ES2954144T3 - Esporozoitos infecciosos de Plasmodium cultivados in vitro - Google Patents
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Abstract
La solicitud está dirigida a esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de un rango de huéspedes humanos en los que la esporogonía desde la etapa de gametocito hasta la etapa de esporozoito es externa a los mosquitos, y a los métodos para producirlos. En el presente documento se proporcionan esporozoitos infecciosos de Plasmodium (SPZ) criados in vitro de un rango de huéspedes humanos, particularmente P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malarlae y P. knowlesi, en los que la esporogonia desde la etapa de gametocito hasta la etapa de esporozoito es externa. a los mosquitos y los métodos para producirlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Esporozoitos infecciosos de Plasmodium cultivados in vitro
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a los campos de la parasitología, la investigación de la malaria y el desarrollo de vacunas contra la malaria. Más en particular se refiere a una composición que comprende esporozoitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones y en el cultivo in vitro de los estadios en el mosquito de los parásitos infecciosos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones, y el uso de dicha composición como vacuna.
Antecedentes de la invención
Anualmente, la malaria por Plasmodium falciparum (Pf) causa >200 millones de casos clínicos, más de 600.000 muertes y es responsable de la pérdida de más de 12.000 millones de dólares del producto interno bruto en África [1 3]. La malaria también es una grave preocupación para los viajeros y el personal militar. Durante 2010-2011, el número de casos de malaria en viajeros procedentes del Reino Unido aumentó un 30 % [4]. En 2011, Estados Unidos tuvo más casos de malaria que en cualquier otro año de los últimos 40 años [5, 6]. En todas las campañas militares estadounidenses en zonas altamente afectadas por la malaria durante los últimos 150 años, las fuerzas estadounidenses han tenido más bajas por malaria que por fuego hostil [7]. Una vacuna altamente eficaz tendrá un impacto espectacular en los aproximadamente 2,5 mil millones de personas "en riesgo" en el mercado de la salud global.
La comunidad mundial gasta actualmente aproximadamente 2.000 millones de dólares al año para controlar la malaria mediante el uso de mosquiteros impregnados de insecticidas, insecticidas y fármacos contra la malaria. Esto equivale aproximadamente a 80 dólares al año por cada niño nacido en África y, en algunos lugares, se gasta entre 5 y 10 veces esa cantidad. Estos planteamientos están teniendo un efecto excelente en muchas zonas. Sin embargo, la resistencia a los medicamentos y a los insecticidas aún se está desarrollando y la capacidad de los donantes financieros y los gobiernos locales para mantener este esfuerzo es limitada. Está claro que la eliminación de la malaria en zonas de alta transmisión requerirá nuevas herramientas. Como se describe en un editorial de 2010, una vacuna altamente eficaz sería la herramienta ideal para la prevención, el control y la eliminación de la malaria en todo el mundo:
"Lo que todavía se necesita es la única herramienta que realmente ha conquistado cualquier enfermedad infecciosa: una vacuna eficaz... asequible... aquí, la comunidad mundial contra la malaria ha sido demasiado complaciente... La RTS,S con el adyuvante AS01 de GlaxoSmithKline es una vacuna de primera generación en estadio preeritrocitario con una eficacia modesta y limitada en el tiempo... No podemos darnos el lujo de esperar 20 años más para la próxima generación... de vacunas".
- Anónimo, The Lancet, 24 de abril de 2010
Y como se describe en un informe de la iniciativa malERA de 2011, la vacuna ideal sería una vacuna en estadio preeritrocítico que impida que los parásitos salgan del hígado al flujo sanguíneo, de este modo se previene la enfermedad, así como la transmisión [8]. Esto ha sido denominado una "vacuna que interrumpe la transmisión de la malaria" ("VIMT").
GlaxoSmithKline ha desarrollado una vacuna candidata denominada RTS,S/AS01, que utiliza una proteína recombinante (que fusiona parte de la proteína circumsporozoíto (CSP) de Pf con el antígeno de superficie de la hepatitis B) con un potente adyuvante (AS01). Ensayos recientes de la fase 3 [9-12] en humanos de 5 a 27 meses demostraron una reducción del 36 % en la incidencia de la malaria durante un año y una reducción del 56 % en la tasa de adquisición de la malaria durante el primer año y una reducción del 47 % en la malaria grave durante el primer año. Desafortunadamente, los resultados en los lactantes no fueron tan sólidos. En humanos de 6 a 12 semanas de edad, la vacuna demostró una reducción del 16 % en la incidencia de la malaria durante un año, una reducción del 31 % en la tasa de adquisición de la malaria durante el primer año y una reducción del 36 % en la malaria grave (26 % por intención de tratamiento) durante el primer año. Estos resultados se han calificado de decepcionantes y no calificarían a esta vacuna como altamente eficaz ni como VIMT.
Durante los últimos diez años, el enfoque para el desarrollo de una vacuna VIMT contra la malaria altamente eficaz se ha desplazado en parte hacia la utilización de todo el parásito, el estadio de esporozoito (SPZ), de Plasmodium como inmunógeno de la vacuna. En un estudio recientemente completado en el Centro de Investigación de Vacunas (VRC) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), la vacuna Sanaria® PfSPZ, compuesta de Pf SPZ atenuada por radiación, se administró mediante inyección intravenosa (IV) y protegió a 6 de 6 (100 %) de los voluntarios que recibieron la dosis más alta. Hubo una respuesta a la dosis con respecto a la eficacia protectora (6/9 protegidos con la siguiente dosis total más baja) y una correlación significativa entre los títulos de anticuerpos contra Pf SPZ y la protección. Por lo tanto, la vacuna Sanaria® PfSPZ es demostrablemente potente y altamente protectora en humanos. Estos resultados históricos se publicaron en línea en Science en agosto de 2013 y en forma impresa en septiembre de 2013 [13].
Los SPZ también se utilizan como componente parásito de un planteamiento de vacunación ante la infección y tratamiento llamado Sanaria® PfSPZ-CVac, en el que se administran SPZ de Plasmodium vivos infecciosos en presencia de un antipalúdico en estadio eritrocítico asexual, tal como la cloroquina [14].
Finalmente, los Pf SPZ infecciosos vivos se utilizan para infecciones controladas de malaria en humanos (CHMI) como un medio para probar vacunas contra la malaria y otros tratamientos [15, 16].
Los esporozoitos de Plasmodium sustancialmente purificados, preparados a partir de glándulas salivales extraídas de mosquitos y desarrollados en un cultivo, se describen en la patente estadounidense 8.043.625.
Actualmente, todo el SPZ de parásito Pf utilizado en las vacunas y reactivos descritos anteriormente se ha obtenido criando mosquitos Anopheles asépticos, infectándolos con gametocitos Pf asépticos, permitiendo que los parásitos Pf progresen a través de la esporogonía in vivo dentro del mosquito, hasta el estadio de esporozoito y luego diseccionar manualmente las glándulas salivales de los mosquitos y aislar y purificar los esporozoitos asépticos (patente estadounidense 7.229.627; patente estadounidense 8.367.810) [17]. Si bien este planteamiento de fabricación puede producir cantidades suficientes de Pf SPZ vivos, asépticos y purificados para su uso en todos los ensayos clínicos de estos productos, la metodología es laboriosa y requiere recursos sustanciales para la cría de insectos y la disección de parásitos. En particular, la disección de las glándulas salivales de los mosquitos es una etapa técnica que requiere mucho tiempo en la producción de Pf SPZ y otros SPZ de las especies de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos.
El desarrollo de los estadios hospedantes en el mosquito del parásito Plasmodium se muestran en la figura 1. Si bien los esfuerzos por establecer la porción asexual (estadios para hospedante vertebrado) del ciclo de vida in vitro del Plasmodium han sido satisfactorios [18], se han hecho esfuerzos sustanciales para conseguir lo mismo para la porción sexual (estadios para hospedante mosquito) y esporogónica, pero estos esfuerzos no han sido satisfactorios para producir esporozoitos de Plasmodium infecciosos clínicamente relevantes de la gama de hospedantes humanos, en particular Pf SPZ. La transformación in vitro de los oocinetos de P. gallinaceum (gama de hospedantes aviares) y Pf dio como resultado un número bajo de ooquistes y SPZ, pero nunca se demostró la infectividad de estos esporozoitos [19-20]. La transformación in vitro de P. berghei (gama de hospedantes roedores) produjo ooquistes y SPZ, pero los SPZ fueron mucho menos infecciosos que los SPZ derivados de mosquitos [21].
Compendio de la invención
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico in vivo se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico in vivo.
En la presente memoria se proporciona una composición que comprende esporozoitos de Plasmodium (SPZ) maduros e infecciosos de la gama de hospedantes humanos, en particular SPZ de Plasmodium falciparum (Pf), tal como se define en las reivindicaciones.
Además, se proporcionan métodos de cultivo in vitro de esporozoitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos durante el desarrollo esporogónico de dichos esporozoitos como se define en las reivindicaciones.
También se proporcionan métodos para aumentar la producción de ooquistes de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos en relación con la producción de ooquistes a partir de un número equivalente de gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos en un mosquito como se define en las reivindicaciones.
También se proporcionan composiciones de vacunas según se definen en las reivindicaciones.
Las invenciones divulgadas en la presente memoria proporcionan, p. ej., las siguientes innovaciones: i) conseguir un promedio de 39 veces más ooquistes desarrollados in vitro en comparación con ooquistes de la misma especie de Plasmodium desarrollados en mosquitos y a partir de un número equivalente de gametocitos en estadio V; ii) producir Pf SPZ infeccioso criado in vitro; y iii) alcanzar la infectividad de las células del hígado humano mediante Pf SPZ producido in vitro que es por lo menos tan eficaz como el Pf SPZ producido por mosquitos.
Este trabajo destaca por ser único en la cantidad de Pf SPZ producida a partir de un número determinado de gametocitos in vitro y en la demostración de la actividad infecciosa plenamente funcional del Pf SPZ producido in vitro. Por ejemplo, se describe en la presente memoria que Pf SPZ producido in vitro invadió satisfactoriamente la línea celular de hepatocitos humanos HC-04 [24,25] y se desarrolló en esquizontes que expresan la proteína de superficie 1 del merozoito (Pf MSP1), una proteína que demuestra infectividad; y se demostró que esta infectividad in vitro era por lo menos tan eficaz como la del Pf SPZ producido por mosquitos.
Descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra el desarrollo esporogónico de Plasmodium falciparum en el mosquito.
La figura 2A-2B proporciona imágenes de muestra del estadio de desarrollo poscigoto de Plasmodium falciparum producido in vitro. (A) muestra una réplica temprana, una réplica en estadio medio y una réplica en estadio tardío
(de izquierda a derecha) y (B) muestra oocinetos maduros. Los parásitos se tomaron de un cultivo de gametocitos 18 días después de la inducción. Las primeras réplicas se ven por primera vez aproximadamente 14 horas y los oocinetos a partir de las 24 horas posteriores al inicio del cultivo de oocinetos. Se mostraron frotis de cultivos teñidos con Giemsa.
La figura 3A-B muestra la inmunotinción de (A) gametocitos y (B) oocinetos mediante anticuerpos contra glicoforina A y Pfs25. Anticuerpos contra la glicoforina A (las flechas abiertas apuntan a la tinción roja) y Pfs25 (las flechas cerradas apuntan a la tinción verde).
La figura 4 muestra imágenes IFA y de campo brillante de ooquistes de Pf que se desarrollan in vitro. Se muestran los ooquistes de 3 días (panel superior) y de 8 días (panel inferior) detectados por IFA utilizando mAb anti-Pfs25 y anti-PfCSP. Se permeabilizaron cultivos de 8 días para IFA. La tinción punteada en ooquistes de 8 días sugiere gemación de Pf SPZ. El panel central muestra ooquistes de 7 a 8 días desarrollándose en cultivo. Las flechas indican ooquistes.
La figura 5A-B muestra (A) ooquistes de 7 días in vitro y (B) en el intestino medio del mosquito teñido con mercurocromo.
La figura 6A-B muestra Pf SPZ producido in vitro: (A) Pf SPZ desarrollado en cultivo bien detectado después de la fijación del pocillo y (B) Pf SPZ extraído. Ambos detectados mediante el IFA utilizando mAb CSP anti-Pf marcado con fluorescencia.
La figura 7 ilustra un ejemplo de un sistema de cultivo 3D in vitro.
La figura 8A-C muestra imágenes de muestra de ooquistes de la matriz 3D modificada con inserto Transwell extraída por centrifugación: (A y B) Imágenes de contraste de fase de ooquistes en el celómetro utilizado para la cuantificación y (C) IFA de ooquistes extraídos en suspensión (no permeabilizados) utilizando mAb CSP anti-Pf marcado con fluorescencia.
La figura 9A-B muestra el desarrollo de Pf SPZ producido in vitro y producido por mosquitos en células HC-04. Micrografías confocales de estadios hepáticos de 6 días en células HC-04 después de la infección con (A) Pf SPZ producido in vitro (paneles superiores) o (B) Pf SPZ criopreservado, aséptico, purificado y producido por mosquitos (paneles inferiores).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Como se usa en la presente memoria con respecto al desarrollo de parásitos, "in vitro" significa independiente y externo a un organismo hospedante intacto (también denominado organismo hospedante completo). Por ejemplo, el desarrollo in vitro de un parásito Plasmodium de la gama de hospedantes humanos incluye el cultivo de parásitos que avanzan a través de estadios de desarrollo externos e independientes de un hospedante animal vivo, p. ej., mosquitos.
Como se usa en la presente memoria, "criar" o "criado" significa estimular y apoyar la progresión ordenada y ontogénica del crecimiento y desarrollo de Plasmodium.
Como se usa en la presente memoria, "esporogonía" (o desarrollo esporogónico) significa la progresión ordenada y ontogénica del desarrollo de Plasmodium a través de los estadios de características sexuales desde gametocito hasta esporozoito.
Como se usa en la presente memoria "especies de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos" (usado de forma intercambiable con especies de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos y parásitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos) se refiere a las siguientes especies de Plasmodium: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. knowlesi.
Como se usa en la presente memoria, "cultivo", en el contexto de parásitos de Plasmodium criados in vitro de una gama de hospedantes humanos, significa un sistema externo a un hospedante animal vivo (p. ej., mosquitos) que comprende un medio y parásitos de Plasmodium de una gama de hospedantes humanos. En determinadas realizaciones, el cultivo comprende además un sustrato.
"Sustrato", como se usa en la presente memoria, significa una superficie de crecimiento. En algunas realizaciones, el sustrato comprende una matriz de cultivo celular, p. ej., que comprende una matriz de poliestireno y/o Matrigel [27, 28].
"Medio", como se usa en la presente memoria, significa una composición de nutrientes. En determinadas realizaciones, el medio es un medio de exflagelación, que facilita la aparición de gametos a partir de gametocitos, que luego se someten a fertilización hasta cigotos, p. ej., imitando las condiciones en el lumen de un mosquito después de una ingesta de sangre. Un medio oocineto facilita la diferenciación de cigotos a oocinetos. Un medio ooquiste proporciona nutrientes para el estadio de esporogonía a esporozoito in vitro.
"Adecuado para su uso farmacéutico humano", como se usa en la presente memoria, se refiere a tener una suficiente cantidad, esterilidad (asepticidad) y pureza para un uso clínico aprobado en humanos, por ejemplo, aceptable según los estándares de la FDA o la USP.
"Aséptico", como se usa en la presente memoria, significa ausencia de introducción o presencia de contaminación por microorganismos detectables tales como bacterias, hongos, virus patológicos y similares. Un método aséptico de preparación de esporozoitos da como resultado una preparación estéril de esporozoitos, libre de cualquier otro tipo de microorganismo o agente infeccioso. Se requiere la preparación aséptica de una composición estéril para su uso clínico y farmacéutico. Los ensayos microbiológicos utilizados para monitorizar una metodología aséptica evalúan la presencia o ausencia de contaminación. Incluyen, pero no se limitan a, la prueba de límites microbianos, la USP <61 > actual y prueba de esterilidad, la USP <71> actual.
"Material auxiliar", como se usa en la presente memoria, se refiere a material en un cultivo o preparación de esporozoitos, que no es el medio ni un componente del medio, ni un vehículo o excipiente y no es específico de los esporozoitos per se. En determinadas realizaciones, el material auxiliar incluye, p. ej., restos biológicos. En algunas realizaciones, el material auxiliar es una consecuencia de los medios por los cuales se producen los esporozoitos.
"Material auxiliar de mosquito", como se usa en la presente memoria, es material biológico o restos derivados de un mosquito y específicos de él.
"Conferir inmunidad protectora" como se usa en la presente memoria se refiere a proporcionar a una población o un hospedante (es decir, un individuo) la capacidad de generar una respuesta inmunitaria protectora contra una enfermedad (p. ej., malaria) causada por un patógeno (p. ej., Plasmodium falciparum) de modo que, tras la exposición, las manifestaciones clínicas, la patología o los síntomas de la enfermedad en un hospedante se reduzcan en comparación con un hospedante no tratado, o de modo que la velocidad a la que aparecen la infección, las manifestaciones clínicas, la patología o los síntomas de la enfermedad dentro de una población son reducidos, en comparación con una población no tratada.
"Respuesta inmunitaria" como se usa en la presente memoria en el contexto de un antígeno específico de Plasmodium significa una respuesta en el receptor a la introducción de esporozoitos, en general caracterizada por, pero sin limitarse a, la producción de anticuerpos y/o respuestas inmunitarias celulares. En general, una respuesta inmunitaria puede ser una respuesta celular tal como la inducción o activación de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+ específicos para epítopos de las especies de Plasmodium, una respuesta humoral de mayor producción de anticuerpos específicos de Plasmodium, o respuestas tanto celulares como humorales. Con respecto a una vacuna contra la malaria, la respuesta inmunitaria establecida por una vacuna que comprende esporozoitos incluye, pero no se limita a, respuestas a proteínas expresadas por esporozoitos extracelulares u otros estadios del parásito después de que los parásitos hayan entrado en las células hospedantes, especialmente hepatocitos y células mononucleares tales como células dendríticas y/o a componentes de dichos parásitos. En una realización de la presente invención, la respuesta inmunitaria es un anticuerpo medible y/o una respuesta celular a antígenos específicos de esporozoitos. En otras realizaciones, tras la exposición posterior a organismos infecciosos, la respuesta inmunitaria previene el desarrollo de parásitos patógenos hasta el estadio eritrocítico que causa la enfermedad.
"Vacuna", como se usa en la presente memoria, es una preparación que comprende un agente inmunógeno y un diluyente farmacéuticamente aceptable potencialmente en combinación con un excipiente, adyuvante y/o aditivo o protector. El inmunógeno puede estar compuesto por un agente infeccioso completo o un subconjunto molecular del agente infeccioso (producido por el agente infeccioso, de forma sintética o recombinante). Cuando se administra la vacuna a un sujeto, el inmunógeno estimula una respuesta inmunitaria que, tras la exposición posterior al agente infeccioso, protegerá al sujeto de enfermedades o mitigará la patología, síntomas o manifestaciones clínicas causadas por ese agente. Una vacuna terapéutica (tratamiento) se administra después de la infección y tiene como objetivo reducir o detener la progresión de la enfermedad. Una vacuna preventiva (profiláctica) tiene como objetivo prevenir la infección inicial o reducir la tasa o carga de la infección. Los agentes utilizados en las vacunas contra una enfermedad parasitaria tal como la malaria pueden ser parásitos completamente muertos (inactivos), parásitos vivos, parásitos vivos atenuados (incapaces de progresar completamente a lo largo de su ciclo de vida) o moléculas purificadas o fabricadas artificialmente asociadas con el parásito, por ejemplo, proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, plásmidos de ADN y virus o bacterias recombinantes que expresan proteínas de Plasmodium. Una vacuna puede comprender esporozoitos junto con otros componentes tales como excipiente, diluyente, vehículo, conservante, adyuvante u otro potenciador inmunitario, o combinaciones de los mismos, como entenderán fácilmente los expertos en la materia.
"Atenuación", como se usa en la presente memoria, significa una alteración o mutación genética de un organismo tal como un parásito de Plasmodium, de modo que pierde su capacidad de completar su ciclo de vida normal, sino que más bien se detiene en un estadio de desarrollo en particular. En los organismos de Plasmodium de la presente invención, las funciones de uno o más genes de un parásito atenuado por radiación o atenuado genéticamente (GAP) se interrumpen de modo que el mutante atenuado conserva la capacidad de infectar a un hospedante e invadir hepatocitos dentro del hígado, pero detiene el desarrollo en el estadio del hígado.
"Invasión de hepatocitos" como se usa en la presente memoria se refiere a la capacidad del estadio de esporozoito
del parásito de Plasmodium para buscar y entrar en células dianas en particular, en este caso, hepatocitos del hospedante, ya sea células de hepatocitos en cultivo [24,25] o células de hepatocitos in vivo después de la introducción inicial en el aparato circulatorio de un hospedante. Los parásitos no atenuados experimentarían entonces un mayor desarrollo en estadios específicos.
"Metabólicamente activo", como se usa en la presente memoria, significa vivo y capaz de realizar funciones sustentativas y algunos procesos del ciclo de vida. Con respecto a los esporozoitos atenuados, esto incluye, pero no se limita a, esporozoitos capaces de invadir hepatocitos en cultivo e in vivo, que potencialmente tienen una capacidad limitada para dividirse y progresar a través de algunos estadios de desarrollo dentro del hígado y la expresión de novo de proteínas específicas del estadio.
Esporozoitos in vitro
La vacuna tal como se define en las reivindicaciones puede comprender esporozoitos atenuados, así como esporozoitos patógenos. Según la invención, la esporogonía desde el estadio de gametocito hasta el estadio de esporozoito se ha producido externa a los mosquitos.
En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro son por lo menos el 70 %, 80 % o 90 % tan infecciosos para los hepatocitos humanos como los esporozoitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos criados en un mosquito. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro son entre el 70 100 %, 80-100 % o 90-100 % tan infecciosos para los hepatocitos humanos como los esporozoitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos criados en un mosquito. En algunas realizaciones, la infectividad se mide in vitro o in vivo.
La infectividad se mide usando un ensayo de potencia de hepatocitos en Pf in vitro de 6 días que se usa para determinar la capacidad del Pf SPZ in vitro para infectar células HC-04 (1F9) (una línea celular hepática humana) [24,25] y convertirse en parásitos en estadio hepático tardío que expresan PfMSP-1 [15]. Un ejemplo de un método de este tipo puede incluir:
a. Cultivo celular y siembra de portaobjetos Lab-Tek recubiertos con ECL. Recubrir portaobjetos de cámara Lab-Tek Permanox de 8 pocillos con matriz de fijación celular ECL durante 1 a 2 horas a 37 ± 2 °C. Diluir células HC-04 (1F9) con un medio DMEM/F-12 completo (CM) para sembrar en 4 x 104 células viables en 0,3 ml por pocillo. Lavar e incubar durante 24 ± 4 h a 37 ± 2b°C y 5 ± 2 % de CO2 ;
b. Infección y cálculo del número de SPZ añadidos por pocillo: Centrifugar los esporozoitos de Pf producidos in vitro durante 2 minutos a 13.200 rpm (fuerza centrífuga relativa 16.100) a 22 ± 2 °C mediante un rotor de ángulo fijo. Desechar los sobrenadantes y volver a suspender los pellets en CM. Aspirar y desechar el medio de cada pocillo del portaobjetos Lab Tek. Añadir 50 μl de suspensión/pocillo de SPZ in vitro por triplicado. Diluir la suspensión de esporozoitos infecciosos 1:10 en CM y contar el número de esporozoitos usando un celómetro y un microscopio de contraste de fase y calcular el número de SPZ añadidos por pocillo. Incubar los portaobjetos de cámara a 37 ± 2 °C y 5 ± 2 % de CO.2 durante 3 h ± 10 min. Lavar la monocapa 3 veces con 0,3 ml de medio DMEM/F-12 completo aspirando suavemente el exceso de medio de cultivo que contiene esporozoitos de cada pocillo usando puntas de pipeta de 1000 μl, teniendo cuidado de no contaminar los pocillos de control con Pf SPZ. Después del lavado final, añadir 0,3 ml de medio DMEM/F-12 completo a cada pocillo;
c. Mantenimiento de los cultivos: El medio de cultivo se cambia diariamente para asegurar el desarrollo satisfactorio de los estadios hepáticos y el mantenimiento de los cultivos. Los cultivos en portaobjetos de cámara se fijan con metanol helado 6 días después de la infección. Conservar a 4 ± 2°C;
d. Tinción para ensayo inmunofluorescente indirecto (IFA): Desechar el PBS de los portaobjetos y luego añadir de 2 a 3 gotas del potenciador de señal Image-iT FX a cada pocillo e incubar a 37 ± 2 °C durante 30 ± 3 minutos. Desechar las soluciones potenciadoras de imágenes y lavar los cultivos 3 veces con PBS. Añadir 100 μl de anticuerpo monoclonal de ratón antiPfMSP-1 diluido a pocillos por triplicado e incubar a 37 ± 2 °C durante 60 a 70 minutos. Al final del periodo de incubación, desechar las soluciones de anticuerpos y lavar con PBS. Diluir IgG anti-ratón Alexa Fluor 488 a 1:200 en PBS con azul de Evan al 0,02 %. Añadir 100 μl de IgG anti-ratón Alexa 488 diluida a los pocillos por triplicado. Incubar los portaobjetos a 37 ± 2 °C durante 60 a 70 minutos. Montar el cubreobjetos usando el medio de montaje Vectashield con DAPI y guardar a 2 - 8 °C, protegido de la luz, hasta el momento de la observación; y
e. Evaluación y enumeración de los estadios hepáticos de Pf.: Mediante un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 400x, evaluar y registrar el número de estadios hepáticos de Pf/pocillo que muestran reactividad a los anticuerpos. Contar el número de parásitos en estadio hepático en los tres pocillos e informar del promedio.
En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro son asépticos. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro tienen un riesgo reducido de contaminación con material auxiliar de un organismo hospedante, p. ej., un mosquito (como podría ser el caso de los esporozoitos diseccionados a partir de las glándulas salivales de los mosquitos hospedantes).
Los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro pertenecen a la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la especie de esporozoitos de Plasmodium criados in vitro es P. falciparum.
En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro son adecuados para su uso farmacéutico. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro se utilizan en una vacuna. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro están atenuados.
Los Pf SPZ criados in vitro se prueban para determinar su capacidad de invadir y desarrollarse en hepatocitos humanos en cultivo. Los PfSPZ criados in vitro también se pueden probar in vivo para determinar su capacidad de completar el ciclo de vida de Pf. Esto se puede hacer utilizando ratones quiméricos de hígado humano a los que se les transfunde sangre humana.
Cultivos
En algunas realizaciones, la composición que comprende dichos esporozoitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones es por lo menos el 70 %, 80 % o 90 % tan infecciosa para los hepatocitos como la de los esporozoitos de Plasmodium de la misma especie criados en un mosquito. En algunas realizaciones, la composición que comprende dichos esporozoitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones es entre el 70-100 %, el 80-100 % o el 90-100 % tan infecciosa para los hepatocitos humanos como la de los esporozoitos de Plasmodium de la misma especie criados en un mosquito. En algunas realizaciones, la infectividad se mide en cultivos de células HC-04, en algunas realizaciones la infectividad se mide mediante infección hepática in vivo.
Un cultivo de esporozoitos de Plasmodium puede comprender un primer medio (denominado exflagelación), que facilita la aparición de gametos a partir de gametocitos, p. ej., imitando las condiciones en el lumen de un mosquito después de una ingesta de sangre. En algunas realizaciones, el medio de exflagelación comprende suero fetal bovino (FBS), glucosa, bicarbonato de sodio y ácido xantruénico. En algunas realizaciones, el medio de exflagelación comprende el 10-30 %, el 15-25 % o el 18-22 % de FBS. En algunas realizaciones, el medio de exflagelación comprende del 0,05 % al 0,5 %, del 0,075 % al 0,5 % o del 0,075 % al 0,25 % de glucosa. En algunas realizaciones, el medio de exflagelación comprende del 0,05 % al 0,5 %, del 0,075 % al 0,5 % o del 0,075 % al 0,25 % de bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, el medio de exflagelación comprende del 0,01 % al 0,05 %, del 0,01 % al 0,04 % o del 0,02 % al 0,04 % de ácido xantruénico. En algunas realizaciones, el medio de exflagelación comprende FBS, del 0,05 % al 0,5 % de glucosa (p. ej., 0,1 %), del 0,05 % al 0,5 % de bicarbonato de sodio (p. ej., 0,1 %) y del 0,01 % al 0,05 % de ácido xanturénico (p. ej., 0,022 %) .
En algunas realizaciones, se elimina el primer medio y el cultivo comprende un segundo medio (denominado oocineto), que facilita la diferenciación de cigotos en oocinetos y la invasión de oocinetos en un sustrato de matriz 3D. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende FBS, RPMI y trehalosa. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende el 10-30 %, el 15-25 % o el 18-22 % de FBS. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende del 0,1 % al 0,5 %, del 0,15 % al 0,3 % o del 0,2 % al 0,3 % de trehalosa. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende del 0,1 % al 0,5 %, del 0,15 % al 0,3 % o del 0,2 % al 0,3 % de dextrosa. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende del 0,01 % al 0,08 %, del 0,02 % al 0,06 %, del 0,03 % al 0,05 % de bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende además un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico es penicilina, estreptomicina o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende un antibiótico en 1 a 50 unidades/ml, 1 a 40 unidades/ml, 5 a 30 unidades/ml o 10 a 20 unidades/ml. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende un antibiótico de 1 a 50 μg/ml, de 1 a 40 μg/ml, de 5 a 30 μg/ml o de 10 a 20 μg/ml. En algunas realizaciones, el medio oocineto comprende medio RPMI que contiene el 10-30 % de FBS (p. ej., 20 %), del 0,1 % al 0,5 % de trehalosa (p. ej., 0,25 %), del 0,1 % al 0,5 % de dextrosa (p. ej., 0,25 %), del 0,01 % % al 0,08 % de bicarbonato de sodio (p. ej., 0,04 %), de 1 a 50 unidades/ml de penicilina (p. ej., 10 unidades/ml) y de 1 a 50 μg/ml de estreptomicina (p. ej., 10 μg/ml).
En algunas realizaciones, se elimina el segundo medio y el cultivo comprende un tercer medio (denominado ooquiste), que proporciona nutrientes para la esporogonía in vitro de los parásitos de Plasmodium al estadio de esporozoito. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende medio de Drosophila de Schneider [26], FBS, bicarbonato de sodio, trehalosa, hipoxantina, HEPES, aminoácidos esenciales, ácido paraaminobenzoico (PABA), antibiótico (p. ej., penicilina y estreptomicina), lipoproteínas, colesterol y vitaminas. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende el 10-30 %, el 15-25 % o el 18-22 % de FBS. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende del 0,01 % al 0,08 %, del 0,02 % al 0,06 %, del 0,03 % al 0,05 % de bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende del 0,1 % al 0,5 %, del 0,15 % al 0,3 % o del 0,2 % al 0,3 % de trehalosa. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende de 10 a 100 μg/ml, de 20 a 100 μg/ml, de 25 a 75 μg/ml o de 40 a 60 μg/ml de hipoxantina. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende HEPES de 0,05 M a 0,25 M, de 0,075 M a 0,2 M o de 0,075 M a 1,5 M. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende del 0,01 % al 0,08 %, del 0,02 % al 0,06 %, del 0,03 % al 0,05 % de PABA. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende además un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico es penicilina, estreptomicina o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende un antibiótico en 1 a 50 unidades/ml, 1 a 40 unidades/ml, 5 a 30 unidades/ml o 10 a 20 unidades/ml. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende un antibiótico en 1 a 50
gg/ml, 1 a 40 gg/ml, 5 a 30 gg/ml o 10 a 20 gg/ml. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende del 0,05 % al 0,5 %, del 0,075 % al 0,5 % o del 0,075 % a 0,25 % de lipoproteínas. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende del 0,05 % al 0,5 %, del 0,075 % al 0,5 % o del 0,075 % al 0,25 % de colesterol. En algunas realizaciones, el medio ooquiste comprende medio de Drosophila de Schneider, el 10-30 % de FBS (p. ej., 20 %), del 0,01 % a 0,08 % de bicarbonato de sodio (p. ej., 0,04 %), del 0,1 % a 0,5 % de trehalosa (p. ej., 0,25 %), de 10 a 100 gg/ml de hipoxantina (p. ej., 50 gg/ml), h Ep Es de 0,05 M a 0,25 M (p. ej., 0,1 M), aminoácidos esenciales (p. ej., 1x, GIBCO), del 0,01 % al 0,08 % de ácido paraaminobenzoico (PABA, p. ej., 0,04 gg/ml), de 1 a 50 unidades/ml de penicilina (p. ej., 10 unidades/ml) y de 1 a 50 gg/ml de estreptomicina (p. ej., 10 gg/ml), del 0,05 % al 0,5 % de lipoproteínas (p. ej., 1,5 %), del 0,05 % al 0,5 % de colesterol (p. ej., 0,1 %) y vitaminas (p. ej., 1x, GIBCO).
El sustrato de cultivo comprende una matriz de cultivo 3D que se ha sembrado previamente con células S2 de Drosophila Schneider [26]. En algunas realizaciones, la matriz de cultivo comprende una matriz de poliestireno (p. ej., AMS Biotechnology Ltd, Reino Unido) recubierta con Matrigel [27, 28]. Por ejemplo, la matriz de poliestireno se puede recubrir con Matrigel colocando cuidadosamente 1 mg/ml de Matrigel encima de la matriz de poliestireno seguido de incubación a 37 °C. En algunas realizaciones, la matriz de cultivo comprende matriz de poliestireno, Matrigel y células S2 de Drosophila Schneider. En algunas realizaciones, la matriz está recubierta con una proteína de la matriz extracelular, p. ej., una laminina, un colágeno o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el cultivo es aséptico. En algunas realizaciones, los esporozoitos derivados del cultivo son adecuados para su uso farmacéutico.
Métodos de cultivo de parásitos de Plasmodium
Se divulgan métodos de cultivo de parásitos de Plasmodium y/o elaboración de cultivos de esporozoitos de Plasmodium vivos e infecciosos criados in vitro y métodos de cultivo y/o elaboración de composiciones de esporozoitos de Plasmodium criados in vitro atenuados.
En determinadas realizaciones, la solicitud se dirige a métodos de cultivo de parásitos de Plasmodium in vitro de la gama de hospedantes humanos durante el desarrollo esporogónico de dichos parásitos como se define en las reivindicaciones, que comprende:
a. cultivar gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones en presencia de glóbulos rojos en un medio de cultivo por exflagelación,
b. aglutinar los glóbulos rojos mediante una lectina,
c. recoger una mezcla que comprende cigotos, gametos, gametocitos y células aglutinadas (en algunas realizaciones esto se logra mediante centrifugación y recogida del pellet),
d. cultivar dicha mezcla como se define en las reivindicaciones, en el que dichos parásitos se diferencian a oocinetos y dichos oocinetos entran en dicha matriz y se diferencian en el estadio de ooquiste,
e. sustituir dicho medio oocineto por un medio de cultivo de ooquistes, y
f. recolectar los parásitos de Plasmodium en estadio de esporozoito producidos de este modo.
Por ejemplo, los métodos de cultivo pueden incluir: (a) suspender gametocitos en estadio V en medio de exflagelación (1 h) (en esta etapa, los gametocitos masculinos y femeninos salen de microgametocitos y macrogametocitos e interactúan (fertilización) para formar cigotos); (b) aglutinar eritrocitos añadiendo lectina, por ejemplo aglutinina de germen de trigo, una lectina purificada a partir de trigo (1 h); (c) centrifugar la suspensión del cultivo para recoger el pellet, que contiene cigotos, restos de eritrocitos y cualesquiera gametocitos y gametos que no se hayan diferenciado; (d) suspender los pellets en medio oocineto y sembrarlos en una matriz de cultivo celular 3D previamente sembrada con células S2 de Drosophila Schneider [26]. La matriz de cultivo 3D se desarrolló utilizando Matrigel [27, 28] en placas de cultivo de 8 pocillos o en otros viales de cultivo de tejidos o insertos de cultivo transpocillo. Los oocinetos desarrollados invaden la matriz en las siguientes 20 a 24 h porque son móviles (a diferencia de los gametocitos, gametos y cigotos que no son móviles); (e) 20-24 h después, se lavan los insertos transpocillos o las placas de cultivo de 8 pocillos para eliminar los oocinetos que no hayan invadido la matriz, así como los gametocitos, gametos y cigotos restantes (que no se desarrollaron hasta convertirse en oocinetos) y el medio de cultivo se sustituye por el medio ooquiste. Los oocinetos que se encuentran en la matriz se transforman en ooquistes entre 12 y 24 h después de la invasión. (f) El medio ooquiste se cambia una vez cada 2-3 días; (g) los ooquistes de 7, 8 y 11 días se determinan los días 7, 8 y 11 después del inicio del cultivo; (h) los SPZ se recolectan del medio los días 15, 18 y 21 después del inicio del cultivo recogiendo el medio de las placas de cultivo de 8 pocillos o transpocillos, seguido de trituración. Los PfSPZ se cuentan con un celómetro; los SPZ recolectados pueden luego sembrarse en células HC-04 para determinar la potencia mediante el ensayo de potencia de hepatocitos de 6 días.
En determinadas realizaciones, los gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos se derivan de un cultivo de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos en glóbulos rojos (eritrocitos), p. ej., como se divulga en Trager W. y Jensen J. B. Science 193: 673-675, 1976
Métodos de aumento de la producción de ooquistes de Plasmodium
En determinadas realizaciones, la solicitud está dirigida a un método in vitro para aumentar la producción de ooquistes de Plasmodium en comparación con ooquistes de la misma especie y desarrollados en mosquitos a partir de un número equivalente de gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones, que comprende:
a. cultivar gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos como se define en las reivindicaciones en presencia de glóbulos rojos en un medio de cultivo por exflagelación,
b. aglutinar dichos glóbulos rojos mediante una lectina,
c. recoger una mezcla que comprende cigotos, gametos, gametocitos y células aglutinadas (en algunas realizaciones esto se logra mediante centrifugación y recogida del pellet),
d. cultivar dicha mezcla como se define en las reivindicaciones, en el que dichos parásitos se diferencian a oocinetos y dichos oocinetos entran en dicha matriz y se diferencian en el estadio de ooquiste,
e. sustituir dicho medio oocineto por un medio de cultivo de ooquistes, y
f. continuar con el cultivo de parásitos sustituyendo el medio ooquiste por un medio ooquiste que contenga células S2 (se añaden células S2 para reponer la pérdida de células durante el cambio de medio) cada 40 80 (preferiblemente, 48-72 horas), y
g. cuantificar los parásitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos el estadio de ooquiste;
h. en el que dicho método produce más ooquistes de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos desarrollado in vitro en comparación con los ooquistes de la misma especie desarrollados en mosquitos a partir de un número equivalente de gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos.
En determinadas realizaciones, los gametocitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos se derivan de un cultivo de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos en glóbulos rojos (eritrocitos), p. ej., como se divulga en Trager (1976).
En algunas realizaciones, la eficacia de transformación de gametocitos en estadio V a oocinetos in vitro está dentro del intervalo del 1-25 %, 5-25 %, 5-21 % u 8-21 %.
En algunas realizaciones, la eficacia de transformación de gametocitos en estadio V a ooquistes de 7, 8 u 11 días está dentro del intervalo del 1-15 %, 2-14 %, 2-25 % o 2,4-12,5 %.
En algunas realizaciones, se desarrollan por lo menos de 10 a 20, de 10 a 30, de 10 a 39 o de 10 a 60 veces más ooquistes in vitro en comparación con los ooquistes desarrollados en mosquitos a partir de un número equivalente de gametocitos en estadio V. En algunas realizaciones, se desarrollan de 10 a 20, de 10 a 30, de 10 a 39 o de 10 a 60 veces más ooquistes in vitro en comparación con los ooquistes desarrollados en mosquitos a partir de un número equivalente de gametocitos en estadio V.
Métodos de uso
Los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro y los esporozoitos de Plasmodium atenuados criados in vitro y atenuados (véanse, por ejemplo, los documentos: US 7.229.627; USSN 61/783.326), pueden usarse como inmunógeno en vacunas para prevenir la malaria. Los parásitos patógenos criados in vitro también son útiles para evaluar la eficacia de los fármacos y vacunas contra la malaria, y en conjunto con agentes contra la malaria, en particular antimaláricos tal como la cloroquina, que se dirigen al estadio eritrocítico asexual de la infección por Plasmodium, útil en regímenes de vacunas para conferir inmunidad protectora.
En determinadas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama de hospedantes humanos de la solicitud se usan en una composición de vacuna como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama de hospedantes humanos están atenuados como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama de hospedantes humanos no están atenuados como se define en las reivindicaciones. Los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama de hospedantes humanos que no están atenuados se utilizan con un agente contra la malaria, p. ej., cloroquina. Los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama hospedantes humanos inducen una respuesta inmunitaria en un sujeto humano. En algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama de hospedantes humanos generan una respuesta inmunitaria a los esporozoitos de Plasmodium correspondientes y, en algunas realizaciones, los esporozoitos de Plasmodium criados in vitro de la gama de hospedantes humanos proporcionan inmunidad protectora a un sujeto humano.
Ejemplos
Ejemplo 1
Optimización de métodos para producir y purificar de forma reproducible grandes cantidades de oocinetos de P. falciparum in vitro.
Se evaluó la producción de oocinetos a partir de cultivos de gametocitos de diferentes edades y con densidades de gametocitos altas y bajas. Se produjeron oocinetos y réplicas tardías de manera reproducible (figuras 2A-2B) a partir de cultivos de alta y baja densidad 14-22 días después de la inducción de gametocitos (Tabla 1). Las réplicas son formas intermedias del parásito durante su desarrollo de cigoto a oocineto y tanto los oocinetos como las réplicas tardías (figuras 2A-2B) se transforman en ooquistes en los mosquitos. Los parásitos se tomaron de un cultivo de gametocitos 18 días después de la inducción. Las primeras réplicas (figura 2A) se observaron por primera vez ~14 h y oocinetos a partir de 24 h después del inicio del cultivo de oocinetos. Los frotis de cultivos teñidos con Giemsa examinados mediante microscopía óptica mostraron una mezcla de cigotos y macrogametos redondos, así como oocinetos y gametocitos en forma de media luna en los cultivos. Los cigotos se distinguían de los macrogametos por la presencia de un núcleo prominente. Los oocinetos se distinguían de los gametocitos por la presencia de núcleos prominentes y la falta de una membrana de eritrocitos circundante. Se utilizaron otros dos planteamientos para proporcionar estimaciones de las tasas de conversión y purificación. En primer lugar, se seleccionaron anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra moléculas expresadas en diferentes estadios del parásito: La Pfs 48/45 se expresó en macrogametocitos y macrogametos maduros, la Pfs 230 en macrogametos y cigotos, la Pfs25 en gametos y oocinetos y la PfCelTOS en oocinetos y PfSPZ (no se muestran los datos). La Pfs230 se localizó en gametocitos y macrogametos, mientras que la Pfs48/45 se localizó en gametos y réplicas. La Pfs25 se localizó de forma variable en los gametocitos, pero se expresó fuertemente en réplicas y oocinetos. Al marcar parásitos cultivados con anticuerpos contra la Pfs25 (las flechas cerradas apuntan a la tinción verde) y el antígeno eritrocitario, la glicoforina A (las flechas abiertas apuntan a la tinción roja) (figuras 3A-3B), se distinguieron los gametocitos de los oocinetos en base a la presencia o ausencia de una membrana de eritrocitos, respectivamente.
Se adoptaron varios planteamientos para purificar y enriquecer los oocinetos cultivados lejos de los eritrocitos no infectados. Aproximadamente el 90 % de los eritrocitos no infectados se pudieron eliminar utilizando la centrifugación en gradiente de linfocito-H, pero los oocinetos se copurificaron con gametocitos, gametos y cigotos. Se desarrolló un procedimiento de 3 etapas para purificar y enriquecer. Este procedimiento fue satisfactorio y se logró >70 % de enriquecimiento. La eficacia media de transformación de gametocitos en estadio V en oocinetos in vitro fue del 13 % (intervalo = 8-21 %, Tabla 1).
Ejemplo 2
Producción de esporozoitos de P. falciparum a partir de oocinetos in vitro.
La primera etapa fue producir ooquistes de manera eficaz. En resumen, los cultivos in vitro de gametocitos en estadio V se transfirieron a un medio de exflagelación (FBS, 0,1 % de glucosa, 0,1 % de bicarbonato de sodio y 0,022 % de ácido xantruénico) y, después de la incubación, los cigotos se transfirieron a un medio oocineto modificado (20 % de FBS, medio RPMI, 0,25 % de trehalosa, 0,25 % dextrosa, 0,04 % bicarbonato de sodio, 10 unidades/ml de penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina) y se colocaron en capas sobre portaobjetos de 8 pocillos recubiertos con Matrigel modificado. Para recubrir los portaobjetos de 8 pocillos, se diluyó Matrigel con medio RPMI y se vertió en portaobjetos
de 8 pocilios. Estos portaobjetos se incubaron a 37 °C durante 2 h y se eliminó el exceso de medio. Los portaobjetos recubiertos con Matrigel se modificaron aún más sembrando células S2 de Drosophila Schneider encima del Matrigel antes de colocar en capas los cigotos. Oocinetos diferenciados invadieron el Matrigel. Los cigotos y oocinetos no diferenciados que no invadieron el Matrigel se eliminaron por lavado durante el cambio de medio oocineto a ooquiste (medio de Drosophila de Schneider, 20 % de FBS, 0,04 % de bicarbonato de sodio, 0,25 % de trehalosa, 50 μg/ml de hipoxantina, 0,1 M de HEPES, aminoácidos esenciales (1x, GIBCO), 0,04 μg/ml de ácido paraaminobenzoico (PABA), 10 unidades/ml de penicilina y 10 μg/ml de estreptomicina, 1,5 % de lipoproteínas, 0,1 % de colesterol y vitaminas (1x, GIBCO)) 24 h después de la incubación. Se añadieron células S2 tanto en el medio oocineto como en el medio ooquiste (figura 4). Se muestran los ooquistes de tres días (figura 4, panel superior) y de 8 días (figura 4, panel inferior) detectados por IFA utilizando mAb anti-Pfs25 y anti-Pf CSP. Se permeabilizaron cultivos de ocho días para IFA. La tinción punteada en ooquistes de 8 días sugirió gemación de Pf SPZ. En el panel central (figura 4), las flechas indican ooquistes de 7 a 8 días que se desarrollan en cultivo. Después de los experimentos iniciales, las condiciones de cultivo, tales como la concentración de Matrigel utilizado para el recubrimiento y el número de cigotos sembrados en cada pocillo, se modificaron para aumentar significativamente la eficacia de transformación del desarrollo desde gametocitos en estadio V hasta ooquistes de 8 días. Usando este protocolo de cultivo in vitro modificado, se logró sistemáticamente la transformación del 2,4 al 12,5 % (media 8,3 %) de gametocitos en estadio V a ooquistes de 8 días (Tabla 2). Esta fue una mejora importante con respecto al 0,13 % registrado inicialmente antes de la modificación del protocolo de cultivo in vitro. La eficacia de transformación en mosquitos de gametocitos en estadio V a ooquistes fue del 0,22 % en 74 ensayos independientes de alimentación por membrana llevados a cabo en Sanaria (Li etal. en prep.). Esta eficacia de transformación fue comparable a la informada en la literatura [22, 23]. La eficacia de transformación in vitro del 8,3 % fue 39 veces mayor que la observada en mosquitos (Tablas 2, 3). El tamaño y la estructura de los ooquistes desarrollados in vitro (figuras 4, 5A, 8A-C) y en mosquitos (figura 5B) fueron similares. La figura 5A muestra el IFA de ooquistes cultivados in vitro de 7 días teñidos con mAb PfCSP de hormiga y ooquistes de 7 días de intestino medio de mosquito teñidos con mercurocromo (figura 5B).
Los cultivos in vitro se recolectaron el día 15 y/o el día 18 recogiendo el sobrenadante de cultivo de los pocillos que incluían células S2 no unidas. Los números de PfSPZ desarrollados morfológicamente se contaron en un celómetro y se tiñó una parte alícuota usando mAb anti-PfCSP fluorescente para ser confirmada (figura 6B, Tabla 4). Los Pf SPZ desarrollados en pocillos de cultivo se detectaron después de la fijación de la tinción de los pocillos con mAb anti-Pf CSP fluorescente (figura 6A). En 7 experimentos independientes, se produjeron entre 180.000 y 350.000 Pf SPZ maduros/recolección de diez portaobjetos de 8 pocillos. En todos los experimentos estuvieron presentes dos formas morfológicamente diferentes de Pf SPZ. Los Pf SPZ morfológicamente maduros parecían idénticos a los Pf SPZ de las glándulas salivales, eran móviles, tenían entre 10 y 13 μm de largo y eran altamente reactivos al mAb anti-Pf CSP (figura 6A-B, Tabla 4). Los Pf SPZ inmaduros, de forma corta, era <10 μm de largo, pero todavía móviles y altamente reactivos al mAb anti-Pf CSP. En todos los experimentos informados, solo se cuantificaron Pf SPZ morfológicamente maduros. La recolección en los días 15 y 18 de los mismos cultivos aumentó los rendimientos a ~500.000 PfSPZ por cada diez portaobjetos.
Posteriormente, se probó un sistema Transwell 3D. En dos experimentos de cultivo independientes que utilizaron este planteamiento, se recolectaron 228.000 y 208.000 Pf SPZ morfológicamente maduros de un cultivo en placa de 6 pocillos. Inicialmente, se usaron dos matrices 3D disponibles comercialmente que resultaron ser adecuadas para el cultivo de ooquistes in vitro. Para el cultivo de células en un entorno biomimético 3D se usa el hidrogel 3D Life (Cellendes GmbH, Alemania), y el sistema de cultivo 3D AlgiMatrix™ (Gibco/Invitrogen) es un andamio biológico sin origen animal que facilita el cultivo celular en 3D. Ambos permiten la esporogonía de Pf. El hidrogel 3D Life requirió digestión con galactosidasa para liberar Pf SPZ de la matriz, mientras que los Pf SPZ maduros quedaron atrapados en la matriz de Algimatrix. Por lo tanto, desarrollamos un sistema de cultivo basado en insertos Transwell junto con la tecnología de cultivo Alvetex 3D (AMS Biotechnology (Europe) Limited, Reino Unido) como alternativa. Los insertos Transwell permitieron el cultivo en dos compartimentos una vez que se insertaron en los pocillos de la placa (figura 7). En este sistema, se colocó un andamio de poliestireno poroso inerte de 200 μm de espesor recubierto con Matrigel sobre la membrana porosa del inserto. Los cigotos sembrados en esta matriz 3D se diferenciaron en oocinetos, invadieron el andamio de poliestireno recubierto de Matrigel y se transformaron en ooquistes. El compartimento superior se sembró con células S2. Los ooquistes se desarrollaron en esta matriz y los PfSPZ se liberaron y recogieron de los compartimentos inferiores. En experimentos preliminares, este sistema permitió el desarrollo esporogónico de Pf (Tabla 5) y el desarrollo y la retención de ooquistes fueron muy similares a los cultivos en portaobjetos de cámara (Tablas 2, 3). Para evaluar el desarrollo esporogónico, se eliminó la membrana porosa junto con la matriz y se recogieron los ooquistes mediante centrifugación. La eficacia de transformación de gametocitos en estadio V a ooquistes de 7 y 11 días (figura 8A-C) fue del 10,3 % (intervalo 9-11,5) y del 9,0 % (intervalo 7,8-10,7), respectivamente (Tabla 5). El número de ooquistes de 11 días representó un aumento tremendo e indicó una retención significativa de ooquistes durante el cultivo. Además, los ooquistes extraídos eran similares en aspecto a los ooquistes que se desarrollaron en el intestino medio de los mosquitos a los 11 días y estos ooquistes formados in vitro expresaron PfCSP (figura 8C). La figura 8A-B muestra imágenes de contraste de fase de ooquistes en un celómetro utilizado para la cuantificación (figura 8A y B), e IFA de ooquistes extraídos en suspensión (no permeabilizados) usando mAb antiPf CSP marcado con fluorescencia (figura 8C). La tinción de ooquistes se llevó a cabo en suspensión sin permeabilización y, por lo tanto, los ooquistes teñidos con PfCSP tenían un patrón uniforme y bastante punteado de la expresión PfCSP (figura 8C).
En dos experimentos de cultivo independientes, se recolectaron 228.000 y 208.000 PfSPZ desarrollados
morfológicamente a partir de un cultivo en placa de 6 pocilios usando 6 insertos modificados. Esto supuso un aumento mínimo de tres veces en el rendimiento en comparación con las cifras logradas con los portaobjetos de 8 pocillos (Tablas 4, 5). En particular, la Tabla 4 muestra los resultados del cultivo de 8 pocillos, mientras que la Tabla 5 muestra los resultados del cultivo transwell. Esta condición de cultivo de inserto Transwell ofreció varias ventajas ya que: i) redujo la pérdida de Matrigel durante los cambios de medio, ii) permitió la recolección repetida de PfSPZ a partir de un solo cultivo, iii) fue capaz de recubrir la matriz con diferentes proteínas de la matriz extracelular, tales como lamininas y colágenos y iv) era adecuado para la ampliación y automatización mediante un sistema de manipulación de líquidos adecuado.
Este resultado representa como mínimo un aumento de 3 veces en el número de Pf SPZ maduros recolectados a partir de ooquistes en comparación con experimentos anteriores.
Ejemplo 3
Demostración de que esporozoitos de P. falciparum criados in vitro y esporozoitos de P. falciparum desarrollados ontogénicamente en mosquitos Anopheles stephensi cada uno invade y se desarrolla dentro de una línea celular de hepatocitos humanos (HC-04) con eficacias similares.
Se analizó la infectividad de Pf SPZ criados in vitro en un ensayo de hepatocitos de 6 días, que se utiliza de forma rutinaria para evaluar la potencia. El ensayo típicamente se lleva a cabo con Pf SPZ antes y después de la criopreservación. Los Pf SPZ frescos y criopreservados producen parásitos en estadio hepático de 6 días que son morfológicamente idénticos, pero hay una pérdida de potencia del 5 al 25 % debido a la criopreservación [5]. Los Pf SPZ criados in vitro son más parecidos a los PfSPZ frescos derivados de mosquitos, por lo que se realizaron comparaciones con lecturas de PfSPZ frescos generados durante las campañas de fabricación. En 7 campañas de producción consecutivas, se desarrollaron entre 20,7 y 32,7 parásitos maduros de 6 días que expresan Pf MSP-1 a partir de 50.000 Pf SPZ frescos producidos por mosquitos (Tabla 4). Se inocularon PfSPZ criados in vitro en 3 pocillos depuestos con células HC-04 (una línea celular de hepatocitos humanos que se ha demostrado que permite la infección de Pf SPZ producido in vivo) [24, 25] y se incubaron durante 6 días (figura 9A, paneles superiores, Tabla 4). La figura 9A-9B muestra micrografías confocales de estadios hepáticos de 6 días en células HC-04 después de la infección con Pf SPZ criado in vitro (paneles superiores de la figura 9A) o Pf SPZ criopreservado, aséptico, purificado y producido por mosquitos (paneles inferiores de la figura 9B). En 4 ensayos independientes de hepatocitos de 6 días, el Pf SPZ producido in vitro sembrado en 56.598 ± 7,294 Pf SPZ/pocillo produjo 28,6 ± 7,0 parásitos de Pf de 6 días que expresan MSP1 (Tabla 4). Esto era comparable a los 25,7 ± 4,1 parásitos de Pf que expresan MSP1 observados con los Pf SPZ frescos, asépticos y purificados en este ensayo (Tabla 4) y ligeramente más que con los Pf SPZ criopreservados (no se muestran los datos). Estos datos también sugirieron que los Pf SPZ producidos in vitro durante 18 días eran más infecciosos que los Pf SPZ criados in vitro durante 15 días. El tamaño de los parásitos de 6 días desarrollados en células HC-04 a partir de Pf SPZ producido in vitro e in vivo (mosquitos) fue similar (figuras 9A-9B). Como control positivo para las fotomicrografías, se incubaron Pf SPZ asépticos, purificados y criopreservados a partir de glándulas salivales de mosquitos en células HC-04 y se evaluó la expresión de Pf MSP1 (figura 9B). Estos datos demostraron que los Pf SPZ producidos in vitro eran tan infecciosos en cultivos de hepatocitos como los Pf SPZ frescos producidos en mosquitos.
ND; no determinado. Los ensayos de hepatocitos de 6 días están en curso.
Estos resultados muestran métodos para producir ooquistes de Pf in vitro con una eficacia 39 veces mayor que los ooquistes producidos en mosquitos. El Pf SPZ criados in vitro invadió y se desarrolló en esquizontes en estadio hepático maduros de 6 días que expresan la proteína de superficie 1 del merozoito Pf con por lo menos tan buena eficacia como el Pf SPZ recién diseccionado a partir de mosquitos.
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Claims (7)
1. Una composición que comprende (i) esporozoitos maduros e infecciosos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos, que es una especie seleccionada del grupo que consiste en P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. knowlesi, que han experimentado desarrollo esporogónico in vitro para alcanzar el estadio de desarrollo de esporozoitos maduros e infecciosos, en el que la esporogonía desde el estadio de gametocitos hasta el estadio de esporozoitos maduros e infecciosos es externa a los mosquitos y en el que la composición que comprende dichos esporozoitos maduros e infecciosos de Plasmodium está ausente de cualquier material auxiliar de mosquito, y (ii) un excipiente, diluyente o vehículo, en el que dicho esporozoitos maduros e infecciosos de Plasmodium se obtienen mediante:
a. el cultivo de gametocitos de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos hasta el estadio de cigoto en ausencia de una matriz y en presencia de glóbulos rojos en un medio de cultivo por exflagelación;
b. la aglutinación de dichos glóbulos rojos con una lectina;
c. la recogida de una mezcla que comprende cigotos, gametos, gametocitos y glóbulos rojos aglutinados;
d. el cultivo de dicha mezcla en un sustrato que comprende una matriz de cultivo 3D que se ha sembrado previamente con células S2 de Drosophila Schneider y en un medio de cultivo de oocinetos, en el que los parásitos en estadio de oocineto penetran en dicha matriz;
e. el intercambio de dicho medio oocineto por un medio ooquiste; y
f. la recolección del parásito en estadio de esporozoito infeccioso y maduro de Plasmodium producido de ese modo.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que los esporozoitos infecciosos y maduros de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos que han experimentado un desarrollo esporogónico in vitro para alcanzar el estadio de desarrollo de esporozoitos maduros e infecciosos son por lo menos el 70 %, 80 % o 90 % tan infecciosos para los hepatocitos humanos como los esporozoitos de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos criados en un mosquito, en el que la infectividad se mide con un ensayo de potencia de hepatocitos de 6 días en Pf in vitro usado para determinar la capacidad del Pf SPZ in vitro para infectar células HC-04 (1F9) y desarrollarse en parásitos en estadio hepático tardío que expresan PfMSP-1.
3. Una composición de vacuna que comprende
A) (a) la composición de la reivindicación 1 o 2, en la que dichos esporozoitos de Plasmodium se han atenuado y (b) y un adyuvante, un aditivo y/o un protector; o
B) (a) la composición de la reivindicación 1 o 2, en la que dichos esporozoitos de Plasmodium no están atenuados y (b) un adyuvante, un aditivo y/o un protector, en el que la composición de vacuna se usa con un agente contra la malaria.
4. La composición de vacuna de la reivindicación 3 para su uso como vacuna para prevenir la malaria en un sujeto.
5. Un método para cultivar parásitos de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos, que es una especie seleccionada del grupo que consiste en P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. knowlesi, in vitro durante el desarrollo esporogónico hasta el estadio de esporozoito maduro e infeccioso, que comprende:
a. cultivar gametocitos de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos hasta el estadio de cigoto en ausencia de una matriz y en presencia de glóbulos rojos en un medio de cultivo por exflagelación;
b. aglutinar dichos glóbulos rojos de la etapa a con una lectina;
c. recoger una mezcla que comprende cigotos, gametos, gametocitos y glóbulos rojos aglutinados de la etapa b; d. cultivar dicha mezcla de la etapa c en un sustrato que comprende una matriz de cultivo 3D que se ha sembrado previamente con células S2 de Drosophila Schneider y en un medio de cultivo de oocinetos, en el que los parásitos en estadio de oocineto penetran en dicha matriz;
e. intercambiar dicho medio oocineto de la etapa d por un medio ooquiste; y
f. recolectar el parásito en estadio de esporozoito infeccioso y maduro de Plasmodium producido de ese modo.
6. Un método para aumentar la producción de ooquistes de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos, que es una especie seleccionada del grupo que consiste en P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. knowlesi, en relación con la producción de ooquistes de la misma especie y un número equivalente de gametocitos de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos en un mosquito, que comprende:
a. cultivar gametocitos de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos hasta el estadio de cigoto en ausencia
de una matriz y en presencia de glóbulos rojos en un medio de cultivo por exflagelación;
b. aglutinar dichos glóbulos rojos con una lectina;
c. recoger una mezcla que comprende cigotos, gametos, gametocitos y glóbulos rojos aglutinados;
d. cultivar dicha mezcla de la etapa c en un sustrato que comprende una matriz de cultivo 3D que se ha sembrado previamente con células S2 de Drosophila Schneider y en un medio oocineto, en el que dichos parásitos se diferencian a ooquistes y dichos oocinetos entran en dicha matriz y se diferencian en el estadio de ooquiste;
e. sustituir dicho medio oocineto por un medio de cultivo de ooquistes; y
f. cuantificar los parásitos de Plasmodium en estadio de ooquiste de dicha gama de hospedantes humanos; en el que dicho método produce más ooquistes de Plasmodium de la gama de hospedantes humanos desarrollados in vitro en comparación con los ooquistes de la misma especie desarrollados en mosquitos a partir del número equivalente de gametocitos de Plasmodium de dicha gama de hospedantes humanos.
7. El método de la reivindicación 6, en el que la especie de dichos ooquistes de Plasmodium es P. falciparum.
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