JP7018042B2

JP7018042B2 - アカモク抽出物を用いた肺損傷改善または呼吸器疾患改善用組成物

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Publication number: JP7018042B2
Application number: JP2019152507A
Authority: JP
Inventors: ヨンフン・チ; ユジン・チョン; ヒョンジュン・キム; ジヨン・チョン; アルム・キム; ヒョジン・キム
Original assignee: チェジュナショナルユニバーシティーインダストリー－アカデミックコーポレーションファウンデーション
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2022-02-09
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: US10953054B2; US20200147157A1; EP3653200A1; JP2020078292A

Description

本発明は、アカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍｈｏｒｎｅｒｉ）抽出物を用いた肺損傷改善または呼吸器疾患改善用組成物、特に粒子状物質などによる肺損傷の改善または呼吸器疾患の改善のための組成物に関する。

高度化された産業化により粒子状物質（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｍａｔｔｅｒ、ＰＭ）などの大気汚染が増加している。また、気候変動に伴う中国などのアジア大陸の砂漠化により国内の黄砂発生が増加し、粒子状物質に対する国民の関心が高まっている（非特許文献１）。粒子状物質は、例えば煤、生物体有機炭素などの炭素成分、例えば塩素、硝酸、アンモニウム、ナトリウム、カルシウムなどのイオン成分、例えば鉛、ヒ素、水銀などの金属成分、例えばベンゾピレンなどの多環芳香族炭化水素などの様々な成分を含んでおり（非特許文献２）、この他にも自動車の排気ガス、採石場、建設現場などから発生する一次粒子とこれによる化学反応によって生成された硫酸塩、硝酸塩、二酸化硫黄、窒素酸化物、アンモニア、揮発性有機化合物などの二次粒子が粒子状物質の発生に影響を及ぼす。また、粒子状物質は、粒子状の物質であってサイズによって分類し、粒子径２．５～１０μｍのものと粒子径２．５μｍ以下のものに区分し、２．５μｍ以下の粒子状物質を超粒子状物質と呼ぶ。粉塵は鼻や喉にかかって気道にまで影響を与えないが、１０μｍよりも小さい場合には上気道、気管支、小気道及び肺胞にも沈着して呼吸器に影響を及ぼしてアレルギー性鼻炎、気管支炎、喘息、肺胞損傷などを誘発する（非特許文献３）。また、慢性炎症に進行する場合、肺機能の低下により呼吸困難を誘発する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こすおそれがある（非特許文献４）。粒子状物質は、呼吸器だけでなく、アレルギー性結膜炎、角膜炎、心血管疾患などを誘発することがあり、このような人体影響は、サイトカイン、ケモカインなどの分泌による炎症反応、白血球数の増加、活性酸素の生成などによると知られており（非特許文献５）、これを抑えることができる物質の研究が求められている。

アカモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍｈｏｒｎｅｒｉ）は、ヒバマタ目ホンダワラ科の多年性褐藻類であり、韓国、日本、中国の沿岸に幅広く分布する種であって、韓国の東海域と日本海域の海流に乗って移動する浮遊性ホンダワラの主要構成種として知られている（非特許文献６）。

アカモクは、フコイダンとアルギン酸を始めとするミネラルやポリフェノールなどの様々な成分が含まれており、美容や健康に役立ついろんな薬理効果と生理機能があると知られており、アカモクから分離された硫酸多糖類の一種であるフコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）は、ＬＰＳに刺激されたマクロファージ細胞株で酸化的ストレスを減少させると報告されている（非特許文献７）。また、アカモクのポリフェノール成分は、強力な抗酸化作用をし（非特許文献８）、カロチノイド系色素の一種であるフコキサンチン（Ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ）は、抗酸化、抗菌、抗高血圧効果を示すと報告されている（非特許文献９）。

本発明は、アカモク抽出物の粒子状物質などによる肺損傷または呼吸器疾患の改善活性を開示する。

ＫｉｍＨＳ，ＣｈｕｎｇＹＳ，ＹｏｏｎＭＢ．Ａｎａｎａｌｙｓｉｓｏｎｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｓｏｆｄｕｓｔｐｏｌｌｕｔｉｏｎｏｎａｉｒｑｕａｌｉｔｙｉｎＥａｓｔＡｓｉａａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｃｅｎｔｒａｌＫｏｒｅａｉｎ２０１４．ＡｉｒＱｕａｌＡｔｍｏｓＨｅａｌｔｈ，２０１５Ｊａｎ１５［Ｅｐｕｂ］．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１８６９－０１４－０３１２－５ＪａｎｇＡｎ－Ｓｏｏ．Ｉｍｐａｃｔｏｆｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｍａｔｔｅｒｏｎｈｅａｌｔｈ．ＪＫｏｒｅａｎＭｅｄＡｓｓｏｃ，２０１４；５７：７６３－７６８ＡｌｌｅｒｇｙＡｓｔｈｍａＲｅｓｐｉｒＤｉｓ，２０１５，３：３１３－３１９ＪＩｎｔ．ＫｒｅａｎＭｅｄ，２０１７，３８：３５３－３６６ＣｈｏＣＣｅｔａｌ．ＩｎＶｉｔｒｏａｎｄＩｎＶｉｖｏＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓｏｆＰＭ２．５ｏｎＤｉｓｅａｓｅＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ＩｎｔＪＥｎｖｉｒｏｎＲｅｓＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ２０１８，１５（７）ＫｏｒｅａｎＪＦｉｓｈＡｑｕａｔＳｃｉ，２０１６，４９：６８９－６９３ＩｎｔＪＢｉｏｌＭａｃｒｏｍｏｌ，２０１４，６８：９８－１０６ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＦｏｏｄ，２０１６，１９：６１５－６２８ＭａｒＤｒｕｇｓ，２０１５，１３：３４２２－３４４２

本発明の目的は、アカモク抽出物を用いた、粒子状物質などによる肺損傷の改善のための組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、アカモク抽出物を用いた、粒子状物質などによる呼吸器疾患の改善のための組成物を提供することにある。

本発明の他の目的や具体的な目的は、以下で提示されるだろう。

本発明者らは、下記の実施例及び実験例から確認されるように、アカモク抽出物が粒子状物質による肺上皮細胞（ＭＬＥ－１２細胞）の生存率の減少と増殖能の減少を抑制させることを確認し、その具体的な機序においては、粒子状物質による肺上皮細胞の酸化的損傷を回復させ、粒子状物質による炎症性サイトカインとケモカインの発現増加を抑制し、このサイトカインなどの発現を促進する機序因子であるＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８（ＭＡＰ－ｋｉｎａｓｅｐ３８）およびＪＮＫ（ｃ－ＪｕｎＮ－ｔｅｒｎｉｍａｌｋｉｎａｓｅ）の活性化（すなわち、リン酸化）を抑制することを確認した。さらに、本発明者らは、粒子状物質を吸入させた動物モデル実験から、アカモク抽出物が気管（ｔｒａｃｈｅａ）、気管支（ｂｒｏｎｃｈｕｓ）および肺（ｌｕｎｇ）組織などにおいて、好中球、好酸球、好塩基球、顆粒球、マクロファージなどの白血球とヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ）、細胞毒性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌ）、樹枝状細胞などのリンパ球といった炎症細胞の浸潤を減少させ、酸化的損傷を抑制し、炎症反応と過敏免疫反応に関与して気管支の収縮、粘液の分泌などを引き起こす肥満細胞の浸潤を減少させるとともに、さらに粘液（喀痰）分泌細胞である杯細胞の増殖を抑制し、それにより粘液の分泌の増加を減少させることを確認することができた。

前述した実験結果を考慮すると、本発明は、一態様において、アカモク抽出物を有効成分として含む肺損傷改善用組成物または肺機能改善用組成物、特に粒子状物質による肺損傷改善用組成物と把握することができ、他の態様においては、アカモク抽出物を有効成分として含む呼吸器疾患改善用組成物、特に粒子状物質による呼吸器疾患改善用組成物と把握することができ、別の態様においては、アカモク抽出物を有効成分として含む喀痰（気管支または肺から分泌される粘液）分泌抑制用組成物と把握することができ、別の態様においては、アカモク抽出物を有効成分として含む気管支拡張用組成物と把握することができる。

前述したように、本発明によれば、アカモク抽出物を用いた、粒子状物質などによる肺損傷の改善のための組成物と呼吸器疾患の改善のための組成物を提供することができる。本発明の組成物は、健康機能食品や薬品などに製品化できる。

肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が細胞毒性及び細胞増殖能に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が細胞毒性及び細胞増殖能に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が酸化的ストレスに及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が脂質過酸化に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が酸化的ストレスによるＤＮＡ損傷に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が炎症性サイトカイン、ケモカイン及び炎症媒介因子の発現に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が炎症性サイトカイン、ケモカイン及び炎症媒介因子の発現に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質によって損傷した肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物が炎症性サイトカインの分泌機序に及ぼす影響を評価した結果である。実験動物モデルで実験群の構成、試料投与時期、試料投与期間などを模式化して示す図である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が血液の白血球百分率の変化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が血液の白血球百分率の変化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ、ＢＡＬＦ）の白血球百分率の変化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ、ＢＡＬＦ）の白血球百分率の変化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管と肺の病理組織学的変化に及ぼす影響を評価した結果である（０：ｎｏｒｍａｌ、１：ｆｅｗｃｅｌｌｓｏｂｓｅｒｖｅｄ、２：ａｒｉｎｇｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｏｎｅｃｅｌｌｌａｙｅｒｄｅｅｐ、３：ａｒｉｎｇｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ２－４ｃｅｌｌｓｄｅｅｐ、及び４：ａｒｉｎｇｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ＞４ｃｅｌｌｓｄｅｅｐ）。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が肺の８－ＯＨｄＧ発現の変化に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸引させた動物モデルでアカモク抽出物が気管と肺のＧｒ－１発現の変化に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管と肺組織の好酸性白血球の浸潤に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管の肥満細胞の浸潤に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管と肺における粘液の分泌及び杯細胞（ｇａｂｌｅｔｃｅｌｌ）の増殖に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物が気管と肺における粘液の分泌及び杯細胞（ｇａｂｌｅｔｃｅｌｌ）の増殖に及ぼす影響を評価した結果である。粒子状物質を吸入させた動物モデルの肺組織における、アカモク抽出物が細胞集団の変化に及ぼす影響を評価した結果である。

本明細書において、「アカモク抽出物」は、抽出対象であるアカモクの茎、葉、根、全草またはこれらの混合物などを水、炭素数１乃至４の低級アルコール（メタノール、エタノール、ブタノールなど）、塩化メチレン、エチレン、アセトン、ヘキサン、エーテル、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコールまたはこれらの混合溶媒を用いて浸出して得た抽出物（すなわち、前記抽出溶媒に可溶性である抽出物）、二酸化炭素、ペンタンなどの超臨界抽出溶媒を用いて得た抽出物、またはその抽出物を分画して得た分画物を意味し、抽出方法は、活性物質の極性、抽出程度、保存程度を考慮して冷浸、還流、加温、超音波放射、超臨界抽出などの任意の方法を適用することができる。分画された抽出物は、抽出物を特定の溶媒に懸濁させた後、極性の異なる溶媒と混合し、静置させて得た分画物、前記粗抽出物をシリカゲルなどが充填されたカラムに吸着させた後、疎水性溶媒、親水性溶媒またはこれらの混合溶媒を移動相として得た分画物を含む意味である。また、前記抽出物の意味には、凍結乾燥、真空乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥などの方式で抽出溶媒が除去された濃縮液相の抽出物または固相の抽出物が含まれる。好ましくは、抽出溶媒として水、エタノールまたはこれらの混合溶媒を用いて得た抽出物、より好ましくは、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いて得た抽出物を意味し、さらに好ましくは、７０％エタノールを用いて得た抽出物、特にその抽出物を減圧濃縮し、その濃縮物に９５％エタノールを加えて静置させた後、遠心分離して得たその上澄み液である抽出物（すなわち、９５％エタノールに可用性である抽出物）を意味する。

また、本明細書において、「有効成分」とは、単独で目的の活性を示すか、或いは、それ自体は活性がない担体と一緒に活性を示すことができる成分を意味する。

また、本明細書において、「肺機能の改善」は、非疾患者である健常者の呼吸機能の向上、慢性閉塞性肺疾患や喘息、気管支炎、気管炎などによる疾患者の呼吸機能不全の回復または疾患者の呼吸機能の向上を意味する。

また、本明細書において、「肺損傷の改善」は、粒子状物質などによる肺細胞または肺組織の損傷の回復、または肺細胞または肺組織の損傷に伴う肺機能低下の回復を意味する。

また、本明細書において、「呼吸器疾患」は、炎症反応または過敏免疫反応（アレルギー反応）、またはこれらの両方の機序による呼吸器疾患であって、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、すなわち肺気腫）、気管炎（ｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）、気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）または鼻炎（ｒｈｉｎｉｔｉｓ）を意味し、好ましくは、粒子状物質による炎症反応または過敏免疫反応、またはこれらの両方の機序が関与し、咳、粘液（喀痰）の過分泌、呼吸困難を伴う呼吸器疾患である喘息、慢性閉塞性肺疾患または鼻炎を意味する。特に慢性閉塞性肺疾患の場合、喫煙や粒子状物質などが原因になって発症するが、その発症機序には、慢性炎症、酸化的ストレスが関与し、これに起因する肺損傷による肺機能低下とそれによる呼吸困難の症状を伴うが（ＢｉｏｌＰｈａｒｍＢｕｌｌ，２０１２，３５：１７５２－１７６０；ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＬｕｎｇＣｅｌｌＭｏｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１０，２９８：Ｌ２６２－Ｌ２６９）、本発明の下記の実験例が、アカモク抽出物が肺組織などで粒子状物質による炎症反応と酸化的ストレスを著しく緩和させることを示すという点で、前記「呼吸器疾患」は慢性閉塞性肺疾患を意味する。

本発明の組成物において、その有効成分は、肺機能の改善効果、肺損傷の改善効果、呼吸器疾患の改善効果などを示すことができる限り、用途、剤形などに応じて任意の量（有効量）で含まれ得るが、通常の有効量は、組成物の全体重量を基準にしたとき、０．００１重量％乃至１５重量％の範囲内で決定される。ここで、「有効量」とは、その適用対象である哺乳動物、好ましくはヒトに医療専門家などの提言による投与期間の間に本発明の組成物が投与されるとき、肺機能の改善効果、肺損傷の改善効果、呼吸器疾患の改善効果などの意図した医療的・薬理学的効果を示すことができる、本発明の組成物に含まれる有効成分の量をいう。このような有効量は、当業者の通常の能力範囲内で実験的に決定できる。

本発明の組成物は、具体的な態様において、食品組成物として把握することができる。

本発明の食品組成物は、いずれの形態でも製造でき、例えば、お茶、ジュース、炭酸飲料、イオン飲料などの飲料類、牛乳、ヨーグルトなどの加工乳類、ガム類、餅、韓菓、パン、お菓子、麺などの食品類、錠剤、カプセル、丸剤、顆粒、液状、粉末、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ゼリー、バーなどの健康機能食品製剤類などに製造できる。また、本発明の食品組成物は、法律上・機能上の区分において、製造・流通時点の施行規則に準拠する限り、任意の製品区分を示すことができる。例えば、韓国の「健康機能食品に関する法律」に基づく健康機能食品であるか、韓国の「食品衛生法」の食品公典（食薬処告示の「食品の基準及び規格」である）上の各食品の類型による菓子類、豆類、茶類、飲料類、特殊用途食品などであり得る。

本発明の食品組成物は、その有効成分に加えて、食品添加物が含まれ得る。食品添加物は、一般に、食品を製造、加工または保存する上で食品に添加されて混合または浸潤される物質として理解できるが、食品と一緒に毎日、そして長期間摂取されるので、その安全性が保障されなければならない。食品の製造・流通を規律する各国の法律（韓国では「食品衛生法」である）による食品添加物公典には、安全性が保障された食品添加物が成分または機能の面で限定的に規定されている。韓国食品添加物公典（食薬処告示の「食品添加物の基準及び規格」）では、食品添加物が成分面で化学的合成品、天然添加物及び混合製剤類に区分されて規定されているが、このような食品添加物は、機能面においては甘味剤、風味剤、保存剤、乳化剤、酸味料、粘増剤などに区分される。

甘味剤は、食品に適切な甘味を与えるために使用されるものであって、天然のものと合成されたもののいずれも本発明の食品組成物に使用することができる。好ましくは、天然甘味剤を使用する場合であるが、天然甘味剤としては、コーンシロップ固形物、蜂蜜、スクロース、フルクトース、ラクトース、マルトースなどの糖甘味剤を挙げることができる。

風味剤は、味や香りを良くする目的で使用されるものであって、天然のものと合成されたもののいずれも使用できる。好ましくは、天然のものを使用する場合である。天然のものを使用する場合、風味以外に、栄養強化の目的も並行することができる。天然風味剤としては、リンゴ、レモン、柑橘、ブドウ、イチゴ、桃などから得られたもの、または緑茶葉、アマドコロ、竹の葉、シナモン、菊の葉、ジャスミンなどから得られたものであり得る。また、高麗人参（紅参）、タケノコ、アロエベラ、イチョウなどから得られたものを使用することができる。天然風味剤は、液相の濃縮液や固相の抽出物であり得る。場合によって、合成風味剤が使用できるが、合成風味剤としては、エステル、アルコール、アルデヒド、テルペンなどが用いられる。

保存剤としては、ソルビン酸カルシウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などが使用でき、また、乳化剤としては、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、ペクチンなどが使用でき、酸味料としては、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、リン酸、グルコン酸、酒石酸、アスコルビン酸、酢酸、リン酸などが使用できる。酸味料は、味を増進させる目的以外に、微生物の増殖を抑制する目的で、食品組成物が適正の酸度となるように添加できる。粘増剤としては、懸濁化剤、沈降剤、ゲル形成剤、膨化剤などが使用できる。

本発明の食品組成物は、前述した食品添加物以外に、機能性と栄養性を補充・補強する目的で、当業分野における公知の、食品添加物としての安定性が保障された生理活性物質やミネラル類を含むことができる。

そのような生理活性物質としては、緑茶などに含まれているカテキン類、ビタミンＢ１、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２などのビタミン類、トコフェロール、ジベンゾイルチアミンなどを挙げることができ、ミネラル類としては、クエン酸カルシウムなどのカルシウム製剤、ステアリン酸マグネシウムなどのマグネシウム製剤、クエン酸鉄などの鉄製剤、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレニウム、ゲルマニウム、バナジウム、亜鉛などを挙げることができる。

本発明の食品組成物には、前述した食品添加物が製品の類型に応じて、その添加目的を達成することができる適量で含まれ得る。

本発明の食品組成物に含まれ得るその他の食品添加物に関連しては、各国の法律に基づく食品公典や食品添加物公典を参照することができる。

本発明の組成物は、他の具体的な態様においては、薬学的組成物として把握できる。

本発明の薬学的組成物は、有効成分以外に、薬学的に許容される担体を含むことで、当業分野における常法で投与経路に応じて経口用剤形または非経口剤形に製造できる。ここで、「薬学的に許容される」とは、有効成分の活性を抑制しないながら、適用（処方）対象が適応可能な以上の毒性を持たないことを意味する。

本発明の薬学的組成物が経口用剤形に製造される場合、適切な担体と一緒に、当業分野における公知の方法によって、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウエハーなどの剤形に製造できる。この時、薬学的に許容される適切な担体の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖類、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、小麦澱粉などの澱粉類、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース類、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、麦芽、ゼラチン、タルク、ポリオール、植物油などを挙げることができる。製剤化する場合、必要に応じて充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤および／または賦形剤を含めて製剤化することができる。

本発明の薬学的組成物が非経口用剤形に製造される場合には、適切な担体と一緒に、当該分野における公知の方法によって点眼剤、注射剤、経皮投与剤、鼻腔吸入剤、坐剤の形で製剤化できる。点眼剤として製剤化する場合、適切な担体としては、滅菌水、生理食塩水、５％デキストロースなどの等張溶液などを使用することができ、必要に応じて塩化ベンザルコニウム、メピルパラベン、エチルパラベンなどを防腐の目的で添加することができる。注射剤として製剤化する場合、適切な担体としては、滅菌水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコールなどのポリオールまたはこれらの混合物を使用することができ、好ましくは、リンガー溶液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）、注射用滅菌水、５％デキストロースなどの等張溶液などを使用することができる。経皮投与剤として製剤化する場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニアコメント剤、エアゾール剤などの形で製剤化することができる。鼻腔吸入剤の場合、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素などの適切な推進剤を用いてエアゾールスプレーの形で製剤化することができ、坐剤として製剤化する場合、その基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、ポリエチレングリコール類、カカオ脂、ラウリン脂、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ステアリン酸ポリオキシエチレン類、ソルビタン脂肪酸エステル類などを使用することができる。

薬学的組成物の具体的な製剤化に関連しては、当該分野に公知されており、例えば文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）］などを参照することができる。上記文献は、本明細書の一部としてみなされる。

本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢、患者の重症度、投与経路に応じて、１日０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、１日１回または数回に分けて行われ得る。このような投与量は、いずれの側面においても本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。

以下、本発明を実施例及び実験例を参照して説明する。しかし、本発明の範囲はこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。

＜実施例＞アカモク抽出物の製造
韓国産アカモク（全草）を精製水を用いて３０分間３回洗浄した後、５０℃で２４時間熱風乾燥機によって含水率１０％以下に乾燥させてピンミル（ＰｉｎＭｉｌｌ）で４０～５０メッシュのサイズに粉砕した。７０％アルコールにアカモク粉末を１０～１５％（ｗ／ｖ）入れ、循環抽出器を用いて７０℃で１２時間抽出し、食品用白土を処理して６０ｒｐｍで２時間攪拌した後、１２，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を回収した。回収した上澄み液は、減圧濃縮機で６０℃で１／５の体積に減圧濃縮し、濃縮液の３倍体積で９５％アルコールを添加して１２時間静置した後、遠心分離と濾過過程を経て上澄み液を回収した。回収した抽出物は、減圧濃縮機で１／５の体積に濃縮した後、凍結乾燥機で乾燥させてアカモクエタノール抽出粉末（ＳＨＥ）を回収した。

＜実験例＞アカモク抽出物の呼吸器疾患改善活性実験など
＜実験例１＞肺上皮細胞株に対するアカモク抽出物（ＳＨＥ）が細胞毒性および細胞増殖能に及ぼす影響
（１）乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）は、細胞質にある酵素であって、細胞膜が損傷すると細胞外に放出されるが、ＬＤＨは、乳酸の脱水素化を触媒してピルビン酸塩（ｐｙｒｕｖａｔｅ）とＮＡＤＨを生成し、ＮＡＤＨはジアフォラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）の触媒作用によってテトラゾリウム（ＩＮＴ）を還元させて赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生成する（ＰａｒｔＦｉｂｒｅＴｏｘｉｃｏｌ２０１７，１４：３９）。ＬＤＨの活性程度を測定して、ＳＨＥが肺上皮細胞株（Ｍｕｒｉｎｅｌｕｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ１２、以下「ＭＬＥ－１２」という。）に及ぼす影響を評価した。また、放出されたＬＤＨの量を用いて、ＳＨＥによって５０％の細胞が細胞の能力を損失する容量であるＩＣ_５０を計算した。また^３Ｈ－チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）取り込み程度を測定して細胞増殖能を評価した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞は、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地にインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）０．０５ｍｇ／ｍｌ、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．０１ｍｇ／ｍｌ、セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）３０ｎＭ、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）１０ｎＭ、β－エストラジオール（β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）１０ｎＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）２％を添加した後、９６ウェルプレートに１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養した後、ＳＨＥを濃度別（０～５００μｇ／ｍｌ）に処理して４８時間培養し、ＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を使用した。ＩＣ_５０（ｈａｌｆｍａｘｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔＶ１０．０（ＳｙｓｔａｔＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）プログラムを用いて分析した。また、ＭＬＥ－１２細胞を２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養した後、ＳＨＥを濃度別（０～５００μｇ／ｍｌ）に処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで５４時間培養した。その後、それぞれのウェルに１μＣｉの^３Ｈ－チミジン（^３Ｈ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（４２Ｃｉ／ｎｍｏｌ、ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、Ａｒｌｉｎｇ－ｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）を処理し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１８時間培養した後、ガラス繊維濾紙に細胞を捕獲して放射能測定器（ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）ＴｒｉＬｕｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて放射性同位元素の量を測定した。

（３）結果を図１に示した。ＭＬＥ－１２細胞にＳＨＥを濃度別（０～５００μｇ／ｍｌ）に処理した結果、０～１２５μｇ／ｍｌの濃度でＳＨＥによる細胞毒性を示さなかった（図１のＡ）。しかし、ＳＨＥを高濃度（２５０、５００μｇ／ｍｌ）で処理した場合には、細胞毒性を示した（図１のＡ）。また、ＳＨＥを０～１２５μｇ／ｍｌの濃度まで処理した場合には、細胞増殖能に影響を及ぼさなかったが、ＳＨＥを２５０、５００μｇ／ｍｌの濃度で処理した場合には、細胞増殖能がそれぞれ１１．０％、２１．２％減少した（図１のＢ）。

＜実験例２＞粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が細胞毒性および細胞増殖能に及ぼす影響
（１）乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）は、細胞質にある酵素であって、細胞膜が損傷すると細胞外に放出されるが、ＬＤＨは、乳酸の脱水素化を触媒してピルビン酸塩（ｐｙｒｕｖａｔｅ）とＮＡＤＨを生成し、ＮＡＤＨは、ジアフォラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）の触媒作用によってテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を還元させて赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生成する。ＬＤＨの活性程度を測定してＭＬＥ－１２細胞で粒子状物質が誘発する細胞損傷程度を測定し、ＳＨＥの細胞損傷保護効果を評価した。また、放出されたＬＤＨの量を用いて、粒子状物質およびＳＨＥによって５０％の細胞が細胞能力を損失する容量であるＩＣ_５０を計算した。また、^３Ｈ－チミジン（^３Ｈ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）取り込み程度を測定して細胞増殖能を評価した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞は、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地にインスリン０．０５ｍｇ／ｍｌ、トランスフェリン０．０１ｍｇ／ｍｌ、セレン酸ナトリウム３０ｎＭ、ヒドロコルチゾン１０ｎＭ、β－エストラジオール１０ｎＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、ウシ胎児血清２％を添加した後、９６ウェルプレートに１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１２時間培養した後、ＳＨＥ（３１．３、１２５μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（３．９～２５０μｇ／ｍｌ）を濃度別（０～５００μｇ／ｍｌ）に処理して４８時間培養した後、ＬＤＨＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を使用した。ＩＣ_５０は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔＶ１０．０（ＳｙｓｔａｔＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）プログラムを用いて分析した。また、ＭＬＥ－１２細胞を２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養した後、ＳＨＥ（３１．３、１２５μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（３．９～２５０μｇ／ｍｌ）を濃度別に処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで５４時間培養した。その後、それぞれのウェルに１μＣｉの^３Ｈ－チミジン（４２Ｃｉ／ｎｍｏｌ、ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、Ａｒｌｉｎｇ－ｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）を処理し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１８時間培養した後、ガラス繊維濾紙に細胞を捕獲して放射能測定器（ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）ＴｒｉＬｕｘ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて放射性同位元素の量を測定した。

（３）結果を図２に示した。ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を濃度別（０～２５０μｇ／ｍｌ）で処理した場合には、１５．６μｇ／ｍｌの濃度から濃度依存的な細胞毒性を示し（図２のＡ）、粒子状物質４４．１５μｇ／ｍｌの処理濃度で５０％のＭＬＥ－１２細胞が細胞生存率を失った（ＩＣ_５０＝４４．１５μｇ／ｍｌ）（図２のＢ）。しかし、ＳＨＥを３１．３、６２．５μｇ／ｍｌの濃度で粒子状物質と並行処理した場合には、細胞毒性を示した高濃度の粒子状物質処理群（１２５、２５０μｇ／ｍｌ）で濃度依存的に細胞毒性が減少した（Ｐ；＊＜０．０５、†＜０．０５）（図２のＡ）。また、粒子状物質の処理濃度（０～２５０μｇ／ｍｌ）が増加するほど、細胞増殖能が有意に減少したが（Ｐ；＊＜０．０５、†＜０．０５）、ＳＨＥを３．９～２５０μｇ／ｍｌの濃度で粒子状物質と並行処理した場合には、細胞増殖能が有意に増加した（Ｐ；＊＜０．０５、＊＊＜０．００５、†＜０．０５）（図２のＣ）。

＜実験例３＞粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が酸化的ストレスに及ぼす影響
（１）活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）は、非蛍光性であるＤＣＦ－ＤＡを酸化させて蛍光物質ＤＣＦに転換させるが、粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞に対するアカモク抽出物（ＳＨＥ）の抗酸化効果を評価するために、ＤＣＦの蛍光強度を測定した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞を２４ウェルプレートに１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注して１２時間培養した後、ＳＨＥ（６２．５、１２５、２５０μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（６２．５、１２５μｇ／ｍｌ）を処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した。その後、細胞を収穫し、冷たいＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、２５μＭのＤＣＦ－ＤＡを処理し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３０分間培養した後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＤＣＦの蛍光強度を測定した。

（３）結果を図３に示した。細胞毒性を示す粒子状物質をＭＬＥ－１２細胞に６２．５、１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理した場合には、濃度依存的にＲＯＳの生成が増加し、ＳＨＥを６２．５、１２５、２５０μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合には、ＲＯＳ生成が減少する傾向を示した。特に粒子状物質１２５μｇ／ｍｌとＳＨＥ１２５、２５０μｇ／ｍｌを並行処理した場合には、ＲＯＳ生成率がそれぞれ５．３倍、４．０倍減少した（図３のＡおよびＢ）。

＜実験例４＞粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が脂質過酸化に及ぼす影響
（１）脂質過酸化（ｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の尺度であるマロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）（以下「ＭＤＡ」という）の含有量を測定し、粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞に対するアカモク抽出物（ＳＨＥ）の脂質過酸化抑制効果を評価した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞を１０ｃｍのディッシュ（ｄｉｓｈ）に１×１０^６で分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養して細胞を付着させた。その後、ＳＨＥ（６２．５、１２５μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（６２．５、１２５μｇ／ｍｌ）を処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで６、２４、４８時間培養した。その後、細胞を収穫して冷たいＤＰＢＳで洗浄し、ＮＥ－ＰＥＲ（登録商標）ＮｕｃｌｅａｒａｎｄＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）にプロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）（２ｍＭＮａ_３ＶＯ_４、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ））を添加してタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質に１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）を添加してアイス（ｉｃｅ）で１０分間反応させた後、４℃、２０００ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を分離した。上澄み液と同量の０．６７％（ｗ／ｖ）チオ安息香酸（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃａｃｉｄ）（ＴＢＡ、０．６７％（ｗ／ｖ）ｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎ５０ｍＭＴＢＡ）を添加して１００℃で１０分間加熱した後、４℃、１０００ｇで１０分間遠心分離し、しかる後に、上澄み液を５３２ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を用いて吸光度を測定した。

（３）結果を図４に示した。ＭＬＥ－１２細胞を濃度１２５μｇ／ｍｌの粒子状物質と一緒に６、２４、４８時間培養したとき、ＭＤＡの含有量が有意に増加した。特に２４時間培養した場合には、ＭＤＡの含有量が粒子状物質を処理していない対照群と比較して２．５倍増加した。また、ＳＨＥを６２．５、１２５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合には、６、２４、４８時間でいずれもＭＤＡの含有量が濃度依存的に有意に減少した（図４）。

＜実験例５＞粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が酸化的ストレスによるＤＮＡ損傷に及ぼす影響
（１）８－ＯＨｄＧ（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）は、酸化的ストレスによるＤＮＡ損傷の指標であって、ＤＮＡを構成する塩基のうち、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）分子の８番目の位置にある水酸化基の酸化が起こりながら８－ＯＨｄＧが生成される（Ｐａｒｔｉｃｌｅａｎｄｆｉｂｒｅｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１７，１４（３８））。８－ＯＨｄＧは、酸化的ストレスを誘発するＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）によるＤＮＡ損傷程度を評価する指標として用いられる。したがって、粒子状物質をＭＬＥ－１２細胞に処理して粒子状物質によるＤＮＡ損傷程度とアカモク抽出物（ＳＨＥ）のＤＮＡ損傷抑制効果をＩＣＣ（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ）を介して確認した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞を、コーティングされたカバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）入りの１２ウェルプレートに８×１０^４で分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養して細胞を付着させた。その後、ＳＨＥ（６２．５、１２５μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（１２５μｇ／ｍｌ）を処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。次いで、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ｉｎＰＢＳ、ｐＨ７．４）を入れて細胞を固定した後、再度洗浄してＩＣＣ（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行った。ＭＬＥ－１２細胞における８－ＯＨｄＧの発現を確認するために、８－ＯＨｄＧ抗体（１：１０００）を常温で１時間反応させた後、反応が終わったら、ビオチン化抗ヤギＩｇＧ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ｇｏａｔＩｇＧ）を室温で３０分間反応させた後、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて発色させ、陽性反応の現れた細胞をヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液で対照染色した後、光学顕微鏡で観察した。

（３）光学顕微鏡で観察した結果を図５に示した。８－ＯＨｄＧの発現を確認した結果、ＭＬＥ－１２細胞において、粒子状物質未処理群（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）と比較して粒子状物質単独処理群（Ｄｕｓｔｏｎｌｙｇｒｏｕｐ）で８－ＯＨｄＧの発現が増加した（図５のＡ及びＢ）。粒子状物質とＳＨＥを並行処理した場合には、粒子状物質単独処理群（Ｄｕｓｔｏｎｌｙｇｒｏｕｐ）と比較して、ＳＨＥを並行処理した群で８－ＯＨｄＧの発現が減少し、ＳＨＥの濃度が高いほど８－ＯＨｄＧの発現を効果的に減少させることを確認した（図５のＣ及びＤ）。

＜実験例６＞粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が炎症性サイトカインとケモカイン発現に及ぼす影響
（１）定量的逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて炎症性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８）とケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）（ＭＣＰ１、ＣＣＬ５）、炎症性媒介因子（ＣＯＸ－２）のｍＲＮＡ発現量を測定し、粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞に対するアカモク抽出物（ＳＨＥ）の抗炎症効果を評価した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞を１０ｃｍのディッシュに５×１０^６で分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養して細胞を付着させた。その後、ＳＨＥ（６２．５、１２５μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（１２５μｇ／ｍｌ）を処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３、２４、４８時間培養した。次いで、細胞を収穫して冷たいＤＰＢＳで洗浄し、ＴＲＩｚｏｌｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡを分離した。その後、５００μｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してよく混合し、１５，０００ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を取った後、イソプロパノールを添加して４℃、１２，０００ｇ、１０分間遠心分離した。遠心分離の後、ＲＮＡペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を７０％ＥｔＯＨで洗浄し、常温で乾燥させ、ｐｒｏｍｅｇａＡ３５００ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＣａｍＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。また、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）とＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲを行った。本実験で使用したプライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）は、以下の通りである。
ＩＬ－１β：
５’－ＧＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＧＴＣＧ－３’、
５’－ＴＴＧＴＣＧＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＣＴＴＧ－３’、
ＴＮＦ－α：
５’－ＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＣ－３’、
５’－ＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＡＣＧ－３’、
ＭＣＰ１：
５’－ＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧ－３’、
５’－ＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣ－３’、
ＣＣＬ５：
５’－ＧＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧ－３’、
５’－ＧＧＣＴＡＧＧＡＣＴＡＧＡＧＣＡＡＧＣＡＡＴＧＡＣ－３’、
ＣＯＸ２：
５’－ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣ－３’、
５’－ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧ－３’、
ＧＡＰＤＨ：
５’－ＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣ－３’、
５’－ＴＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＣ－３’。

（３）結果を図６及び図７に示した。ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して３、２４および４８時間培養したとき、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ１、ＣＣＬ５、ＣＯＸ－２のｍＲＮＡ発現が、粒子状物質を処理していない群と比較していずれも増加し、ＳＨＥを６２．５、１２５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理したときには、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ１、ＣＣＬ５、ＣＯＸ－２のｍＲＮＡ発現量が有意に減少した。

＜実験例７＞粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が炎症性サイトカインの分泌機序に及ぼす影響
（１）細胞成長、細胞分化、細胞死滅などの様々な細胞内機序に関与する細胞伝達機序であるＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）のＭＡＰ－ｋｉｎａｓｅｐ３８、ｃ－ＪｕｎＮ－ｔｅｒｎｉｍａｌｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）の発現量を測定して、粒子状物質によって損傷したＭＬＥ－１２細胞に対してアカモク抽出物（ＳＨＥ）がＭＡＰＫシグナル経路（ｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ）に及ぼす影響を確認した。

（２）ＭＬＥ－１２細胞を１０ｃｍのディッシュに１×１０^７で分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１２時間培養して細胞を付着させた。その後、ＳＨＥ（６２．５、１２５μｇ／ｍｌ）と粒子状物質（１２５μｇ／ｍｌ）を処理して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで３、２４、４８時間培養した。ＭＬＥ－１２細胞のサイトゾルタンパク質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＮＥ－ＰＥＲ（登録商標）ＮｕｃｌｅａｒａｎｄＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を用いて分離した。サイトゾルタンパク質４０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０～１２％）を用いて電気泳動し、分離されたタンパク質は、ニトロセルロースメンブレン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて１００Ｖで１２０分間転移させた。その後、非特異的反応を抑制するために、２％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｉｌｋ）（ｍａｅｉｌ、ＳｏｕｔｈｏｆＫｏｒｅａ）を用いて室温で１時間反応させ、ｐ３８（１：１０００、ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８（１：１０００、ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＥＲＫ（１：１０００、ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ（１：１０００、ＣｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＪＮＫ（１：２００、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ｐ－ＪＮＫ（１：２００、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）抗体を用いて１時間反応させた後、４℃で一晩反応させた。その後、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ）、抗ウサギＩｇＧ（ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ）（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて４５分間反応させた。Ｗｅｓｔｚｏｌ（ｔＮｔＲＯＮＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）を用いて発色を得、ＦｕｓｉｏｎＳｏｌｏ（登録商標）（ＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔ、Ｅｂｅｒｈａｒｄｚｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてバンドイメージを得た。バンドイメージは、ＩｍａｇｅＪｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ１．４６）を用いて分析した。β－ａｃｔｉｎ（１：２０００、Ｓｉｇｍａ、ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、ＵＳＡ）との発現程度を比較して強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を求めた。

（３）結果を図８に示した。ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して３時間培養したとき、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫのリン酸化を増加させた。ＥＲＫは、ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して３時間培養した場合には粒子状物質を処理していない群よりもリン酸化が３．４倍増加し、ＳＨＥを６２．５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が２．０倍減少し、ＳＨＥを１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理した場合にはリン酸化が１４．０倍減少した（図８のＡ及びＢ）。ｐ３８は、ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して３時間培養した場合には粒子状物質を処理していない群よりもリン酸化が１．１倍増加し、ＳＨＥを６２．５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が１．３倍減少し、ＳＨＥを１２５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸が１．４倍減少した（図８のＡ及びＣ）。ｐ３８は、ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して２４時間培養したときには、粒子状物質を処理していない群よりもリン酸化が２．４倍増加し、ＳＨＥを６２．５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が２．５倍減少し、ＳＨＥを１２５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が４．６倍減少した（図８のＡ及びＣ）。ＪＮＫは、ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して３時間培養した場合には粒子状物質を処理していない群よりもリン酸化が３．０倍増加し、ＳＨＥを６２．５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が１．２倍減少し、ＳＨＥを１２５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が１．１倍減少した（図８のＡおよびＤ）。また、ＪＮＫは、ＭＬＥ－１２細胞に粒子状物質を１２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して２４時間培養した場合には粒子状物質を処理していない群よりもリン酸化が１．４倍増加し、ＳＨＥを６２．５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が１．３倍減少し、ＳＨＥを１２５μｇ／ｍｌの濃度で並行処理した場合にはリン酸化が１．４倍減少した（図８のＡおよびＤ）。

＜実験例８＞実験動物モデル
＜実験例８－１＞実験群の構成と試料投与
実験動物は、７～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、各グループあたり４匹ずつ分けて使用した。実験群は健常対照群（以下、Ｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）、粒子状物質単独吸入群（以下、Ｄｕｓｔｏｎｌｙｇｒｏｕｐ）、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（以下、ＯＶＡ）感作群（以下、ＯＶＡｏｎｌｙ）、ＯＶＡ感作＋粒子状物質吸入群（以下、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔｇｒｏｕｐ）、ＯＶＡ感作＋粒子状物質吸入及び試料並行投与群（以下、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００ｍｇ／ｋｇ、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇｇｒｏｕｐ）、ＯＶＡ感作＋粒子状物質吸入及びアレルギー性呼吸器炎症薬（プレドニゾン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ））投与群（ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ５ｍｇ／ｋｇｇｒｏｕｐ）に分けて実験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０μｇのＯＶＡと２ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３、２００μｌの生理食塩水と一緒によく混ぜた後、１回腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ、ｉ．ｐ．）した。１５日後に粒子状物質吸入群に５ｍｇ／ｍ^３の濃度で３０分ずつ７日間ネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）を用いて毎日、粒子状物質を吸入させた。粒子状物質の吸入と共に、ＳＨＥ並行投与群にはＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇの濃度で毎日経口投与させ、アレルギー性呼吸器炎症薬処理群にはプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）を５ｍｇ／ｋｇの濃度で毎日経口投与した（図９）。

＜実験例８－２＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が血液の白血球百分率の変化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）に及ぼす影響
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、ヘパリン注射器を用いて心臓採血を介して採血し、各群別にマウスの血液を得た。その後、スライドグラスに薄く塗抹した後、ＤｉｆｆＱｕｉｃｋ溶液を用いて染色し、顕微鏡下で好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）の数を測定して比較した。

（２）ディファレンシャルセルカウント（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）結果を図１０および図１１に示した。健常対照群と比較してＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）の浸潤が有意に増加した（図１０のＡ及び図１１のＡとＢ）。ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００ｍｇ／ｋｇ群では、好酸球の浸潤が６．６倍減少し、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では、好酸球の浸潤が１０．０倍減少した（図１１のＡ）。また、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）の浸潤が１．５倍（図１０のＡ）減少し、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）の浸潤が３．０倍（図１１のＢ）減少した。一方、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）と単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）の浸潤程度はＯＶＡと粒子状物質による変化が起こらなかった（図１０のＢおよびＣ）。

＜実験例８－３＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ、ＢＡＬＦ）の白血球百分率の変化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）に及ぼす影響
（１）気管支肺胞洗浄液に含まれている細胞は、肺組織及び気管支の炎症状態を反映するので（ＪＴｏｘｉｃｏｌＥｎｖｉｒｏｎＨｅａｌｔｈＡ２０１７，８０（４），１９７－２０７）、気管支肺胞洗浄液の白血球百分率の変化を観察して、粒子状物質の吸入による肺および気管支の炎症にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が及ぼす影響を確認した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、気管内カテーテルを用いて気道内にＤＰＢＳを注入して気管支肺胞洗浄液を採取した。採取した気管支肺胞洗浄液を４℃で３０００ｇ、５分間遠心分離した後、メタノールで固定し、スライドに付着させた。細胞が付着したスライドは、Ｄｉｆｆ－Ｑｉｃｋ溶液を用いて染色し、顕微鏡下で好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）の数を測定して比較した。

（３）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｕｎｔ結果を図１２および図１３に示した。健常対照群に比べてＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群でリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）と好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）の浸潤が有意に増加し（図１２のＢ及び図１３のＡ）、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群とアレルギー性呼吸器炎症薬を並行投与した群では、リンパ球、好酸球の浸潤が有意に減少し、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）は有意性がなかったが、減少する傾向を示した（図１２のＢ、図１３のＡ及びＢ）。これに対し、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）と単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）の浸潤程度はＯＶＡと粒子状物質による変化が起こらなかった（図１２のＡ及びＣ）。

＜実験例８－４＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が気管と肺の病理組織学的変化に及ぼす影響
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して気管（ｔｒａｃｈｅａ）と肺を採取した後、常法によってパラフィンブロックを製作した。パラフィンブロックを３μｍに薄切し、スライドに付着させた後、脱パラフィン、含水過程を経た後、マイヤーヘマトキシリン（Ｍａｙｅｒ’ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液とエオシン（ｅｏｓｉｎ）溶液を用いて染色し、脱水及び透明過程を経て封入した。

（２）結果を図１４に示した。健常対照群に比べてＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群の気管で炎症細胞の浸潤が有意に増加したが（図１４のＡ）、これに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００ｍｇ／ｋｇ群で気管内炎症細胞の浸潤が減少し、特にＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群ではアレルギー性呼吸器炎症薬を並行投与した群と同様に効果的に炎症細胞の浸潤が減少したことを確認した（図１４のＡ）。肺組織も気管と同様に、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群の気管で炎症細胞の浸潤が有意に増加したが（図１４のＢ）、これに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群ではＳＨＥ濃度依存的に肺組織内炎症細胞の浸潤が顕著に減少した（図１４のＢ）。図１４のグラフにおいて、０：ｎｏｒｍａｌ、１：ｆｅｗｃｅｌｌｓｏｂｓｅｒｖｅｄ、２：ａｒｉｎｇｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｏｎｅｃｅｌｌｌａｙｅｒｄｅｅｐ、３：ａｒｉｎｇｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ２～４ｃｅｌｌｓｄｅｅｐ、及び４：ａｒｉｎｇｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ＞４ｃｅｌｌｓｄｅｅｐを示した。

＜実験例８－５＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が肺の８－ＯＨｄＧ発現の変化に及ぼす影響
（１）８－ＯＨｄＧ（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）は、酸化的ストレスによるＤＮＡ損傷の指標であって、ＤＮＡを構成する塩基のうち、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）分子の８番目の位置にある水酸化基の酸化が起こりながら８－ＯＨｄＧが生成される。８－ＯＨｄＧは、酸化的ストレスを誘発するＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）によるＤＮＡ損傷程度を評価する指標として用いられる（Ｐａｒｔｉｃｌｅａｎｄｆｉｂｒｅｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１７，１４（３８））。したがって、粒子状物質の吸入による酸化的ストレスの程度とアカモク抽出物（ＳＨＥ）の抗酸化効果をＩＨＣ（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を介して確認した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して肺組織を採取し、常法によってパラフィンブロックを製作した。パラフィンブロックは、３μｍに薄切してスライドに付着させた後、ＩＨＣ（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行った。８－ＯＨｄＧの発現を確認するために、８－ＯＨｄＧ抗体（１：２０００）を常温で１時間反応させた後、再び４℃で一晩反応させた。反応が終わった後、ビオチン化抗ヤギＩｇＧ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ｇｏａｔＩｇＧ）を室温で反応させた後、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて発色させ、陽性反応の現れた細胞をヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液で対照染色した後、光学顕微鏡で観察した。

（３）８－ＯＨｄＧの発現を確認した結果を図１５に示した。好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）と好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、上皮細胞の核において、健常対照群と比較して、Ｄｕｓｔｏｎｌｙ群、ＯＶＡｏｎｌｙ群、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で８－ＯＨｄＧ陽性細胞が有意に増加したが、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００ｍｇ／ｋｇ群、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群で８－ＯＨｄＧ陽性細胞が有意に減少し、特にＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では薬物並行投与群であるＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ５ｍｇ／ｋｇ群と同様のレベルに８－ＯＨｄＧ陽性細胞が著しく減少した。

＜実験例８－６＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が気管と肺のＧｒ－１発現の変化に及ぼす影響
（１）Ｇｒ－１は、顆粒球の分化と成熟に関与する顆粒球マーカーであって、感染などが起こったとき、サイトカインを分泌して免疫機序に作用することが知られている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２０１２，３６（３），４５１－６３）。したがって、粒子状物質の吸入による気管（ｔｒａｃｈｅａ）と肺組織の顆粒球浸潤にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が及ぼす影響を確認した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して気管と肺組織を採取し、常法によってパラフィンブロックを製作した。パラフィンブロックを３μｍに薄切してスライドに付着させた後、脱パラフィン、含水過程を経て、組織内の内因性ペルオキシダーゼを抑制するために、０．３％の過酸化水素溶液に浸漬しておいた。その後、非特異的免疫反応を抑制するために、ブロッキングラット血清（ｂｌｏｃｋｉｎｇｒａｔｓｅｒｕｍ）を３０分間反応させた後、ｍｏｕｓｅＬｙ－６Ｇ／Ｌｙ－６Ｃ（１：２００、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を４℃で一晩反応させた。反応が終わった後、ビオチン化抗ウサギ血清（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍ）を室温で４５分間反応させた後、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて発色させ、ヘマトキシリン溶液で対照染色した。それぞれの段階の間には、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）、０．３％ＰＢＳ－ｔｒｉｔｏｎＸ１００で十分洗浄し、脱水および透明化過程を経た後、封入した。

（３）結果を図１６に示した。健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群の気管で顆粒球の浸潤が５．２倍有意に増加したのに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では顆粒球の浸潤が減少し、特にＳＨＥを４００ｍｇ／ｋｇで並行投与した場合に２．２倍有意に減少した。これは、アレルギー性呼吸器炎症薬を並行投与した群と同様のレベルに顆粒球の浸潤が減少したことを確認した（図１６のＡ）。肺組織においても、気管と同様に、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群の気管で顆粒球の浸潤が５．６倍明らかに増加したのに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では顆粒球の浸潤がそれぞれ１．５、１．７倍有意に減少した（図１６のＢ）。これは、アレルギー性呼吸器炎症薬を並行投与した群と同様のレベルに顆粒球の浸潤が減少して（健常対照群と比較して顆粒球の浸潤が２．０倍減少）、ＳＨＥの投与が粒子状物質による気管と肺組織での顆粒球の浸潤を効果的に抑制することを確認した。

＜実験例８－７＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が気管および肺組織の好酸性白血球の浸潤に及ぼす影響
（１）慢性アレルギー性呼吸器炎症疾患の特徴的な病理的所見は、好酸球性白血球の増加であり、炎症性タンパク質を含有している好酸球は、気道上皮細胞の損傷を誘導し、気道過敏性を増加させ、肥満細胞の脱顆粒を誘導してアレルギー性呼吸器炎症の発症に重要な役割を果たす（ＷｏｒｌｄＡｌｌｅｒｇｙＯｒｇａｎＪ２０１６，９，７）。したがって、粒子状物質の吸入による気管と肺組織の好酸球性白血球の浸潤にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が及ぼす影響を確認した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して気管と肺組織を採取し、常法によってパラフィンブロックを製作した。パラフィンブロックを３μｍに薄切してスライドに付着させた後、０．０５％Ｃｏｎｇｏｒｅｄｉｎ５０％ＥｔＯＨ溶液を用いて組織を染色し、封入した。

（３）結果を図１７に示した。健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群の気管で好酸球性白血球の浸潤が４．４倍有意に増加したのに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では好酸球性白血球の浸潤が減少する傾向を示し、特にＳＨＥを４００ｍｇ／ｋｇ並行投与した群では１．９倍有意に好酸球性白血球の浸潤が減少した（図１７のＡ）。肺組織においても、気管と同様に、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群の気管で好酸球性白血球の浸潤が明らかに増加し、ＳＨＥを並行投与した場合には好酸球性白血球の浸潤が濃度依存的に減少する傾向を示し、特にＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では好酸球の浸潤が１．７倍減少した（図１７のＢ）。

＜実験例８－８＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が気管の肥満細胞の浸潤に及ぼす影響
（１）肥満細胞（ｍａｓｔｃｅｌｌ）は、主に結合組織と粘膜に存在し、細胞質に顆粒を有することを特徴とするが、顆粒にはヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）などの化学的媒介体を含んでおり、肥満細胞が外部刺激によって活性化されるときに遊離して炎症反応、過敏反応などに関与して気管支の収縮や粘液の分泌の増加などを起こす（ＷｏｒｌｄＡｌｌｅｒｇｙＯｒｇａｎＪ２０１６，９，７）。したがって、粒子状物質の吸入による気管の肥満細胞の浸潤にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が及ぼす影響を確認した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して気管を採取し、常法によってパラフィンブロックを製作した。パラフィンブロックを３μｍに薄切してスライドに付着させた後、０．０５％トルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅ）溶液を用いて組織を染色し、封入した。

（３）結果を図１８に示した。健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で気管内に肥満細胞の浸潤が有意に増加し、また、ＯＶＡｏｎｌｙ群とＤｕｓｔｏｎｌｙ群よりも気管内に肥満細胞の浸潤が明らかに増加した（図１８のＡ）。これに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では、気管内の肥満細胞の浸潤が有意に減少した（図１８のＡ）。また、健常対照群と比較してＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で肥満細胞の脱顆粒率が増加し（図１８のＢ）、ＯＶＡｏｎｌｙ群とＤｕｓｔｏｎｌｙ群よりも肥満細胞の脱顆粒率が明らかに増加した（図１８のＢ）。ところが、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では、肥満細胞の脱顆粒率が減少し、特にＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では、薬物並行投与群であるＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ５ｍｇ／ｋｇ群よりも効果的に肥満細胞の脱顆粒率を減少させた（図１８のＢ）。

＜実験例８－９＞粒子状物質を吸入させた動物モデルでアカモク抽出物（ＳＨＥ）が粘液の分泌及び杯細胞（ｇａｂｌｅｔｃｅｌｌ）の増殖に及ぼす影響
（１）外来物質によって反復的な気道炎症に晒される場合、気道リモデリング（ａｉｒｗａｙｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が起こるが、杯細胞の増加と粘液腺の増殖（ｍｕｃｏｕｓｇｌａｎｄｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）などの症状が現れる（Ｃｈｅｓｔ２０１８，１５４（１），１６９－１７６）。したがって、粒子状物質の吸入による粘液の分泌及び杯細胞の増殖にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が及ぼす影響を確認した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して気管と肺組織を採取し、常法によってパラフィンブロックを製作した。パラフィンブロックを３μｍに薄切してスライドに付着させた後、ＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄｏｆＳｃｈｉｆｆ）染色を行った。また、抗ムチン５ＡＣ抗体（ａｎｔｉ－ｍｕｃｉｎ５ＡＣａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｒ＆Ｄａｂｃａｍ）染色のためにパラフィンブロックを３μｍに薄切してスライドに付着させた後、脱パラフィン、含水過程を経て、組織内の内因性ペルオキシダーゼを抑制するために０．３％過酸化水素溶液に浸漬しておいた。その後、非特異的免疫反応を抑制するために、ブロッキング馬血清（ｂｌｏｃｋｉｎｇｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ）を３０分間反応させた後、抗ムチン５ＡＣ抗体（ａｎｔｉ－ｍｕｃｉｎ５ＡＣａｎｔｉｂｏｄｙ）（１：５００、Ｒ＆Ｄａｂｃａｍ）を４℃で一晩反応させた。反応が終わった後、ビオチン化抗マウス血清（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍ）を室温で４５分間反応させ、しかる後に、３，３’－ジアミンベンジジン（ＤＡＢ、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて発色させ、ベマトキシリン溶液で対照染色した。それぞれの段階の間には、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）、０．３％ＰＢＳ－ｔｒｉｔｏｎＸ１００で十分洗浄し、脱水および透明化過程を経た後、封入した。

（３）結果を図１９及び図２０に示した。気管のＰＡＳとムチン（ｍｕｃｉｎ）－５ＡＣ抗体に対する免疫組織化学染色結果から、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で粘液の分泌が増加し、杯細胞の過増殖が観察されたが、これに対し、ＳＨＥを並行投与した群では濃度依存的に粘液の分泌と杯細胞の増殖が減少し、特にＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では薬物並行投与群であるＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ５ｍｇ／ｋｇ群と同様のレベルに減少した（図１９のＡ及びＢ）。一方、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群では、ＯＶＡｏｎｌｙ群とＤｕｓｔｏｎｌｙ群よりも気管内への粘液の分泌が明らかに増加した（図１９のＢ）。

（４）また、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で肺組織からの粘液の分泌が増加し、杯細胞の過増殖が観察されたのに対し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では、粘液の分泌と杯細胞の増殖が濃度依存的に減少し、薬物並行投与群であるＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ５ｍｇ／ｋｇ群と同様のレベルに減少した（図２０のＡ及びＢ）。

＜実験例８－１０＞粒子状物質を吸入させた動物モデルの肺組織でアカモク抽出物（ＳＨＥ）が細胞集団の変化に及ぼす影響
（１）アレルギー性呼吸器炎症疾患は、免疫系が関与する慢性炎症性疾患であって、Ｔ細胞と好酸球の浸潤、肥満細胞と好塩基球の活性化などが特徴的である（ＷｏｒｌｄＡｌｌｅｒｇｙＯｒｇａｎＪ２０１６，９，７）。したがって、粒子状物質の吸入による免疫細胞集団の変化にアカモク抽出物（ＳＨＥ）が及ぼす影響を調べるために、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて分析した。

（２）ＢＡＬＢ／ｃマウスを安楽死させた後、剖検して肺を採取し、薄切して０．４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を加えて３７℃で３０分間反応させ、８～１０分ごとによく混ぜた。その後、ＰＢＳを添加して１５００ｒｐｍで５分間よく混ぜ、赤血球溶解のためにＡＣＫ溶液を添加して１０分間常温で反応させた後、ＤＰＢＳで洗浄した。肺の単一細胞浮遊液にＦｃｂｌｏｃｋｅｒを４℃で１５分間反応させて非特異的反応を減少させた。その後、ＦＩＴＣ－またはＰＥ－、ＰｅｒＣｐ－ＣｙＴＭ５．５－、ＢＶ４２１－、ＡＦ７００－標識ＣＤ３ｅ（１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ４（Ｈ１２９．１９）、ＣＤ８ａ（５３－６．７）、ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）抗体を４℃で１５分間反応させた。その後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、ＫｒａｅｍｅｒＢｌｖｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。

（３）結果を図２１に示した。健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群でＣＤ３ｅ^＋ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ）の数が１．３倍に増加し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ４００ｍｇ／ｋｇ群では１．２倍有意に減少した（図２１のＡ）。また、ＣＤ３ｅ^＋ＣＤ８^＋細胞毒性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌ）の数も、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で有意に増加し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群ではそれぞれ１．５倍、２．０倍有意に濃度依存的に減少した（図２１のＢ）。ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｃ^＋樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）の数は、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で４．０倍に増加し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群ではそれぞれ１．３倍、１．４倍有意に濃度依存的に減少した（図２１のＣ）。ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ１１ｂ^＋マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の数も、健常対照群と比較して、ＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ群で増加する傾向を示し、ＳＨＥを並行投与したＯＶＡ＋Ｄｕｓｔ＋ＳＨＥ２００、４００ｍｇ／ｋｇ群では有意に減少した（図２１のＤ）。

統計処理
各実験は、３回以上繰り返し（各群当りｎ＝３以上）実施した。それぞれの実験結果は、平均値±標準偏差で表し、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌのスチューデントｔ－検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ－ｔｅｓｔ）を用いて＊＊；Ｐ＜０．００５、＊＊＊；Ｐ＜０．０００５、††；Ｐ＜０．００５、†††；Ｐ＜０．０００５、＃；Ｐ＜０．０５のレベルで有意性を検定した。

Claims

アカモク抽出物を有効成分として含む肺損傷改善用組成物の製造方法であって、
前記抽出物は、下記の方法で得られる上澄み液またはその濃縮物であり、
前記上澄み液は、アカモク全草の水、エタノールまたはこれらの混合溶媒抽出物に食品用白土を処理して遠心分離し、上澄み液を回収した後、その上澄み液に水とエタノールとの混合溶媒を添加して静置した後、遠心分離し、濾過して得られ、
前記濃縮物は、前記濾過して得られた上澄み液を濃縮して得られることを特徴とする肺損傷改善用組成物の製造方法。
前記肺損傷が粒子状物質による肺損傷である、請求項１に記載の組成物の製造方法。
前記組成物が食品組成物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物の製造方法。
前記組成物が薬学的組成物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物の製造方法。
アカモク抽出物を有効成分として含む肺機能改善用組成物の製造方法であって、
前記抽出物は、下記の方法で得られる上澄み液またはその濃縮物であり、
前記上澄み液は、アカモク全草の水、エタノールまたはこれらの混合溶媒抽出物に食品用白土を処理して遠心分離し、上澄み液を回収した後、その上澄み液に水とエタノールとの混合溶媒を添加して静置した後、遠心分離し、濾過して得られ、
前記濃縮物は、前記濾過して得られた上澄み液を濃縮して得られることを特徴とする肺機能改善用組成物の製造方法。
前記組成物が食品組成物であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物の製造方法。
前記組成物が薬学的組成物であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物の製造方法。
アカモク抽出物を有効成分として含む呼吸器疾患改善用組成物の製造方法であって、
前記抽出物は、下記の方法で得られる上澄み液またはその濃縮物であり、
前記上澄み液は、アカモク全草の水、エタノールまたはこれらの混合溶媒抽出物に食品用白土を処理して遠心分離し、上澄み液を回収した後、その上澄み液に水とエタノールとの混合溶媒を添加して静置した後、遠心分離し、濾過して得られ、
前記濃縮物は、前記濾過して得られた上澄み液を濃縮して得られることを特徴とする呼吸器疾患改善用組成物の製造方法。
前記呼吸器疾患が粒子状物質による呼吸器疾患であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物の製造方法。
前記呼吸器疾患が喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管炎、気管支炎または鼻炎であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物の製造方法。
前記呼吸器疾患が慢性閉塞性肺疾患であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物の製造方法。
前記組成物が食品組成物であることを特徴とする、請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
前記組成物が薬学的組成物であることを特徴とする、請求項８乃至１１のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
アカモク抽出物を有効成分として含む喀痰分泌抑制用組成物の製造方法であって、
前記抽出物は、下記の方法で得られる上澄み液またはその濃縮物であり、
前記上澄み液は、アカモク全草の水、エタノールまたはこれらの混合溶媒抽出物に食品用白土を処理して遠心分離し、上澄み液を回収した後、その上澄み液に水とエタノールとの混合溶媒を添加して静置した後、遠心分離し、濾過して得られ、
前記濃縮物は、前記濾過して得られた上澄み液を濃縮して得られることを特徴とする喀痰分泌抑制用組成物の製造方法。
前記組成物が食品組成物であることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物の製造方法。
前記組成物が薬学的組成物であることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物の製造方法。