JP6980529B2 - 美白成分の副作用を予測する方法 - Google Patents
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Description
i)美白成分の長時間使用に伴う毒性の増加幅;
ii)美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異;および
iii)紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅
試験物質は、Rhododenol(>98%)、Raspberryketone(>98%)、Monobenzone(>98%)、Rucinol(>98%)、5‐アダマンタン‐1‐イル‐N‐(2,4‐ジヒドロキシベンジル)‐2,4‐ジメトキシ‐安息香酸アミド(>98%)である。Rhododenol、Raspberryketone、5‐アダマンタン‐1‐イル‐N‐(2,4‐ジヒドロキシベンジル)‐2,4‐ジメトキシ‐安息香酸アミドは、合成して提供された(図1)。特に、5‐アダマンタン‐1‐イル‐N‐(2,4‐ジヒドロキシベンジル)‐2,4‐ジメトキシ‐安息香酸アミド(以下、「AP」という)は、本発明の一側面において、発明者らによって合成された物質で、下記化学式1の構造を有し、下記実験例2による場合、メラニン細胞のメラニン生成抑制効果に優れるものと測定された。
実験に使用された細胞は、HEMn‐MPとA375である。
細胞毒性は、Cell Counting Kit‐8(CCK‐8)により測定し、メーカーはDojindo Molecular Technologies(USA)である。測定方法は、96wellで培養が終わった細胞の培地を除去し、同一の培地で10%CCK‐8を製造した後、各wellに200μlずつ添加し、37℃で約2時間反応させる。その後、反応が終了した培地100μlを、ELISA reader機器を利用して450nmで吸光度を測定した。細胞の死滅が進行するほど、CCK‐8がcolorlessからorange colorへと変わるようになって長波長に変わる。
データ結果の統計は、Student´s t‐testを使用し、独立した3回以上の試験を通じて得られた結果を基に、平均値および標準偏差(SD)で示した。
HEMn‐MP(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,moderately pigmented donor,Cat.No.C‐102‐5C)における各美白成分別の細胞毒性濃度を求めるために、それぞれの美白成分を下記表1の濃度でそれぞれ処理した後、1日および7日後のControl群(0.5% DMSO)に対する細胞生存率(% Cell Survival Rate)を測定し、グラフに示した(図2)。また、測定結果を通じて各美白成分別/処理時間別にCC20とCC50の濃度を求め、これを利用して1日目に対する7日目の細胞毒性濃度の比率を計算した値を表2に示した。
Human melanoma cell line,A375(Cat.No.CRL‐1619)細胞株における各美白成分別、処理時間別の細胞毒性を確認したが、今回の試験では、試料の処理条件を3種類に区分して毒性を測定した。まず、それぞれの美白成分を処理した後、24h経過後に細胞毒性を測定、または24h経過後に素材が処理された培地を捨てた後、新しい培地に交換して48h追加培養した後に細胞毒性を測定、そして、試料が処理された後、培地の交換なしに72h経過後に細胞毒性を測定してグラフに示した(図3)。また、測定結果を通じて各美白成分別/処理時間別にCC20とCC50の濃度を求め、これを利用して1日目に対する3日目の細胞毒性濃度の比率を計算した(表3)。
HEMn‐MP細胞における美白成分別のメラニン生成抑制効能を究明した。各試料別に表4の濃度で処理した後、7日間培養してControl群(0.5% DMSO)に対するメラニン量を測定してグラフに示した(図4)。また、各美白成分別にメラニン抑制効能を定量化したEC50(メラニン生成50%抑制効能濃度)を計算して示した(表5)。そして、細胞毒性とメラニン生成抑制効能濃度間の相関倍数(濃度差)を調べるために、それぞれの定量値CC20またはCC50をEC50で除した値を示した(表6)。
UVB照射による美白成分別の細胞毒性に及ぼす影響を確認するために、UVB照射なしに各素材のみを処理したグループと、UVB 20mJ/cm3を照射した後に各素材を処理したグループに分けて、7日後に互いの細胞毒性を比較した(図5)。これは、UVB刺激により敏感になった細胞に多様な美白素材を処理した場合に、どのよう反応性を示すことを確認するためのものである。細胞にUVBを照射した後に素材処理された細胞において増加した細胞毒性を算出し、UVB単独によって示された細胞毒性の比率を差し引いた値に補正した後、平均を出して表した(表7)。
Claims (6)
- 美白成分の副作用を予測する方法であって、
前記方法は、
i)美白成分の長時間使用に伴う毒性濃度の増加幅;および
ii)美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異;
を測定することを含み、
前記i)の毒性濃度の増加幅は、
メラニン細胞に美白成分を処理後3〜36時間となる時点に測定された第1の細胞毒性濃度に対する、48時間以上となる時点に測定された第2の細胞毒性濃度の比率であり、
前記ii)の美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異は、
メラニン細胞のメラニン生成を有効に抑制する美白成分のメラニン生成抑制効能濃度に対する、メラニン細胞の毒性を引き起こす美白成分の細胞毒性濃度の相関倍数であり、
前記i)の第1の細胞毒性濃度に対する第2の細胞毒性濃度の比率が3倍以上である場合に、美白成分の副作用があるものと判断するステップと、
前記ii)の相関倍数が10倍以上である場合に、美白成分の安全性が確保されているものと判断するステップとを含み、
前記細胞毒性濃度は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、美白成分を処理した細胞の吸光度で表される細胞生存率(%)を測定することによって得られ、
前記美白効能濃度は、美白成分を処理した細胞の、美白成分を処理しなかった対照群と比較したメラニン量を測定することにより得られる、
方法。 - iii)紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅;
を測定することをさらに含み、
前記iii)の敏感度増加幅は、
紫外線が照射されなかったメラニン細胞に美白成分を処理した対照群の細胞毒性濃度に対する、紫外線が照射されたメラニン細胞に美白成分を処理した実験群の細胞毒性濃度の比率であり、
前記iii)の比率が平均15%未満である場合に、美白成分の安全性が確保されているものと判断するステップをさらに含む、
請求項1に記載の美白成分の副作用を予測する方法。 - 前記測定は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、細胞の20%が死滅する濃度であるCC20(20% Cytotoxicity Concentration)を測定することを含む、請求項1又は2に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
- 前記測定は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、細胞の半分が死滅する濃度であるCC50(50% Cytotoxicity Concentration)を測定することを含む、請求項1又は2に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
- 前記メラニン細胞のメラニン生成抑制効能濃度は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、メラニンの生成を50%阻害する効能濃度であるEC50(50%Inhibitory Concentration of Melanin synthesis)である、請求項1に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
- 前記紫外線は、0.1〜500mJ/cm3の量で照射されることを特徴とする、請求項2に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
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