JP2018512114A - 美白成分の副作用を予測する方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書の一側面においては、美白成分の副作用を予測する方法であって、前記方法は、ｉ）美白成分の長時間使用に伴う毒性の増加幅、ii）美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異、および、iii）紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅のうち一つ以上を測定することを含む方法を提供する。前記方法は、美白成分を長時間使用した場合の副作用発生有無を効果的に予測する効果がある。

Description

本明細書には、美白成分の副作用を予測する方法が開示される。
顔の色を白くする皮膚美白（Ｓｋｉｎ Ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ）化粧品に対する関心が高い。特に、東洋人、その中でも女性が絶大なる関心を示す。世界有数の化粧品会社が東洋人の女性をターゲットとしているのには、それなりの理由があるというわけである。東洋人は、その人口も多いが、白人や黒人に比べて、白い皮膚に特に執着をする傾向がある。運動に関心があるにもかかわらず、屋外運動をとことん避ける女性も事実少なくない。特に、ゴルフ場に行ってみると、初めから顔は覆面をし、腕とふくらはぎの部分は服で覆って到底身元の確認ができない程度である場合もある。
紫外線遮断剤がメラニンを作る紫外線を遮断するならば、美白化粧品は、紫外線を受けた後、メラニンが作られないようにする。食品医薬品安全庁は、美白物質の濃度が一定基準以上のものに限り、機能性化粧品として認めている。美白物質は、一定量以上となっていて初めて、実際に効果を発揮するためである。美白物質は多様な機序でメラニンの生成を防ぐが、メラニンの生成に関連した酵素であるチロシナーゼが活性化されることを防いだり、チロシナーゼ酵素に刺激を受けたチロシンが酸化することを防いだり、既に生成されたメラニンがメラノサイトから角質形成細胞へ移る段階を抑制したりする。
しかし、前述した機序により作用する美白物質は、副作用を誘発することもある。一例として、カネボウ社の機能性美白原料である「ロドデノール（ＲｈｏｄｏｄｅｎｏｌまたはＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｌ）」を主成分とした美白ラインを購買して使用した顧客約１６，０００名から白斑症に似た症状が現れたことから、莫大な補償金額の支払いおよびブランド廃止という初めての事態が発生した。メラニン生成抑制効果素材として開発されて美白化粧品として販売されたカネボウ社のＲｈｏｄｏｄｅｎｏｌとその類似体であるＲａｓｐｂｅｒｒｙｋｅｔｏｎｅ、そして白斑症患者のまだらな色素を白色化させるＭｏｎｏｂｅｎｚｏｎｅは、いずれもメラニン細胞毒性という共通的な現象を伴うものと明らかにされた。しかし、類似した機序（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ抑制）によりメラニン生成抑制効果を示すＲｕｃｉｎｏｌ（４‐ｎ‐Ｂｕｔｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ）の場合には、商業化された美白製品を使用した顧客から、まだ臨床的な問題が報告されていない。
そこで、美白成分の長期反復的使用により現れ得る臨床副作用をあらかじめ予測することのできる検証システム等を通じて、素材の安全性をスクリーニングする必要性が台頭している。また、美白成分の安定性究明のために数年間という長い時間と莫大な費用を消費することが容易でないという点から、簡便でありながらも、迅速かつ正確な美白成分の副作用測定システムの必要性が台頭している。
韓国登録公報第１０‐１２０６２００号
本発明の一側面においては、美白成分の副作用を予測する方法を提供する。
また、本発明の他の一側面においては、美白成分の副作用を予測して、副作用が顕著に減少した美白成分を判断する方法を提供する。
本発明の一側面は、美白成分の副作用を予測する方法であって、美白成分の長時間使用に伴う細胞毒性の増加幅を測定する方法を提供する。
本発明の一側面は、美白成分の副作用を予測する方法であって、美白効能濃度と細胞毒性誘発濃度間の相関倍数を測定する方法を提供する。
本発明の一側面は、美白成分の副作用を予測する方法であって、紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅を測定する方法を提供する。
本発明の一側面による美白成分の副作用測定方法は、美白成分を長時間使用した場合の副作用の発生有無を効率的に予測する効果がある。
本発明の一側面による美白成分の副作用測定方法は、美白効能濃度と細胞毒性誘発濃度間の相関関係を簡便に究明する効果がある。
本発明の一側面による美白成分の副作用測定方法は、紫外線の有無による副作用の増加幅を効果的に予測する効果がある。
実験例に使用された美白成分である試験物質の構造である。 実験例１‐１において、試料毎の、１日および７日における濃度による細胞毒性を示したもので、ＲＤはロドデノール（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｏｌ）、ＲＫはラズベリーケトン（Ｒａｓｐｂｅｒｒｙｋｅｔｏｎｅ）、ＭＢはモノベンゾン（Ｍｏｎｏｂｅｎｚｏｎｅ）、ＲＣはルシノール（Ｒｕｃｉｎｏｌ）、ＡＰは５アダマンタン‐１‐イル‐Ｎ‐（２，４‐ジヒドロキシベンジル）‐２，４‐ジメトキシ‐安息香酸アミドである。 実験例１‐２において、各試料別に、２４時間試料処理後の細胞毒性、２４時間試料処理し、新しい培地に交換した後、４８時間後の細胞毒性、７２時間試料処理後の細胞毒性を示したものである。 実験例２において、各試料別に、７日におけるＭｅｌａｎｉｎ合成阻害濃度を比較したものである。 実験例３において、各素材別に、ＵＶＢ照射有／無後７日における細胞毒性の変化値を比較したものである。
本発明の一観点において、美白成分の長時間使用に伴う毒性の増加幅を測定する、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
本発明の一観点において、美白成分の副作用を予測する方法として、前記方法は、下記のうち一つ以上を測定することを含む方法を提供する。
ｉ）美白成分の長時間使用に伴う毒性の増加幅；
ii）美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異；および
iii）紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅
本発明の一観点において、前記ｉ）の毒性の増加幅は、メラニン細胞に美白成分を処理後３〜３６時間となる時点に測定された第１の細胞毒性に対する、４８時間以上となる時点に測定された第２の細胞毒性の比率である、美白成分の副作用を予測する方法を提供する。
本発明の一観点において、前記ii）の美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異は、メラニン細胞のメラニン生成を有効に抑制する美白成分のメラニン生成抑制効能濃度に対する、メラニン細胞の毒性を引き起こす美白成分の細胞毒性濃度の相関倍数である、美白成分の副作用を予測する方法を提供する。
本発明の一観点において、前記iii）の敏感度増加幅は、紫外線が照射されなかったメラニン細胞に美白成分を処理した対照群の細胞毒性に対する、紫外線が照射されたメラニン細胞に美白成分を処理した実験群の細胞毒性の比率である、美白成分の副作用を予測する方法を提供する。
本発明の一観点において、美白成分の副作用を測定する方法であって、メラニン細胞に美白成分を添加するステップ；美白成分が添加されたメラニン細胞の処理時間を３〜３６時間とした第１の細胞毒性を測定するステップ；美白成分が添加されたメラニン細胞の処理時間が４８時間以上となる時点で第２の細胞毒性を測定するステップ；および、前記第１の細胞毒性に対する前記第２の細胞毒性の比率を測定するステップ；を含む、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
本発明の一観点において、前記第１の細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、３時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１４時間以上、１６時間以上、１８時間以上、２０時間以上、または２２時間以上であってよい。
一方、前記第１の細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、３６時間以下、３４時間以下、３２時間以下、３０時間以下、２８時間以下、２６時間以下、または２４時間以下であってよい。
本発明の一観点において、前記第２の細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１０８時間以上、１２０時間以上、１３２時間以上、１４４時間以上、１５６時間以上、１６８時間以上、または１８０時間以上であってよい。
一方、前記第２の細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、４８０時間以下、４５６時間以下、４３２時間以下、４０８時間以下、３８４時間以下、３６０時間以下、３３６時間以下、３１２時間以下、２８８時間以下、２６４時間以下、２４０時間以下、２１６時間以下、または１９２時間以下であってよい。
処理時間が前記範囲内である場合、時間による細胞毒性の比率を効果的に測定することができる。
本発明の一観点において、前記細胞毒性は、美白成分を処理しなかった対照群に対する美白成分を処理した細胞の吸光度で表される細胞生存率（％）であってよい。たとえば、下記数式１による細胞生存率（％）であることを特徴とする美白成分の副作用を測定する方法であってよい。
Figure 2018512114
本発明の一観点において、前記細胞毒性は、対照群に対し細胞の２０％が死滅する濃度であるＣＣ２０（２０％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）であることを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。前記ＣＣ２０は、通常、細胞毒性が現れ始める濃度とみなされる。
本発明の一観点において、前記細胞毒性は、対照群に対し細胞の半分が死滅する濃度であるＣＣ５０（５０％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）であることを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。前記ＣＣ５０は、Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ群（対照群）に対し、細胞の半分が死滅する濃度を示す。
本発明の一観点において、前記第１の細胞毒性に対する前記第２の細胞毒性の比率は、倍数値（Ｆｏｌｄ）に換算して測定してよい。
本発明の他の観点において、美白成分の副作用を測定する方法であって、美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異を測定する方法を含む、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。たとえば、前記美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異の測定は、メラニン細胞に美白成分を処理した後、細胞毒性濃度を測定し、前記処理後のメラニン細胞のメラニン生成抑制効能濃度を測定し、前記メラニン生成抑制効能濃度に対する前記細胞毒性濃度の相関倍数を測定することを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法であってよい。
本発明の他の観点において、美白成分が添加されたメラニン細胞の処理時間を３〜４８０時間とした細胞毒性を測定するステップ；美白成分が添加されたメラニン細胞の処理時間を３〜４８０時間とし、メラニンの生成を５０％阻害する効能濃度であるＥＣ５０を測定するステップ；および、前記測定された細胞毒性をＥＣ５０で除して細胞毒性濃度とメラニン阻害効果濃度（ＥＣ５０）との相関倍数を測定するステップ；を含む、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
本発明の他の観点において、前記細胞毒性は、対照群に対し細胞の半分が死滅する濃度であるＣＣ５０（５０％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、または、対照群に対し細胞の２０％が死滅する濃度であるＣＣ２０（２０％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）であることを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
本発明の他の観点において、前記細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、３時間以上、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１０８時間以上、１２０時間以上、１３２時間以上、１４４時間以上、１５６時間以上、１６８時間以上、または１８０時間以上であってよい。
一方、前記細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、４８０時間以下、４５６時間以下、４３２時間以下、４０８時間以下、３８４時間以下、３６０時間以下、３３６時間以下、３１２時間以下、２８８時間以下、２６４時間以下、２４０時間以下、２１６時間以下、または１９２時間以下であってよい。
本発明の他の観点において、前記効能濃度であるＥＣ５０を測定するステップにおける処理時間は、たとえば、３時間以上、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１０８時間以上、１２０時間以上、１３２時間以上、１４４時間以上、１５６時間以上、１６８時間以上、または１８０時間以上であってよい。
一方、前記効能濃度であるＥＣ５０を測定するステップにおける処理時間は、たとえば、４８０時間以下、４５６時間以下、４３２時間以下、４０８時間以下、３８４時間以下、３６０時間以下、３３６時間以下、３１２時間以下、２８８時間以下、２６４時間以下、２４０時間以下、２１６時間以下、または１９２時間以下であってよい。
処理時間が前記範囲内である場合、美白効能（メラニン細胞のメラニン生成抑制効能濃度）と細胞毒性濃度間の相関倍数を効果的に測定することができる。
本発明のまた他の観点において、紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅を測定することを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
たとえば、前記敏感度増加幅の測定は、紫外線が照射されたメラニン細胞に美白成分を処理した実験群の細胞毒性を測定し、紫外線が照射されなかったメラニン細胞に美白成分を処理した対照群の細胞毒性を測定し、前記実験群と対照群の細胞毒性の比率を測定することを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法であってよい。
本発明の他の観点において、紫外線が照射されたメラニン細胞に美白成分を処理後３〜４８０時間となる時点で実験群の細胞毒性を測定し、紫外線が照射されなかったメラニン細胞に美白成分を処理後３〜４８０時間となる時点で対照群の細胞毒性を測定するステップ；前記実験群と対照群の細胞毒性の比率を測定するステップ；を含む、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
本発明のまた他の観点において、前記実験群と対照群の細胞毒性は、前記式（１）による細胞生存率（％）であることを特徴とする、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
本発明のまた他の観点において、前記実験群と対照群の細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、３時間以上、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１０８時間以上、１２０時間以上、１３２時間以上、１４４時間以上、１５６時間以上、１６８時間以上、または１８０時間以上であってよい。
一方、前記実験群と対照群の細胞毒性を測定するステップの処理時間は、たとえば、４８０時間以下、４５６時間以下、４３２時間以下、４０８時間以下、３８４時間以下、３６０時間以下、３３６時間以下、３１２時間以下、２８８時間以下、２６４時間以下、２４０時間以下、２１６時間以下、または１９２時間以下であってよい。
処理時間が前記範囲内である場合、紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅を効果的に測定することができる。
本発明の他の観点において、前記紫外線は、０．１ｍＪ／ｃｍ３以上、０．５ｍＪ／ｃｍ３以上、１ｍＪ／ｃｍ３以上、２ｍＪ／ｃｍ３以上、３ｍＪ／ｃｍ３以上、４ｍＪ／ｃｍ３以上、５ｍＪ／ｃｍ３以上、６ｍＪ／ｃｍ３以上、７ｍＪ／ｃｍ３以上、８ｍＪ／ｃｍ３以上、９ｍＪ／ｃｍ３以上、１０ｍＪ／ｃｍ３以上、１１ｍＪ／ｃｍ３以上、１２ｍＪ／ｃｍ３以上、１３ｍＪ／ｃｍ３以上、１４ｍＪ／ｃｍ３以上、１５ｍＪ／ｃｍ３以上、１６ｍＪ／ｃｍ３以上、１７ｍＪ／ｃｍ３以上、１８ｍＪ／ｃｍ３以上、１９ｍＪ／ｃｍ３以上、または２０ｍＪ／ｃｍ３以上であってよい。
一方、前記紫外線は、５００ｍＪ／ｃｍ３以下、４８０ｍＪ／ｃｍ３以下、４６０ｍＪ／ｃｍ３以下、４４ｍＪ／ｃｍ３以下、４２０ｍＪ／ｃｍ３以下、４００ｍＪ／ｃｍ３以下、３８０ｍＪ／ｃｍ３以下、３６０ｍＪ／ｃｍ３以下、３４０ｍＪ／ｃｍ３以下、３２０ｍＪ／ｃｍ３以下、３００ｍＪ／ｃｍ３以下、２８０ｍＪ／ｃｍ３以下、２６０ｍＪ／ｃｍ３以下、２４０ｍＪ／ｃｍ３以下、２２０ｍＪ／ｃｍ３以下、２００ｍＪ／ｃｍ３以下、１８０ｍＪ／ｃｍ３以下、１６０ｍＪ／ｃｍ３以下、１４０ｍＪ／ｃｍ３以下、１２０ｍＪ／ｃｍ３以下、１００ｍＪ／ｃｍ３以下、８０ｍＪ／ｃｍ３以下、６０ｍＪ／ｃｍ３以下、または４０ｍＪ／ｃｍ３以下であってよい。
紫外線照射量が前記範囲内である場合、紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅を効果的に測定することができる。
また、本発明の一観点において、前記美白成分の副作用を測定する方法のうちいずれか一つ以上を測定することを含む、美白成分の副作用を測定する方法を提供する。
美白成分の副作用は多様であり、代表的な副作用としては、皮膚の老化、癌の発生、斑点やニキビの発生、妊娠線の発生および白斑症などの副作用がある。このうち最も代表的な副作用は、白斑症であり、白斑症と類似した副作用の症状を誘発するものと知られている美白成分は、Ｒｈｏｄｏｄｅｎｏｌ、Ｒａｓｐｂｅｒｒｙｋｅｔｏｎｅ、Ｍｏｎｏｂｅｎｚｏｎｅである。本発明において、前記美白成分をメラニン細胞毒性のＰｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓとして使用した。一方、１９９８年にＰＯＬＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓのＤｒ．Ｏｋｕｂｏがモミの木から分離した４‐ｂｕｔｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌを美白効能物質として開発した後、Ｒｕｃｉｎｏｌという名称で１９９９年から市場に製品出市したが、この美白成分は、現在まで１５年以上あまりにわたり多くの美白製品の原料として使用されている。特に、この製品使用者の臨床副作用事例はまだ報告されていないところ、本研究においては、長期間の使用により安全性が立証されたＲｕｃｉｎｏｌをメラニン細胞毒性のＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄとして使用した。
以下、実験例を挙げつつ、本発明の構成および効果についてより具体的に説明する。しかし、これらの実験例は、本発明の理解を助けるために、例示の目的でのみ提供されたものであるに過ぎず、本発明の範疇および範囲がそれによって制限されるものではない。
美白成分（試験物質）の準備
試験物質は、Ｒｈｏｄｏｄｅｎｏｌ（＞９８％）、Ｒａｓｐｂｅｒｒｙｋｅｔｏｎｅ（＞９８％）、Ｍｏｎｏｂｅｎｚｏｎｅ（＞９８％）、Ｒｕｃｉｎｏｌ（＞９８％）、５‐アダマンタン‐１‐イル‐Ｎ‐（２，４‐ジヒドロキシベンジル）‐２，４‐ジメトキシ‐安息香酸アミド（＞９８％）である。Ｒｈｏｄｏｄｅｎｏｌ、Ｒａｓｐｂｅｒｒｙｋｅｔｏｎｅ、５‐アダマンタン‐１‐イル‐Ｎ‐（２，４‐ジヒドロキシベンジル）‐２，４‐ジメトキシ‐安息香酸アミドは、合成して提供された（図１）。特に、５‐アダマンタン‐１‐イル‐Ｎ‐（２，４‐ジヒドロキシベンジル）‐２，４‐ジメトキシ‐安息香酸アミド（以下、「ＡＰ」という）は、本発明の一側面において、発明者らによって合成された物質で、下記化学式１の構造を有し、下記実験例２による場合、メラニン細胞のメラニン生成抑制効果に優れるものと測定された。
Figure 2018512114
Ｍｏｎｏｂｅｎｚｏｎｅ（４‐ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ‐ｐｈｅｎｏｌ）はＳａｎｔａｃｒｕｚｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ‐２３２２５７）で、Ｒｕｃｉｎｏｌ（４‐ｂｕｔｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ）はＴｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｂ３７７３）でそれぞれ購入した。すべての試験物質はＤＭＳＯに溶かし、細胞に処理された最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％である。
メラニン細胞株の準備
実験に使用された細胞は、ＨＥＭｎ‐ＭＰとＡ３７５である。
ＨＥＭｎ‐ＭＰ（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｄｏｎｏｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ‐１０２‐５Ｃ）の購入先は、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）である。細胞培養液は、Ｍｅｄｉｕｍ ２５４（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ‐２５４‐５００）にＨＭＧＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ‐００２‐５）を入れた培地を使用した。細胞培養過程はメーカーのマニュアルどおりに進め、すべての細胞はｐａｓｓａｇｅ ３〜８の間を利用した。要約すると、３７℃および５％ＣＯ２インキュベーターで１７５Ｔフラスコに細胞を培養し、継代培養時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ‐ＥＤＴＡを利用して細胞を分離した後、遠心分離機（１２００ＲＰＭ、５分）を利用して細胞を集め、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でｓｅｅｄｉｎｇして培養した。細胞毒性試験のために、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでｓｅｅｄｉｎｇして１日培養させ、各薬物を特定の濃度で２００μｌ／ｗｅｌｌ培地に処理した後、一定時間が経過した後に細胞毒性を検証した。
また別の細胞株であるＡ３７５（Ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）は、ＡＴＣＣ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ‐１６１９，ＵＳＡ）から購入した。細胞培養液はＤＭＥＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２‐６０４，Ｌｏｎｚａ，ＵＳＡ）にＦＢＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６０００‐０４４，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）を１０％入れた培地を使用し、継代培養および細胞毒性試験法は、ＨＥＭと同じである。
細胞毒性の測定
細胞毒性は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ‐８（ＣＣＫ‐８）により測定し、メーカーはＤｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＵＳＡ）である。測定方法は、９６ｗｅｌｌで培養が終わった細胞の培地を除去し、同一の培地で１０％ＣＣＫ‐８を製造した後、各ｗｅｌｌに２００μｌずつ添加し、３７℃で約２時間反応させる。その後、反応が終了した培地１００μｌを、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ機器を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。細胞の死滅が進行するほど、ＣＣＫ‐８がｃｏｌｏｒｌｅｓｓからｏｒａｎｇｅ ｃｏｌｏｒへと変わるようになって長波長に変わる。
細胞生存率は、下記数式１により求めた。
Figure 2018512114
統計処理
データ結果の統計は、Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ ｔ‐ｔｅｓｔを使用し、独立した３回以上の試験を通じて得られた結果を基に、平均値および標準偏差（ＳＤ）で示した。
実験例１‐１：ＨＥＭｎ‐ＭＰ細胞における各美白成分別／処理時間別の細胞毒性濃度の比較
ＨＥＭｎ‐ＭＰ（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｄｏｎｏｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ‐１０２‐５Ｃ）における各美白成分別の細胞毒性濃度を求めるために、それぞれの美白成分を下記表１の濃度でそれぞれ処理した後、１日および７日後のＣｏｎｔｒｏｌ群（０．５％ ＤＭＳＯ）に対する細胞生存率（％ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｒａｔｅ）を測定し、グラフに示した（図２）。また、測定結果を通じて各美白成分別／処理時間別にＣＣ２０とＣＣ５０の濃度を求め、これを利用して１日目に対する７日目の細胞毒性濃度の比率を計算した値を表２に示した。
Figure 2018512114
Figure 2018512114
ＨＥＭｎ‐ＭＰ細胞を利用した毒性試験における各美白成分に対する細胞毒性反応は、薬物露出時間に応じて著しく異なった。美白成分のうち副作用がある物質として公知となっているＲＤ、ＲＫ、ＭＢを処理した細胞において、１日基準での細胞毒性に比べて７日基準での細胞毒性が最小４．５倍から最大１４．９倍ほど毒性が増加（ＣＣ５０基準）したのに対し、これまで副作用に対する臨床報告がないＲＣ（１．２倍）とＡＰ（２．２倍）は、比較的細胞毒性の増加幅が狭かった（表２）。これは、試料によって、薬物処理（露出）期間が増加するほど、その毒性の増加幅も多様に現れるということを示しており、興味深いことに、白斑症誘発（メラニン細胞毒性）素材として知られているＲＤ、ＲＫ、ＭＢにおいて、その現象は特に高く現れた。したがって、１日基準での細胞毒性に比べて７日基準での細胞毒性が２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３．０倍以上、３．１倍以上、３．２倍以上、３．３倍以上、３．４倍以上、３．５倍以上、３．６倍以上、３．７倍以上、３．８倍以上、３．９倍以上、４．０倍以上、４．１倍以上、４．２倍以上、４．３倍以上、または４．４倍以上である場合、美白成分の副作用があると判断することができる。
実験例１‐２：Ａ３７５細胞における各美白成分別／処理時間別の細胞毒性濃度の比較
Ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，Ａ３７５（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ‐１６１９）細胞株における各美白成分別、処理時間別の細胞毒性を確認したが、今回の試験では、試料の処理条件を３種類に区分して毒性を測定した。まず、それぞれの美白成分を処理した後、２４ｈ経過後に細胞毒性を測定、または２４ｈ経過後に素材が処理された培地を捨てた後、新しい培地に交換して４８ｈ追加培養した後に細胞毒性を測定、そして、試料が処理された後、培地の交換なしに７２ｈ経過後に細胞毒性を測定してグラフに示した（図３）。また、測定結果を通じて各美白成分別／処理時間別にＣＣ２０とＣＣ５０の濃度を求め、これを利用して１日目に対する３日目の細胞毒性濃度の比率を計算した（表３）。
Figure 2018512114
Ａ３７５細胞実験の結果においても、ＲＤ、ＲＫ、ＭＢを処理した場合、１日基準での細胞毒性に比べて３日基準での細胞毒性が１６．８〜４１倍増加（ＣＣ５０基準）した一方、ＲＣ（４．２倍）、ＡＰ（１．７倍）は、比較的毒性の増加幅が少ないものと示された（表３）。これを通じて、ＲＤ、ＲＫ、ＭＢは、相対的に時間による毒性増加が著しく大幅に増加することにより、これらの試料に接触したメラニン細胞の毒性は、時間に比例して細胞死滅の可能性が大きいものと考えられ、これは、白斑症を誘発する試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｌａｎｏ‐ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ特徴的な現象の一つと考えられる。したがって、１日基準での細胞毒性に比べて３日基準での細胞毒性が７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、１０倍以上、１０．５倍以上、１１倍以上、１１．５倍以上、または１２倍以上である場合、美白成分の副作用があると判断することができる。
特に、Ａ３７５細胞において、１日間試料を処理したときに薬物を除去し、２日間追加培養した場合、ＲＤ、ＲＫ、ＭＢ試料処理群は、毒性が引き続き増加したのに対し、ＲＣ、ＡＰ処理群は、それ以上細胞毒性が増加しなかった点から見て、薬物露出後の除去による細胞毒性の回復力（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）も、薬物によって異なり、これもやはり、白斑症症状誘発美白成分とＲＣ、ＡＰ美白成分が差別される点の一つである（図２）。
実験例２：ＨＥＭｎ‐ＭＰ細胞における各美白成分別の細胞毒性濃度と効能濃度との相関関係の比較
ＨＥＭｎ‐ＭＰ細胞における美白成分別のメラニン生成抑制効能を究明した。各試料別に表４の濃度で処理した後、７日間培養してＣｏｎｔｒｏｌ群（０．５％ ＤＭＳＯ）に対するメラニン量を測定してグラフに示した（図４）。また、各美白成分別にメラニン抑制効能を定量化したＥＣ５０（メラニン生成５０％抑制効能濃度）を計算して示した（表５）。そして、細胞毒性とメラニン生成抑制効能濃度間の相関倍数（濃度差）を調べるために、それぞれの定量値ＣＣ２０またはＣＣ５０をＥＣ５０で除した値を示した（表６）。
Figure 2018512114
Figure 2018512114
Figure 2018512114
表６は、各美白成分別の、７日での細胞毒性（ＣＣ５０）濃度とメラニン阻害効能（ＥＣ５０）濃度間の相関倍数を比較したものであって、ＣＣ２０／ＥＣ５０は、２０％の細胞毒性濃度を５０％メラニン阻害効能濃度で除した値で、効能濃度から２０％毒性が現れる濃度の相関倍数を示したものであり、ＣＣ５０／ＥＣ５０は、５０％の細胞毒性濃度を５０％メラニン阻害効能濃度で除した値で、効能濃度から５０％毒性が現れる濃度の相関倍数を示したものである。
ＲＤ、ＲＫ、ＭＢは、メラニン抑制効能濃度（ＥＣ５０）から１．４〜２．８倍高く処理すると５０％細胞毒性を示すようになるが、ＲＣとＡＰは、２０倍以上高く処理した場合にのみ、５０％細胞毒性を示した（表６）。すなわち、ＲＤ、ＲＫ、ＭＢは、効能濃度と細胞毒性濃度の差、つまり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎが非常に狭いのに対し、ＲＣとＡＰは、効能と毒性濃度との間に２０倍以上の十分なＳａｆｅｔｙ ｍａｒｇｉｎが維持されることにより、広い安全領域が確保されていることを確認した。したがって、ＣＣ５０／ＥＣ５０が５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１１倍以上、１２倍以上、１３倍以上、１４倍以上、１５倍以上、１６倍以上、１７倍以上、１８倍以上、１９倍以上、または２０倍以上である場合、美白成分の安全性が確保されているものと判断することができる。
また、このような現象は、試料の種類によって、メラニン生成抑制効能がメラニン細胞死滅を同時に伴うこともあるという問題点を提起する。これは、化粧品素材の開発において効能以上に安全性を確保しなければならないという点で重要な因子である。
実験例３：ＨＥＭｎ‐ＭＰ細胞における各美白成分別の細胞ＵＶＢ照射有無による毒性濃度変化（美白成分に対する敏感度増加幅）の比較
ＵＶＢ照射による美白成分別の細胞毒性に及ぼす影響を確認するために、ＵＶＢ照射なしに各素材のみを処理したグループと、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ３を照射した後に各素材を処理したグループに分けて、７日後に互いの細胞毒性を比較した（図５）。これは、ＵＶＢ刺激により敏感になった細胞に多様な美白素材を処理した場合に、どのよう反応性を示すことを確認するためのものである。細胞にＵＶＢを照射した後に素材処理された細胞において増加した細胞毒性を算出し、ＵＶＢ単独によって示された細胞毒性の比率を差し引いた値に補正した後、平均を出して表した（表７）。
Figure 2018512114
表７は、各素材別の、ＵＶＢ照射有無後、７日後の細胞毒性変化率を測定した値であり、各素材別に代表濃度（３ｐｏｉｎｔｓ）において、ＵＶＢ刺激のない細胞に対するＵＶＢ刺激を受けた細胞における毒性比率（％）を示した。ただし、前記値は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群において示されたＵＶＢによる細胞毒性比率（１５〜２０％）を補正した数値である。
紫外線（ＵＶＢ）をメラニン細胞に照射した後にそれぞれの素材を処理した場合、試験濃度において、ＲＤとＲＫは平均２０％前後の細胞毒性が増加したのに対し、ＲＣとＡＰは５％未満で有意なほどの細胞毒性増加は見られなかった。これは、紫外線に露出されて既に敏感になったメラニン細胞の場合、ＲＤとＲＫへの反応時の毒性がさらに深まることが分かる。このような現象もやはり、ＲＣとＡＰにおいては示されなかったものであり、これは、白斑症を誘発する素材の狭いＳａｆｅｔｙ Ｍａｒｇｉｎにより示され得る特徴の一つであると考えられる。したがって、前記比率が平均１５％未満、平均１４％未満、平均１３％未満、平均１２％未満、平均１１％未満、平均１０％未満、平均９％未満、平均８％未満、または平均７％未満である場合、美白成分の安全性が確保されていると判断することができる。
以上の結果を総合してみると、ＲＤ、ＲＫ、ＭＢは、メラニン細胞との反応時間が増加するほど、細胞が紫外線（ＵＶＢ）に露出されて敏感になるほど、収録細胞毒性を深めさせることが分かる。このことは、Ｒｈｏｄｏｄｅｎｏｌ含有化粧品の使用顧客の中で白斑症の副作用を示した人々が、長期間製品を使用し続け、特に、紫外線が露出された部位において副作用がひどかったという結果と一致する。
したがって、本発明の一側面である前記実験例１〜３によって美白成分を測定する場合、長時間の使用に伴う美白成分の副作用を予測することが可能であり、美白効能濃度と細胞毒性誘発濃度間の相関関係を簡便に究明することができ、紫外線の有無に伴う副作用の増加幅を効果的に予測する効果があり、美白成分の副作用を測定する方法として適合する。

Claims (12)

  1. 美白成分の副作用を予測する方法であって、
    前記方法は、下記のうち一つ以上を測定することを含む方法：
    ｉ）美白成分の長時間使用に伴う毒性の増加幅；
    ii）美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異；および
    iii）紫外線前処理による美白成分に対する敏感度増加幅。
  2. 前記ｉ）の毒性の増加幅は、
    メラニン細胞に美白成分を処理後３〜３６時間となる時点に測定された第１の細胞毒性に対する、４８時間以上となる時点に測定された第２の細胞毒性の比率である、請求項１に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  3. 前記ii）の美白効能濃度と細胞毒性濃度との差異は、
    メラニン細胞のメラニン生成を有効に抑制する美白成分のメラニン生成抑制効能濃度に対する、メラニン細胞の毒性を引き起こす美白成分の細胞毒性濃度の相関倍数である、請求項１に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  4. 前記iii）の敏感度増加幅は、
    紫外線が照射されなかったメラニン細胞に美白成分を処理した対照群の細胞毒性に対する、紫外線が照射されたメラニン細胞に美白成分を処理した実験群の細胞毒性の比率である、請求項１に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  5. 前記測定は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、美白成分を処理した細胞の吸光度で表される細胞生存率（％）の測定を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  6. 前記測定は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、細胞の２０％が死滅する濃度であるＣＣ２０（２０％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を測定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  7. 前記測定は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、細胞の半分が死滅する濃度であるＣＣ５０（５０％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を測定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  8. 前記メラニン細胞のメラニン生成抑制効能濃度は、美白成分を処理しなかった対照群に対する、メラニンの生成を５０％阻害する効能濃度であるＥＣ５０（５０％Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｌａｎｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）である、請求項３に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  9. 前記紫外線は、０．１〜５００ｍＪ／ｃｍ３の量で照射されることを特徴とする、請求項４に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  10. 前記ｉ）の第１の細胞毒性に対する第２の細胞毒性の比率が３倍以上である場合に、美白成分の副作用があるものと判断するステップをさらに含む、請求項２に記載の美白成分の副作用を予測方法。
  11. 前記ii）の相関倍数が１０倍以上である場合に、美白成分の安全性が確保されているものと判断するステップをさらに含む、請求項３に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
  12. 前記iii）の比率が平均１５％未満である場合に、美白成分の安全性が確保されているものと判断するステップをさらに含む、請求項４に記載の美白成分の副作用を予測する方法。
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