CN107278233B - 用于预测美白成分的副作用的方法 - Google Patents

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Abstract

在本说明书的一个方面，提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，所述方法包括测量以下中的至少一项：i)由于长期使用美白成分而引起的毒性的增加；ii)具有美白效果的浓度与具有细胞毒性的浓度之差；和iii)根据紫外线预处理对美白成分的敏感度的增加。此外，该方法具有有效地预测长时间使用美白成分是否会发生副作用的效果。

Description

用于预测美白成分的副作用的方法
技术领域
本申请公开一种用于预测美白成分的副作用的方法。
背景技术
使脸明亮的皮肤美白化妆品引起了很多人的兴趣。特别是东方女性表现出极大的兴趣。这是世界领先的化妆品公司将东方女性作为目标的充分的理由。与白种人或黑种人相比，东方人人口众多，且往往对于明亮的皮肤有着不寻常的眷恋。没有几个女人能避免户外运动。特别是在高尔夫球场上，有些人打高尔夫戴口罩并用衣服遮住胳膊和腿。
而防晒霜阻止紫外线照射，皮肤美白化妆品防止紫外线照射后的黑色素生成。仅在皮肤美白物质的浓度高于预定水平时，韩国食品药品管理局(Korea Food&DrugAdministration)才会批准功能性化妆品。这是因为只有当存在高于预定量的皮肤美白物质时，皮肤美白物质才能显示其功效。皮肤美白物质通过各种机理防止黑色素生成。例如，皮肤美白物质阻止了酪氨酸酶的活化，酪氨酸酶是参与黑色素生成，防止由酪氨酸酶刺激的酪氨酸的氧化，或防止黑色素从黑色素细胞转移至角质形成细胞的酶。
但是，皮肤美白物质往往会引起副作用。例如，具有功能性皮肤美白物质“杜鹃醇(或白桦精萃)”作为主要成分的Kanebo皮肤美白系列在约16,000名消费者中引起白斑病样症状，导致巨额赔偿金和品牌废除。Kanebo的杜鹃醇已开发为有效预防黑色素生成的物质并作为皮肤美白化妆品销售，其类似物覆盆子酮和莫诺苯腙使患有白斑病的患者的皮肤脱色，通常认为伴有黑色素细胞毒性。相比之下，对于通过类似机理(抑制酪氨酸酶活性)表现出抑制黑色素生成的作用的噜忻喏(4-n-丁基间苯二酚)，消费者没有报道商业化的皮肤美白产品的临床问题。
因此，对通过例如能够预测在长期反复使用美白成分后可能发生的临床副作用的系统来筛选物质的安全性的需要正在增加。另外，需要一种能够方便、快速、准确地预测美白成分的副作用的系统，这是因为为了调查美白成分的安全性而消耗长达几年的时间以及巨额成本并不合理。
相关技术的引用
(专利文献1)韩国专利注册公开号10-1206200。
发明内容
技术问题
在一方面，本申请公开用于预测美白成分的副作用的方法。
另一方面，本申请旨在提供一种通过预测美白成分的副作用来判断副作用明显降低的美白成分的方法。
技术方案
在一方面，本申请提供了用于测量由于长期使用美白成分而引起的细胞毒性增加的方法作为用于预测美白成分的副作用的方法。
另一方面，本申请提供一种用于测量皮肤美白浓度和细胞毒性浓度之间的相关因子的方法作为用于预测美白成分的副作用的方法。
另一方面，本申请提供一种用于测量由于紫外线预处理引起的对美白成分的敏感度增加的方法作为预测美白成分的副作用的方法。
有益效果
根据本申请的一个方面，用于预测美白成分的副作用的方法提供有效地预测长期使用美白成分时可能发生的副作用的作用。
根据本申请的一个方面，用于预测美白成分的副作用的方法提供方便地研究皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之间的相关性的作用。
根据本申请的一个方面，用于预测美白成分的副作用的方法提供有效地预测由于紫外线照射引起的副作用增加的作用。
附图说明
图1展示测试实施例中用作美白成分的测试物质的结构。
图2展示在测试实施例1-1中测得的不同浓度的样品在第1天和第7天的细胞毒性。RD表示杜鹃醇，RK表示覆盆子酮，MB表示莫诺苯腙，RC表示噜忻喏，且AP表示5-金刚烷-1-基-N-(2,4-二羟基苄基)-2,4-二甲氧基-苯甲酰胺。
图3展示在测试实施例中用样品处理24小时后测得的细胞毒性，在更换新鲜培养基后用样品处理24小时和48小时后测得的细胞毒性，以及用样品处理72小时后测得的细胞毒性。
图4比较了在测试实施例2中测得的在第7天样品中黑色素合成的抑制浓度。
图5比较了测试实施例3中测得的7天中接受UVB照射或不接受UVB照射的细胞毒性的变化。
具体实施方式
在一方面，本申请提供一种通过测量由于长期使用美白成分引起的毒性增加来预测美白成分的副作用的方法。
在一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，所述方法包括测量以下中的至少一项：
i)由于长期使用美白成分而引起的毒性的增加；
ii)皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之差；和
iii)由于紫外线预处理引起的对美白成分的敏感度的增加。
一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其中i)的毒性的增加为在用美白成分处理黑色素细胞之后48小时或更长时间测得的第二细胞毒性与在3-36小时测得的第一细胞毒性的比率。
一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其中ii)的皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之差为造成黑色素细胞毒性的美白成分的细胞毒性浓度与有效抑制黑色素细胞的黑色素生成的美白成分的黑色素生成有效抑制浓度的相关因子。
一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其中iii)的敏感度的增加为其中用美白成分处理经紫外线照射的黑色素细胞的测试组的细胞毒性与其中用美白成分处理未经紫外线照射的黑色素细胞的对照组的细胞毒性的比率。
一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其包括：将美白成分加入黑色素细胞中的步骤；在将美白成分加入至黑色素细胞后3-36小时测量第一细胞毒性的步骤；在将美白成分加入至黑色素细胞后48小时测量第二细胞毒性的步骤；以及测量第二细胞毒性与第一细胞毒性的比率的步骤。
在本申请的一方面，可以例如在3小时或更晚，4小时或更晚、6小时或更晚、8小时或更晚、10小时或更晚、12小时或更晚、14天或更晚、16小时或更晚、18小时或更晚、20小时或更晚、或22小时或更晚测量第一细胞毒性。
此外，可以例如在36小时或更早、34小时或更早、32小时或更早、30小时或更早、28小时或更早、26小时或更早、或24小时或更早测量第一细胞毒性。
在本申请的一方面，可以例如在48小时或更晚、60小时或更晚、72小时或更晚、84小时或更晚、96小时或更晚、108小时或更晚、120小时或更晚、132小时或更晚、144小时或更晚、156小时或更晚、168小时或更晚、或180小时或更晚测量第二细胞毒性。
此外，可以例如在480小时或更早、456小时或更早、432小时或更早、408小时或更早、384小时或更早、360小时或更早、336小时或更早、312小时或更早、288小时或更早、264小时或更早、240小时或更早、216小时或更早，或192小时或更早测量第二细胞毒性。
当在上述时间范围内进行测量时，可以有效地测量细胞毒性的比率。
在本申请的一方面，细胞毒性可以是与未用美白成分处理的对照组相比，由用美白成分处理的细胞的吸光度表示的细胞存活率(％)。例如，可以根据等式1通过测量细胞存活率(％)来预测美白成分的副作用。
[等式1]
细胞存活率(％)＝{(A样品-Ab)/(Ac-Ab)}x 100
A样品：用美白成分处理的样品在450nm的吸光度
Ab：空白的吸光度
Ac：载体对照的吸光度(0.5％DMSO)
在本申请的一方面，细胞毒性可以为与未用美白成分处理的对照组相比，20％细胞死亡的CC20(20％细胞毒性浓度)。CC20通常被认为是细胞毒性开始出现的浓度。
在本申请的一个方面，细胞毒性可以是与未用美白成分处理的对照组相比，一半细胞死亡的CC50(50％细胞毒性浓度)，其中。CC50是与载体对照组相比一半细胞死亡的浓度。
在本申请的一方面，可以测量第二细胞毒性与第一细胞毒性的比率作为倍数值。
另一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其包括测量皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之差。例如，可以通过测量用美白成分处理黑色素细胞后的细胞毒性浓度，测量处理后黑色素细胞的黑色素生成有效抑制浓度，并测定与黑色素生成有效抑制浓度相比细胞毒性浓度的相关因子来测量皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之差。
另一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其包括：在将美白成分加入至黑色素细胞后3-480小时测量细胞毒性浓度的步骤；在将美白成分加入至黑色素细胞后的3-480小时，测量EC50，或抑制50％黑色素生成的有效浓度的步骤；以及通过将细胞毒性除以EC50来测量细胞毒性浓度和黑色素生成有效抑制浓度(EC50)的相关因子的步骤。
另一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其中细胞毒性浓度为与对照组相比一半细胞死亡的CC50(50％细胞毒性浓度)，或为与对照组相比20％细胞死亡的CC20(20％细胞毒性浓度)。
在本申请的另一方面，可以例如在3小时或更晚、6小时或更晚、12小时或更晚、24小时或更晚、48小时或更晚、60小时或更晚、72小时或更晚、84小时或更晚、96小时或更晚、108小时或更晚、120小时或更晚、132小时或更晚、144小时或更晚、156小时或更晚、168小时或更晚，或180小时或更晚测量所述细胞毒性。
此外，可以例如在480小时或更早、456小时或更早、432小时或更早、408小时或更早、384小时或更早、360小时或更早、336小时或更早、312小时或更早、288小时或更早、264小时或更早、240小时或更早、216小时或更早，或192小时或更早测量所述细胞毒性。
在本申请的另一方面，可以例如在3小时或更晚、6小时或更晚、12小时或更晚、24小时或更晚、48小时或更晚、60小时或更晚、72小时或更晚、84小时或更晚、96小时或更晚、108小时或更晚、120小时或更晚、132小时或更晚、144小时或更晚、156小时或更晚、168小时或更晚、或180小时或更晚测量有效浓度EC50。
此外，可以例如在480小时或更早、456小时或更早、432小时或更早、408小时或更早、384小时或更早、360小时或更早、336小时或更早、312小时或更早、288小时或更早、264小时或更早、240小时或更早、216小时或更早，或192小时或更早测量有效浓度EC50。
当在上述时间范围内进行测量时，可以有效地测量皮肤美白效果(黑色素细胞的黑色素生成有效抑制浓度)与细胞毒性浓度之间的相关因子。
另一方面，本申请提供一种通过测量由于紫外线预处理引起的对美白成分的敏感度的增加来预测美白成分的副作用的方法。
例如，可以通过测量其中用美白成分处理的经紫外线照射的黑色素细胞的测试组的细胞毒性，测量其中用美白成分处理的未经紫外线照射的黑色素细胞的对照组的细胞毒性并测量试验组和对照组的细胞毒性比率来测量敏感度的增加。
另一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其包括：在用美白成分处理经紫外线照射的黑色素细胞后的3-480小时测量测试组的细胞毒性，并在用美白成分处理未经紫外线照射的黑色素细胞后3-480小时测量对照组的细胞毒性的步骤；以及测定试验组和对照组的细胞毒性的比率的步骤。
另一方面，本申请提供一种用于预测美白成分的副作用的方法，其中测试组和对照组的细胞毒性为根据等式1所示的细胞存活率(％)。
在本申请的另一方面，可以例如在3小时或更晚、6小时或更晚、12小时或更晚、24小时或更晚、48小时或更晚、60小时或更晚、72小时或更晚、84小时或更晚、96小时或更晚、108小时或更晚、120小时或更晚、132小时或更晚、144小时或更晚、156小时或更晚、168小时或更晚、或180小时或更晚测量测试组和对照组的细胞毒性。
此外，可以例如在480小时或更早、456小时或更早、432小时或更早、408小时或更早、384小时或更早、360小时或更早、336小时或更早、312小时或更早、288小时或更早、264小时或更早、240小时或更早、216或更早、或192或更早测量测试组和对照组的细胞毒性。
当在上述时间范围内进行测量时，可以有效地测量由于紫外线预处理引起的对美白成分的敏感度的增加。
在本申请的另一方面，UV的强度可以为0.1mJ/cm3或更高、0.5mJ/cm3或更高、1mJ/cm3或更高、2mJ/cm3或更高、3mJ/cm3或更高、4mJ/cm3或更高、5mJ/cm3或更高、6mJ/cm3或更高、7mJ/cm3或更高、8mJ/cm3或更高、9mJ/cm3或更高、10mJ/cm3或更高、11mJ/cm3或更高、12mJ/cm3或更高、13mJ/cm3或更高、14mJ/cm3或更高、15mJ/cm3或更高、16mJ/cm3或更高、17mJ/cm3或更高、18mJ/cm3或更高、19mJ/cm3或更高、或20mJ/cm3或更高。
此外，UV的强度可以为500mJ/cm3或更低、480mJ/cm3或更低、460mJ/cm3或更低、44mJ/cm3或更低、420mJ/cm3或更低、400mJ/cm3或更低、380mJ/cm3或更低、360mJ/cm3或更低、340mJ/cm3或更低、320mJ/cm3或更低、300mJ/cm3或更低、280mJ/cm3或更低、260mJ/cm3或更低、240mJ/cm3或更低、220mJ/cm3或更低、200mJ/cm3或更低、180mJ/cm3或更低、160mJ/cm3或更低、140mJ/cm3或更低、120mJ/cm3或更低、100mJ/cm3或更低、80mJ/cm3或更低、60mJ/cm3或更低、或40mJ/cm3或更低。
当在上述时间范围内进行测量时，可以有效地测量由于紫外线预处理引起的对美白成分的敏感度的增加。
另一方面，本申请提供了一种用于预测美白成分的副作用的方法，该方法包括测量上述那些项目之一。
美白成分的副作用是各种各样的且代表性副作用包括皮肤老化、致癌作用、痤疮、皲裂、白斑病等。其最典型的副作用是白斑病。已知引起白斑病样副作用的美白成分包括杜鹃醇、覆盆子酮和莫诺苯腙。在本申请中，这些美白成分用作黑色素细胞毒性的阳性化合物。1998年，POLA化学工业公司的Okubo博士开发了从杉木中分离出的作为具有皮肤美白效果的物质4-丁基间苯二酚。其于1999年投入市场，名称为噜忻喏。这种美白成分在皮肤美白产品中的使用已超过15年。由于这些产品的用户没有报告临床副作用，因此在本申请中使用安全性已经通过长期使用证实的噜忻喏作为黑色素细胞毒性的阴性化合物。
【发明模式】
以下，通过实施例对本申请进行详细说明。然而，以下实施例仅用于说明的目的，本申请的范围不受实施例的限制。
美白成分(测试物质)的制备
测试物质为杜鹃醇(>98％)、覆盆子酮(>98％)、莫诺苯腙(>98％)、噜忻喏(>98％)和5-金刚烷-1-基-N-(2,4-二羟基苄基)2,4-二甲氧基-苯甲酰胺(>98％)。杜鹃醇、覆盆子酮和5-金刚烷-1-基-N-(2,4-二羟基苄基)2,4-二甲氧基-苯甲酰胺是合成的(图1)。特别地，本申请的发明人合成的物质5-金刚烷-1-基-N-(2,4-二羟基苄基)-2,4-二甲氧基-苯甲酰胺(以下称为“AP”)具有化学式1的结构且在测试实施例2中发现呈现黑色素细胞的黑色素生成的优异抑制作用。
【化学式1】
Figure BDA0001389702640000071
5-金刚烷-1-基-N-(2,4-二羟基苄基)-2,4-二甲氧基-苯甲酰胺
莫诺苯腙(4-苄氧基-苯酚)购自Santa Cruz Biotechnology(美国，目录号：Sc-232257)，噜忻喏(4-丁基间苯二酚)购自东京化工(Tokyo Chemical Industry，日本，目录号：3B773)。将所有测试物质溶于DMSO中，并在DMSO中处理使细胞终浓度为0.5％。
黑色素细胞的制备
在实验中使用HEMn-MP和A375细胞。
HEMn-MP(人表皮黑色素细胞，新生的，中度色素供体，目录号：C-102-5C)细胞购自Life Technologies(美国)。作为细胞培养基，使用补充有HMGS(目录号S-002-5)的培养基254(目录号M-254-500)。根据制造商手册培养细胞，使用第3-8代的细胞。总而言之，在37℃、5％CO2培养箱中在175T烧瓶中培养细胞。在传代培养期间，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA分离细胞，通过离心(1200rpm，5分钟)收集细胞，并在接种后培养至5×103个细胞/cm2。对于细胞毒性试验，将细胞接种到每个孔为2x104个细胞的96孔板上，培养一天，并用每种物质以200μL/孔进行处理。然后，在预定时间后测量细胞毒性。
A375(人黑色素瘤细胞系)细胞购自ATCC(目录号CRL-1619，美国)。作为细胞培养基，使用补充有10％FBS(目录号：16000-044，Gibco，美国)的DMEM(目录号：12-604，Lonza，美国)。以相同的方式对HEM细胞进行亚培养和细胞毒性试验。
细胞毒性测量
通过Dojindo Molecular Technologies(美国)制造的细胞计数试剂盒-8(CellCounting Kit-8，CCK-8)测量细胞毒性。从96孔板中移除培养基后，向每个孔中加入200μL的相同培养基中的10％CCK-8。在37℃温育约2小时后，使用ELISA读数仪在450nm下测定100μL培养基的吸光度。随着细胞死亡，CCK-8的颜色从无色变成橙色，转变成更长的波长。
根据等式1计算细胞存活率。
[等式1]
细胞存活率(％)＝{(A样品-Ab)/(Ac-Ab)}x 100
A样品：用美白成分处理的样品在450nm下的吸光度
Ab：空白的吸光度
Ac：载体对照的吸光度(0.5％DMSO)
统计分析
通过学生t检验对数据进行统计学分析。基于三次或更多次独立测试的结果，获得平均值和标准偏差(SD)。
测试实施例1-1：取决于美白成分和处理时间的HEMn-MP细胞的细胞毒性浓度的比 较
为了确定美白成分对HEMn-MP(人表皮黑色素细胞，新生的，中度色素供体，目录号：C-102-5C)细胞的细胞毒性浓度，与用每种美白成分以表1(图2)中描述的浓度处理后在第1天和第7天的对照组(0.5％DMSO)相比，测量细胞存活率(％细胞存活率)。根据测量结果，计算关于美白成分和处理时间的CC20和CC50。然后，计算第7天的细胞毒性浓度与第1天的细胞毒性浓度相比的比率(表2)。
【表1】
Figure BDA0001389702640000091
【表2】
Figure BDA0001389702640000092
在使用HEMn-MP细胞的毒性试验中，美白成分的细胞毒性取决于暴露时间而明显变化。在美白成分中，已知具有副作用的RD、RK和MB在第7天与第1天相比显示出细胞毒性增加(CC50)4.5-14.9倍。相比之下，没有报道临床副作用的RC(1.2倍)和AP(2.2倍)显示出细胞毒性增加相对较小(表2)。这表明毒性的增加取决于样品的处理(暴露)时间。有趣的是，对已知引起白斑病(黑色素细胞毒性)的RD、RK和MB，这种现象特别明显。结论，当第7天的细胞毒性与第1天的细胞毒性相比为2.7倍或更高、2.8倍或更高、2.9倍或更高、3.0倍或更高、3.1倍或更高、3.2倍或更高、3.3倍或更高、3.4倍或更高、3.5倍或更高、3.6倍或更高、3.7倍或更高、3.8倍或更高、3.9倍或更高、4.0倍或更高、4.1倍或更高、4.2倍或更高、4.3倍或更高、或4.4倍或更高时，可以确定美白成分有副作用。
测试实施例1-2取决于美白成分和处理时间的A375细胞的细胞毒性浓度的比较
研究美白成分对不同处理时间下的A375(人黑色素瘤细胞系，目录号CRL-1619)细胞的细胞毒性。测量3种不同样品处理条件的毒性。在更换新鲜培养基后，用美白成分将样品处理24小时和48小时，和在不更换培养基的情况下，用美白成分将样品处理72小时，测定细胞毒性。结果如图(图3)所示。根据测量结果，计算关于美白成分和处理时间的CC20和CC50。然后，计算第3天的细胞毒性浓度与第1天的细胞毒性浓度相比的比率(表3)。
【表3】
Figure BDA0001389702640000101
对于A375细胞，与第1天相比，用RD、RK和MB处理治疗后第3天的细胞毒性增加约16.8-41倍(CC50)，而RC(4.2倍)和AP(1.7倍)的毒性增加较小(表3)。RD、RK和MB显示毒性随时间明显增加，表明用这些样品处理的黑色素细胞的毒性与时间成比例。这被认为是引起白斑病的样品的体外黑色素细胞毒性的特征之一。结论，可以确定当第3天的细胞毒性与第1天的细胞毒性相比为7倍或更高、7.5倍或更高、8倍或更高、8.5倍或更高、9倍或更高、9.5倍或更高、10倍或更高、10.5倍或更高、11倍或更高、11.5倍或更高、或12倍或更高时，美白成分有副作用。
特别是，当用样品对A375细胞处理一天，然后在去除样品后再培养2天时，用RD、RK和MB样品处理的组显示毒性持续增加，而用RC和AP处理的组显示细胞毒性没有增加。这表明去除样品后细胞毒性的恢复取决于样品而不同。这是引起白斑病的美白成分与RC和AP美白成分之间的另一个差异(图2)。
测试实施例2HEMn-MP细胞的细胞毒浓度与美白成分有效浓度的相关性的比较
研究对于HEMn-MP细胞，美白成分对黑色素生成的抑制作用。在用表4所示浓度的样品处理细胞，并培养7天后，与对照组(0.5％DMSO)相比，测量黑色素的量(图4)。此外，计算美白成分的EC50(黑色素生成的50％有效抑制浓度)(表5)。然后，将CC20或CC50除以EC50，以研究细胞毒性与黑色素生成有效抑制浓度之间的相关因子(差异)(表6)。【表4】
Figure BDA0001389702640000121
【表5】
浓度 RD(mM) RK(mM) MB(μM) RC(μM) AP(μM)
EC<sub>50</sub> 1.13±0.16 0.97±0.09 6.8±2.5 2.7±0.6 0.11±0.01
*EC50(黑色素合成的50％抑制浓度)
【表6】
倍数 RD RK MB RC AP
CC<sub>20</sub>/EC<sub>50</sub> 0.8 0.4 1.3 >20 11.8
CC<sub>50</sub>/EC<sub>50</sub> 2.1 1.4 2.8 >20 >20
表6比较了第7天，细胞毒性浓度(CC50)和美白成分的黑色素合成的抑制浓度(EC50)之间的相关因子。CC20/EC50是通过将20％细胞毒性浓度除以黑色素生成的50％有效抑制浓度而获得的值，并代表20％细胞毒性浓度和有效浓度的相关因子。CC50/EC50是通过将50％细胞毒性浓度除以黑色素生成的50％有效抑制浓度而获得的值，并表示50％细胞毒性浓度和有效浓度的相关因子。
而RD、RK和MB在1.4-2.8倍显示50％的细胞毒性，RC和AP仅在20倍或更高时显示50％的细胞毒性(表6)。也就是说，RD、RK和MB在有效浓度和细胞毒性浓度之间，即体外安全性幅度，显示出非常窄小的差异，但RC和AP显示出较宽的安全性幅度。因此，当CC50/EC50为5倍或更高、6倍或更高、7倍或更高、8倍或更高、9倍或更高、10倍或更高、11倍或更高、12倍或更高、13倍或更高、14倍或更高、15倍或更高、16倍或更高、17倍或更高、18倍或更高、19倍或更高、或20倍或更高时，可以确认美白成分是安全的。
这种现象表明，对于一些样品，抑制黑色素生成的作用可能导致黑色素细胞死亡。在化妆品开发中，这是应确保的安全性中的一个重要因素。
测试实施例3对于HEMn-MP细胞，取决于UVB照射的、美白成分的毒性浓度(对美白 成分的敏感度的增加)的比较
为了研究UVB照射对美白成分的细胞毒性的影响，比较在无UVB照射的情况下用美白成分处理的组和以20mJ/cm3的UVB照射，然后用美白成分处理的组的细胞毒性(图5)。也就是说，研究通过UVB照射激发的细胞对各种美白成分的反应。用UVB照射细胞并用样品处理细胞后，确定细胞毒性的增加，并计算与处理前相比的细胞毒性的比率(表7)。
【表7】
Figure BDA0001389702640000141
表7显示在有或无UVB照射下第7天美白成分的细胞毒性的变化。与UVB未照射的细胞相比，UVB照射的细胞的毒性比率(％)是以每种美白成分的代表性浓度(3个点)测定的。针对对照组的细胞毒性(15-20％)，校正比率。
当用UVB照射黑色素细胞，然后用美白成分处理时，RD和RK显示出细胞毒性平均增加约20％，而RC和AP显示出细胞毒性的微量增加小于5％。这意味着在用RD和RK处理时，UVB照射激发的黑色素细胞显示出加剧的毒性。对于RC和AP，没有观察到这种现象，且这种现象被认为是引起白斑病、具有小安全系数的美白成分的特征之一。结论，当比率平均为15％或更低、14％或更低、13％或更低、12％或更低、11％或更低、10％或更低、9％或更低、8％或更低、或7％或更低时，可以确定美白成分是安全的。
总之，用RD、RK和MB将黑色素细胞处理较长时间时和细胞暴露于UVB时，RD、RK和MB会加剧细胞毒性。这与以往长期使用含杜鹃醇的化妆品的使用者，特别是在暴露于紫外线的部位上所报道的白斑病副作用的事实是一致的。
因此，根据本发明的一个方面的用于预测美白成分的副作用的方法，可以预测由长期使用引起的美白成分副作用，可以方便地阐明皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之间的相关性，并且可以有效地预测由于UV照射引起的副作用的增加。

Claims (1)

1.一种用于预测皮肤美白成分是否会引起副作用的方法，所述方法包括测量以下中的至少一项：
i)由于使用皮肤美白成分而引起的细胞毒性浓度的增加，其中i)的细胞毒性浓度的增加为在用皮肤美白成分处理黑色素细胞后第7天时测得的第二细胞毒性浓度与在第1天时测得的第一细胞毒性浓度的比率；
ii)皮肤美白浓度与细胞毒性浓度之间的差异，其中ii)中的所述差异是用在第7天时测得的细胞毒性浓度除以在第7天时测得的皮肤美白浓度所得到的值；和
iii)由于紫外线预处理引起的对皮肤美白成分的细胞毒性的增加，其中iii)中的细胞毒性的增加是在第7天时测得的测试组的细胞存活率(％)与在第7天时测得的对照组的细胞存活率(％)的比值，其中测试组中用皮肤美白成分处理经UVB照射的黑色素细胞，对照组中用皮肤美白成分处理未经UVB照射的黑色素细胞，
其中该方法进一步包括确定以下至少之一：
1)当i)的所述比率为3或更大时，皮肤美白成分具有副作用；
2)当ii)的所述差异为10或更大时，皮肤美白成分是安全的；和
3)当iii)的所述比值的平均值低于15％时，皮肤美白成分是安全的，
其中ii)的所述皮肤美白浓度为有效抑制黑色素细胞产生黑色素的皮肤美白成分的浓度，
其中ii)的所述皮肤美白浓度是通过测量与未用美白成分处理的对照组相比、用美白成分处理的细胞中黑色素的量而获得的，
其中ii)的所述皮肤美白浓度是与未用所述皮肤美白成分处理的对照组相比，抑制50％黑色素生成的EC50，
其中iii)的所述细胞存活率(％)是用美白成分处理的细胞的吸光度与未用美白成分处理的对照组的吸光度的比值，
其中i)和ii)的所述细胞毒性浓度为导致黑色素细胞毒性的皮肤美白成分的浓度，
其中i)和ii)的所述细胞毒性浓度是通过测量细胞存活率(％)而获得的，其中所述细胞存活率(％)是用美白成分处理的细胞的吸光度与未用美白成分处理的对照组的吸光度的比值，
其中i)和ii)的所述细胞毒性浓度为与未用所述皮肤美白成分处理的对照组相比，20％细胞死亡的CC20或一半细胞死亡的CC50；
其中所述UVB以20mJ/cm3的强度进行照射，并且
其中副作用为白斑病。
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