KR20160147985A - 생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충 - Google Patents

생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충 Download PDF

Info

Publication number
KR20160147985A
KR20160147985A KR1020167033486A KR20167033486A KR20160147985A KR 20160147985 A KR20160147985 A KR 20160147985A KR 1020167033486 A KR1020167033486 A KR 1020167033486A KR 20167033486 A KR20167033486 A KR 20167033486A KR 20160147985 A KR20160147985 A KR 20160147985A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plasmodium
vitro
culture
phase
host range
Prior art date
Application number
KR1020167033486A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102467128B1 (ko
Inventor
아브라함 지. 에펜
스티븐 엘. 호프만
Original Assignee
사나리아 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사나리아 인코퍼레이티드 filed Critical 사나리아 인코퍼레이티드
Publication of KR20160147985A publication Critical patent/KR20160147985A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102467128B1 publication Critical patent/KR102467128B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A61P33/12—Schistosomicides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

출원은 생식 모세포 단계로부터 종충 단계로의 포자 생식이 모기의 외부에서 일어나는, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충 및 그것의 제조 방법에 관한 것이다. 본원에는 생식 모세포 단계로부터 종충 단계로의 포자 생식이 모기의 외부에서 일어나는, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충 (SPZ), 특히 플라스모디움 팔시파룸, 플라스모디움 비박스, 플라스모디움 오발레, 플라스모디움 말라리아에 및 플라스모디움 노울레시 및 그것들의 제조 방법이 제공된다.

Description

생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충{INFECTIOUS PLASMODIUM SPOROZOIITES GROWN IN VITRO}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 5월 2일에 출원된 미국 임시 출원 번호 61/987,834 및 2014년 6월 25일에 출원된 미국 임시 출원 번호 62/016,981에 대한 우선권을 주장하고, 상기 각 출원의 내용은 본원에 전체 내용이 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 기생충학, 말라리아 연구 및 말라리아 백신 개발 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 숙주 범위의 플라스모디움 종충 (Plasmodium sporozoites) 및 인간 숙주 범위의 감염성 플라스모디움 기생충의 모기 단계, 특히 종충 단계의 생체 외 배양물, 및 생체 외 배양된 플라스모디움 종충의 백신 및 다른 시약들의 면역원성 성분으로서의 사용에 관한 것이다.
매년, 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum, Pf) 말라리아는 2억을 초과하는 임상적 사례, 60만 이상의 사망을 유발하고, 아프리카에서 국내 총생산의 120억 달러보다 큰 손실의 원인이 된다 [1-3]. 말라리아는 또한 여행자 및 군 인력 (military personnel)에게는 심각한 관심사이다. 2010년에서 2011년 동안 미국으로부터의 여행자들에게서 말라리아 사례의 수는 30% 증가하였다 [4]. 2011년에, 미국에서는 지나간 40년 중 어느 해보다 많은 사례의 말라리아가 발생하였다 [5, 6]. 과거 150년 동안 고도로 말라리아가 창궐한 지역의 모든 미국 군사 작전에서, 미군은 적의 포화로부터보다 많은 인과관계를 말라리아로부터 나타냈다 [7]. 고도로 효과적인 백신은 전세계적 보건 시장에서 대략 25억의 "위험" 개체에 극적인 영향을 미칠 것이다.
세계적 공동체는 현재 살충제가 스며든 베드넷 (bednet), 살충제 및 항말라리아 약물의 사용을 통해 말라리아를 통제하기 위해 년간 대략 20억 달러를 소비하고 있다. 이것은 아프리카에서 태어나는 모든 아동에 대해 일년에 대략 80달러에 달하는 것이고, 일부 지역에서는 그 양의 5 내지 10배가 소비되고 있다. 이들 접근법은 많은 지역에서는 탁월한 효과를 나타낸다. 그러나, 약물 및 살충제 내성이 여전히 발달되고 있고, 재정적 기부자들 및 지역 정부들이 이런 노력을 지속할 수 있는 능력이 한계에 도달하였다. 고전염 지역으로부터 말라리아를 제거하는 것은 새로운 도구를 필요로 할 것이라는 것이 자명하다. 2010 논설에서 기술된 것과 같이, 고도로 효과적인 백신이 전세계적으로 말라리아의 방지, 통제 및 제거를 위한 이상적인 도구가 될 것이다:
"여전히 필요로 하는 것은 어떠한 감염성 질환도 진정으로 정복해왔던 유일
한 도구이다: 효과적이고... 저렴한 백신... 지금 , 전세계적인 말라리아 공
동체는 너무 무사안일주의에 빠져 있다... 글락소스미스클라인의 RTS,S 플러
스애주번트 AS01은 보통 및 시간-제한적 효능을 가진 1세대 전-적혈구기 백
신이다...우리들은 차세대... 백신...을 앞으로도 20년 동안 기다릴 여유가
없다..."
- 익명의 제보자, 더 란셋, 2010년 4월 24일.
또 2011 malERA 발의 보고서에서도 기술된 것과 같이, 이상적인 백신은 기생충이 간 밖으로 나와서 혈류로 들어가는 것을 방지함으로써 전염뿐 아니라 질환을 방지하는 전-적혈구기 백신일 것이다 [8]. 이것은 "말라리아 전염을 방해하는 백신" ('VIMT')으로서 명명되었다.
글락소 스미스 클라인 (Glaxo Smith Kline)은 RTS,S/AS01으로 명명된 후보 백신을 개발하였는데, 그것은 강력한 애주번트 (AS01)를 가지는 재조합 단백질 (Pf 포자소체 (circumsporozoite) 단백질의 일부와 B형 간염 표면 항원을 융합시킴)을 사용한다. 최근 5 내지 27개월의 인간에서의 단계 3 실험 [9-12]은 일년 동안 말라리아 발생률의 36% 감소 및 첫 해 동안 말라리아 획득 속도의 56% 감소, 및 첫 해 동안 심각한 말라리아의 47% 감소를 증명하였다. 유감스럽게도, 유아에서의 결과는 그렇게 강력하지 않았다. 6 내지 12주의 인간에서, 백신은 일년 동안 말라리아 발생률의 16% 감소, 첫 해 동안 말라리아 획득 속도의 31% 감소 및 첫 해 동안 심각한 말라리아의 36% 감소 (치료할 목적으로 26%)를 증명하였다. 이들 결과는 기대에 못 미치는 것으로 여겨졌고 이 백신은 고도로 효과적인 것이거나 또는 VIMT로서의 자격을 얻지 못하였다.
지난 10년 동안, 고도로 효과적인 VIMT 말라리아 백신의 개발을 위한 초점은 백신 면역원으로서의 플라스모디움의 전체 기생충, 종충 (SPZ) 단계의 활용으로 부분적으로 옮겨갔다. 미국 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID)의 백신 연구 센터 (VRC)에서의 최근 완료된 연구에서, 방사선 감쇄된 Pf SPZ로 구성된 사나리아 PfSPZ 백신이 정맥 내 (IV) 주사에 의해 투여되었고 최고량을 받은 자원자들 6명 중에서 6명 (100%)이 보호되었다. 보호 효능 (9명 중 6명이 다음으로 낮은 총 용량으로 보호됨)과 관련하여 용량 반응 및 Pf SPZ에 대한 항체 역가와 보호 사이에 유의미한 상관관계가 있었다. 그러므로 Sanaria® PfSPZ 백신은 인간에서 명백히 강력하고 고도로 보호적이다. 이들 역사적인 결과는 2013년 8월에 사이언스지에 온라인상으로 공개되었고 2013년 9월에 기사로 출간되었다 [13].
SPZ는 또한 Sanaria® PfSPZ-CVac로 불리는 백신접종에 대한 감염 및 치료 접근법의 기생충 성분으로서 사용되고 있는데, 살아있는 감염성 플라스모디움 SPZ가 클로로퀸과 같은 무성 (asexual) 적혈구기 항말라리아제의 존재하에 투여된다 [14].
마지막으로, 살아있는 감염성 Pf SPZ는 말라리아 백신 및 다른 치료제들을 시험하기 위한 수단으로서 통제된 인간 말라리아 감염 (CHMI)을 위해 사용되고 있다 [15, 16].
모기로부터 추출된 침샘으로부터 제조되고 배양중에 성장된 실질적으로 정제된 플라스모디움 종충들은 미국 특허 8,043,625에 기술되어 있다 (본원에 참조로 포함됨).
현재, 상기 기술된 백신 및 시약에 사용된 전체 기생충 Pf SPZ는 무균성 아노펠레스 (Anopheles) 모기를 기르고, 그것들을 무균성 Pf 생식 모세포 (gametocyte)로 감염시키고, Pf 기생충이 모기 내에서 생체 내 포자 생식 (sporogony)을 통해 종충 단계로 진행하도록 허용한 다음, 모기로부터의 침샘을 손으로 해부하고 무균성 종충을 분리하고 정제함으로써 얻어졌다 (미국 특허 7,229,627; 미국 특허 8,367,810) [17]. 이런 제조 접근법이 이들 생성물을 위한 모든 임상 실험에서 사용하기 위해 충분한 양의 살아있는, 무균성, 정제된 Pf SPZ를 생성할 수 있는 한편으로, 방법론은 노동 집약적이고 곤충 농사 및 기생충 해부를 위한 실질적인 자원을 필요로 한다. 특히, 모기 침샘으로부터의 해부는 인간 숙주 범위의 Pf SPZ 및 다른 플라스모디움-종 SPZ의 제조에서 기술적 및 시간-소모적인 단계이다.
플라스모디움 기생충 발달의 모기 숙주 단계들은 도 1에 도시되어 있다. 생체 외 플라스모디움 생명 주기의 무성 부분 (척추동물-숙주 단계)을 수립하기 위한 노력들이 성공적이었고 [18] 유성 (sexual) (모기-숙주 단계) 및 포자 생식 부분에 대해 동일한 것을 수립하기 위한 실질적인 노력이 기울여졌지만, 이들 노력은 인간 숙주 범위의 임상적으로 관련된 감염성 플라스모디움 종충, 특히 Pf SPZ를 제조하는 데에는 성공하지 못하였다. 플라스모디움 갈리나세움 (P. gallinaceum) (조류 숙주 범위) 및 Pf 단상 접합자 (ookinete)의 생체 외 형질전환은 적은 수의 낭포체 (oocyst) 및 SPZ를 초래하였지만, 이들 종충의 감염성은 증명되지 못하였다 [19-20]. 플라스모디움 베르게이 (P. berghei) (설치류 숙주 범위)의 생체 외 형질전환은 낭포체 및 SPZ를 생성하였지만, SPZ는 모스키토-유도된 SPZ보다 감염성이 훨씬 적었다 [21].
발명의 요약
본원에는 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 (in vitro-reared) 감염성 플라스모디움 종충 (SPZ), 특히 플라스모디움 팔시파룸 (Pf) SPZ가 제공되며, 이때 생식 모세포 단계로부터 종충 단계로의 포자 생식은 모기의 외부에서 일어난다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충은 어떠한 수반되는 모기 물질이 없다.
추가로 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 기생충, 특히 Pf 기생충의 배양물이 제공되며, 상기 기생충은 생체 외에서 포자 생식 발달이 진행되었다. 일부 구체예에서, 배양물은 어떠한 수반되는 모기 물질이 없다.
추가로 인간 숙주 범위의 플라스모디움 종충을 생체 외에서 상기 종충의 포자 생식 발달 단계 동안에 배양하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포를 편모 방출 배양 배지에서 적혈구의 존재하에 배양하는 단계, 렉틴을 사용하여 적혈구들을 접합시키는 단계, 접합자 (zygote), 생식 세포 (gamete), 생식 모세포 및 접합된 세포들을 포함하는 혼합물 (예컨대 펠릿)을 수집하는 단계, 수집된 혼합물 (예컨대 펠릿)을 매트릭스를 포함하는 기질 상에서 및 단상 접합자 배양 배지에서 배양하는 단계, 배지를 교환하고 낭포체 배지에서 배양을 계속하는 단계 및 그로써 생성된 플라스모디움 종충을 수확하는 단계를 포함한다.
또한 모기에서 동등한 수의 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포로부터의 낭포체 제조에 비해 인간 숙주 범위 플라스모디움 낭포체의 제조를 증가시키는 방법이 제공되며, 그 방법은 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포를 편모 방출 배양 배지에서 배양하는 단계, 접합자, 생식 세포, 생식 모세포 및 접합된 세포들을 포함하는 혼합물 (예컨대 펠릿)을 수집하는 단계, 수집된 혼합물 (예컨대 펠릿)을 매트릭스를 포함하는 기질 상에서 및 단상 접합자 배양 배지에서 배양하는 단계, 배지를 교환하고 낭포체 배지에서 배양을 계속하는 단계 및 플라스모디움 낭포체의 수를 정량하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 동등한 수의 플라스모디움 생식 모세포로부터 모기에서 발달된 동일 종의 낭포체에 비교하여 생체 외에서 발달된 더 많은 낭포체를 생성한다.
또한 인간 숙주 범위의 플라스모디움-길러진 종충을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 플라스모디움-종 특이적 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
또한 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충을 포함하는 백신 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 백신은 어떠한 수반되는 모기 물질이 없다.
본원에 개시된 발명은, 예컨대 다음의 혁신을 제공한다: i) 모기에서 발달된 동일한 플라스모디움 종의 및 동등한 수의 단계 V 생식 모세포로부터의 낭포체와 비교하여 생체 외에서 발달된 평균 39-배 더 많은 낭포체를 이룸; ii) 생체 외-길러진, 감염성 Pf SPZ의 제조; 및 iii) 적어도 모기-생성된 Pf SPZ와 같은 정도로 효과적인, 생체 외-생성된 Pf SPZ에 의한 인간 간세포의 감염성에 도달함.
본 작업은 생체 외에서 주어진 수의 생식 모세포로부터 제조된 Pf SPZ의 양, 및 생체 외-제조된 Pf SPZ의 완전히 기능성인 감염 활성의 증명에 있어서 독특한 것으로서 두드러진다. 예를 들어, 본원에는 생체 외-제조된 Pf SPZ가 인간 간세포 셀라인 HC-04를 성공적으로 침입하고 [24, 25], 감염성을 증명하는 단백질인 낭충 표면 단백질 1 (Pf MSP1)을 발현하는 분열체로 발달되는 것이 기술되며; 이런 생체 외 감염성은 적어도 모기-생성된 Pf SPZ만큼 효과적이었음이 증명되었다.
도 1은 모기에서의 플라스모디움 팔시파룸의 포자 생식 발달을 도시한다.
도 2A 및 2B는 생체 외에서 제조된 플라스모디움 팔시파룸의 후-접합 단계의 샘플 영상을 도시한다. (A)는 초기 레토르트 (retort), 중간 단계 레토르트 및 후기 단계 레토르트 (좌측으로부터 우측으로)을 나타내고 (B)는 성숙한 단상 접합자를 나타낸다. 기생충들은 유도 후 18일의 생식 모세포 배양물로부터 취하였다. 초기 레토르트는 단상 접합자 배양의 개시 후 약 14시간에 처음 볼 수 있었고 단상 접합자는 24시간으로부터 볼 수 있었다. 배양물의 김자-염색된 도말 표본이 도시되었다.
도 3A 및 B는 글리코포린 A 및 Pfs25에 대한 항체들을 사용하는 (A) 생식 모세포 및 (B) 단상 접합자의 면역염색을 도시한다. 글리코포린 A에 대한 항체들 (삼각형 화살표는 적색 염색을 가리킴) 및 Pfs25에 대한 항체들 (흰색 화살표는 녹색 염색을 가리킴).
도 4는 생체 외에서 발달하는 Pf 낭포체의 IFA 및 명시야 (bright field) 영상을 도시한다. 항-Pfs25 및 항-PfCSP mAb를 사용한 IFA에 의해 검출된 3일 (상부 패널) 및 8일 (하부 패널) 낭포체가 도시된다. 8일 배양물은 IFA에 대해 투과되었다. 8-일 낭포체의 반점이 있는 염색은 발아하는 Pf SPZ를 시사한다. 중간 패널은 배양 중에 발달하는 7 내지 8일 낭포체를 도시한다. 화살표는 낭포체를 가리킨다.
도 5A 및 B는 (A) 생체 외 7일 낭포체 및 (B) 머큐로크롬 염색된 모기 중장 (midgut)을 도시한다.
도 6A 및 B는 생체 외-제조된 Pf SPZ를 도시한다: (A) 웰의 고정 후 검출된 배양 웰에서 발달된 Pf SPZ 및 (B) 추출된 Pf SPZ. 둘 다 형광 표지된 항-Pf CSP mAb를 사용한 IFA에 의해 검출되었다.
도 7은 생체 외 3D 배양 시스템의 실례를 도시한다.
도 8A 내지 C는 원심분리에 의해 추출된 트랜스웰 삽입 변형된 3D 매트릭스로부터의 낭포체의 샘플 영상을 도시한다: (A & B) 정량에 사용된 셀로미터 (cellometer)에서의 낭포체들의 상 대비 영상 및 (C) 형광 표지된 항-Pf CSP mAb를 사용하는 현탁액 (투과되지 않음) 중의 추출된 낭포체의 IFA.
도 9A 및 B는 HC-04 세포에서 생체 외-제조된 및 모기 생성된 Pf SPZ의 발달을 도시한다. (A) 생체 외-제조된 Pf SPZ (상부 패널) 또는 (B) 모기 생성된, 무균성, 정제된, 저온보존된 Pf SPZ (하부 패널)로의 감염 후 HC-04 세포에서 6일 간 단계의 공초점 현미경 사진.
정의
기생충 발달에 관련하여 본원에서 사용된 "생체 외"는 무상 숙주 유기체 (또한 전체 숙주 유기체로서도 언급됨)와 무관하고 그것의 외부에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 인간 숙주 범위의 플라스모디움 기생충의 생체 외 발달은 살아있는 동물 숙주, 예컨대 모기의 외부에서 모기와 무관한 발달 단계를 통해 진보하는 기생충을 배양하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된, "기르는 (rearing)" 또는 "길러진"은 플라스모디움 성장 및 발달의 질서정연하고 개체 발생적인 진전을 촉진하고 지지하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, "포자 생식" (또는 포자 생식 발달)은 생식 모세포로부터 종충으로의 특징적인 유성 단계들을 통한 플라스모디움 발달의 질서정연하고 개체 발생적인 진전을 의미한다.
본원에서 사용된 "인간 숙주 범위의 플라스모디움 종" (인간 숙주 범위 플라스모디움 종들, 인간 숙주 범위의 플라스모디움 기생충 및 인간 숙주 범위 플라스모디움 기생충들과 상호교환적으로 사용됨)은 다음 종들의 플라스모디움을 포함한다: 플라스모디움 팔시파룸, 플라스모디움 비박스, 플라스모디움 오발레, 플라스모디움 말라리아에 및 플라스모디움 노울레시.
본원에서 사용된, "배양물"은 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 기생충들의 맥락에서, 배지 및 인간 숙주 범위의 플라스모디움 기생충들을 포함하는 살아있는 동물 숙주 (예컨대 모기)의 외부의 시스템을 의미한다. 특정 구체예에서, 배양물은 추가로 기질을 포함한다.
본원에서 사용된 "기질"은 성장 표면을 의미한다. 일부 구체예에서, 기질은 예컨대 폴리스티렌 매트릭스 및/또는 마트리겔을 포함하는 세포 배양 매트릭스를 포함한다 [27, 28].
본원에서 사용된 "배지"는 영양분 조성물을 의미한다. 특정 구체예에서, 배지는 편모 방출 배지로, 생식 모세포로부터 생식 세포의 출현을 용이하게 하며, 그런 다음 예컨대 혈액 흡입 (blood meal) 후 모기 루멘 조건을 모방함으로써 접합자로의 수정을 진행한다. 특정 구체예에서, 배지는 단상 접합자 배지로, 접합자의 단상 접합자로의 분화를 용이하게 한다. 특정 구체예에서, 배지는 낭포체 배지로, 종충 단계로의 생체 외 포자 생식을 위한 영양분을 제공한다.
본원에서 사용된, "인간 약학적 용도에 적합한"은 인간에서 승인된 임상 용도에 대해 충분한, 예를 들면 FDA 또는 USP 표준에 따라 허용 가능한 양, 멸균성 (무균성) 및 순도를 가지는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 "무균성"은 박테리아, 진균, 병리학적 바이러스 등과 같은 검출 가능한 미생물 오염물의 도입 또는 존재가 없는 것을 의미한다. 종충 제조의 무균 방법은 종충의 멸균 - 어떠한 다른 유형의 미생물 또는 감염성 병원체가 없는 - 제조를 초래한다. 멸균 조성물의 무균 제조는 임상 및 약학적 용도에 필요하다. 무균 방법론을 모니터링하기 위해 사용된 미생물 분석은 오염물의 존재 또는 부재를 평가한다. 그것들은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 미생물 한계 시험, 현행 USP <61> 및 멸균성 시험, 현행 USP <71> (본원에 참조로 포함됨)을 포함한다.
본원에서 사용된 "수반되는 물질"은 종충의 배양 또는 제조 중의 물질을 나타내며, 그것은 배지 또는 배지의 성분, 또는 담체 또는 부형제가 아니고, 종충 자체에 특이적이지 않다. 특정 구체예에서, 수반되는 물질은 예컨대 생물학적 파편을 포함한다. 일부 구체예에서 수반되는 물질은 종충이 제조되는 수단의 결과이다.
본원에서 사용되는 "수반되는 모기 물질"은 모기로부터 유도되고 모기에 특이적인 생물학적 물질 또는 파편이다.
본원에서 사용되는 "보호 면역을 부여하는"은 병원체 (예컨대 플라스모디움 팔시파룸)에 의해 유발된 질환 (예컨대 말라리아)에 대해 보호적인 면역 반응을 생성하는 능력을 집단 또는 숙주 (즉 개체)에 제공하여서 도전시, 숙주에서 질환의 임상적 징후, 병리학 또는 증상들이 미-처리 숙주에 비교하여 감소되거나, 또는 집단 내에서 나타나는 감염률 또는 질환의 임상적 징후, 병리학 또는 증상들이 미-처리 집단에 비교하여 감소되는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "면역 반응"은 플라스모디움-특이적 항원의 맥락에서, 일반적으로, 그것에 한정되는 것은 아니지만 항체 및/또는 세포 면역 반응의 생성을 특징으로 하는 종충의 도입에 대한 수용체의 반응을 의미한다. 일반적으로, 면역 반응은 플라스모디움-종 에피토프에 특이적인 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 유도 또는 활성화, 플라스모디움-특이적 항체들의 증가된 생성의 체액 반응 또는 세포 및 체액 반응 둘 다와 같은 세포 반응일 수 있다. 말라리아 백신과 관련하여, 종충을 포함한 백신에 의해 수립된 면역 반응은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 세포외 종충 또는 기생충이 숙주 세포, 특히 간세포 및 단핵 세포, 예컨대 수지상 세포에 들어간 후 기생충의 다른 단계에 의해 발현된 단백질들 및/또는 상기 기생충의 성분들에 대한 반응을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 면역 반응은 종충-특이적 항원에 대한 측정 가능한 항체 및/또는 세포 반응이다. 다른 구체예에서, 감염성 유기체에 의한 후속적인 도전시, 면역 반응은 질환을 유발하는 적혈구 단계에 대한 병원성 기생충의 발달을 방지한다.
본원에서 사용되는 "백신"은 면역원성 제제 및 부형제, 보조제 및/또는 첨가제 또는 보호제와 잠재적으로 조합된 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 제제이다. 면역원은 전체 감염성 제제 또는 감염성 제제의 분자 하위세트 (감염성 제제에 의해 합성적으로 또는 재조합적으로 제조됨)로 구성될 수 있다. 백신이 대상에게 투여될 때, 면역원은 감염성 제제로의 후속적인 도전시, 그 대상을 질병으로부터 보호하거나 그 제제에 의해 유발된 병리학, 증상들 또는 임상적 징후들을 완화시킬 면역 반응을 자극한다. 치료용 (치료) 백신은 감염 후 제공되며 질환 진전을 감소시키거나 정지시키기 위한 것이다. 방지용 (예방) 백신은 초기 감염을 방지하거나 감염의 속도 또는 부담을 감소시키기 위한 것이다. 말라리아와 같은 기생충 질환에 대한 백신에 사용된 제제들은 전체-사멸된 (비활성) 기생충, 살아있는 기생충, 생명-감쇄된 기생충 (생명 주기를 통해 완전하게 진행될 수 없음) 또는 기생충과 관련된 정제된 또는 인공적으로 제조된 분자 - 예컨대 재조합 단백질, 합성 펩티드, DNA 플라스미드, 및 플라스모디움 단백질들을 발현하는 재조합 바이러스 또는 박테리아일 수 있다. 백신은 기술분야의 당업자들에 의해 쉽게 인지되는 것과 같이, 종충과 함께 다른 성분들, 예컨대 부형제, 희석제, 담체, 보존제, 보조제 또는 다른 면역 증강제, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "감쇄"는 플라스모디움 기생충과 같은 유기체의 유전자 변경 또는 돌연변이로 정상적인 생명 주기를 완성하는 능력은 소실되지만 특정 발달 단계에서 정지되는 것을 의미한다. 본 발명의 플라스모디움 유기체에서, 방사선 감쇄된 또는 유전학적으로 감쇄된 기생충 (GAP)의 하나 이상의 유전자의 기능이 파괴되어서 감쇄된 돌연변이는 숙주를 감염시키고 간 내에서 간세포에 침입하는 능력은 보유하지만 간-단계에서 발달이 정지된다.
본원에서 사용되는 "간세포 침입"은 종충-단계의 플라스모디움 기생충의 특별한 표적 세포, 이 경우 숙주 간세포, 즉 배양 중의 간세포 [24, 25] 또는 숙주의 순환계 안으로의 초기 도입 후 생체 내에서의 간세포를 찾아내고 그 안에 들어가는 능력을 나타낸다. 그런 다음 비-감쇄 기생충은 추가의 단계-특이적 발달을 진행할 것이다.
본원에서 사용되는 "대사적으로 활성"은 살아있는 상태를 의미하고 생명을 유지하는 기능 및 일부의 생명-주기 과정을 수행할 수 있다. 감쇄된 종충과 관련하여, 이것은 간 내에서 분할하여 일부 발달 단계를 통해 진전할 수 있는 제한된 능력 및 단계-특이적 단백질의 드 노보 발현을 잠재적으로 가지는, 배양 중 및 생체 내 간세포를 침입할 수 있는 종충을 포함하며, 그것에 한정되지 않는다.
생체 외 종충
생체 외-길러진 살아있는, 감염성 종충, 특히 플라스모디움 종충 - 감쇄된 종충뿐 아니라 병원성 종충의 조성물이 개시된다. 특정 구체예에서, 출원은 생식 모세포 단계로부터 종충 단계로의 포자 생식이 모기 외부에서 일어나는 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충의 배양에 관련된다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충은 어떠한 수반되는 모기 물질이 없다. 특정 구체예에서, 생식 모세포 단계로부터 종충 단계로의 포자 생식은 모기 외부에서 발생하였다.
일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 모기에서 길러진 인간 숙주 범위의 플라스모디움 종충의 적어도 70%, 80% 또는 90%만큼 인간 간세포에 감염성이다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 모기에서 길러진 인간 숙주 범위의 플라스모디움 종충의 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%만큼 인간 간세포에 감염성이다. 일부 구체예에서, 감염성은 생체 외에서 또는 생체 내에서 측정된다.
일부 구체예에서, 감염성은 생체 외 Pf SPZ의 HC-04 (1F9) 세포 (인간 간 셀라인)를 감염시키고 [24, 25] PfMSP-1을 발현하는 후기 간 단계 기생충으로 발달하는 [15] 능력을 측정하기 위해 사용된 생체 외 Pf 6-일 간세포 효능 분석을 사용하여 측정된다. 그런 방법의 실례는 다음을 포함할 수 있다:
a. 세포 배양 및 ELC -코팅된 Lab- Tek 슬라이드의 시딩. 8개의 웰 Permanox Lab-Tek 챔버 슬라이드를 ECL 세포 부착 매트릭스로 1 내지 2시간 동안 37 ± 2℃에서 코팅한다. HC-04 (1F9) 세포를 완전 DMEM/F-12 배지 (CM)로 희석하여 4 x 104 생존 세포를 웰당 0.3 mL에 시딩한다. 그것을 세척하고 24 ± 4시간 동안 37 ± 2b℃에서 및 5 ± 2% C02에서 인큐베이션한다;
b. 감염 및 웰당 첨가된 SPZ의 수의 계산: 생체 외-제조된 Pf 종충을 2분 동안 13,200 rpm (상대 원심력 16,100)에서 22 ± 2℃에서 고정각 회전기를 사용하여 원심분리한다. 상층액을 버리고 펠릿을 CM에 재현탁한다. Lab Tek 슬라이드의 각 웰로부터 배지를 흡인하고 버린다. 50 μL의 생체 외 SPZ 현탁액/웰을 3개 한 벌로 첨가한다. 감염시키는 종충 현탁액을 CM으로 1:10으로 희석하고 셀로미터 및 상 대비 현미경을 사용하여 종충의 수를 계수하고, 웰당 첨가된 SPZ의 수를 계산한다. 챔버 슬라이드를 37 ± 2℃ 및 5 ± 2% C02에서 3시간 ± 10분 동안 인큐베이션한다. 단층을 0.3 mL의 DMEM/F-12 완전 배지로, Pf SPZ로 대조 웰을 오염시키지 않도록 조심하면서, 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 각 웰로부터 종충을 함유한 과잉 배양 배지를 부드럽게 흡인하면서 3회 세척한다. 최종 세척 후에, 0.3 mL의 DMEM/F-12 완전 배지를 각 웰에 첨가한다;
c. 배양의 유지: 배양 배지는 매일 교환하여 간 단계의 성공적인 발달 및 배양의 유지를 보장한다. 챔버 슬라이드 배양물을 감염 후 6일 후에 빙-냉 메탄올로 고정시킨다. 그것을 4 ± 2℃에서 저장한다;
d. 간접 면역-형광 분석 ( IFA )을 위한 염색: 슬라이드로부터 PBS를 버린 후 2, 3방울의 영상 iT-FX 신호 증강제를 각 웰에 첨가하고 37 ± 2℃에서 30 ± 3분 동안 인큐베이션한다. 영상 증강제 용액을 버리고 배양물을 PBS로 3회 세척한다. 100 μL의 희석된 항-PfMSP-1 단클론성 마우스 항체를 3개 한 벌의 웰에 첨가하고, 37 ± 2℃에서 60 내지 70분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간이 끝날 때에, 항체 용액을 버리고 PBS로 세척한다. Alexa Fluor 488 항-마우스 IgG를 0.02% 에반스 블루를 포함한 PBS로 1:200으로 희석한다. 거기에 100 μL의 희석된 Alexa 488 항-마우스 IgG를 3개 한 벌의 웰에 첨가한다. 슬라이드를 37 ± 2℃에서 60 내지 70분 동안 인큐베이션한다. 벡타쉴드 마운팅 배지 DAPI를 사용하여 커버슬립을 고정시키고 2 내지 8℃에서, 빛으로부터 먼 곳에, 관찰시까지 저장한다; 및
e. Pf 간 단계의 평가 및 수 측정: 에피형광 (epifluorescence) 현미경을 400x 배율로 사용하여 항체 반응성을 보이는 Pf 간 단계/웰의 수를 평가하고 기록한다. 간 단계 기생충의 수를 모든 3개의 웰에서 계수하고 평균을 기록한다.
일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 무균성이다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 숙주 유기체, 예컨대 모기로부터의 수반된 물질로 오염될 위험이 감소되었다 (숙주 모기의 침샘으로부터 해부된종충을 사용한 경우에서와 같을 것임).
일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 인간 숙주 범위의 것이다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충의 종은 플라스모디움 팔시파룸이다.
일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 약학적 용도에 적합하다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 백신에 사용된다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 감쇄된다.
생체 외-길러진 Pf SPZ는 배양 중의 인간 간세포를 침입하고 간세포에서 발달하는 능력에 대해 시험된다. 생체 외-길러진 Pf SPZ는 또한 생체 내에서 Pf 생명 주기를 완성하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 이것은 인간 혈액으로 수혈된 인간 간 키메라 마우스를 사용함으로써 수행될 수 있다.
배양
특정 구체예에서, 출원은 인간 숙주 기원의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충의 배양에 관련되는데, 상기 기생충은 생체 외에서 포자 생식 발달이 진행 중이거나 진행되었다.
특정 구체예에서, 배양은 포자 생식 발달의 동등한 단계에서 인간 숙주 범위의 플라스모디움 기생충을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양은 인간 숙주 범위의 플라스모디움 기생충의 지속적인 포자 생식 발달을 유지할 수 있다.
특정 구체예에서, 기생충은 발달의 종충 단계에 도달하였다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 모기에서 길러진 동일 종의 플라스모디움 종충의 적어도 70%, 80% 또는 90%만큼 간세포에 감염성이다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 모기에서 길러진 동일 종의 플라스모디움 종충의 적어도 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%만큼 간세포에 감염성이다. 일부 구체예에서, 감염성은 HC-04 세포의 배양물에서 측정되고, 일부 구체예에서 감염성은 생체 내에서 간 감염에 의해 측정된다.
일부 구체예는 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충의 배양물에 관련되는데, 상기 배양물은 어떠한 수반되는 모기 물질이 없고 상기 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 인간 숙주 범위의, 및 모기에서 길러진 동일 종의 플라스모디움 종충의 적어도 70%, 80% 또는 90%만큼 인간 간세포에 감염성이다. 일부 구체예에서, 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 인간 숙주 범위의, 및 모기에서 길러진 동일 종의 플라스모디움 종충의 적어도 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%만큼 인간 간세포에 감염성이다.
일부 구체예에서, 배양물은 제 1 (편모 방출로서 언급됨) 배지를 포함하는데, 그것은 생식 모세포로부터 생식 세포의 출현을, 예컨대 혈액 흡입 후 모기 루멘 조건을 모방함으로써 용이하게 한다. 일부 구체예에서, 편모 방출 배지는 우태아 혈청 (FBS), 글루코오스, 중탄산 나트륨 및 젠튜레닉산을 포함한다. 일부 구체예에서, 편모 방출 배지는 10 내지 30%, 15 내지 25% 또는 18 내지 22%의 FBS를 포함한다. 일부 구체예에서, 편모 방출 배지는 0.05% 내지 0.5%, 0.075% 내지 0.5% 또는 0.075% 내지 0.25%의 글루코오스를 포함한다. 일부 구체예에서, 편모 방출 배지는 0.05% 내지 0.5%, 0.075% 내지 0.5% 또는 0.075% 내지 0.25%의 중탄산 나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 편모 방출 배지는 0.01% 내지 0.05%, 0.01% 내지 0.04% 또는 0.02% 내지 0.04%의 잰튜레닉산을 포함한다. 일부 구체예에서, 편모 방출 배지는 FBS, 0.05% 내지 0.5% 글루코오스 (예컨대 0.1%), 0.05% 내지 0.5% 중탄산 나트륨 (예컨대 0.1%) 및 0.01% 내지 0.05% 잰튜레닉산 (예컨대 0.022%)을 포함한다.
일부 구체예에서, 제 1 배지는 제거되고 배양물은 제 2 (단상 접합자로 언급됨) 배지를 포함하는데, 그것은 접합자의 단상 접합자로의 분화 및 단상 접합자의 3D 매트릭스 기질 안으로의 침입을 용이하게 한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 FBS, RPMI 및 트레할로오스를 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 10 내지 30%, 15 내지 25% 또는 18 내지 22%의 FBS를 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 0.1 % 내지 0.5%, 0.15% 내지 0.3% 또는 0.2% 내지 0.3%의 트레할로오스를 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 0.1% 내지 0.5%, 0.15% 내지 0.3% 또는 0.2% 내지 0.3%의 덱스트로오스를 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 0.01% 내지 0.08%, 0.02% 내지 0.06%, 0.03% 내지 0.05%의 중탄산 나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 추가로 항생물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 항생물질은 페니실린, 스트렙토마이신 또는 그것들의 조합물이다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 항생물질을 1 내지 50 유닛/mL, 1 내지 40 유닛/mL, 5 내지 30 유닛/mL 또는 10 내지 20 유닛/mL로 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 항생물질을 1 내지 50 μg/mL, 1 내지 40 μg/mL, 5 내지 30 μg/mL 또는 10 내지 20 μg/mL로 포함한다. 일부 구체예에서, 단상 접합자 배지는 10 내지 30%의 FBS (예컨대 20%), 0.1% 내지 0.5%의 트레할로오스 (예컨대 0.25%), 0.1% 내지 0.5%의 덱스트로오스 (예컨대 0.25%), 0.01% 내지 0.08%의 중탄산 나트륨 (예컨대 0.04%), 1 내지 50 유닛/mL의 페니실린 (예컨대 10 유닛/mL) 및 1 내지 50 μg/mL의 스트렙토마이신 (예컨대 10 μg/mL)을 포함하는 RPMI 배지를 포함한다.
일부 구체예에서, 제 2 배지는 제거되고 배양물은 제 3 (낭포체로서 언급됨) 배지를 포함하는데, 그것은 플라스모디움 기생충의 종충 단계로의 생체 외 포자 생식을 위한 영양분을 제공한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 슈나이더 초파리 배지 [26], FBS, 중탄산 나트륨, 트레할로오스, 하이포크산틴, HEPES, 필수 아미노산, 파라-아미노벤조산 (PABA), 항생물질 (예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신), 리포단백질, 콜레스테롤 및 비타민을 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 10 내지 30%, 15 내지 25% 또는 18 내지 22%의 FBS를 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 0.01% 내지 0.08%, 0.02% 내지 0.06%, 0.03% 내지 0.05%의 중탄산 나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 0.1% 내지 0.5%, 0.15% 내지 0.3% 또는 0.2% 내지 0.3%의 트레할로오스를 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 10 내지 100 μg/mL, 20 내지 100 μg/mL, 25 내지 75 μg/mL 또는 40 내지 60 μg/mL의 하이포크산틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 0.05M 내지 0.25M, 0.075M 내지 0.2M 또는 0.075M 내지 1.5M의 HEPES를 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 0.01% 내지 0.08%, 0.02% 내지 0.06%, 0.03% 내지 0.05%의 PABA를 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 추가로 항생물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 항생물질은 페니실린, 스트렙토마이신 또는 그것들의 조합물이다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 항생물질을 1 내지 50 단위/mL, 1 내지 40 단위/mL, 5 내지 30 단위/mL 또는 10 내지 20 단위/mL로 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 항생물질을 1 내지 50 μg/mL, 1 내지 40 μg/mL, 5 내지 30 μg/mL 또는 10 내지 20 μg/mL로 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 0.05% 내지 0.5%, 0.075% 내지 0.5% 또는 0.075% 내지 0.25%의 리포단백질을 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 0.05% 내지 0.5%, 0.075% 내지 0.5% 또는 0.075% 내지 0.25%의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구체예에서, 낭포체 배지는 슈나이더 초파리 배지, 10 내지 30%의 FBS (예컨대 20%), 0.01% 내지 0.08%의 중탄산 나트륨 (예컨대 0.04%), 0.1% 내지 0.5%의 트레할로오스 (예컨대 0.25%), 10 내지 100 μg/mL의 하이포크산틴 (예컨대 50 μg/mL), 0.05M 내지 0.25M의 HEPES (예컨대 0.1M), 필수 아미노산 (예컨대 l x, GIBCO), 0.01% 내지 0.08%의 파라-아미노벤조산 (PABA, 예컨대 0.04 μg/mL), 1 내지 50 단위/mL의 페니실린 (예컨대 10 단위/mL) 및 1 내지 50 μg/mL의 스트렙토마이신 (예컨대 10 μg/mL), 0.05% 내지 0.5%의 리포단백질 (예컨대 1.5%), 0.05% 내지 0.5%의 콜레스테롤 (예컨대 0.1%) 및 비타민 (예컨대 l x, GIBCO)을 포함한다.
일부 구체예에서, 배양 기질은 3D 배양 매트릭스를 포함한다. 일부 구체예에서, 3D 배양 매트릭스는 초파리 슈나이더 S2 세포로 사전-시딩된다 [26]. 일부 구체예에서, 배양 매트릭스는 마트리겔로 코팅된 폴리스티렌 매트릭스 (예컨대 AMS Biotechnology Ltd, UK)를 포함한다 [27, 28]. 예를 들어, 폴리스티렌 매트릭스는 1 mg/mL의 마트리겔을 폴리스티렌의 상부에 조심스럽게 놓은 후 이어서 37℃에서 인큐베이션함으로써 마트리겔로 코팅될 수 있다. 일부 구체예에서, 배양 매트릭스는 폴리스티렌 매트릭스, 마트리겔 및 초파리 슈나이더 S2 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 매트릭스는 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 라미닌, 콜라겐 또는 그것들의 조합물로 코팅된다.
일부 구체예에서, 배양물은 무균성이다. 일부 구체예에서, 배양물로부터 유도된 종충은 약학적 용도에 적합하다.
플라스모디움 기생충의 배양 방법
플라스모디움 기생충의 배양 방법 및/또는 생체 외-길러진 살아있는, 감염성 플라스모디움 종충의 배양 방법 및 생체 외-길러진 감쇄된 플라스모디움 종충의 배양 방법 및/또는 조성물의 제조 방법이 개시된다.
특정 구체예에서, 출원은 다음을 포함하는, 상기 기생충의 포자 생식 발달 동안 생체 외에서 인간 숙주 범위의 플라스모디움 기생충의 배양 방법에 관련된다:
a. 편모 방출 배양 배지에서 적혈구의 존재하에 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포를 배양하는 단계,
b. 렉틴을 사용하여 적혈구들을 접합시키는 단계,
c. 접합자, 생식 세포, 생식 모세포 및 접합된 세포들을 포함하는 혼합물을 수집하는 단계 (일부 구체예에서 이것은 원심분리 및 펠릿의 수집에 의해 이루어진다),
d. 상기 혼합물을 매트릭스를 포함하는 기질 상에서 및 단상 접합자 배지에서 배양하는 단계로, 이때 상기 기생충은 단상 접합자로 분화하고 상기 단상 접합자는 상기 매트릭스로 들어가서 낭포체 단계로 분화하는 단계,
e. 상기 단상 접합자 배지를 낭포체 배양 배지로 교체하는 단계, 및
f. 그로써 생성된 플라스모디움 종충-단계 기생충을 수확하는 단계.
예를 들어, 배양 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 편모 방출 배지에 단계 V 생식 모세포를 현탁시키는 단계 (1시간) (이 단계에서 암수의 생식 세포가 미소 및 대생식 모세포로부터 출현하고 상호작용 (수정)하여 생식 세포가 형성된다); (b) 적혈구를 렉틴, 예컨대 밀로부터 정제된 렉틴인 맥아 아글루티닌의 첨가에 의해 접합시키는 단계 (1시간); (c) 배양 현탁액을 원심분리하여 접합자, 적혈구 파편 및 분화를 진행하지 않은 어떠한 생식 모세포 및 생식 세포를 함유하는 펠릿을 수집하는 단계; (d) 펠릿을 단상 접합자 배지에 현탁시키고 초파리 슈나이더 S2 세포로 사전-시딩된 3D 세포 배양 매트릭스 위에 시딩하는 단계 [26]. 3D 배양 매트릭스는 마트리겔을 사용하여 [27, 28] 8-웰 배양 플레이트에서 또는 다른 조직 배양 바이알 또는 트랜스웰 배양 삽입에서 발달되었다. 그런 다음 발달된 단상 접합자는, 그것들이 운동성이기 때문에 (운동성이 없는 생식 모세포, 생식 세포 및 접합자와 달리) 매트릭스 안으로 다음 20 내지 24시간에 침입하는 단계; (e) 20 내지 24시간 후에, 트랜스 웰 삽입 또는 8-웰 배양 플레이트를 세척하여 매트릭스 안으로 침입되지 않은 어떠한 단상 접합자뿐 아니라, 남아 있는 생식 모세포, 생식 세포 및 접합자 (단상 접합자로 발달되지 않음)를 제거하고, 배양 배지를 낭포체 배지로 교체하는 단계. 매트릭스에 있는 단상 접합자는 침입 후 12 내지 24시간 내에 낭포체로 변형된다; (f) 낭포체 배지를 2 내지 3일마다 1회 교환하는 단계; (g) 7, 8 및 11일 낭포체를 배양 개시 후 7, 8 및 11일에 측정하는 단계; (h) SPZ를 배양 개시 후 15, 18 및 21일에 8-웰 또는 트랜스 웰 배양 플레이트로부터 배지를 수집한 후 적정함으로써 배지로부터 수확하는 단계. PfSPZ는 셀로미터를 사용하여 계수되고; 수확된 SPZ는 그런 다음 6-일 간세포 효능 분석을 사용하여 효능을 측정하기 위해 HC-04 세포에 시딩될 수 있다.
특정 구체예에서, 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포는 예컨대 Trager W, and Jensen JB. Science 193:673-675, 1976 (본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것과 같이, 적색 혈구 (적혈구)에서 인간 숙주 범위 플라스모디움의 배양물로부터 유도된다.
플라스모디움 낭포체의 증가된 제조 방법
특정 구체예에서, 출원은 모기에서 동등한 수의 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포로부터 발달되고 동일 종의 낭포체에 비교하여 플라스모디움 낭포체의 제조를 증가시키는 생체 외 방법에 관한 것으로, 그 방법은:
a. 편모 방출 배양 배지에서 적혈구의 존재하에 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포를 배양하는 단계,
b. 렉틴을 사용하여 상기 적혈구들을 접합시키는 단계,
c. 접합자, 생식 세포, 생식 모세포 및 접합된 세포들을 포함하는 혼합물을 수집하는 단계 (일부 구체예에서 이것은 원심분리 및 펠릿의 수집에 의해 이루어진다),
d. 상기 혼합물을 매트릭스를 포함하는 기질 상에서 및 단상 접합자 배지에서 배양하는 단계로, 이때 상기 기생충은 단상 접합자로 분화하고 상기 단상 접합자는 상기 매트릭스로 들어가서 낭포체 단계로 분화하는 단계,
e. 상기 단상 접합자 배지를 낭포체 배양 배지로 교체하는 단계,
f. 40 내지 80시간 (바람직하게는 48 내지 72시간) 마다 낭포체 배지를 S2 세포를 함유하는 낭포체 배지로 교체함으로써 계속해서 기생충을 배양하는 단계 (S2 세포는 배지 교환 중에 세포의 손실을 보충하기 위하여 첨가됨), 및
g. 인간 숙주 범위의 낭포체 단계 플라스모디움 기생충을 정량하는 단계를 포함하고;
h. 상기 방법은 모기에서 동등한 수의 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포로부터 발달된 동일 종의 낭포체에 비교하여 생체 외에서 발달된 더 많은 인간 숙주 범위의 플라스모디움 낭포체를 생성한다.
특정 구체예에서, 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포는 예컨대 Trager (1976)에서 개시된 것과 같이, 적색 혈구 (적혈구)에서 인간 숙주 범위 플라스모디움의 배양물로부터 유도된다.
일부 구체예에서, 단계 V 생식 모세포의 단상 접합자로의 생체 외 변형의 효율은 1 내지 25%, 5 내지 25%, 5 내지 21% 또는 8 내지 21%의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 단계 V 생식 모세포의 7, 8 또는 11일 낭포체로의 변형의 효율은 1 내지 15%, 2 내지 14%, 2 내지 25% 또는 2.4 내지 12.5%의 범위 내에 있다.
일부 구체예에서, 모기에서 동등한 수의 단계 V 생식 모세포로부터 발달된 낭포체에 비교하여 적어도 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 39 또는 10 내지 60-배 더 많은 낭포체가 생체 외에서 발달한다. 일부 구체예에서, 모기에서 동등한 수의 단계 V 생식 모세포로부터 발달된 낭포체에 비교하여 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 39 또는 10 내지 60-배 더 많은 낭포체가 생체 외에서 발달한다.
사용 방법
말라리아를 방지하기 위한 백신에서 면역원으로서 생체 외-길러진 플라스모디움 종충 및 감쇄된 생체 외-길러진 플라스모디움 종충 (예를 들면 U.S. 7,229,627; USSN 61/783,326 (둘 다 본원에 참조로 포함됨) 참조)의 사용 방법들이 개시된다. 또한, 항말라리아 약물 및 백신의 효력을 평가하기에 유용한, 및 보호 면역을 부여하기 위한 백신 치료계획에 유용한, 플라스모디움 감염의 무성 적혈구 단계를 표적으로 하는 항말라리아제, 특히 클로로퀸과 같은 항말라리아제와 조합된 생체 외-길러진 병원성 기생충의 사용 방법들이 개시된다.
특정 구체예에서, 출원의 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 백신 조성물에 사용된다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 감쇄된다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 감쇄되지 않는다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 감쇄되지 않고 항말라리아제, 예컨대 클로로퀸과 함께 사용된다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 인간 대상에서 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 해당하는 플라스모디움 종충에 대한 면역 반응을 생성하고, 일부 구체예에서, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충은 인간 대상에게 보호 면역을 제공한다.
실시예
실시예 1
생체 외에서 대다수의 플라스모디움 팔시파룸 낭포체를 재생적으로 제조하고 정제하기 위한 최적화된 방법
상이한 시기 (age)의 생식 모세포 배양물로부터의, 및 높은 및 낮은 생식 모세포 밀도에서 단상 접합자 생성을 평가하였다. 단상 접합자 및 후기 레토르트를 생식 모세포 유도 후 14 내지 22일의 높은- 및 낮은-밀도 배양물 (표 1) 둘 다로부터 재생적으로 제조하였다 (도 2A 및 2B). 레토르트는 접합자로부터 단상 접합자로의 발달 중의 기생충의 중간 형태이고 단상 접합자 및 후기 레토르트 (도 2A 및 2B)는 둘 다 모기에서 낭포체로 변형한다. 기생충을 유도 후 18일 생식 모세포 배양물로부터 취하였다. 초기 레토르트 (도 2A)는 단상 접합자 배양의 개시 후 처음 ~14시간에 볼 수 있었고 단상 접합자는 24시간으로부터 볼 수 있었다. 광 현미경에 의해 조사한 김자-염색된 도말 표본은 배양물에서의 둥근 대생식세포 및 접합자, 뿐만 아니라 반월형 생식 모세포 및 단상 접합자의 혼합물을 나타냈다. 접합자는 중요한 핵의 존재에 의해 대생식세포와 구별되었다. 단상 접합자는 중요한 핵의 존재 및 주변의 적혈구 막의 결핍에 의해 생식 모세포와 구별되었다. 두 가지 다른 접근법을 사용하여 변환의 견적 및 정제율을 제공하였다. 먼저, 기생충의 상이한 단계에서 발현된 분자에 대해 지시된 단클론성 항체 (mAb)를 스크리닝하였다: Pfs 48/45는 성숙한 대생식 모세포 및 대생식세포 상에서 발현되었고, Pfs 230은 대생식세포 및 접합자 상에서 발현되었으며, PFs25는 생식세포 및 단상 접합자 상에서 발현되었고, PfCelTOS는 단상 접합자 및 PfSPZ 상에서 발현되었다 (데이터는 제시하지 않음). Pfs230은 생식 모세포 및 대생식세포 상에 위치한 한편, Pfs48/45는 생식세포 및 레토르트에 위치하였다. Pfs25는 생식 모세포에 가변적으로 위치하였지만, 레토르트 및 단상 접합자 상에서 강력하게 발현되었다. 배양된 기생충들을 Pfs25에 대한 항체 (흰색 화살표는 녹색 염색을 가리킴) 및 적혈구 항원, 글리코포린 A (삼각형 화살표는 적색 염색을 가리킴)로 표지함으로써 (도 3A 및 3B), 생식 모세포를 각각 적혈구 막의 존재 또는 부재를 기반으로 단상 접합자와 구별시켰다.
미감염 적혈구로부터 배양된 단상 접합자를 정제하고 풍부화하기 위하여 여러 접근법을 택하였다. 대략 90%의 미감염 적혈구는 림포라이트-H 구배 원심분리를 사용하여 제거할 수 있었지만, 단상 접합자는 생식 모세포, 생식세포 및 접합자들과 함께 공동-정제되었다. 정제 및 풍부화를 위해 3-단계 과정을 개발하였다. 이 과정은 성공적이었고 70%보다 큰 풍부화를 이루었다. 생체 외에서 단계 V 생식 모세포의 단상 접합자로의 변형의 평균 효율은 13% 였다 (범위 = 8 내지 21%, 표 1).
플라스모디움 팔시파룸 생체 외 단상 접합자 배양의 요약. 2.1% 내지 4.6%의 단계 V 생식 모세포 및 생식 모세포 유도 후 14일 내지 22일 후의 단계 V 생식 모세포를 가진 생식 모세포 배양을 사용하여 생체 외에서 단상 접합자를 제조하였다. 단계 V 생식 모세포의 총 수의 8.0% 내지 21.0% 범위의 단상 접합자를 배양물에 첨가하였다.
총 수 생식 모세포의 단상 접합자 및 후기 레토르트로의 변형 효율
실험 번호 단계 V 생식 모세포 단상 접합자 및
후기 레토르트
1 8.25 x 107 1.06 x 107 13%
2 8.94 x 107 9.72 x 106 11%
3 7.29 x 107 5.85 x 106 8%
4 7.61 x 107 1.63 x 107 21%
5 1.03 x 108 8.54 x 106 8%
6 1.02 x 108 1.80 x 107 18%
평균 13%
실시예 2
단상 접합자로부터 플라스모디움 팔시파룸 종충의 생체 외 제조
제 1 단계는 낭포체를 효과적으로 제조하는 것이었다. 간단하게 설명하면, 생체 외 배양물로부터의 단계 V 생식 모세포를 편모 방출 배지 (FBS, 0.1 % 글루코오스, 0.1% 중탄산 나트륨 및 0.022% 잰튜레닉산)에 옮기고, 인큐베이션한 후에 접합자를 변형된 단상 접합자 배지 (20% FBS, RPMI 배지, 0.25% 트레할로오스, 0.25% 덱스트로오스, 0.04% 중탄산 나트륨, 10 단위/mL 페니실린 및 10 μg/mL 스트렙토마이신)에 옮긴 후, 변형 마트리겔-코팅된 8-웰 슬라이드 위에 놓았다. 8-웰 슬라이드를 코팅하기 위하여, 마트리겔을 RPMI 배지로 희석하고 8-웰 슬라이드에 부었다. 이들 슬라이드를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 과잉 배지를 제거하였다. 마트리겔 코팅된 슬라이드를, 접합자를 놓기 전에 마트리겔의 상부에 초파리 슈나이더 S2 세포를 시딩함으로써 추가로 변형시켰다. 분화된 단상 접합자는 마트리겔 안으로 침입하였다. 마트리겔 안으로 침입하지 않은 미분화된 접합자 및 단상 접합자를 24시간 인큐베이션 후에 단상 접합자 배지로부터 낭포체 배지 (슈나이더 초파리 배지, 20% FBS, 0.04% 중탄산 나트륨, 0.25% 트레할로오스, 50 μg/mL 하이포크산틴, 0.1M HEPES, 필수 아미노산 (1 x, GIBCO), 0.04 μg/mL 파라-아미노벤조산 (PABA), 10 단위/mL 페니실린 및 10 μg/mL 스트렙토마이신, 1.5% 리포단백질, 0.1% 콜레스테롤 및 비타민 (1 x, GIBCO))로 교환하는 도중에 세척으로 제거하였다. 단상 접합자 및 낭포체 배지 둘 다에서 S2 세포를 첨가하였다 (도 4). 항-Pfs25 및 항-PfCSP mAb를 사용한 IFA에 의해 검출된 3-일 (도 4, 상부 패널) 및 8-일 (도 4, 하부 패널) 낭포체를 나타낸다. 8-일 배양물은 IFA에 대해 투과되었다. 8-일 낭포체에서 반점 염색은 발아하는 PfSPZ를 시사하였다. 중간 패널 (도 4)에서 화살표는 배양 중에 발달하는 7 내지 8-일 낭포체를 나타낸다. 초기 실험 후, 배양 조건, 예컨대 코팅에 사용된 마트리겔의 농도 및 각 웰에 시딩된 접합자 수를 단계 V 생식 모세포로부터 8일 낭포체로의 발달의 변형 효율을 유의미하게 증가시키기 위하여 변경하였다. 이 변경된 생체 외 배양 프로토콜을 사용하여, 단계 V 생식 모세포로부터 8일 낭포체로의 2.4 내지 12.5% (평균 8.3%)의 변형이 일관되게 이루어졌다 (표 2). 이것은 생체 외 배양 프로토콜의 변경 전 초기에 기록된 0.13%에 대해 주요한 개선이었다. 모기에서 단계 V 생식 모세포로부터 낭포체로의 변형 효율은 사나리아에서 수행한 74개의 독립적인 막 공급 분석 (membrane feeding assay)에서 0.22%였다 (Li et al. in prep.). 이런 변형 효율은 문헌에 기록된 것과 비교할만 하였다 [22, 23]. 생체 외에서 8.3%의 변형 효율은 모기에서 관찰된 것보다 39-배 더 높았다 (표 2, 3). 생체 외에서 (도 4, 5A, 8A 내지 8C) 및 모기에서 (도 5B) 발달하는 낭포체의 크기 및 구조는 유사하였다. 도 5A는 항-PfCSP mAb로 염색된 생체 외-배양된 7-일 낭포체의 IFA 및 머큐로크롬 염색된 모기 중장 7-일 낭포체 (도 5B)를 도시한다.
생체 외 배양물을 15일 및/또는 18일에, 미부착 S2 세포를 포함하는 웰로부터 배양 상층액을 수집함으로써 수확하였다. 형태학적으로 발달된 PfSPZ의 수를 셀로미터에서 계수하고 확인을 위해 부분표본을 형광 항-PfCSP mAb를 사용하여 염색하였다 (도 6B, 표 4). 배양 웰에서 발달된 Pf SPZ를 형광 항-Pf CSP mAb를 사용한 웰 염색의 고정 후에 검출하였다 (도 6A). 7개의 독립적인 실험에서, 10개의 8-웰 슬라이드로부터 수확당 180,000 내지 350,000의 성숙한 Pf SPZ가 생성되었다. 모든 실험에서, Pf SPZ의 형태학적으로 상이한 두 가지 형태가 존재하였다. 침샘 Pf SPZ와 동일하게 보인 형태학적으로 성숙한 Pf SPZ는 이동성이었고, 10 내지 13 μm 길이였으며, 항-Pf CSP mAb에 대해 고도로 반응성이었다 (도 6A 및 6B, 표 4). 짧은 형태이고, 미성숙한 Pf SPZ는 10 μm보다 짧은 길이였지만, 여전히 이동성이었고 항-Pf CSP mAb에 대해 고도로 반응성이었다. 기록된 모든 실험에서, 형태학적으로 성숙한 Pf SPZ만을 정량하였다. 동일한 배양물로부터 15일 및 18일 두 날 모두에 수확하는 것은 수율을 10개의 슬라이드당 ~500,000 PfSPZ로 증가시켰다.
계속해서, 3D 트랜스웰 시스템을 시험하였다. 이 접근법을 사용한 두 개의 독립적인 배양 실험에서, 하나의 6-웰 플레이트 배양물로부터 228,000 및 208,000의 형태학적으로 성숙한 Pf SPZ를 수확하였다. 초기에, 낭포체의 생체 외 배양에 적합한 것으로 밝혀진 두 개의 상업적으로 입수 가능한 3D 매트릭스를 사용하였다. 생체모방 3D 환경에서 세포를 배양하기 위해 3D Life 하이드로겔 (Cellendes GmbH, Germany)을 사용하고, AlgiMatrixTM 3D 배양 시스템 (Gibco/Invitrogen)은 3D 세포 배양을 용이하게 하는 동물 기원-유리 (free) 바이오스캐폴드 (bioscaffold)이다. 두 가지 모두 Pf 포자 생식을 지지한다. 3D Life 하이드로겔은 매트릭스로부터 Pf SPZ를 방출시키기 위하여 갈락토시다제 소화를 필요로 하였던 한편, 성숙한 Pf SPZ는 알기매트릭스 (Algimatrix) 매트릭스에 포획되었다. 그러므로, 본 발명자들은 대안으로서 Alvetex 3D 배양 기술 (AMS Biotechnology (Europe) Limited, UK)과 함께 트랜스웰 삽입 기반 배양 시스템을 개발하였다. 트랜스웰 삽입은 일단 플레이트 웰에 삽입된 후에는 2-구획 배양을 가능하게 하였다 (도 7). 이 시스템에서, 마트리겔로 코팅된 200 μm 두께의 비활성 다공성 폴리스티렌 스캐폴드를 삽입의 다공성 막 위에 배치하였다. 이 3D 매트릭스상에 시딩된 접합자들은 단상 접합자로 분화하였고, 마트리겔 코팅된 폴리스티렌 스캐폴드를 침입하였으며 낭포체로 변형하였다. 상부 구획은 S2 세포로 시딩하였다. 낭포체는 이 매트릭스에서 발달하였고 PfSPZ는 하부 구획으로 방출되었고 그곳으로부터 수집하였다. 예비 실험에서, 이 시스템은 Pf 포자 생식 발달을 지지하였고 (표 5), 낭포체 발달 및 보유는 챔버 슬라이드 배양과 매우 유사하였다 (표 2, 3). 포자 생식 발달을 평가하기 위하여, 매트릭스와 함께 다공성 막을 제거하였고 낭포체를 원심분리에 의해 수집하였다. 단계 V 생식 모세포로부터 7- 및 11-일 낭포체로의 변형 효율 (도 8A 내지 8C)은 각각 10.3% (범위 9 내지 11.5) 및 9.0% (범위 7.8 내지 10.7)였다 (표 5). 11-일 낭포체의 수는 대단한 증가를 나타냈고, 배양물 중의 낭포체의 유의미한 보유를 가리켰다. 나아가, 추출된 낭포체는 외관상 11일에 모기 중장에서 발달된 낭포체와 유사하였고, 이들 생체 외 형성된 낭포체는 PfCSP를 발현하였다 (도 8C). 도 8A 및 8B는 정량에 사용된 셀로미터에서 낭포체의 상 대비 영상을 도시하고 (도 8A 및 8B), 형광 표지된 항-Pf CSP mAb를 사용한 현탁액 (투과되지 않음) 중의 추출된 낭포체의 IFA가 도시된다 (도 8C). 낭포체의 염색은 투과 없이 현탁액에서 수행되었고, 그러므로 PfCSP-염색된 낭포체는 반점 패턴보다는 균일한 PfCSP 발현을 나타냈다 (도 8C).
두 개의 독립적인 배양 실험에서, 6개의 변형된 삽입을 사용한 하나의 6-웰 플레이트 배양물로부터 228,000 및 208,000의 형태학적으로 발달된 PfSPZ를 수확하였다. 이것은 8-웰 슬라이드로 이룬 수에 비교하여 수율에 있어서 최소 3-배 증가한 것이었다 (표 4, 5). 특히, 표 4는 8-웰 배양의 결과를 나타내는 한편 표 5는 트랜스웰 배양의 결과를 나타낸다. 이 트랜스웰 삽입 배양 조건은 다음과 같은 여러 장점을 제공하였다: i) 배지 교환 중 마트리겔의 손실의 감소, ii) 단일 배양물로부터 PfSPZ의 허용된 반복적 수확, iii) 상이한 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 라미닌 및 콜라겐으로 매트릭스를 코팅할 수 있는 용이함 및 iv) 적합한 액체 취급 시스템을 사용하여 규모 확장 및 자동화에 대한 적합성.
이 결과는 이전 실험들에 비교하여 낭포체로부터 수확된 성숙한 Pf SPZ의 수의 최소한 3-배 증가를 나타낸다.
8-웰 챔버 슬라이드를 사용한 생체 외 배양물에서 생식 모세포의 3일 및 7 내지 8일 낭포체로의 변형 효율. 3일 및 8일 낭포체를 각각 항-Pfs25 및 항-PfCSP mAb를 사용하여 IFA에 의해 산정하였다. 3개 한 벌의 웰로부터의 낭포체를 계수하였고 기하학적 평균 낭포체/웰을 계산하였다. 변형 효율은 낭포체로 발달한 단계 V 생식 모세포의 백분율이었다. 각 실험에 대해 15,000 내지 50,000 생식 모세포/웰로 시딩한 동일한 생식 모세포 배양물을 사용하였다.
실험 번호 단계 V 생식 모세포/웰 웰당 3일 낭포체의 기하학적 평균 수 (범 위) 3일 낭포체로의 변형 효율 웰당 7 내지 8일 낭포체의 기하학적 평균 수 ( 범위) 생식 모세포의 8일 낭포체로의 변형 효율 8일 낭포체로 의 평균 변형 효율
1 15,000 428 (180-540) 2.9% 359 (260-375) 2.4% 8.9%
2 15,000 2113 (1790-2695) 14.1% 1877 (1470-2585) 12.5%
3 15,000 2334 (2235-2405) 15.5% 1786 (1450-2220) 11.9%
1 25,000 1107 (650-1685) 4.4% 978 (900-1050) 3.9% 8.4%
2 25,000 2916 (1635-4515) 11.8% 2210 (1970-2825) 8.8%
3 25,000 3888 (3730-4070) 15.5% 3092 (2885-3365) 12.4%
1 50,000 2367 (2110-2995) 4.8% 1846 (1810-1910) 3.7% 7.5%
2 50,000 5695 (3765-7860) 11.4% 3931 (3475-4250) 7.9%
3 50,000 6997 (5650-9150) 14.0% 5407 (3835-6595) 10.8%
모기 및 생체 외에서 생식 모세포의 7 또는 8일 낭포체로의 변환 효율
모기 생체 외
생식 모세포의 평균(±SD) 수 21,781 ± 3,581a 25,000b
낭포체의 평균(±SD) 수 47.2 ± 32.9c 2093.4 ± 1061.8d
변환율 0.22% 8.37%
a 모기당 섭취된 산정된 생식 모세포.
b 실험당 웰당 수 (N=3).
c 모기 중장당 평균은 74개의 독립적인 SMFA의 기하학적 평균의 평균이고 각 실험에 대해 N = 20 내지 25이다 (Li et al. in preparation).
d 웰당 평균은 3개의 독립적인 실험의 기하학적 평균의 평균이다.
실시예 3
생체 외-길러진 플라스모디움 팔시파룸 종충 및 아노펠레스 스테펜시 ( Anopheles stephensi ) 모기에서 개체발생적으로 발달된 플라스모디움 팔시파룸 종충이 각각 유사한 효율로 인간 간세포 셀라인 (HC-04) 내에서 침입하고 발달한 것을 증명함
생체 외-길러진 Pf SPZ를, 기본적으로 효능을 평가하기 위해 사용되는 6-일 간세포 분석에서 감염성에 대해 시험하였다. 분석은 전형적으로 저온보존 전과 후에 Pf SPZ를 사용하여 수행된다. 신선하고 저온보존된 Pf SPZ는 형태학적으로 동일한 6-일 간 단계 기생충을 생성하지만, 저온보존으로 인해 효능이 5 내지 25% 손실된다 [5]. 생체 외-길러진 Pf SPZ는 신선한 모기-유도된 PfSPZ에 더 유사하고, 그러므로 제조 캠페인 중에 생성된 신선한 PfSPZ로부터의 판독과 비교하였다. 7개의 연속적인 제조 캠페인에서, Pf MSP-1을 발현하는 20.7 내지 32.7의 성숙한 6-일 기생충들이 50,000 모기-생성된 신선한 Pf SPZ로부터 발달되었다 (표 4). 생체 외-길러진 PfSPZ를 HC-04 세포 (생체 내에서 생성된 Pf SPZ의 감염을 지지하는 것으로 밝혀진 인간 간세포 셀라인)로 플레이팅된 3 웰에 접종하였고 [24, 25] 6-일 동안 인큐베이션하였다 (도 9A 상부 패널, 표 4). 도 9A 및 9B는 생체 외-길러진 Pf SPZ (도 9A 상부 패널) 또는 모기-생성된, 무균성, 정제된, 저온보존된 Pf SPZ (도 9B 하부 패널)로의 감염 후에 HC-04 세포에서 6일 간 단계의 공초점 현미경사진을 도시한다. 4개의 독립적인 6-일 간세포 분석에서, 56,598 ± 7,294 Pf SPZ/웰로 시딩된 생체 외-제조된 Pf SPZ는 28.6 ± 7.0 Pf MSP 1-발현 6-일 기생충을 생성하였다 (표 4). 이것은 이 분석에서 신선한, 무균성, 정제된 Pf SPZ로 볼 수 있는 25.7 ± 4.1 Pf MSP 1-발현 기생충에 비교할만 하였고 (표 4) 저온보존된 Pf SPZ보다는 약간 더 많았다 (데이터는 제시하지 않음). 이들 데이터는 또한 18-일 생체 외-제조된 Pf SPZ가 15-일 생체 외-길러진 Pf SPZ보다 더 감염성이었음을 나타냈다. 생체 외- 및 생체 내 (모기)-생성된 Pf SPZ로부터 HC-04 세포에서 발달된 6-일 기생충의 크기는 유사하였다 (도 9A 및 9B). 현미경 사진에 대한 포지티브 대조표준으로서, 모기 침샘으로부터의 무균성, 정제된, 저온보존된 Pf SPZ를 HC-04 세포에서 인큐베이션하였고, Pf MSP1 발현에 대해 평가하였다 (도 9B). 이들 데이터는 생체 외-제조된 Pf SPZ가 신선한 모기-생성된 Pf SPZ만큼 간세포 배양물에서 감염성이었음을 증명하였다.
생체 외 Pf SPZ 제조 및 6-일 간세포 분석에서 생체 외-수확된 및 신선한, 무균성, 정제된 침샘-유도된 Pf SPZ의 감염성 비교.
생체 외 배양물을 배양 개시 후 15일 및/또는 18일에 수확하였다. 수확한 형태학적으로 성숙한 PfSPZ의 수를 셀로미터상에서의 계수에 의해 측정하였다. 미성숙 형태는 계수하지 않았다. PfSPZ의 감염성을 HC04 세포에서 사나리아의 6-일 간세포 분석에서 IFA에 의한 PfMSP1-발현 기생충의 수를 계수함으로써 측정하였다. 7개의 연속적인 GMP 제조 캠페인 (50,000 PfSPZ/웰)에서 제조된 신선한, 무균성, 정제된 침샘-유도된 PfSPZ의 감염성
실험 번호 15 및 18일에 수확한 형태학적으로 성숙한 PfSPZ의 수 간세포 분석 제조 캠페인 웰당 6-일 기생충의 평균 수 ± SD
웰당 시딩된 Pf SPZ의 수 웰당 6-일 기생충의 평균 수 ± SD
15 일 18 일 15 일 18 일 15 일 18 일
1 203,125 247,000 60,937 71,500 24.5 ± 6.8 32.3 ± 5.6 1 20.7 ± 3.5
2 180,500 ND 47,500 ND 21.7 ± 2.1 ND 2 32.7 ± 1.5
3 200,000 231,000 50,000 55,000 17 ± 2.3 37 ± 5.0 3 21.3 ± 4.0
4 204,000 258,750 55,000 56,250 32.3 ± 3.8 35.3 ± 0.9 4 28.3 ± 1.5
5 350,000 ND ND ND ND ND 5 23.0 ± 2.6
6 217,000 253,750 ND ND ND ND 6 29.0 ± 2.6
7 210,000 280,500 ND ND ND ND 7 25.0 ± 1.7
평균 ± SD 56,598 ± 7,294 28.6 ± 7.0 N/A 25.7 ± 4.1
ND; 측정되지 않음. 6-일 간세포 분석은 진행중임.
3D 배양 트랜스웰 삽입 및 마트리겔로 코팅된 폴리스티렌 매트릭스를 사용한 단계 V 생식 모세포의 7 및 11-일 낭포체로의 변형 효율. 낭포체는 원심분리에 의해 매트릭스로부터 추출하였고 셀로미터상에서 계수하였다.
단계 V 생식 모세포의 수/삽입 낭포체의 수/삽입 변형 효율: 단계 V 생식 모세포의 낭 포체로의 변형
7 일 11 일 7 일 11 일
250,000 28,690 26,400 11.5% 10.7%
300,000 31,300 25,800 10.4% 8.6%
274,000 24,600 21,400 9.0% 7.8%
이들 결과는 모기에서 생성된 낭포체보다 39배 더 큰 효율로 생체 외에서의 Pf 낭포체의 제조 방법을 보여준다. 생체 외-길러진 Pf SPZ는 적어도 모기로부터 새롭게 해부한 Pf SPZ만큼 양호한 효율로, 침입하여 Pf 낭충 표면 단백질 1을 발현하는 성숙한 6일 간 단계 분열체로 발달하였다.
전술한 설명에서, 본 발명은 적합한 구체예들을 참조로 기술되었지만, 이들 구체예는 단지 발명을 이해시킬 목적이고 다양한 변경 또는 수정이 가능하다.
참고문헌
1. Sachs J, and Malaney P. The economic and social burden of malaria. Nature 415:680-685, 2002.
2. Murray CJ, et al. Global malaria mortality between 1980 and 2010: a systematic analysis. Lancet 379:413-431, 2012.
3. World Health Organization. Global Malaria Programme. World Malaria Report 2013: World Health Organization 2013.
4. Health Protection Agency (HPA) UK Press Release. 25 April 2011. Malaria cases up almost 30 per cent in two years as it's revealed most cases haven't taken antimalaria tablets.
5. Mali S, Kachur SP, and Arguin PM. Malaria surveillance--United States, 2010. MMWR Surveill Summ 61:1-17, 2012.
6. Cullen KA, Arguin PM, and Division of Parasitic DM, Center for Global Health C. D. C.,. Malaria surveillance - United States, 2011. MMWR Surveill Summ 62 Suppl 5:1-17, 2013.
7. Beadle C, and Hoffman SL. History of malaria in the United States Naval Forces at war: World War I through the Vietnam conflict. Clin Infect Dis 16:320-329, 1993.
8. Alonso PL, et al. A research agenda for malaria eradication: vaccines. PLoS Med 8: e1000398, 2011.
9. Kester KE, et al. Randomized, double-blind, phase 2a trial of falciparum malaria vaccines RTS,S/AS01B and RTS,S/AS02A in malaria-naive adults: safety, efficacy, and immunologic associates of protection. J Infect Dis 200:337-346, 2009.
10. Agnandji ST, et al. First results of phase 3 trial of RTS,S/AS01 malaria vaccine in African children. N Engl J Med 365:1863-1875, 2011.
11. Agnandji S, et al. A phase 3 trial of RTS,S/AS01 malaria vaccine in African infants. N Engl J Med 367:2284-2295, 2012.
12. Olotu A, et al.. Four-year efficacy of RTS,S/AS01E and its interaction with malaria exposure. N Engl J Med 368:1111-1120, 2013.
13. Seder RA, et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science 341:1359-1365, 2013.
14. Mutapi F, Billingsley PF, Secor WE. Infection and treatment immunizations for successful parasite vaccines. Trends Parasitol. 2013 Mar;29(3):135-41.
15. Roestenberg M, et al. Controlled Human Malaria Infections by Intradermal Injection of Cryopreserved Plasmodium falciparum Sporozoites. Am J Trop Med Hyg 88:5-13, 2013.
16. Sheehy SH, et al.. Optimising Controlled Human Malaria Infection Studies Using Cryopreserved Parasites Administered by Needle and Syringe. PLoS One 8: e65960, 2013.
17. Hoffman SL, et al. Development of a metabolically active, non-replicating sporozoite vaccine to prevent Plasmodium falciparum malaria. Hum Vaccin 6:97-106, 2010.
18. Trager W, and Jensen JB. Human malaria parasites in continuous culture. Science 193:673-675, 1976.
19. Warburg A, and Miller LH. Sporogonic development of a malaria parasite in vitro. Science 255:448-450, 1992.
20. Warburg A, and Schneider I. In vitro culture of the mosquito stages of Plasmodium falciparum. Exp Parasitol 76:121-126, 1993.
21. Al-Olayan EM, Beetsma AL, Butcher GA, Sinden RE, and Hurd H. Complete development of mosquito phases of the malaria parasite in vitro. Science 295:677-679, 2002.
22. Vaughan JA, Noden BH, and Beier JC. Sporogonic development of cultured Plasmodium falciparum in six species of laboratory-reared Anopheles mosquitoes. Am J Trop Med Hyg 51:233-243, 1994.
23. Pradel G. Proteins of the malaria parasite sexual stages: expression, function and potential for transmission blocking strategies. Parasitology 134:1911-1929, 2007.
24. Prachumsri, J. & N. Yimamnuaychok, U.S. Patent 7,015,036, March 21, 2006.
25. Sattabongkot J, Yimamnuaychoke N, Leelaudomlipi S, Rasameesoraj M, Jenwithisuk R, Coleman RE, Udomsangpetch R, Cui L, Brewer TG. (2006) Establishment of a human hepatocyte line that supports in vitro development of the exo-erythrocytic stages of the malaria parasites Plasmodium falciparum and P. vivax. Am J Trop Med Hyg. 74(5):708-15, 2006.
26. Schneider I. (1972) Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 1972 Apr;27(2):353-65.
27. Hughes, C.S., Postovit, L.M., Lajoie, G.A. (2010). "Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture". Proteomics 10 (9):1886-90.
28. Benton, G., George, J., Kleinman, H.K., Arnaoutova, I. (2009). "Advancing science and technology via 3D culture on basement membrane matrix". Journal of cellular physiology 221 (1):18-25.

Claims (24)

  1. 생식 모세포 단계로부터 종충 단계까지의 포자 생식이 모기 외부에서 일어나는, 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충.
  2. 제 1항에 있어서, 어떠한 수반되는 모기 물질이 없는 것을 특징으로 하는 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 모기에서 길러진 인간 숙주 범위의 플라스모디움 종충의 적어도 70%, 80% 또는 90%만큼 인간 간세포에 감염성인 것을 특징으로 하는 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 무균성인 것을 특징으로 하는 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충.
  5. 제 4항에 있어서, 약학적 용도에 적합한 것을 특징으로 하는 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스모디움 종충의 종은 플라스모디움 팔시파룸인 것을 특징으로 하는 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 종충.
  7. 인간 숙주 범위의 생체 외-길러진 감염성 플라스모디움 기생충의 배양물로서, 상기 기생충은 생체 외에서 포자 생식 발달을 진행하는 배양물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 기생충은 발달의 종충 단계에 도달한 것을 특징으로 하는 배양물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 종충 단계 기생충은 모기에서 길러진 동일 종의 인간 숙주 범위 플라스모디움 종충의 적어도 70%, 80% 또는 90%만큼 인간 간세포에 감염성인 것을 특징으로 하는 배양물.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 무균성인 것을 특징으로 하는 배양물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 종충 단계 기생충은 약학적 용도에 적합한 것을 특징으로 하는 배양물.
  12. 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 숙주 범위의 플라스모디움의 종은 플라스모디움 팔시파룸인 것을 특징으로 하는 배양물.
  13. 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 동등한 수의 단계 V 생식 모세포로부터 모기에서 발달된 동일한 플라스모디움 종의 낭포체에 비교하여 적어도 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 39 또는 10 내지 40-배 더 많은 낭포체가 생체 외에서 발달하는 것을 특징으로 하는 배양물.
  14. 인간 숙주 범위의 감염성 플라스모디움 종충의 배양물로서, 상기 배양물은 어떠한 수반되는 모기 물질이 없는 배양물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 플라스모디움 종충은 모기에서 길러진 동일 종의 인간 숙주 범위 플라스모디움 종충의 적어도 70%, 80% 또는 90%만큼 인간 간세포에 감염성인 것을 특징으로 하는 배양물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 플라스모디움 종충은 무균성인 것을 특징으로 하는 배양물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 플라스모디움 종충은 약학적 용도에 적합한 것을 특징으로 하는 배양물.
  18. 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스모디움 종충의 종은 플라스모디움 팔시파룸인 것을 특징으로 하는 배양물.
  19. 종충의 포자 생식 발달 중에 생체 외에서 인간 숙주 범위의 플라스모디움 종충을 배양하는 방법으로서,
    a. 편모 방출 배양 배지에서 적혈구의 존재하에 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포를 배양하는 단계;
    b. 렉틴을 사용하여 상기 적혈구들을 접합시키는 단계;
    c. 접합자, 생식 세포, 생식 모세포 및 접합된 적혈구들을 포함하는 혼합물을 수집하는 단계;
    d. 상기 혼합물을 매트릭스를 포함하는 기질 상에서 및 단상 접합자 배양 배지에서 배양하는 단계로, 단상 접합자 단계 기생충이 상기 매트릭스로 침투하는 단계;
    e. 상기 단상 접합자 배지를 낭포체 배지로 교환하는 단계; 및
    f. 그로써 제조된 플라스모디움 종충 단계 기생충을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 플라스모디움 종충의 종은 플라스모디움 팔시파룸인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 모기에서 동일 종 및 동등한 수의 인간 플라스모디움 생식 모세포로부터의 낭포체 생성에 비해 인간 숙주 범위 플라스모디움 낭포체의 생성을 증가시키는 방법으로서,
    a. 편모 방출 배양 배지에서 적혈구의 존재하에 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포를 배양하는 단계;
    b. 렉틴을 사용하여 상기 적혈구들을 접합시키는 단계;
    c. 접합자, 생식 세포, 생식 모세포 및 접합된 적혈구들을 포함하는 혼합물을 수집하는 단계;
    d. 단계 c의 상기 혼합물을 매트릭스를 포함하는 기질 상에서 및 단상 접합자 배지에서 배양하는 단계로, 상기 기생충은 단상 접합자로 분화하고 상기 단상 접합자는 상기 매트릭스로 들어가서 낭포체 단계로 분화하는 단계;
    e. 상기 단상 접합자 배지를 낭포체 배양 배지로 교체하는 단계, 및
    f. 인간 숙주 범위의 낭포체 단계 플라스모디움 기생충을 정량하는 단계를 포함하고;
    g. 상기 방법은 모기에서 동등한 수의 인간 숙주 범위 플라스모디움 생식 모세포로부터 발달된 동일 종의 낭포체에 비교하여 생체 외에서 발달된 더 많은 인간 숙주 범위의 플라스모디움 낭포체를 생성하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 플라스모디움 낭포체의 종은 플라스모디움 팔시파룸인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충을 포함하는 백신 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 생체 외-길러진 플라스모디움 종충 또는 제 23항의 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 플라스모디움-특이적 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
KR1020167033486A 2014-05-02 2015-05-01 생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충 KR102467128B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461987834P 2014-05-02 2014-05-02
US61/987,834 2014-05-02
US201462016981P 2014-06-25 2014-06-25
US62/016,981 2014-06-25
PCT/US2015/028890 WO2015168620A1 (en) 2014-05-02 2015-05-01 Infectious plasmodium sporozoites grown in vitro

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160147985A true KR20160147985A (ko) 2016-12-23
KR102467128B1 KR102467128B1 (ko) 2022-11-15

Family

ID=54359397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167033486A KR102467128B1 (ko) 2014-05-02 2015-05-01 생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충

Country Status (12)

Country Link
US (5) US9878026B2 (ko)
EP (1) EP3137106B1 (ko)
JP (2) JP7021851B2 (ko)
KR (1) KR102467128B1 (ko)
CN (1) CN106413746A (ko)
AP (1) AP2016009590A0 (ko)
AU (1) AU2015252843B2 (ko)
CA (1) CA2947595A1 (ko)
ES (1) ES2954144T3 (ko)
IL (1) IL248500B (ko)
SG (2) SG11201608935TA (ko)
WO (1) WO2015168620A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102467128B1 (ko) 2014-05-02 2022-11-15 사나리아 인코퍼레이티드 생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충
EP3265815A4 (en) 2015-03-04 2018-08-15 Sanaria Inc. Serum antibody assay for determining protection from malaria, and pre-erythrocytic subunit vaccines
US11332711B1 (en) 2018-04-05 2022-05-17 University Of South Florida Sporozoite cryopreservation compositions and methods

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4824671A (en) * 1986-03-24 1989-04-25 Reuter Laboratories, Inc. In vitro method for producing infective bacterial spores and spore-containing insecticidal compositions
US7015036B2 (en) 2000-09-25 2006-03-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Human liver cell line
US8802919B2 (en) 2002-04-05 2014-08-12 Sanaria Inc. Apparatuses and methods for the production of haematophagous organisms and parasites suitable for vaccine production
WO2003087322A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Sanaria Inc. Production of haematophagous organisms and parasites suitable for vaccine production
US20050208078A1 (en) 2003-11-20 2005-09-22 Hoffman Stephen L Methods for the prevention of malaria
ATE524735T1 (de) * 2002-11-20 2011-09-15 Sanaria Inc Impfstoff zur vorbeugung gegen malaria
US20050220822A1 (en) * 2003-11-20 2005-10-06 Hoffman Stephen L Methods for the prevention of malaria
EP2128613A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-02 Institut Pasteur Method for screening compounds for their ability to increase rigidity of red blood cells infected by a protozoan parasite of the genus plasmodium and application thereof
DK2387416T3 (en) 2009-01-16 2017-09-25 Sanaria Inc PURIFIED PLASMODIUM AND VACCINE COMPOSITIONS
US20120288525A1 (en) 2011-05-11 2012-11-15 Chakravarty Sumana Pharmaceutical compositions comprising attenuated plasmodium sporozoites and glycolipid adjuvants
EP2956166B1 (en) 2013-01-25 2019-01-16 Sanaria Inc. Genetic attenuation of plasmodium by b9 gene disruption
US20160216276A1 (en) 2013-08-30 2016-07-28 Sanaria Inc. Serum antibody assay for determining protection from malaria, and pre-erythrocytic subunit vaccines
KR102467128B1 (ko) 2014-05-02 2022-11-15 사나리아 인코퍼레이티드 생체 외 성장된 감염성 플라스모디움 종충
EP3265815A4 (en) 2015-03-04 2018-08-15 Sanaria Inc. Serum antibody assay for determining protection from malaria, and pre-erythrocytic subunit vaccines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EXPERIMENTAL PARASITOLOGY, vol.76, pp.121~126(1993)* *

Also Published As

Publication number Publication date
IL248500A0 (en) 2016-12-29
EP3137106B1 (en) 2023-07-05
US20220257742A1 (en) 2022-08-18
US10441646B2 (en) 2019-10-15
WO2015168620A1 (en) 2015-11-05
BR112016025199A2 (pt) 2017-08-15
KR102467128B1 (ko) 2022-11-15
BR112016025199A8 (pt) 2021-07-13
AU2015252843A1 (en) 2016-11-17
US11207395B2 (en) 2021-12-28
US20180161413A1 (en) 2018-06-14
ES2954144T3 (es) 2023-11-20
US11883475B2 (en) 2024-01-30
US20240173393A1 (en) 2024-05-30
JP2017514490A (ja) 2017-06-08
US9878026B2 (en) 2018-01-30
SG11201608935TA (en) 2016-11-29
AU2015252843B2 (en) 2020-12-24
JP7021851B2 (ja) 2022-02-17
CA2947595A1 (en) 2015-11-05
CN106413746A (zh) 2017-02-15
EP3137106A4 (en) 2018-01-17
AP2016009590A0 (en) 2016-11-30
JP2020141691A (ja) 2020-09-10
EP3137106A1 (en) 2017-03-08
SG10201900876VA (en) 2019-03-28
US20160287688A1 (en) 2016-10-06
IL248500B (en) 2022-07-01
US20200113987A1 (en) 2020-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Brown Theileria
US11883475B2 (en) Infectious Plasmodium sporozoites grown in vitro
JP5738199B2 (ja) 精製されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍおよびワクチン組成物
Matuschewski et al. Arrested Plasmodium liver stages as experimental anti-malaria vaccines
Ramasamy et al. Interactions of human malaria parasites, Plasmodium wVaxand P. falciparum, with the midgut of Anopheles mosquitoes
Huang et al. An in vitro model of infection of chicken embryos by Cryptosporidium baileyi
Andreadis et al. Morphological and molecular characterization of a microsporidian parasite, Takaokaspora nipponicus n. gen., n. sp. from the invasive rock pool mosquito, Ochlerotatus japonicus japonicus
Gonzalez-Ceron et al. Plasmodium vivax: impaired escape of Vk210 phenotype ookinetes from the midgut blood bolus of Anopheles pseudopunctipennis
Shi et al. Transfected Eimeria tenella could complete its endogenous development in vitro
OA18109A (en) Infectious plasmodium sporozoites grown in vitro
BR112016025199B1 (pt) Métodos de cultura de esporozoítos de plasmodium falciparum infecciosos in vitro e para aumentar a produção de oocistos de plasmodium falciparum, bem como a referida cultura
Okamura et al. Babesia caballi and Babesia equi: implications of host sialic acids in erythrocyte infection
Blight et al. Dissection-independent production of Plasmodium sporozoites from whole mosquitoes
US9909100B2 (en) Plant extract based composition useful for leishman IA promastigotes
CN104302313A (zh) 作为整体有机体的疟疾疫苗平台的啮齿动物疟原虫寄生生物
Blight et al. Dissection-independent production of a protective whole-sporozoite malaria vaccine
Abdullah et al. Demonstration of mosquito midgut antigen for the effective control of mosquito population
Heyde The role of Leishmania major proliferation for the interaction between the parasite and its tissue environment in vivo
Michael et al. CULTIVATION AND IN VITRO STUDIES OF BABESIA
WO2020225554A1 (en) Parasite purification
Paulman Plasmodium gallinaceum in vivo and in vitro
Serrano et al. Differential effect of culture epimastigotes and blood-form Trypamastigotes on normal mouse splenocyte responsiveness to mitogens
against Infection et al. Sporozoites with Plasmodium yoelii
Sun et al. Biosafety and Health

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant