JP6928988B2 - アリトールを有効成分とする経口抗肥満活性剤および肥満抑制方法 - Google Patents
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Description
ズイナあるいはリョウブ(地域によってズイナのことをリョウブと呼ばれている。本発明においては、リョウブ=ズイナである。以下、この説明を省略する。)の抗肥満作用を利用するものである。
血糖値、体重増加、および内臓脂肪蓄積の一以上を改善する特徴的な生理活性に優れ、かつ安全な天然物そのものに対する強い社会的要請があるところ、ズイナあるいはリョウブの葉、茎などの植物体には、生理活性を有する希少糖が含まれていること、希少糖が血糖値、体重増加、および内臓脂肪蓄積の一以上を改善する特徴的な生理活性物質であること(非特許文献7)に基づき、これらの植物体そのものに希少糖と同様の効果があるか否かを検討したこれまでの研究で、ズイナ乾燥粉末を5%添加した食餌をラットに長期間与えると体脂肪蓄積が抑制されること、またその作用は、ズイナに含有するD-プシコースとアリトールによる可能性が示唆されているという成果を得てすでに特許出願をした(特許文献2)。
本発明は、アリトールを含有している天然物である植物体そのもの、すなわち自然界では極少量しか産生しない希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体そのものにおける、体脂肪蓄積抑制機能、および/または、総コレステロール値上昇抑制機能を上記先願においてすでに検証したが、本発明は、アリトールそのものにもD-プシコースと同等の抗肥満作用があることを期待し、アリトールを有効成分とする経口抗肥満活性剤および肥満抑制方法を提供することを目的とした。
(1)アリトールをD−プシコースよりも大きい抗肥満作用の有効成分として成ることを特徴とする、摂取者にD−プシコースよりも大きい抗肥満効果を与えるための経口抗肥満活性剤。
(2)アリトールを食品の形態で摂取させて成ることを特徴とする上記(1)に記載の経口抗肥満活性剤。
(3)前記アリトールはズイナあるいはリョウブから抽出したことを特徴とする上記(1)または(2)に記載の経口抗肥満活性剤。
(4)前記アリトールはズイナあるいはリョウブに含まれる形態であることを特徴とする上記(1)または(2)に記載の経口抗肥満活性剤。
(5)前記アリトールは、D-プシコースとアリトールとを含有する、アリトール混合物であることを特徴とする上記(1)ないし(4)の何れか一に記載の経口抗肥満活性剤。
(6)前記アリトール混合物において、アリトールおよび/またはD-プシコースの含有量が調整されていることを特徴とする上記(5)に記載の経口抗肥満活性剤。
(7)アリトールを食品の形態で摂取させ、摂取者にD−プシコースよりも大きい抗肥満効果を与えることを特徴とする肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
(8)前記アリトールはズイナあるいはリョウブから抽出したことを特徴とする上記(7)に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
(9)前記アリトールはズイナあるいはリョウブに含まれる形態であることを特徴とする上記(7)または(8)に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
(10)前記アリトールは、D-プシコースとアリトールとを含有する、アリトール混合物であることを特徴とする上記(7)ないし(9)の何れか一に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
(11)前記アリトール混合物において、アリトールおよび/またはD-プシコースの含有量を調整することを特徴とする上記(10)に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
希少糖とは、自然界に微量にしか存在しない単糖およびその誘導体と定義づけられる。六炭糖(ヘキソース)については、アルドースの場合はL-アロース、L-グロース、L-グルコース、L-ガラクトース、L-アルトロース、L-イドース、L-マンノース、L-タロース、D-タロース、D-マンノース、D-イドース、D-アルトロース、D-ガラクトース、D-グルコース、D-グロース、D-アロースの16種類、ケトースの場合はL-プシコース(L-アルロース)、L-ソルボース、L-フルクトース、L-タガトース、D-タガトース、D-フルクトース、D-ソルボース、D-プシコースの8種類が存在する。例えば、D-プシコースがヒトに対する毒性を有するとの報告はなく、動物に対する毒性は低いと考えられる。
希少糖で、D-プシコースを得る方法は、現在のところ、D-フルクトースを酵素(エピメラーゼ)処理して得られる製法が一般的である。
D-プシコース、L-プシコース、D-タガトース、L-タガトース、D-ソルボースおよびL-ソルボースから選ばれる少なくとも1であるケトヘキソースから、周期律表の第8族の元素から選ばれる金属を含有する触媒の存在下、糖アルコールであるタリトール、アリトール、イディトール等を水素添加反応により製造することができる(特許文献3)。
ソルビトール、マンニトール等の炭素数が6の糖アルコールは、種々の用途に用いられている。また、タリトール、アリトール、イディトール等は、自然界にはほとんど存在しない糖アルコールであるが、食品、化粧品、医薬品、化学品、農薬、植物成長調整剤等に用いられることが期待される糖質である。
希少糖とは、国際希少糖学会によって「自然界にその存在量が少ない単糖とその誘導体」と定義され、単糖とその誘導体としての糖アルコールを加えると、60種類ほどになる。D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるD-ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。DTEの発見によって、D-グルコースからD-フルクトース、D-プシコースを製造し、さらにD-アロース、アリトール、D-タリトールを製造することができるようになった。
自然界にはほとんど存在しない糖アルコールであるアリトールは、D-プシコースから、周期律表の第8族の元素から選ばれる金属を含有する触媒の存在下、水素添加反応により製造したもの、ズイナ属の植物体に含まれる形態のものを用いることができる。
ズイナ属の植物は、自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体である(非特許文献8)。すなわち、自然界にあって希少糖と称される生理活性作用を有するD-プシコースとアリトールをその植物体内で生産し含有している唯一の植物である。ズイナ属の植物は日本においては苗木として販売されており、一部の種に属するものは、その長い穂と香りの良い頭花から観賞用庭園で育てられ、また、垣根としての利用、あるいは生け花として用いられている。我が国においては苗木として販売されているが、その種子発芽による増殖をすることが容易ではなかった。ズイナ属の植物は、生理活性作用を有するD-プシコースとアリトールをその植物体内で生産し含有していことが分かったことで、種子を効率よく発芽させるための方法の開発が切望されることとなった。
物理・化学的処理方法としては、例えば天日乾燥、風乾、凍結乾燥等の乾燥処理、ブレンダー、ホモジナイザー、ボールミル等による粉砕処理等があげられ、物理・化学的処理物としては、乾燥処理物、凍結乾燥処理物、粉砕処理物等があげられる。生物的処理方法としては、発酵方法等があげられ、生物的処理物としては発酵処理物があげられる。
成木の芽、葉、枝、花または根、あるいは発芽した種子、継体培養または組織培養により成長した植物体を用いると好ましい。
抽出および抽出物の処理に際しては、例えば抗酸化剤や保存剤等を添加することもできる。溶媒抽出に用いる溶媒としては、植物体の機能成分を抽出できる溶媒なら何を用いてもよく、例えば水、蒸留水、脱イオン水、無機塩水溶液、緩衝液等の水性媒体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の一価アルコール、プロピレングリコール、グリセロールなどの多価アルコール、ヘキサン、トルエン、石油エーテル、ベンゼン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、1,1,2−トリクロロエテン、ジメチルスルフォキシド、アセトン等の有機溶媒等があげられ、水性媒体、アルコールが好ましい。
緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等があげられる。無機塩水溶液の無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等があげられる。アルコールとしては、一価アルコールが好ましく、一価アルコールとしてはエタノールが好ましい。
これら溶媒は単独または複数混合して用いることができる。混合した溶媒としては、含水アルコールが好ましく、含水一価アルコールがより好ましく、含水エタノールが特に好ましい。含水率としては、70%以下が好ましく、40%以下がより好ましい。溶媒としては、超臨界流体化した二酸化炭素を用いることもできる。
抽出は、例えば植物体1重量部に対し溶媒0.1重量部〜10000重量部、好ましくは1重量部〜100重量部用いて行う。抽出温度は特に制限が無いが、0℃〜100℃が好ましく、20℃〜90℃がより好ましい。抽出時間は、特に制限が無いが、1分間〜1週間が好ましく、30分間〜1日間がより好ましい。また、ズイナあるいはリョウブからの抽出方法として、前述のズイナあるいはリョウブ、前述のズイナあるいはリョウブの物理・化学的処理物、前述の生物的処理物を水性媒体で抽出した残さを水、アルコール、もしくは含水アルコールで抽出することができる。
水性媒体としては、特に制限がないが、水、純水、脱イオン水が好ましい。水性媒体およびアルコールもしくは含水アルコールで抽出するときの抽出温度は特に制限がないが、0℃〜100℃が好ましく、20℃〜90℃がより好ましい。抽出時間は、特に制限が無いが、1分間〜1週間が好ましく、30分間〜1日間がより好ましい。またズイナあるいはリョウブとしては、乾燥処理または発酵処理されたものを用いるのが好ましい。
抽出に使用する機器としては特に制限が無いが、効率よく抽出するために工夫された容器、攪拌機、還流冷却器、ソックスレー抽出機、ホモジナイザー、振とう機、超音波発生装置等などがあげられる。本発明の肝機能保護剤または改善剤は、前述の方法で調製したズイナあるいはリョウブまたは該抽出物を含有し、必要に応じて薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体、更に必要に応じて他の治療のための有効成分を含有していてもよい。
希少糖を含有する植物としては、現在のところズイナおよびリョウブが知られ、植物図鑑などによると以下の記載がなされている。
[ズイナ]
ズイナはズイナ属に属する植物である。ズイナ属(ズイナ属、随菜属、学名:Itea spp.)は、ユキノシタ科の落葉低木で、約10種の灌木からなる植物の属である。その若葉をヨメナのようにゆでて食べるので、ヨメナノキとも称され、幹は高さ1〜2メートル、若枝は淡緑色、葉は互生し、卵状長楕円形で先は鋭くとがり、縁に細かい鋸歯がある。葉面には約8対の平行した側脈が目立つ。5〜6月には、枝先に長さ5〜17センチメートルの上向きの総状花序をつけ、白色の小花が多数開く。花弁は卵状披針形で5枚が直立し、咢片、雄しべともに花弁と同数、雌しべは1本で柱頭は頭状、子房は半上位である。ズイナは暖地の山中に生え、近畿地方南部、四国、九州に分布している。ズイナ属は、希少糖に含まれるD-プシコースおよびアリトールを植物体内に産生する唯一の植物であるとして知られている。我が国においては苗木としても販売されている。
リョウブは、リョウブ科に属する植物であり、植物図鑑には以下のごとく説明されている。
北海道、本州、四国、九州及び朝鮮半島の済州島に分布、山林の中にはえる落葉の小高木で、高さ3〜7mばかり、幹はなめらかで茶褐色、枝は輪状に出る。若枝には星状毛がある。葉は有柄で互生し、広い倒被針形で縁に鋸歯があり、枝の先に集まってつき、表面無毛か星状毛がまばらにつき、裏面脈上に毛が密生する。夏、枝の先端に長さ6〜15cmの総状花序を出し、小さな白い花を密につける。がくは小形で5裂する。花冠は径5〜6mm、深く5裂し、小さな梅の花に似ている。雄しべは10本、雌しべは1本。球形で小形のさく果をむすぶ。材は上質の木炭となり、幼芽は食用となる。リョウブには希少糖D-プシコースは含まれていないが、地方によってはズイナのことをリョウブと呼ばれる場合がある。本発明は、ズイナについてである。
ズイナの種子は休眠状態にあるため休眠を打破しない限り播種しても発芽することはない。種子の休眠を打破するには、乾燥雰囲気の冷暗所で所定の期間保存することが必要であり、例えば、ズイナの種子を収穫した後、乾燥雰囲気、4℃、暗所にて2ないし6ヶ月の期間保存することでなされる。乾燥条件下としては、水蒸気圧が少ないほど好ましく、例えば、密閉されたプラスチック容器内に大量のシリカゲルとともに貯蔵される。貯蔵温度としては、4℃以下、好ましくは4℃が挙げられる。また、こうした条件下での貯蔵期間としては2週間以上、好ましくは2ないし6ヵ月が好ましい。ズイナの種子は光発芽種子なので、土を被せては発芽しにくく、発芽は、明所で25〜30℃の温度条件とすることが好ましく、28℃で2週間後の発芽率は60%程度である。
発芽した種子を成長させるには、例えば、発芽種子を同じ1/2MS培地〔1%ショ糖を含む(pH5.8)〕で成長させるか、ロックウールや土に植えて通常の草木と同様に成長させることができる。発芽した種子を培地に植えた場合でも土植えした場合でもその後の生育スピードに遜色はないが、土栽培の方が若干木化は進む。これらと比較してロックウール栽培では栽培初期の生育が早い。発芽した種子の移植は、例えば、播種後約10日程度を経過後に行うことができる。
ズイナの第2−5葉が展開した幼苗、あるいは、通常のズイナの幼木の茎頂部あるいは茎部を含むズイナ植物体をそのまま、あるいは、葉を取り去りそのまま、1/2MS培地(1%ショ糖添加あるいは無添加)などの植物培養培地に置くだけあるいは挿し木のように突きさして培養することにより苗を大量に増殖することを可能としたズイナの栽培法がある。ズイナ植物体は、交配により改良した種子の休眠を打破して幼苗としたものを利用することができる。休眠を打破した種子の発芽およびその継代培養による幼苗の量産によりズイナの植物体あるいは苗を容易に大量に得ることが可能となる。
ズイナの苗を量産するには、植物体の一部分を取り出して、試験管の中などで無菌的に培養する組織培養によることができる。例えば、茎の先端にある生長点付近の細胞を培養することにより簡便に大量の苗を生産することができる。例えば、第2−5葉が展開した幼苗の茎頂部を含む植物体(約5−10mm程度)を切り取り、1/2MS培地に挿し木のように突きさして、あるいは茎だけを置くだけで培養する。茎頂部を切断した植物体の下部(根と、子葉あるいは第一葉を含む植物)からは、複数の脇芽が観察される。茎頂の切断により脇芽形成が起こることから、簡単に生長点を得ることができる。葉がついていない茎だけの場合培地に置くだけで全てからの均質な幼葉が観察される。
継代培養については、茎頂部の挿し木、茎部の挿し木(茎頂部を含まない)のいずれでも良く、1/2MS培地(1%ショ糖を含む)に移植後、概ね10日以内に発根する。葉がついていない茎だけの場合、培地に置くだけで30日後に全てからの均質な幼葉およびが一部に発根が観察される。
シャーレ中で発根処理(1ヶ月あるいはそれ以上発根するまで培養)した植物をバーミキュライトや培養土に移植し、好ましくは透明フィルムなどのフードをかぶせる。なお、幼苗から培養時に培養土を用いると生育が抑制される傾向があるため、培養土よりもバーミキュライトを用いることが好ましい。そして、2−3日後にはフードをずらして湿気を取り除き、さらに2−4日後には完全にフードを取り払う。この馴化ステップに関しては、フード付コンテナを用いれば、双葉のみの幼苗でも問題はない。また、ロックウール等を用いた水耕での育苗も可能である。育苗期は防虫網などを被せてハスモンヨトウの幼虫などの害を防ぐことが好ましい。発根したズイナ植物体をプラグトレーの培地または培養土に移植してプラグ苗の形態で生育させる。
生育中に外気温が低くなると(最低気温が15度を下回る程度)、葉が赤色化する。ズイナは落葉しないが、コバノズイナは冬期には落葉する。苗木の生長は温度の影響に大きく左右されるので、春先以降に馴化ステップを開始し、夏場に向けて育てる方が効率は良く、冬場は、上記の継代作業に集中し、春先から苗作りに取り掛かるスケジュールが良い。
ズイナ苗つくりと同様に、ズイナの幼木から茎部を含むズイナ植物体、あるいは、ズイナの第2−5葉が展開した幼苗から茎頂部あるいは茎部を含むズイナ植物体を切断し、切断したズイナ植物体をそのまま、あるいは葉を取り去りそのまま、発根培地に挿し木のように突きさして置き、これを培養して発根させ、発根したズイナ植物体を培地または培養土、栽培資材(ロックウール等)に移植して幼葉野菜および/または新葉野菜を収穫できるまで生育させ、当該幼葉野菜および/または新葉野菜を収穫する。発根培地には、1/2MS培地またはGamborg B5培地を用いる。発根したズイナ植物体をズイナ野菜に育成する際、培地を用いることにより、D-プシコースおよびアリトールの機能に基づく機能野菜の無菌的な育成が可能となる。
(シャーレで無菌培養したズイナ苗全体を使う場合)
継代培養(48日間)したズイナ苗を根を切らないように手で根ごと抜き、爪楊枝などを用いて発根培地(たとえばMS培地)をできる限り取り除いた。そして、水を拭き取り、ズイナ苗の生重量を測定する。なお、この場合、シャーレ1枚あたりズイナ生重1〜4g程度が得られる。たとえば、表1は、シャーレ枚数とズイナ苗の生重量との測定結果の一例を示す図である。
圃場で生育したズイナの成葉のみを剪定鋏で切り取り袋に集める。そして、ズイナ成葉の生重量を測定する。
ズイナの成葉を液体窒素に漬けて凍結した後に、二重にした袋に入れて−80℃で保存する。保存したズイナの成葉は適宜破砕をしておく。
液体窒素にズイナを浸けて凍結させておき、液体窒素で冷やしたステンレスビーカーに凍結したズイナを入れた後、ビーカーを二重ガーゼで蓋をする。ズイナを入れた5リットルのビーカーを真空凍結乾燥機(FREEZONE 12Plus、LABCONCO社製)に入れ、あるいは、ズイナを入れた2リットルのビーカーを真空凍結乾燥機(FREEZE DRY SYSTEM/FREEZONE2.5、LABCONCO社製)に入れ、時々撹拌しつつ一定時間凍結乾燥した。なお、5リットルビーカー一杯にズイナを入れた場合でも一週間程度で乾燥した。乾燥後、重量を測定したところ生重量の約10分の1になった。重量測定したズイナをミニスピードミル(ラボネクスト)に移した。ミニスピードミルでズイナを10〜20秒破砕したら中身を確認し、それを、ズイナが粉状となるまで繰り返した。なお、連続でズイナを破砕するとミルが高温となり、ズイナパウダーが変色するため、ミルを冷やす、あるいは、ミルを交換するなどの対応が好ましい。破砕したズイナを薬さじやスパチュラを用い、できる限り集めて容器に入れた。ズイナを入れた容器のフタをパラフィルムで巻き、アルミホイルで遮光し、箱に入れ、室温暗黒下で保存した。
本発明のアリトールを有効成分とする抗肥満活性剤は、経口で投与する抗肥満活性剤、該抗肥満活性剤を含む組成物の形態で、ヒトを含む哺乳類を対象とし、該哺乳類に例えば経口的に投与される。本発明の抗肥満活性剤を含む組成物は、抗肥満活性作用を有する組成物であり、食品、医薬品、食品用添加物、肥料、農薬、化粧品等であってもよい。
有効成分とするアリトールは、植物体から抽出したもの、植物体に含まれる形態であってもよい。植物体は、ズイナあるいはリョウブである。有効成分とするアリトールは、D-プシコースとアリトールとを含有する、アリトール混合物であってもよい。アリトール混合物においては、アリトールおよび/またはD-プシコースの含有量を調整することができる。有効成分とするアリトールが、D-プシコースとアリトールとを含有する、アリトール混合物である場合、自然界では極少量しか産生しないD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体である、ユキノシタ科ズイナ属の落葉低木のズイナを植物体の形態で利用することができる。当該植物体は、従来、栄養学的に検討された報告は見当たらなかったとはいえ、新葉を食用にしていた植物そのものであるから、無理なく日常的に摂取することができ、いわゆる機能性食品などの食品として使用することに適する。
得られた顆粒状の組成物は、水に対する分散性が良好であり、微粉末として飛散する傾向が小さく、製品として分包することが容易である。また、一般に、健康上および嗜好上の理由から、生体内機能性成分のズイナを植物体以外の添加剤、例えば、上記のヒドロキシプロピルセルロースのような結合剤等が多く添加されたものは消費者には好まれない。結合剤は、得られた顆粒状の組成物を水に溶解した場合の溶解性、分散性を損なわない範囲の量で用いることができる。用いる結合剤の強さにもよるが、結合剤は、溶液として使用する場合には3重量%以下であり、粉末添加の場合には10重量%以下で用いることができる。
本発明において、アリトールを抗肥満活性剤として、あるいは肥満抑制方法において用いる際は、アリトールを食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬品に添加して成ることを特徴とする。すなわち、アリトールを有効成分として配合した食品、肥料、農薬、化粧品又は医薬として用いることができる。その際、アリトールが植物体に含まれる形態で利用される場合もあり、そのときは食物繊維含有素材をさらに含むことができる。食物繊維含有素材の好ましい例は日本茶、紅茶および中国茶から選ばれる茶の粉末である。また、アリトールはD-プシコースを含有する形態で利用され、必要によりアリトールおよびD-プシコースの含有量が調整される。
本発明のアリトールを有効成分とする抗肥満活性剤は、錠剤、カプセル、顆粒剤、粉末、またはトローチ等の形態であっても良いから、ズイナの凍結乾燥物の粉砕物または破砕物と同様の例えば食物繊維含有素材を添加した場合であっても、良好に造粒することができる。食物繊維の主な作用についてはタンパク質の代謝、脂質代謝、糖質代謝に関わる分野では多くの研究が行われている。また、腸内に存在する細菌群に対する生理作用に関する研究も注目を集めている。食物繊維は、主として植物の繊維を含む、葉、芽、茎、花、実、根、穂、種子、果実等の部分に多く含まれる。食物繊維含有素材は、典型的には、緑色植物の繊維を含有する素材である。好ましい例としては、いわゆる青汁を製造するための食品素材が挙げられる。例えば、アシタバ、麦若葉、緑茶、ケール、カンショ若葉、ブロッコリー、モロヘイヤ、ゴマ若葉、桑葉、ボタンボウフウ、ヨモギ等およびそれらの混合物が挙げられる。食物繊維含有素材の形状や製法は特に限定されないが、好ましくは粉末状であり、好ましくは75μm以下の粉末である。
実施例の実験から、アリトールには抗肥満作用があることが確認された。また、既に抗肥満作用を有することが知られているD -プシコースよりも体脂肪蓄積量が低値を示したことから、アリトールの抗肥満作用は、D-プシコースのそれに比べて大きい可能性が示唆された。
本発明の食品の摂取量は、自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体または該植物体抽出物の体脂肪蓄積を抑制する有効量の範囲内、または総コレステロール値を低下させる有効量の範囲内であればよい。本発明の食品中における自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体の含有量は、食品全体に対して通常約0.1〜20質量%、好ましくは、約0.5〜10質量%、より好ましくは、約1〜5質量%である。該植物体抽出物の含有量は、植物体そのものの10%程度が目安となる。自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体または該植物体抽出物の含有量が少なすぎても効果が発現しない。
例えば、本発明の食品を体重増加抑制目的で成人に摂取させる場合、摂取させる対象、摂取形態、摂食量等によっても異なるが、自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体の摂取量として、一般的に一日につき、体重1kgあたり、乾燥重量として、1〜400mg、好ましくは40〜400mgである。なお、前記の量は1回で摂取させてもよいが、数回に分けて摂取させてもよい。自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体または該植物体抽出物の投与量が少なすぎても効果が発現しない。また、嗜好性や摂食量に影響をあたえずに効果が発現するという観点からも、上記の各摂取量が好ましい。他の動物の場合も、同様の量を摂取することができる。
このようにして得られる食品は、安全であるので、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトに対して継続的に与えることができる。
上記の食品中の自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体または該植物体抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、0.01質量%以上であり、そして50質量%以下、好ましくは20質量%以下、更に好ましくは10質量%以下である。
本発明の自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体または該植物体抽出物を医薬品或いはサプリメントとして、或いは医薬品或いはサプリメントに配合して使用する場合の投与量は、自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体の形態により、また、対象者の状態、体重、性別、年齢またはその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人1人当たりの1日の投与量は、通常、自然界では極少量しか産生しない、希少糖のD-プシコースおよびアリトールをその植物体内で生産し含有している植物体または該植物体抽出物として15mg以上であり、そして10g以下、好ましくは5g以下、更に好ましくは1g以下である。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、1日1回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
また、投与または摂取対象としては、それを必要としている若しくは希望している動物であれば特に限定されないが、エネルギー消費促進、体脂肪蓄積抑制、または肥満予防または改善を必要とする若しくは希望するヒトが挙げられる。
(1)実験動物
1)実験動物および飼育条件
実験動物には3週齢のWistar系雄性ラット(日本エスエルシー株式会社)32匹を用いた。ラットの飼育には個別のステンレスゲージを用い、明期を8:00〜20:00、暗期を20:00〜8:00とする12時間の明暗サイクルで飼育した。また、室温を約25℃、湿度を約55%として飼育した。10日間予備飼育を行い、予備飼育期間中は粉末飼料(MF、オリエンタル酵母工業株式会社)と水を自由に与えた。予備飼育終了後、32匹のラットを平均体重と標準偏差が均等になるように8匹ずつ4群に分け、それぞれ対照食を与える対照群(C群)、重量比5%のアリトールを含む食餌を与えるアリトール群(A群)、重量比5%のエリスリトールを含む食餌を与えるエリスリトール群(E群)、重量比5%のD-プシコースを含む食餌を与えるD-プシコース群(P群)とした。各群に与える実験食の組成を下記表2に示す。
飼育終了後、絶食させずに午前9:00に断頭屠殺し、解剖を行った。血液を採取し、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、腹腔内脂肪組織(副睾丸脂肪、腎周囲脂肪、腸間膜脂肪)を摘出し秤量した。採取した肝臓を−80℃で保存し、血液については、卓上遠心分離機(テーブルトップ遠心機5220、久保田商事株式会社)を用いて、3000rpm(1509×g)で15分間遠心分離し、得られた血清を分析まで−20℃で保存した。
−20℃で保存しておいた血清を氷中で約1時間溶解させた後、下記の血清成分分析を行った。
(i)血清グルコース濃度
グルコースCII−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いて、血清グルコース濃度を測定した。具体的には、96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで2μLずつ分注した。キット中の発色試液300μLを各ウェルに添加し37℃で5分間加温した。加温後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて505nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清グルコース濃度を求めた。
レビス インスリン−ラットT(株式会社シバヤギ)を用いて、血清インスリン濃度を測定した。具体的には、濃縮洗浄液をイオン交換水で10倍に希釈したものを洗浄液とし、調製した洗浄液を用いてキットの抗体固相化プレートの各ウェルに満たし4回洗浄し、キッチンペーパーに軽く叩きつけるようにしてウェルに残った液を取り除いた。その後、緩衝液を用いて4000倍に希釈したキット内のビオチン結合抗インスリン抗体を各ウェルに100μLずつ分注し、撹拌した。ウェルに血清サンプルと標準インスリン溶液を10μL分注し、撹拌した後、シールを用いて密閉した後に室温で2時間静置した。静置後反応液を捨て、洗浄液を各ウェルに満たし4回洗浄した。キッチンペーパーに軽く叩きつけるようにしてウェルに残った液を取り除いた。緩衝液を用いて2000倍に希釈したペルオキシダーゼ・アジピン結合物を各ウェルに100μLずつ分注し撹拌した後、室温で30分間静置した。静置後、反応液を捨て洗浄液を各ウェルに満たし4回洗浄した。その後、キッチンペーパーに軽く叩きつけるようにしてウェルに残った液を取り除いた。各ウェルに発色液を100μLずつ分注し、室温で30分間静置した。反応停止液を100μLずつ分注し、発色反応を停止した。マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて450nmの波長での吸光度を測定した。得られた検量線から血清インスリン濃度を求めた。
コレステロールE−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで2μLずつ分注した。キット中の発色試液300μLを各ウェルに添加し37℃で5分間加温した。加温後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて600nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清総コレステロール濃度を求めた。
HDL−コレステロールE−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。0.5mLチューブに血清を20μL分注した。さらに、沈殿試薬20μLを加え攪拌した。室温で10分間静置した後、微量高速冷却遠心機(MX−300、株式会社トミー精工)を用いて3000rpm(1640×g)で15分間遠心分離を行った。分離した上清を採取し、これを血清HDL−コレステロール濃度測定用サンプルとした。96ウェルプレートにブランク、標準液、サンプル(n=2)をそれぞれで5μLずつ分注した。発色試液300μLを各ウェルに添加し、37℃で5分間加温した。加温後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて600nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清HDL−コレステロール濃度を求めた。
血清総コレステロール濃度から血清HDL−コレステロース濃度を引いた値を血清non−HDL−コレステロール濃度として算出した。
NEFA C−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで5μLずつ分注した。キット中の発色試液Aを100μL各ウェルに添加し37℃で10分間加温した。加温後、発色試液Bを200μL各ウェルに添加し、37℃で10分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて550nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清遊離脂肪酸濃度を求めた。
トリグリセライドE−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで2μLずつ分注した。発色試液300μLを各ウェルに添加し37℃で5分間加温した。加温後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて600nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清中性脂肪濃度を求めた。
リン脂質C−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで2μLずつ分注した。発色試液を300μLを各ウェルに添加し37℃で5分間加温した。加温後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて600nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清リン脂質濃度を求めた。
血清TNF−α濃度測定には、市販のキット(Rat TNF−α Assay Kit−IBL、株式会社免疫生物研究所)を用いた。抗体固相化プレートに検体および各濃度の標準液を分注した。プレートカバーをし、4℃での一夜反応させた。反応後、イオン交換水を用いて40倍に希釈した洗浄液と、キッチンペーパーを用いて抗体固相化プレートを4回洗浄した。次に、緩衝液を用いて30倍に希釈した標識抗体溶液を100μLずつ各ウェルに分注した後、プレートカバーをし、4℃で30分反応させた。反応終了後、洗浄液とキッチンペーパーを用いて、抗体固相化プレートを5回洗浄した。その後、発色液(TMB)を100μLずつ各ウェルに分注し、遮光下常温で30分間反応させた。反応後、反応停止液(1NのH2SO4)を100μLずつ各ウェルに加え、撹拌後450nm吸光波長で試薬盲検を対照として、検体および標準液の吸光度をマイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて測定した。検量線より、血清TNF−α濃度を測定した。
血清レプチン濃度測定には、市販のキット(マウス/ラットレプチン測定キット、株式会社森永生科学研究所)を用いた。抗体固相化プレートにイオン交換水を用いて20倍に希釈した洗浄液と、キッチンペーパーを用いて抗体固相化プレートを2回洗浄した。各ウェルに検体希釈液を45μLずつ分注した後、モルモット抗レプチン抗血清を50μLずつ分注した。標準曲線用レプチン溶液および検体希釈液を用いて4倍希釈した検体を5μLずつ分注した後、プレートカバーをし、4℃での一夜反応させた。反応後、洗浄液とキッチンペーパーを用いて抗体固相化プレートを5回洗浄した。次に、酵素標識抗モルモットIgG抗体原液と酵素標識抗体希釈液を混合させた酵素標識抗モルモットIgG抗体溶液を100μLずつ分注した。分注後、プレートカバーをし、4℃で3時間反応させた。反応終了後、洗浄液とキッチンペーパーを用いて、抗体固相化プレートを7回洗浄した。その後、発色液(TMB)を100μLずつ各ウェルに分注し、遮光下常温で30分間反応させた。反応後、反応停止液(1NのH2SO4)を100μLずつ各ウェルに加え、撹拌後450nm吸光波長で試薬盲検を対照として、検体および標準液の吸光度をマイクロプレートリーダー吸光測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて測定した。検量線より、血清レプチン濃度を測定した。
A/GB−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで5μLずつ分注した。総タンパク発色試液250μLを各ウェルに添加し室温で30分間反応させた。反応終了後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて540nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清総タンパク質濃度を求めた。
A/GB−テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いた。96ウェルプレートにブランク、標準液、血清サンプル(n=2)をそれぞれで1μLずつ分注した。キット中のアルブミン発色試液250μLを各ウェルに添加し室温で10分間反応させた。反応終了後、マイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて630nmの波長で吸光度を測定した。得られた検量線から血清アルブミン濃度を求めた。
血清アルブミン濃度を血清グロブリン(総タンパク質−アルブミン)濃度で除した値をA/Gとして算出した。
(i)肝臓グリコーゲン含量:Lo法(非特許文献9参照)
蓋付き試験管に肝臓約0.05gを採取し、秤量した。30%KOHを1.0mL加えて、蓋を閉じ、ヒーティングブロックを用いて、100℃で10分間加熱した後、攪拌し再度100℃で10分加熱した。その後、氷中で5分間冷却し、95%エタノールを1.2mL分注し、再度氷中で5分間冷却し、グリコーゲンを沈殿させた。卓上遠心分離機(テーブルトップ遠心機5220、久保田商事株式会社)を用いて、2500rpm(1139×g)で15分間遠心分離し、アスピレーターで上清を除去した。さらに、イオン交換水を4mL加え、攪拌してサンプル溶液とした。2.0mLチューブに標準液(グルコースCII−テストワコー・200mg/dLグルコース溶液より調製)及びサンプル溶液を100μL分取した。5%フェノール溶液100μLを添加し、さらに97%濃硫酸500μLを分注し攪拌し、室温で30分間静置した。静置後、96ウェルプレートに300μL分注し、490nm波長における吸光度をマイクロプレートリーダー吸光度測定装置(VERSA max ACK、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)で測定した。得られた検量線から溶液のグルコース濃度を求め、肝臓グリコーゲン含量を算出した。
(ii)肝臓脂質抽出:Folch法(非特許文献10参照)
肝臓約0.05gを2.0mLチューブに秤量し、メタノール0.5mLを分注した。さらに、ホモジナイザー(POLYTRON PT 1200E、KINEMATICA AG)を用いて氷上で10秒間粉砕した。これを3回行った。その後、クロロホルム1.0mLを添加し、攪拌して冷蔵庫で1晩放置した。放置後のサンプルを微量高速冷却遠心機(MX−300、株式会社トミー精工)で3000rpm(1640×g)5分間遠心分離した。次に、生理食塩水を200μL分注した1.5mLチューブに遠心分離により得られた上清800μLを移し、攪拌した。再び、微量高速冷却遠心機(MX−300、株式会社トミー精工)を用いて3000rpm(1640×g)で5分間遠心分離した。遠心分離後、上清をアスピレーターで吸引除去し、下層を肝臓脂質抽出液とした。
(iii)肝臓総脂肪含量
重量を測定した0.5mLチューブに脂質抽出液200μLを分注した。チューブの蓋を開けた状態で2時間の減圧乾固をデシケーター内で行った。減圧乾固後の重量を測定し、チューブの重量を減算し算出したものを肝臓総脂肪量とした。総脂肪測定済みのサンプルに脂質溶解液(1−ブタノール:メタノール:トリトンX−100=2:1:1(v/v)を混合した溶液)を200μL添加し、攪拌したものを肝臓脂質サンプルとした。
(iv)肝臓中性脂肪含量:GPO・DAOS法
血清中性脂肪濃度と同様に、肝臓脂質サンプルの中性脂肪濃度を求め、中性脂肪含量を算出した。
(v)肝臓コレステロール含量:コレステロールオキシダーゼ・DAOS法
血清総コレステロール濃度と同様に、肝臓脂質サンプルの総コレステロール濃度を求め、コレステロール含量を算出した。
(i)屠体脂肪量:ソックスレー法
冷凍保存していた屠体を一晩ドラフト内で自然解凍した。解凍した屠体をディスポカップに入れ、その上からビニール袋で覆いアルミホイルで包んだ。これをオートクレーブで120℃、90分で水蒸気加圧を行った後、3時間放熱させた。水蒸気加圧された屠体の重量を測定し、フードプロセッサーでホモジナイズした。ホモジナイズを行った試料を採取し、ピンセットで骨を除いて屠体サンプルとした。濾紙に屠体サンプルを約2g秤量し、これを包み、ソックスレーサンプルとした。ソックスレーサンプルを乾燥機で105℃、6時間の乾燥を行い、デシケーター内で1時間放冷した。放冷後の重量を測定し、ソックスレー抽出器を用いて、石油エーテルで16時間脂肪の抽出を行った。抽出器からサンプルを取り出し、石油エーテルを蒸発させた後に乾燥機を用いて105℃で1時間乾燥させ、デシケーター内で1時間放冷した。放冷後のサンプルの重量を測り、抽出前後の乾燥重量差から算出したものをサンプルの粗脂肪量とした。オートクレーブ後の屠体重量当たりの粗脂肪量を算出し屠体脂肪量とした。
(ii)総体脂肪量 総脂肪量は先行研究(非特許文献11参照)にて用いられていた以下の式により算出した。総体脂肪量(g)=屠体脂肪量(g)+ 総腹腔内脂肪組織量(g)×0.85
データを平均値±標準誤差によって示した。統計解析については、Tukey法で各群間の有意差を調べ、p<0.05を有意差ありと判定した(非特許文献12参照)。
(1)体重、食餌摂取量および食餌効率を表3に示す。
平均体重推移を図2に、平均食餌摂取量の経日変動を図3に示した。最終体重、体重増加量、1日当たりの食餌摂取量および食餌効率には、各群間で差は見られなかった。
肝臓絶対重量には、各群間に差は見られなかったが、体重当たりの相対重量は、他の3群に比べてD-プシコース群で有意に高値を示した。腎臓重量絶対重量は、アリトール群に比べてD-プシコース群で有意に高値を示し、体重当たりの相対重量は、他の3群に比べてD-プシコース群で有意に高値を示した。総腹腔内脂肪重量(副睾丸脂肪重量、腎周囲脂肪重量、腸間膜脂肪重量)は、絶対重量、相対重量のいずれも対照群に比べてアリトール群で有意に低値を示した。また、副睾丸脂肪および腎周囲脂肪重量は、絶対重量、相対重量のいずれも対照群に比べてアリトール群で有意に低値を示した。その他の組織重量には、各群間に差は見られなかった。
血清グルコース濃度は、対照群に比べてエリスリトール群およびD-プシコース群で有意に低値を示した。血清インスリン濃度は、エリスリトール群に比べて対照群およびアリトール群で有意に低値を示した。血清HDL−コレステロース濃度は、アリトール群に比べてエリスリトール群およびD-プシコース群で有意に高値を示した。血清遊離脂肪酸濃度は、D-プシコース群に比べて対照群およびアリトール群で有意に高値を示した。血清リン脂質濃度は、対照群に比べてアリトール群で有意に低値を示した。血清アルブミン濃度は、対照群およびアリトール群に比べてD-プシコース群で有意に高値を示した。他の血清成分濃度には、各群間に差は見られなかった。
グリコーゲン含量は、対照群およびアリトール群に比べてエリスリトール群で有意に低値を示し、D-プシコース群に比べてアリトール群で有意に低値を示した。コレステロール含量は、対照群およびアリトール群に比べてD-プシコース群で有意に高値を示した。中性脂肪含量には各群間に有意差は見られなかった。
本研究では、ラットの総体脂肪量および総体脂肪率、総腹腔内脂肪重量(副睾丸脂肪重量、腎周囲脂肪重量、腸間膜脂肪重量)が、対照群に比べてアリトール群で有意に低値を示した。このことから、アリトールには抗肥満作用があることが示唆された。先行研究において、山田らはD-プシコースを1.3〜5.2%添加した食餌をラットに与えて5週間飼育したところ、D-プシコースの食餌添加量が2.6%以上の場合に腹腔内脂肪組織重量の低下が見られと報告している(非特許文献13参照)。さらに、北側はD-プシコースの食餌添加量がわずか0.4%にすぎないにも関わらず、抗肥満作用を確認したが、これは同時に添加したアリトール(0.6%含有)の効果、あるいはD-プシコースとアリトールの相乗効果により抗肥満作用が発揮された可能性があると報告している(特許文献2)。これらのことは、本研究で見られたアリトールの抗肥満作用を支持するものである。
Claims (11)
- アリトールをD−プシコースよりも大きい抗肥満作用の有効成分として成ることを特徴とする、摂取者にD−プシコースよりも大きい抗肥満効果を与えるための経口抗肥満活性剤。
- アリトールを食品の形態で摂取させて成ることを特徴とする請求項1に記載の経口抗肥満活性剤。
- 前記アリトールはズイナあるいはリョウブから抽出したことを特徴とする請求項1または2に記載の経口抗肥満活性剤。
- 前記アリトールはズイナあるいはリョウブに含まれる形態であることを特徴とする請求項1または2に記載の経口抗肥満活性剤。
- 前記アリトールは、D-プシコースとアリトールとを含有する、アリトール混合物であることを特徴とする請求項1ないし4の何れか一に記載の経口抗肥満活性剤。
- 前記アリトール混合物において、アリトールおよび/またはD-プシコースの含有量が調整されていることを特徴とする請求項5に記載の経口抗肥満活性剤。
- アリトールを食品の形態で摂取させ、摂取者にD−プシコースよりも大きい抗肥満効果を与えることを特徴とする肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 前記アリトールはズイナあるいはリョウブから抽出したことを特徴とする請求項7に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 前記アリトールはズイナあるいはリョウブに含まれる形態であることを特徴とする請求項7または8に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 前記アリトールは、D-プシコースとアリトールとを含有する、アリトール混合物であることを特徴とする請求項7ないし9の何れか一に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 前記アリトール混合物において、アリトールおよび/またはD-プシコースの含有量を調整することを特徴とする請求項10に記載の肥満抑制方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
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