施形態では、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、ヒト被験体に防御免疫をもたらす。

（実施例１）
ｉｎｖｉｔｒｏで多数のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍオーキネートを再現性よく産生および精製するための最適化方法
異なる齢数の、高いおよび低い生殖母細胞密度での生殖母細胞培養物からのオーキネート産生を評価した。生殖母細胞誘導１４～２２日後の（表１）、高および低密度培養物の両方に由来するオーキネートおよび後期レトルトを再現性よく産生した（図２Ａ～図２Ｂ）。レトルトは、接合子からオーキネートへのその発達における、寄生生物の中間形態であり、オーキネートおよび後期レトルトは両者共に（図２Ａ～図２Ｂ）、蚊においてオーシストへと変態する。誘導１８日後の生殖母細胞培養物から寄生生物を採取した。初期レトルト（図２Ａ）が先ず、ほぼ１４時間で観察され、オーキネートは、オーキネート培養開始２４時後から観察された。光学顕微鏡で検鏡した培養物のギムザ染色したスメアは、培養物における丸い大配偶子および接合子、ならびに三日月形の生殖母細胞およびオーキネートの混合物を示した。顕著な核の存在によって、接合子を大配偶子から区別した。顕著な核の存在および周囲の赤血球膜の欠如によって、オーキネートを生殖母細胞から区別した。２種の他のアプローチを使用して、変換および精製率の推定をもたらした。先ず、寄生生物の異なるステージで発現される分子に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をスクリーニングした：Ｐｆｓ４８／４５は、成熟大生殖母細胞および大配偶子において、Ｐｆｓ２３０は、大配偶子および接合子において、Ｐｆｓ２５は、配偶子およびオーキネートにおいて、ＰｆＣｅｌＴＯＳは、オーキネートおよびＰｆＳＰＺにおいて発現された（データ図示せず）。Ｐｆｓ２３０は、生殖母細胞および大配偶子に局在化した一方、Ｐｆｓ４８／４５は、配偶子およびレトルトに局在化した。Ｐｆｓ２５は、生殖母細胞に変動して局在化したが、レトルトおよびオーキネートに強く発現された。Ｐｆｓ２５（黒矢印は、緑色染色を指す）および赤血球抗原、グリコホリンＡ（白矢印は、赤色染色を指す）（図３Ａ～図３Ｂ）に対する抗体で培養寄生生物を標識することにより、それぞれ赤血球膜の存在または非存在に基づき、生殖母細胞をオーキネートから区別した。

いくつかのアプローチを採用して、非感染赤血球から離して、培養されたオーキネートを精製および濃縮した。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ－Ｈ勾配遠心分離を使用して、非感染赤血球のおよそ９０％を除去することができたが、オーキネートは、生殖母細胞、配偶子および接合子と同時精製された。精製および濃縮のための３ステップ手順を開発した。この手順は成功し、＞７０％濃縮を達成した。ｉｎｖｉｔｒｏでのステージＶ生殖母細胞からオーキネートへの変態の平均効率は、１３％であった（範囲＝８～２１％、表１）。

（実施例２）
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるオーキネートからのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトの産生
第１のステップは、オーシストを効率的に産生することであった。簡潔に説明すると、ｉｎｖｉｔｒｏ培養物からステージＶ生殖母細胞を鞭毛放出培地（ＦＢＳ、０．１％グルコース、０．１％重炭酸ナトリウムおよび０．０２２％キサンツレン酸）へと移し、インキュベーション後に、接合子を改変オーキネート培地（２０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ培地、０．２５％トレハロース、０．２５％デキストロース、０．０４％重炭酸ナトリウム、１０ユニット／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）へと移し、改変マトリゲルコーティングされた８ウェルスライド上に重層した。８ウェルスライドをコーティングするために、マトリゲルをＲＰＭＩ培地で希釈し、８ウェルスライドに注いだ。このようなスライドを３７℃で２時間インキュベートし、過剰な培地を除去した。接合子を重層する前に、マトリゲルの上にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳｃｈｎｅｉｄｅｒＳ２細胞を播種することにより、マトリゲルコーティングされたスライドをさらに改変した。分化したオーキネートは、マトリゲルに侵入した。インキュベーション２４時間後に、オーキネートからオーシスト培地（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、２０％ＦＢＳ、０．０４％重炭酸ナトリウム、０．２５％トレハロース、５０μｇ／ｍＬヒポキサンチン、０．１ＭＨＥＰＥＳ、必須アミノ酸（１×、ＧＩＢＣＯ）、０．０４μｇ／ｍＬパラ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、１０ユニット／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１．５％リポタンパク質、０．１％コレステロールおよびビタミン（１×、ＧＩＢＣＯ））への交換の際に、マトリゲルに侵入しなかった未分化接合子およびオーキネートを洗い流した。オーキネートおよびオーシスト培地の両方において、Ｓ２細胞を添加した（図４）。抗Ｐｆｓ２５および抗ＰｆＣＳＰｍＡｂを使用したＩＦＡによって検出された３日目（図４、上パネル）および８日目（図４、下パネル）のオーシストを示す。８日間培養物をＩＦＡのために透過処理した。８日目のオーシストにおける点状染色は、出芽ＰｆＳＰＺを示唆した。中央パネル（図４）において、矢印は、培養において発達する７～８日目のオーシストを示す。初期実験後に、コーティングに使用されるマトリゲルの濃度および各ウェルに播種される接合子の数等、培養条件を改変して、ステージＶ生殖母細胞から８日目のオーシストへの発達の変態効率を有意に増加させた。この改変ｉｎｖｉｔｒｏ培養プロトコールを使用して、ステージＶ生殖母細胞から８日目のオーシストへの２．４～１２．５％（平均８．３％）変態が、一貫して達成された（表２）。これは、ｉｎｖｉｔｒｏ培養プロトコールの改変前の初期に記録された０．１３％の大きな改善であった。蚊におけるステージＶ生殖母細胞からオーシストへの変態効率は、Ｓａｎａｒｉａ（Ｌｉら、発表準備中）で行われた７４回の独立的膜供給アッセイにおいて０．２２％であった。この変態効率は、文献［２２、２３］において報告されたものに匹敵した。ｉｎｖｉｔｒｏでの８．３％の変態効率は、蚊において観察されるものよりも３９倍高かった（表２、３）。ｉｎｖｉｔｒｏで（図４、図５Ａ、図８Ａ～図８Ｃ）および蚊において（図５Ｂ）発達するオーシストのサイズおよび構造は同様であった。図５Ａは、抗（ａｎｔ－）ＰｆＣＳＰｍＡｂで染色されたｉｎｖｉｔｒｏ培養された７日目のオーシストのＩＦＡを示し、マーキュロクロム染色された蚊中腸の７日目のオーシストを示す（図５Ｂ）。

付着していないＳ２細胞を含むウェルからの培養上清を収集することにより、１５日目および／または１８日目にｉｎｖｉｔｒｏ培養物を回収した。形態学的に発達したＰｆＳＰＺの数をセロメーターにおいて計数し、確認のために蛍光抗ＰｆＣＳＰｍＡｂを使用してアリコートを染色した（図６Ｂ、表４）。蛍光抗ＰｆＣＳＰｍＡｂで染色するウェルの固定後に、培養ウェルにおいて発達したＰｆＳＰＺを検出した（図６Ａ）。７回の独立的実験において、１０枚の８ウェルスライドから回収あたり１８０，０００～３５０，０００個の間の成熟ＰｆＳＰＺを産生した。全実験において、２種の形態学的に異なる形態のＰｆＳＰＺが存在した。唾液腺ＰｆＳＰＺと同一に見えた形態学的に成熟したＰｆＳＰＺは、運動能力があり、１０～１３μｍ長であり、抗ＰｆＣＳＰｍＡｂに対し高度に反応性であった（図６Ａ～図６Ｂ、表４）。短い形態の、未成熟ＰｆＳＰＺは、＜１０μｍ長であったが、依然として運動能力があり、抗ＰｆＣＳＰｍＡｂに対し高度に反応性であった。報告された全実験において、形態学的に成熟したＰｆＳＰＺのみを定量化した。同じ培養物からの１５および１８日目の両方における回収は、１０枚のスライド当たりほぼ５００，０００ＰｆＳＰＺまで収量を増加させた。

その後、３Ｄトランズウェル系を検査した。このアプローチを使用した２回の独立的培養実験において、２２８，０００および２０８，０００個の形態学的に成熟したＰｆＳＰＺを１枚の６ウェルプレート培養物から回収した。最初に、オーシストのｉｎｖｉｔｒｏ培養に適していることが判明した２種の市販の３Ｄマトリックスを使用した。３ＤＬｉｆｅＨｙｄｒｏｇｅｌ（ＣｅｌｌｅｎｄｅｓＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、生物模倣型３Ｄ環境において細胞を培養し、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（商標）３Ｄ培養系（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、３Ｄ細胞培養を容易にする動物起源不含生物足場である。両者共に、Ｐｆスポロゴニーを支持する。３ＤＬｉｆｅＨｙｄｒｏｇｅｌは、ＰｆＳＰＺをマトリックスから放出するためにガラクトシダーゼ消化を必要としたが、成熟ＰｆＳＰＺは、Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘマトリックスに捕捉された。したがって、本発明者らは、代替としてのＡｌｖｅｔｅｘ３Ｄ培養技術（ＡＭＳＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｕｒｏｐｅ）Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ）と併せて、トランズウェルインサートに基づく培養系を開発した。トランズウェルインサートは、プレートウェルに挿入されると、２区画培養を可能にした（図７）。この系において、マトリゲルでコーティングされた、不活性２００μｍ厚多孔性ポリスチレン足場を、インサートの多孔性膜上に配置した。この３Ｄマトリックス上に播種された接合子は、オーキネートへと分化し、マトリゲルコーティングされたポリスチレン足場に侵入し、オーシストへと変態した。上部区画には、Ｓ２細胞を播種した。このマトリックスにおいて発達したオーシストおよびＰｆＳＰＺを下部区画に放出させ、ここから収集した。予備実験において、この系は、Ｐｆスポロゴニー発達を支持し（表５）、オーシスト発達および保持は、チャンバースライド培養と極めて類似した（表２、３）。スポロゴニー発達を評価するために、マトリックスと共に多孔性膜を除去し、遠心分離によってオーシストを収集した。ステージＶ生殖母細胞から７および１１日目のオーシストへの変態効率（図８Ａ～図８Ｃ）は、それぞれ１０．３％（範囲９～１１．５）および９．０％（範囲７．８～１０．７）であった（表５）。１１日目のオーシストの数は、おびただしい増加を表し、培養におけるオーシストの有意な保持を示した。さらに、抽出されたオーシストは、１１日目の蚊中腸において発達したオーシストと外観が同様であり、これらのｉｎｖｉｔｒｏ形成されたオーシストは、ＰｆＣＳＰを発現した（図８Ｃ）。図８Ａ～図８Ｂは、定量化に使用されるセロメーターにおけるオーシストの位相差像を示し（図８Ａ＆図８Ｂ）、蛍光標識された抗ＰｆＣＳＰｍＡｂを使用した懸濁液（透過処理なし）における抽出されたオーシストのＩＦＡを示す（図８Ｃ）。透過処理なしの懸濁液におけるオーシストの染色を行ったところ、ＰｆＣＳＰ染色されたオーシストは、点状パターンではなく均一なＰｆＣＳＰ発現を有していた（図８Ｃ）。

２回の独立的培養実験において、２２８，０００および２０８，０００個の形態学的に発達したＰｆＳＰＺを、６個の改変インサートを使用した１枚の６ウェルプレート培養から回収した。これは、８ウェルスライドにより達成される数と比較して、収量において最小で３倍増加であった（表４、５）。特に、表４は、８ウェル培養の結果を示す一方、表５は、トランズウェル培養の結果を示す。このトランズウェルインサート培養条件は、ｉ）培地交換の際のマトリゲルの損失を低下させ、ｉｉ）単一の培養からのＰｆＳＰＺの反復回収を可能にし、ｉｉｉ）ラミニンおよびコラーゲン等、異なる細胞外マトリックスタンパク質によるマトリックスのコーティングに適しており、ｉｖ）適した液体取り扱い系を使用したスケールアップおよび自動化に適していたため、いくつかの利点を提供した。

この結果は、以前の実験と比較して、オーシストから回収される成熟ＰｆＳＰＺの数において最小で３倍増加を表す。

（実施例３）
ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトおよびＡｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉ蚊において個体発生的に発達したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトがそれぞれ、同様の効率でヒト肝細胞細胞株（ＨＣ－０４）内に侵入および発達することの実証。
効力の評価に慣例的に使用される６日間肝細胞アッセイにおいて、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺをその感染性に関して検査した。このアッセイは、典型的には、凍結保存前後のＰｆＳＰＺにより行われる。新鮮および凍結保存されたＰｆＳＰＺは、形態学的に同一の６日肝臓期寄生生物を産生するが、凍結保存による効力の５～２５％損失がある［５］。ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺは、新鮮蚊由来ＰｆＳＰＺとより類似しており、したがって、製造キャンペーンにおいて作製された新鮮ＰｆＳＰＺ由来の読み出し情報と比較を行った。７連続産生キャンペーンにおいて、ＰｆＭＳＰ－１を発現する２０．７～３２．７の成熟した６日目の寄生生物は、５０，０００の蚊で産生された新鮮ＰｆＳＰＺから発達した（表４）。ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺを、ＨＣ－０４細胞（ｉｎｖｉｖｏで産生されたＰｆＳＰＺの感染を支持することが示されたヒト肝細胞細胞株）を蒔いた３ウェルに接種し［２４、２５］、６日間インキュベートした（図９Ａ上パネル、表４）。図９Ａ～図９Ｂは、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺ（図９Ａ上パネル）または蚊で産生された、無菌的、精製、凍結保存されたＰｆＳＰＺ（図９Ｂ下パネル）による感染後の、ＨＣ－０４細胞における６日肝臓期の共焦点顕微鏡像を示す。４回の独立的６日間肝細胞アッセイにおいて、５６，５９８±７，２９４ＰｆＳＰＺ／ウェルで播種されたｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺは、２８．６±７．０ＰｆＭＳＰ１を発現する６日目の寄生生物を産生した（表４）。これは、このアッセイにおける新鮮、無菌的、精製されたＰｆＳＰＺにより観察される２５．７±４．１ＰｆＭＳＰ１発現寄生生物に匹敵し（表４）、凍結保存されたＰｆＳＰＺによるものよりも僅かに多かった（データ図示せず）。これらのデータは、１８日目のｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺが、１５日目のｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺよりも感染性であったことも示唆した。ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ（蚊）産生されたＰｆＳＰＺ由来のＨＣ－０４細胞において発達した６日目の寄生生物のサイズは、同様であった（図９Ａ～図９Ｂ）。顕微鏡写真のための陽性対照として、蚊唾液腺由来の無菌的、精製、凍結保存されたＰｆＳＰＺをＨＣ－０４細胞においてインキュベートし、ＰｆＭＳＰ１発現を評価した（図９Ｂ）。これらのデータは、ｉｎｖｉｔｒｏ産生されたＰｆＳＰＺが、蚊で産生された新鮮ＰｆＳＰＺと同じほどに肝細胞培養物において感染性であったことを実証した。

これらの結果は、蚊において産生されるオーシストよりも３９倍優れた効率で、ｉｎｖｉｔｒｏでＰｆオーシストを産生するための方法を示す。ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｆＳＰＺは、侵入し、蚊から新鮮に解剖されたＰｆＳＰＺと少なくとも同じほど優れた効率で、Ｐｆメロゾイト表面タンパク質１を発現する成熟した６日肝臓期シゾントへと発達した。

前述において、本発明は、適した実施形態を参照しつつ記載されているが、これらの実施形態は、本発明の理解のみを目的としており、様々な変更または改変が可能である。

Claims

生殖母細胞期から成熟かつ運動能力があるスポロゾイト期までのスポロゴニーが蚊の生体外で起こる、ヒト宿主域のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトであって、ここで、前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、蚊において飼育されたヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの少なくとも７０％のヒト肝細胞感染性であり、前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが、以下：
ａ．マトリックスの非存在下かつ赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍステージＶ生殖母細胞を接合子期まで培養するステップと、
ｂ．接合子、配偶子および生殖母細胞を含む混合物を収集するステップと、
ｃ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培養培地において前記混合物を培養するステップであって、オーキネート期寄生生物が、前記マトリックスに浸透するステップと、
ｄ．前記オーキネート培養培地をオーシスト培地に交換するステップと、
ｅ．ａからｄのステップにより産生された前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト期寄生生物を回収するステップと
を含む方法により産生される、ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが無菌的である、請求項１に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトが薬学的使用に適する、請求項２に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、請求項１～３のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト。
請求項１に記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含む培養物。
前記スポロゾイトが、発達の成熟スポロゾイト期に達した、請求項５に記載の培養物。
無菌的である、請求項５または６に記載の培養物。
前記ｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性スポロゾイトが、薬学的使用に適する、請求項７に記載の培養物。
ヒト宿主域の前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、請求項５～８のいずれかに記載の培養物。
等しい数のステージＶ生殖母細胞から蚊において発達した同じＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のオーシストと比較して、少なくとも１０～２０倍多いオーシストが、ｉｎｖｉｔｒｏで発達する、請求項１～９のいずれかに記載の培養物。
ヒト宿主域のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトをｉｎｖｉｔｒｏで産生する方法であって、
ａ．マトリックスの非存在下かつ赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍステージＶ生殖母細胞を接合子期まで培養するステップと、
ｂ．ステップａの培養物から、接合子、配偶子および生殖母細胞を含む混合物を収集するステップと、
ｃ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培養培地において前記混合物を培養するステップであって、オーキネート期寄生生物が、前記マトリックスに浸透するステップと、
ｄ．前記オーキネート培養培地をオーシスト培地に交換するステップと、
ｅ．ａからｄのステップにより産生されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイト期寄生生物を回収するステップと
を含む、方法。
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、請求項１１に記載の方法。
蚊における同じ種の等しい数のヒトＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞からのオーシスト産生と比べて、ヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの産生を増加させるための方法であって、
ａ．マトリックスの非存在下かつ赤血球細胞の存在下で、鞭毛放出培養培地においてヒト宿主域ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍステージＶ生殖母細胞を接合子期まで培養するステップと、
ｂ．接合子、配偶子および生殖母細胞を含む混合物を収集するステップと、
ｃ．マトリックスを含む担体上で、オーキネート培地においてステップｃの前記混合物を培養するステップであって、前記寄生生物が、オーキネートへと分化し、前記オーキネートが、前記マトリックスに進入し、オーシスト期へと分化するステップと、
ｄ．前記オーキネート培地をオーシスト培養培地と置き換えるステップと、
ｅ．ヒト宿主域のオーシスト期Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を定量化するステップとを含み、
等しい数のヒト宿主域Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ生殖母細胞から、蚊において発達した同じ種のオーシストと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏで発達したヒト宿主域のより多くのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストを産生する、方法。
前記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍオーシストの種が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである、請求項１３に記載の方法。
請求項１～４のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを含むワクチン組成物。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ特異的抗原に対する被験体における免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項１～４のいずれかに記載のｉｎｖｉｔｒｏ飼育された感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトまたは請求項１５に記載のワクチン組成物を含む、組成物。