JP7007828B2 - ミトコンドリア機能向上剤 - Google Patents

Description

特許法第３０条第２項適用 ▲１▼掲載年月日：平成２９年２月１日 掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１３７／ｐｃ／ｉｐｄｆｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｉ＝１５７ ▲２▼集会名：日本薬学会第１３７年会（仙台） 開催場所：仙台国際センター（宮城県仙台市青葉区青葉山無番地） 開催日：平成２９年３月２６日

本発明は、ミトコンドリアエネルギー産生促進効果を有する新規成分を含有するミトコンドリア機能向上剤に関する。

ミトコンドリアにおいて、酸素は電子伝達系の最終的な電子の受け取り手として働く。低酸素環境下では、受け取り手を失った電子によって活性酸素（Reactive Oxygen Species；ＲＯＳ）が産生され、細胞の障害が引き起こされる結果、エネルギー産生が低下する。

このようなエネルギー産生を低下させる低酸素環境は、運動による消費酸素増大時の酸素不足、運動不足や加齢などによる心肺機能低下時の酸素不足、疲労やストレスなどによる自律神経不均衡時の酸素不足、ストレスなどによる浅呼吸時の酸素不足など、日常活動のあらゆる場面で晒される環境であり、現代人にとってその回避は困難である。

ミトコンドリアのエネルギー産生を高める有効成分として、ピロロキノリンキノンが知られている（例えば、特許文献１参照）。ピロロキノリンキノンは抗酸化物質として機能する成分であり、ミトコンドリア内の活性酸素を除去する作用機序によりエネルギー産生を高める。しかしながら、ピロロキノリンキノンは腎臓に対する強い毒性も報告されており、安全域が狭いという問題がある。

国際公開第２００６／０２５２４７号

上述のように、ミトコンドリアのエネルギー産生を低下させる低酸素環境は現代人にとって日常生活のあらゆる場面で晒されるものである。したがって、ミトコンドリアのエネルギー産生を高める成分としては、日常的に摂取可能な成分であることが望まれる。本発明者はそのような成分の探索のため、ミトコンドリアの機能を高める作用機序として、強い毒性を有するピロロキノリンキノンのような抗酸化作用によるミトコンドリア内の活性酸素の除去とは異なる作用機序に着目した。

ミトコンドリア電子伝達系を構築するタンパク質の１つとして、例えばチトクロムCオキシダーゼサブユニットIV（ＣＯＸ－IV）が知られている。ＣＯＸ－IVが正常に発現することにより電子の受け渡しがなされ、ミトコンドリア代謝が維持される結果、ＲＯＳの産生が抑制されてエネルギー産生能が維持される。一方、低酸素環境下ではＣＯＸ－IVの発現が抑制されるため、このようなミトコンドリアの機能は低下する。

そうすると、ＣＯＸ－IVのようにミトコンドリア電子伝達系に関連する物質の発現を促進する作用機序を生じさせる成分であれば、低酸素環境下であってもミトコンドリアの機能を向上させる成分として期待できる。しかしながら、そのような作用機序によってミトコンドリアの機能を向上させる成分は知られていない。

そこで、本発明の目的は、ミトコンドリア電子伝達系に関連する物質の発現を促進することでミトコンドリアの機能を向上させる剤を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、杜仲葉などの植物に含まれるアスペルロシドによってＣＯＸ－IVの発現が促進されることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． アスペルロシドを含有するミトコンドリア機能向上剤。
項２． チトクロムCオキシダーゼサブユニットIVの発現を促進する、項１に記載のミドコンドリア機能向上剤。
項３． 杜仲葉エキスを含有するミトコンドリア機能向上剤。
項４． チトクロムCオキシダーゼサブユニットIVの発現を促進する、項３に記載のミドコンドリア機能向上剤。

本発明のミトコンドリア機能向上剤によれば、杜仲葉などの植物に含まれるアスペルロシドの新たな作用機序によってミトコンドリア機能を向上させることが可能となる。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、アスペルロシドを含む。アスペルロシドは、天然物に含まれるイリドイド配糖体化合物の一種として知られている成分である。アスペルロシドとしては、天然物から取得されたアスペルロシドであってもよいし、化学合成により製造されたアスペルロシドであってもよい。

アスペルロシドを含有する天然物として、例えば杜仲（Eucommia ulmoides）、オオバコ（Plantago lanceolata）、ノニ（Morinda citrifolia）等の植物が挙げられる。植物は、栽培により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよい。使用する植物の部位は、アスペルロシドを含む部位であれば制限されず、全草、花、果実、葉、枝、樹皮、根茎、種子のいずれも使用できる。杜仲の場合は、好ましくは葉が例示され、オオバコの場合は、好ましくは種子が例示され、ノニの場合は、好ましくは葉が例示される。天然物からアスペルロシドを得る方法は従来公知である。本発明のミトコンドリア機能向上剤は、天然物からのアスペルロシドの単離精製物の態様で含んでいてもよいし、天然物からのアスペルロシドの粗精製物の態様で含んでいてもよい。

粗精製物の例としては、天然物の加工処理物が挙げられ、好ましくは杜仲葉、オオバコ種子、ノニ葉等の植物部位の加工処理物が挙げられる。加工処理物の具体的な態様としては、乾燥物、粉砕物（生及び乾燥物を含む）、エキスが挙げられ、好ましくはエキスが挙げられる。エキスとしては、搾汁、溶媒抽出物、溶媒抽出物のアスペルロシドを含む分画物等が挙げられる。また、エキスの具体的態様は、非濃縮エキス（濃縮処理されていないもの）、軟エキス（つまり液状濃縮物）及びエキス末（つまり乾燥物）が挙げられる。

上述のアスペルロシドの粗精製物のうち、アスペルロシドを所定量で含ませることが容易な点で、特に好ましくは杜仲葉エキスが挙げられる。アスペルロシドの粗精製物としての杜仲葉エキスを得る方法は特に限定されないが、例えば次のようにして得ることができる。杜仲葉エキスは、例えば、杜仲葉をそのままの生の状態で、または杜仲葉の乾燥物の状態で用意し、そのままの大きさで、または更に必要に応じて裁断または粉砕した後、溶媒抽出、超臨界抽出等の慣用の抽出方法に従って調製することができる。

杜仲葉の乾燥物を得る方法は特に限定されないが、例えば次のようにして得ることができる。杜仲葉の乾燥物は、杜仲葉を乾燥工程に供することで得ることができ、乾燥工程では、天日乾燥、遠赤外線照射、乾燥機（熱風乾燥、冷風乾燥、真空凍結乾燥）等の従来公知の方法が行われる。杜仲葉の乾燥物中の水分量としては、特に限定されないが、通常１２重量％以下、好ましくは８重量％以下、より好ましくは５重量％以下が挙げられる。

また、杜仲葉の乾燥物を得る方法においては、上述の乾燥工程に加えて、杜仲葉を蒸す工程、葉打ちする工程、揉捻する工程、乾燥する工程、焙煎する工程等の少なくともいずれかの工程を適宜組み合わせることができる。それぞれの工程を行う順番は任意であるが、例えば、杜仲葉を蒸す工程、葉打ちする工程、揉捻する工程は、乾燥工程の前に行うことができ、焙煎する工程は、乾燥工程の後に行うことができる。

より具体的には、杜仲葉の乾燥物を得る方法においては、例えば、杜仲生葉を天日乾燥し、１００～１４０℃で３０～５０分間焙煎することができる。また、例えば、杜仲生葉を蒸した後、これを揉捻し、更に必要に応じて熟成させながら乾燥し、更に得られた乾燥物を焙煎する方法も挙げられる。揉捻工程の前の蒸し工程における温度としては、例えば９０～１２０℃、好ましくは１００～１１０℃が挙げられ、時間としては、６０～１４０秒間が挙げられる。揉捻工程の後の乾燥工程においては、３～５日、好ましくは３～４日間、天日下に供してもよいし、６０～１００℃で３～１０時間、好ましくは４～８時間、乾燥機に供してもよい。この方法においては、さらに、杜仲生葉を温度１００～１１０℃で２０～１２０秒間蒸し、次いで揉捻し、天日で４～５日または乾燥機を用いて熟成させながら、水分量５％まで乾燥し、焙煎することが好ましい。

杜仲葉（生のもの）又は杜仲葉の乾燥物を裁断または粉砕する場合、適当な大きさに裁断または粉砕できる公知の方法が適宜用いられる。粉砕物の形状としては、粗粉状及び細粉状のいずれであってもよい。粉砕する場合、例えば前述のようにして得られた乾燥物を慣用の粉砕機（ジェットミル等）などに供することにより粉砕物を得ることができる。

杜仲葉の抽出方法としては特に限定されない。抽出溶媒としては、水（温水及び熱水を含む）、有機溶媒（メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール等の炭素数１～４の低級アルコール；プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール；アセトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類；キシレン、ベンゼン、クロロホルム等）、これらの混合物が挙げられ、好ましくは、水、低級アルコール、これらの混合物が挙げられ、より好ましくは、温水、熱水などの加熱水が挙げられ、更に好ましくは熱水が挙げられる。これらの溶媒は１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

抽出方法における具体的な条件は、アスペルロシドを抽出できる条件であれば特に制限されない。例えば、抽出溶媒として水を用いる場合、水に浸漬させる方法が挙げられる。浸漬中、必要に応じて攪拌を行ってもよい。水の量は、例えば杜仲葉１重量部（乾燥重量基準）に対して、１０～８００重量部、好ましくは１０～７００重量部、より好ましくは１０～５００重量部の割合になるように調整することができる。抽出時の水の温度としては、例えば２０～１００℃程度、好ましくは７０～９８℃程度が挙げられ、抽出時間としては、１～６０分、好ましくは５～４０分、より好ましくは１０～４０分が挙げられる。その後、固液分離を行うことで固形物を取り除き、抽出物を取得することができる。固液分離法としては常法を用いることができ、例えば濾過や遠心分離法等が挙げられる。

一度抽出に使用した杜仲葉は、再度抽出に供することもできる。また、得られる抽出物は、一種の抽出温度条件下で得られたものであってもよいし、異なる複数の抽出温度条件下で得られたものの混合物であってもよい。具体的には、例えば５０～６０℃程度で抽出した抽出物と７０～１００℃程度で抽出した抽出物とを混合して抽出物を得てもよい。なお、水以外の抽出溶媒を使用して抽出を行う場合や杜仲葉以外の天然物を使用する場合の抽出条件は、前記条件を参考にして当業者が適宜決定することができる。

なお、同種の天然物を用いた場合であっても、天然物の収穫年度や収穫月、生育期間、生育場所等によって天然物中のアスペルロシドの含有量は異なり、また、同時期に収穫した天然物であっても個体によってアスペルロシドの含有量が異なることも多い。このため、例えば同様の手順で抽出物を得ても同一組成の抽出物が得られるとは限らず、むしろアスペルロシドの含有量の異なる抽出物しか得られないことも多い。このことから、本発明のミトコンドリア機能向上剤は杜仲葉エキスを含むものとして調製される場合、得られた抽出物に他の抽出物を必要に応じて混合する、水等で希釈する、及び／又は濃縮する処理を行ったり、また、抽出物に、アスペルロシドの単離精製物及び／又は合成アスペルロシド等を混合する処理を行ったりして、アスペルロシドが所定の含有量となるように調製されることが好ましい。

抽出物の分画を得る方法としては、抽出物中に含まれるアスペルロシドを分画して精製度を高める方法であればよい。例えば、濾過処理；ポリスチレンゲル（ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体等）、イオン交換樹脂、活性炭等の担体を充填したカラムを用いた各種クロマトグラフィー等の吸着処理が挙げられる。このような処理によって、不純物に起因する色や臭いの除去をしてもよい。

得られたエキス（搾汁、溶媒抽出物、溶媒抽出物のアスペルロシドを含む分画物等）をミトコンドリア機能向上剤に含ませる場合、当該エキスは、そのままの濃縮されない非濃縮エキスの態様であってもよいし、濃縮された液状の軟エキスの態様であってもよいし、非濃縮エキスまたは軟エキスをさらに乾燥処理したエキス末であってもよい。乾燥処理としては、スプレードライ処理及び凍結乾燥処理が挙げられる。

アスペルロシドの単離精製物を得る方法としては特に限定されないが、上述の抽出物のアスペルロシドを含む分画物をさらに精製処理する方法が挙げられる。精製処理は、アスペルロシドを単離して精製度をさらに高める方法であればよく、常法に従って行うことができる。例えば、クロマトグラフィー等の分離処理や、再結晶処理等が挙げられる。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、投与（摂取）によって、体内のミトコンドリアの機能を向上させる。ミトコンドリアの機能を向上させるとは、ミトコンドリアのエネルギー産生能を促進することである。ミトコンドリアの機能向上においては、エネルギー産生能が相対的に低い状態（正常レベルか否かを問わない）においてエネルギー産生能を促進することで、エネルギー産生能が相対的に高い状態（正常レベルか否かを問わない）がもたらされる。ミトコンドリアの機能向上の例としては、低酸素状態となることでミトコンドリアのエネルギー産生能が低下した状態において、当該低下したエネルギー産生能を促進することで、非低酸素状態における正常のエネルギー産生能のレベルに引き上げることが挙げられる。ミトコンドリアの機能向上の他の例としては、非低酸素状態でミトコンドリアのエネルギー産生能が正常である場合において、予めエネルギー産生能を促進しておくことで、低酸素状態となってもエネルギー産生能が正常なレベルから逸脱しないようにエネルギー産生能の低下を予防することが挙げられる。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、ミトコンドリア電子伝達系を構築するタンパク質の１つであるチトクロムCオキシダーゼサブユニットIV（ＣＯＸ－IV）の発現を促進する。本発明のミトコンドリア機能向上剤は、ＣＯＸ－IVの発現を促進する作用によって、ミトコンドリア代謝を促進し、その結果、活性酸素（ＲＯＳ）の産生を抑制してエネルギー産生能を促進することができる。つまり、本発明のミトコンドリア機能向上剤によるミトコンドリアの機能向上においては、ＣＯＸ－IV発現量が相対的に低い状態（正常レベルか否かを問わない）においてＣＯＸ－IV発現を促進することで、ＣＯＸ－IV発現量が相対的に高い状態（正常レベルか否かを問わない）がもたらされる。ＣＯＸ－IV発現促進の例としては、低酸素状態となることでＣＯＸ－IV発現量が低下した状態において、ＣＯＸ－IV発現を促進することで、非低酸素状態における正常のＣＯＸ－IV発現量のレベルに引き上げることが挙げられる。ＣＯＸ－IV発現促進の他の例としては、非低酸素状態でＣＯＸ－IV発現量が正常である場合において、予めＣＯＸ－IV発現を促進しておくことで、低酸素状態となってもＣＯＸ－IV発現量が正常なレベルから逸脱しないようにＣＯＸ－IV発現量の低下を予防することが挙げられる。

本発明において、低酸素状態には、日常活動のあらゆる場面で生じる低酸素状態が含まれ、一時的に生じる低酸素状態と慢性的に生じる低酸素状態とのいずれも含まれる。低酸素状態の具体例としては、運動による消費酸素の増大時に酸素が不足した状態、動悸や息切れ等により酸素が不足した状態、運動不足や加齢などによる心肺機能低下時に酸素が不足した状態、疲労、ストレス、不定愁訴による自律神経不均衡時に酸素が不足した状態、ストレスなどによる浅呼吸時に酸素が不足した状態、疲労、倦怠感、食欲低下等の体調により酸素が不足した状態などが挙げられる。従って、本発明のミトコンドリア機能向上剤は、このような低酸素状態に抗ってエネルギー産生能を向上させるのに有効である。

なお、低酸素状態によるＣＯＸ－IVの発現低下は体内のいずれの部位においても生じうるが、本発明のミトコンドリア機能向上剤は、特に肝臓におけるＣＯＸ－IVの発現促進に有効に作用する。このため、低酸素状態としては、特に肝臓機能の低下と関わりの深い、疲労、倦怠感、食欲低下等の体調により酸素が不足した状態が好ましく挙げられる。従って、本発明のミトコンドリア機能向上剤は、このような肝臓機能の低下と関わりの深い体調による低酸素状態に抗ってエネルギー産生能を向上させるのに特に有効である。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、上述のアスペルロシド又は杜仲葉エキスを含む限り、その形態及び性状は特に限定されない。

本発明のミトコンドリア機能向上剤の形態としては、経口投与形態及び非経口投与形態（注射剤、点滴剤、点鼻剤、経皮吸収剤、坐剤など）のいずれもが含まれる。本発明のミトコンドリア機能向上剤は、植物に含まれるアスペルロシド又は杜仲葉エキスを有効成分とするものであり、日常活動のあらゆる場面で生じる低酸素状態に抗ってエネルギー産生能を向上させる目的で使用可能であるため、日常的及び／又は継続的な投与（摂取）が容易な経口投与形態であることが好ましい。

また、本発明のミトコンドリア機能向上剤の性状は、液状であってもよいし、固形状であってもよい。液状の例としては、液剤、飲料剤、乳剤、懸濁剤、酒精剤、シロップ剤、エリキシル剤、軟エキス剤等を含む）等が挙げられ、固形状の例としては、錠剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤（ハードカプセル及びソフトカプセルを含む）、トローチ剤、チュアブル剤、乾燥エキス剤等が挙げられる。本発明のミトコンドリア機能向上剤が固形状である場合、持続性または徐放性の剤形としてもよいし、投与（摂取）時に水等と混合するようにしてもよい。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、一般食品（飲料を含む）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、サプリメント等を含む）、病者用食品、医薬品、医薬部外品として使用することができ、また、他のミトコンドリア機能向上剤、食品、医薬品、医薬部外品等への添加剤等として使用することもできる。特に、日常的及び／又は継続的に気軽に摂取させる観点から、杜仲茶（特にアスペルロシド含有量を増加させた杜仲茶）やアスペルロシドを含む清涼飲料水として、又は、アスペルロシドを含むサプリメントや杜仲葉エキスを含むサプリメントとして使用することが好ましい。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、各種形態及び性状、並びに使用目的に応じて、従来公知の通常の手順に従い製造することができる。例えば、１種または２種以上の食品学的または薬学的に許容される賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、増量剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、コーティング剤、栄養成分等を必要に応じて用いて製造することができる。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、ヒトに投与する（摂取させる）場合、１日投与量中にアスペルロシドを体重１ｋｇ当たりの量として例えば５～３００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０～１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは１５～１５０ｍｇ／ｋｇ／日、一層好ましくは２０～１００ｍｇ／ｋｇ／日含ませることができる。また、杜仲葉エキスを含有するミトコンドリア機能向上剤の場合は、１日投与量中に杜仲葉エキスを体重１ｋｇ当たりの量として例えば４００～２４，０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは８００～１２，０００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは１，４００～１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日、一層好ましくは１，６００～８，０００ｍｇ／ｋｇ／日含ませることができる。

本発明のミトコンドリア機能向上剤は、ミトコンドリアのエネルギー産生能を向上させる必要がある人に対して用いることができる。例えば、運動を行う人、持久力を必要とする人に対して活動をサポートする目的で用いることができ、疲労感やストレスを感じている人、不定愁訴がある人に対して不快な体調を軽減する目的で用いることができ、更年期以降の人に対して日常活動をサポートする目的で用いることができる。特に、肝臓機能の低下と関わりの深い状態である、疲労感、倦怠感、食欲低下を感じている人に対して不快な体調を軽減する目的で用いることが好ましい。

本発明のミトコンドリア機能向上剤の投与（摂取）方法は特に限定されないが、例えば、１日１回又は複数回、経口的又は非経口的に行うことができ、好ましくは、１日１回又は２～３回、経口的に行うことができる。

以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

試験例
（低酸素モデルのラットの作製）
以下の方法によって、低酸素モデルのラットを作製した。
６週齢のWistar系雄性ラット (清水実験材料株式会社)に対し、１２時間(7:00-19:00が明)の明暗、室温２３℃、及び相対湿度５０～６０％の環境下で、コリン欠乏高脂肪飼料の自由摂餌・自由飲水の各条件により４週間飼育した。コリン欠乏高脂肪飼料（CDHF飼料、オリエンタル酵母工業株式会社）の組成は、8.000重量% ビタミンフリーカゼイン、37.950重量% ラード、48.375重量% シュークロース、4.000重量% ハーパーミネラル、1.050重量% ビタミン混合物、0.625重量% Ｌ-シスチンである。これによって、CDHF飼料給餌ラットを作製した。

得られたCDHF飼料給餌ラットに、亜硝酸ナトリウム液（pH7.4、生理食塩水に亜硝酸ナトリウムを溶解したもの）を３０ｍｇ／ｋｇ／日で６週間、腹腔内投与し、メトヘモグロビン血症を惹起させることで低酸素ストレス負荷を行った。これによって、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を形成した低酸素モデルのラットを作製した。

（杜仲葉エキスの調製）
（1）杜仲葉乾燥物の製造
杜仲葉乾燥物の製造は、特開平８－１７３１１０号公報の実施例２の記載に準じて行った。具体的には、杜仲の生葉５ｋｇを、日本茶製造用の送帯蒸機（宮村鉄工株式会社製の給葉機（地上型１５００）及びネットコンベア（送帯式１０００））により１１０℃で９０秒間蒸熱した。具体的には、生葉を送帯蒸機の投入口から機内に投入し、コンベヤ上を移動する間に上下スチーム供給装置からスチームを当て、１１０℃で９０秒間蒸熱した。次にこの蒸熱後の杜仲葉を、揉捻機を用いて３０分間揉捻した後、得られた揉捻物を乾燥機を用いて８０℃で水分量を５％以下に乾燥させた（以下、これを「杜仲葉乾燥物」という）。
（2）杜仲葉エキスの調製
上記（1）の製造方法に従って調製した杜仲葉乾燥物を、炒葉機（ＩＲ－１０ＳＰ型：寺田製作所）を用いて１１０℃で３０分間焙煎し、焙煎杜仲葉乾燥物を得た。このうち１ｋｇを９０℃の熱水１５ｋｇに投入し、９０℃で３０分間抽出し、抽出物１４ｋｇを得た。その後、これを１５０メッシュのフィルターを用いて濾過し、濾液を５℃に冷却し一晩放置した。上澄み液を取り出し、減圧下５０℃で濾液を濃縮し、１ｋｇの濃縮液を得た。得られた濃縮液を、遠心分離器（クボタ株式会社製、ＫＳ８０００）で回転速度１８００ｒｐｍにて遠心分離して沈殿物を除去し、得られた上澄み液を加熱殺菌（８５℃、２時間）し、杜仲葉水抽出液を得た。これをスプレードライ法により乾燥し、杜仲葉エキスを得た。得られた杜仲葉エキスには、アスペルロシドが１．１４重量％含まれていた。

（高純度のアスペルロシドの調製）
上記の「(1)杜仲葉乾燥物の製造」に従って調製した杜仲葉乾燥物を微粉砕化し、杜仲葉粉末とした。これを水に溶解し、これをDiaion HP20（三菱化学株式会社製）を充填したカラムに注入した。次いで、これに溶出液として水を注入して、水により溶出される成分を除去した。その後、３０容積％メタノール水溶液を注入し、溶出画分を得たのち、これを濃縮し固形物にした。これをメタノール水溶液（メタノール：水＝１：２（容積比））に溶解し、ＯＤＳカラム（充填剤：YMC S-15／30 120A ODS）に導入した。かかるカラムに移動層としてメタノール水溶液（メタノール：水＝１：２（容積比））を流速５００ｍＬ／分で送液し、ＵＶ２１５ｎｍでの吸光度を指標にしながらピーク分画した。得られた分画物はメタノールを減圧留去し、粗アスペルロシド水溶液を得た。粗アスペルロシド水溶液をさらに同様の方法でＯＤＳ処理し、純度９７重量％以上の画分のみ集め、メタノールを減圧留去し、高純度のアスペルロシドを得た（純度９７重量％以上）。

（ピオグリタゾン）
試薬Pioglitazone Hydrochloride (東京化成工業株式会社、純度98.0重量%以上)を用いた。

（低酸素モデルのラットへの投与）
得られた低酸素モデルのラットへ、杜仲葉抽出エキス、アスペルロシド、及びピオグリタゾンを、表１に示す用量となるよう、コリン欠乏高脂肪餌に混ぜて経口投与した。

（コントロール）
６週齢のWistar系雄性ラット (清水実験材料株式会社)に対し、１２時間(7:00-19:00が明)の明暗、室温２３℃、及び相対湿度５０～６０％湿度の環境下で、通常のMF飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）の自由摂餌・自由飲水の各条件により４週間飼育した。

（肝ミトコンドリアＣＯＸ－IV定量）
コントロール、非投与の低酸素モデルのラット、及び各投与剤を投与された低酸素モデルのラットより採取した肝臓からミトコンドリア分画を調製し、－８０℃で保存した。保存しておいたミトコンドリア分画を解凍し、50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4 ; 5mM EDTA、1mM Na₃VO₄、50mM NaF、プロテインインヒビターカクテル(Roche Life Science、Basel, Switzerland)) を添加・懸濁し、超音波処理を10分行った後、4℃、9,000rpmで10min遠心分離した。上清を前述の50 mM Tris-HCl bufferで希釈して蛋白濃度が 6mg/mLとなるように調整し、ミトコンドリア蛋白抽出試料を得た。

ミトコンドリア蛋白抽出試料を用い、以下のようにしてミトコンドリアＣＯＸ－IVを定
量した。まず、ミトコンドリア蛋白抽出試料と試薬液（62.5 mM トリス-塩酸緩衝液（pH6.8)、25 w/v% glycerol、2 w/v%ドデシル硫酸ナトリウム、5 w/v%メルカプトエタノール、0.01 w/v%ブロモフェノールブルー）とを等量（体積基準）混合し、100℃で10分加熱し、ウェスタンブロッティング用の測定用試料を得た。次に、測定用試料中の蛋白量がwell当り30μg核蛋白となるようにアプライし、電気泳動（200V、30分）によりタンパク質を分離した後、ブロッティング（100V、60分）を行った。なお、一次抗体には、抗ＣＯＸ－IV抗体（ab16056; abcam, Cambridge, United Kingdom)を用い、二次抗体には goat an
ti-rabbit IgG-HRP（sc-2004 ; Santa Cruz Biotechnology, California, USA)を用いた。一次抗体は2,000倍希釈（体積基準）となるように、また二次抗体には4,000倍希釈（体積基準）となるように、各々5 w/v%スキムミルク添加TBS-T（Tris Buffered Saline with Tween 20）で希釈して用いた。

結果を表１に示す。ＣＯＸ－IV相対発現量は、コントロールのマウスにおけるＣＯＸ－IV量を１とした場合の相対量を示す。また、発現促進効果は、表中の式に従って導出した割合（％）で示すことで、低酸素モデルを基準とした発現促進効果として評価した。なお、それぞれの数値は、ｎ＝３の平均として導出した。

低酸素モデル（比較例）では、コントロール（参考例１）に比べてＣＯＸ－IV発現量が顕著に下がった。一方、ミトコンドリア賦活剤であるピオグリタゾンを投与した低酸素モデル（参考例２）ではコントロール（参考例１）に比べてＣＯＸ－IV発現量が促進された。そして、杜仲葉エキスを投与した低酸素モデル（実施例１）、アスペルロシドを投与した低酸素モデル（実施例２、３）でも、ＣＯＸ－IV発現量が促進された。

Claims (1)

1. 杜仲葉エキスを含有し、低酸素状態に対して適用され、チトクロムCオキシダーゼサブユニットIVの発現を促進するために用いられる、ミトコンドリア機能向上剤（但し、分岐鎖アミノ酸を含む場合を除く）。